Filoproteomika oparta na spektrometrii mas (MSPP) została użyta do typowania zbioru izolatów Campylobacter jejuni ssp. doylei na poziomie szczepu w porównaniu do typowania sekwencji wielolocus (MLST).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Podtypowanie izolatów Campylobacter jejuni ssp. doylei przy użyciu filoproteomiki opartej na spektrometrii mas (MSPP)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
MALDI-TOF MS oferuje możliwość różnicowania niektórych bakterii nie tylko na poziomie gatunku i podgatunku, ale nawet poniżej, na poziomie szczepu. Izoformy alleli wykrywalnych jonów biomarkerowych powodują przesunięcia masy specyficzne dla izolatu. Filoproteomika oparta na spektrometrii mas (MSPP) to nowatorska technika, która łączy wykrywalne masy biomarkerów za pomocą spektrometrii mas w schemacie, który umożliwia wnioskowanie relacji filoproteomicznych na podstawie specyficznych przesunięć masowych izolatu w porównaniu ze szczepem referencyjnym zsekwencjonowanym w genomie. Wydedukowane sekwencje aminokwasów są następnie wykorzystywane do obliczania dendrogramów opartych na MSPP.
Tutaj opisujemy przebieg pracy MSPP, wpisując kolekcję siedmiu szczepów izolatu Campylobacter jejuni ssp. doylei. Wszystkie siedem szczepów było pochodzenia ludzkiego, a typowanie sekwencji wielolocus (MLST) wykazało ich różnorodność genetyczną. Typowanie MSPP zaowocowało siedmioma różnymi typami sekwencji MSPP, wystarczająco odzwierciedlającymi ich filogenetyczne relacje.
Schemat MSPP C. jejuni ssp. doylei zawiera 14 różnych jonów biomarkerowych, głównie białka rybosomalne w zakresie mas od 2 do 11 kDa. MSPP można w zasadzie dostosować do innych platform spektrometrii mas o rozszerzonym zakresie mas. Dlatego technika ta ma potencjał, aby stać się użytecznym narzędziem do typowania drobnoustrojów na poziomie szczepu.
Wprowadzenie
W ciągu ostatniej dekady, spektrometria mas czasu przelotu wspomagana desorpcją laserową (MALDI-TOF MS) stała się wysoko cenioną standardową metodą identyfikacji rodzajów i gatunków drobnoustrojów w mikrobiologii klinicznej 1,2. Identyfikacja gatunków opiera się na rejestrowaniu małych odcisków palców białek z nienaruszonych komórek lub lizatów komórkowych. Typowy zakres mas dla spektrometru mas stosowanego w rutynowej mikrobiologii klinicznej wynosi 2-20 kDa. Dodatkowo, uzyskane widma mogą być wykorzystane do rozróżnienia szczepów na poziomie3 poniżej gatunku i poniżej podgatunku. Wczesne pionierskie badania zidentyfikowały....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotuj bezpieczne miejsce pracy, biorąc pod uwagę warunki bezpieczeństwa biologicznego
- Zapoznaj się z przepisami laboratoryjnymi i bezpieczeństwa, które mają znaczenie w pracy z mikroorganizmami. Z większością mikroorganizmów chorobotwórczych dla ludzi należy obchodzić się w warunkach 2 poziomu bezpieczeństwa biologicznego, ale niektóre, takie jak Salmonella enterica serowar Typhi, wymagają 3 poziomu bezpieczeństwa biologicznego. Informacje na temat poziomu postępowania z każdym patogenem można uzyskać pod adresem www.cdc.gov/biosafety.
- Niezależnie od klasyfikacji zagrożenia biologicznego danego mikroorganizmu, wszystkie materiały,....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wcześniej z sukcesem opracowaliśmy schemat MSPP dla C. jejuni ssp. jejuni13. W niniejszej pracy dążyliśmy do rozszerzenia tej metody na pokrewną podgatunek C. jejuni ssp. doylei. W tym konkretnym ustawieniu eksperymentalnym pozyskano siedem izolatów C. jejuni ssp. doylei z belgijskiej kolekcji mikroorganizmów/Laboratorium Mikrobiologii UGent BCCM/LMG w Gandawie, Belgia. Wszystkie siedem izolatów wykorzystanych w naszych anal.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Najważniejszym krokiem na drodze do ustanowienia schematu MSPP jest jednoznaczne genetyczne określenie tożsamości jonów biomarkerowych. Jeżeli bez wątpienia nie jest możliwe zidentyfikowanie biomarkera, należy go wykluczyć ze schematu13.
Schemat C. jejuni ssp. doylei obejmuje 14 różnych jonów biomarkerowych. Są one o 5 mniej w porównaniu ze schematem MSPP C. jejuni ssp. jejuni 13. Najistotniejszą różnicą pomiędzy wykrywalnymi biomarkera.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni Hannah Kleinschmidt za doskonałe wsparcie techniczne. Artykuł został sfinansowany przez program wsparcia otwartego dostępu Deutsche Forschungsgemeinschaft oraz fundusz wydawniczy Georg August Universität Göttingen.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| acetonitryl | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy | 34967 | |
| System Autoflex III TOF/TOF 200 | Bruker Daltonics, Brema, Niemcy | GT02554 G201 | Spektrometr |
| mas standard testu bakteryjnego BTS | Bruker Daltonics, Brema, Niemcy | 604537 | |
| BioTools 3.2 SR1 | Bruker Daltonics, Brema, Niemcy | 263564 | Pakiet oprogramowania |
| Standard testu bakteriologicznego Bruker IVD | Bruker Daltonics, Brema, Niemcy | 8290190 | 5 probówek |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei izolat | Belgia koordynowane zbieranie mikroorganizmów/Laboratorium Mikrobiologii UGent BCCM/LMG Gandawa, Belgia | LMG8843 | ATCC 49349; IMVS 1141; NCTC 11951; szczep 093 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei izolat | Belgia koordynowany zbiór mikroorganizmów/Laboratorium Mikrobiologii UGent BCCM/LMG Gandawa, Belgia | LMG9143 | Goossens Z90 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei izolat | Belgia koordynowane zbieranie mikroorganizmów/Laboratorium Mikrobiologii UGent BCCM/LMG Gandawa, Belgia | LMG7790 | ATCC 49350; CCUG 18265; Kasper 71; LMG 8219; NCTC 11847 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei izolat | Belgia koordynowane zbieranie mikroorganizmów/Laboratorium Mikrobiologii UGent BCCM/LMG Gandawa, Belgia | LMG9243 | Goossens N130 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei izolat | Belgia koordynowane zbieranie mikroorganizmów/Laboratorium Mikrobiologii UGent BCCM/LMG Gandawa, Belgia | LMG8871 | NCTC A603/87 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei izolat | Belgia koordynowany zbiór mikroorganizmów/Laboratorium Mikrobiologii UGent BCCM/LMG Gandawa, Belgia | LMG9255 | Goossens B538 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei izolat | Belgia koordynowane zbieranie mikroorganizmów/Laboratorium Mikrobiologii UGent BCCM/LMG Gandawa, Belgia | LMG8870 | NCTC A613/87 |
| Columbia baza agarowa | Merck, Darmstadt, Niemcy | 1.10455 .0500 | 500 g |
| Kompas do FlexSeries 1.2 SR1 | Bruker Daltonics, Brema, Niemcy | 251419 | Pakiet oprogramowania |
| defibrynowana krew owcza | Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Niemcy | SR0051 | |
| etanol | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy | 02854 Kwas | |
| Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy | F0507 | ||
| Matryca HCCA | Bruker Daltonics, Brema, Niemcy | 604531 | |
| Bibułki papierowe | Kimtech Science przez Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy | ||
| MALDI Biotyper 2.0 | Bruker Daltonics, Brema, Niemcy | 259935 | Pakiet oprogramowania |
| Mast Cryobank Fiolki | Mast Diagnostica, Reinfeld, Niemcy | Tarcza ze stali polerowanej CRYO/B | |
| MSP 96 | Bruker Daltonics, Brema, Niemcy | 224989 | |
| Zestaw QIAamp DNA Mini | Qiagen, Hilden, Niemcy | 51304 | |
| rekombinowana insulina ludzka | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy | I2643 | |
| kwas trifluorooctowy | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy | T6508 | |
| woda, klasa biologii molekularnej | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy | W4502 |
Bibliografia
- Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
- Bader, O.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
