Artykuł metodologiczny

Podtypowanie izolatów Campylobacter jejuni ssp. doylei przy użyciu filoproteomiki opartej na spektrometrii mas (MSPP)

DOI:

10.3791/54165

⸱

30 października 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institut für Medizinische Mikrobiologie, Universitätsmedizin Göttingen

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Filoproteomika oparta na spektrometrii mas (MSPP) została użyta do typowania zbioru izolatów Campylobacter jejuni ssp. doylei na poziomie szczepu w porównaniu do typowania sekwencji wielolocus (MLST).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MALDI-TOF MS oferuje możliwość różnicowania niektórych bakterii nie tylko na poziomie gatunku i podgatunku, ale nawet poniżej, na poziomie szczepu. Izoformy alleli wykrywalnych jonów biomarkerowych powodują przesunięcia masy specyficzne dla izolatu. Filoproteomika oparta na spektrometrii mas (MSPP) to nowatorska technika, która łączy wykrywalne masy biomarkerów za pomocą spektrometrii mas w schemacie, który umożliwia wnioskowanie relacji filoproteomicznych na podstawie specyficznych przesunięć masowych izolatu w porównaniu ze szczepem referencyjnym zsekwencjonowanym w genomie. Wydedukowane sekwencje aminokwasów są następnie wykorzystywane do obliczania dendrogramów opartych na MSPP.

Tutaj opisujemy przebieg pracy MSPP, wpisując kolekcję siedmiu szczepów izolatu Campylobacter jejuni ssp. doylei. Wszystkie siedem szczepów było pochodzenia ludzkiego, a typowanie sekwencji wielolocus (MLST) wykazało ich różnorodność genetyczną. Typowanie MSPP zaowocowało siedmioma różnymi typami sekwencji MSPP, wystarczająco odzwierciedlającymi ich filogenetyczne relacje.

Schemat MSPP C. jejuni ssp. doylei zawiera 14 różnych jonów biomarkerowych, głównie białka rybosomalne w zakresie mas od 2 do 11 kDa. MSPP można w zasadzie dostosować do innych platform spektrometrii mas o rozszerzonym zakresie mas. Dlatego technika ta ma potencjał, aby stać się użytecznym narzędziem do typowania drobnoustrojów na poziomie szczepu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatniej dekady, spektrometria mas czasu przelotu wspomagana desorpcją laserową (MALDI-TOF MS) stała się wysoko cenioną standardową metodą identyfikacji rodzajów i gatunków drobnoustrojów w mikrobiologii klinicznej 1,2. Identyfikacja gatunków opiera się na rejestrowaniu małych odcisków palców białek z nienaruszonych komórek lub lizatów komórkowych. Typowy zakres mas dla spektrometru mas stosowanego w rutynowej mikrobiologii klinicznej wynosi 2-20 kDa. Dodatkowo, uzyskane widma mogą być wykorzystane do rozróżnienia szczepów na poziomie3 poniżej gatunku i poniżej podgatunku. Wczesne pionierskie badania zidentyfikowały specyficzne jony biomarkerowe dla określonej podgrupy szczepów Campylobacter jejuni4, Clostridium difficile5, Salmonella enterica ssp. enterica serowar Typhi6, Staphylococcus aureus 7-9 i Escherichia coli 10-12.

Kombinacja kilku zmiennych mas biomarkerów odpowiadających izoformom alleli daje możliwość głębszego podtypowania. Wcześniej z powodzeniem wdrożyliśmy metodę przekształcania tych zmian w profilach mas w znaczące i powtarzalne relacje filoproteomiczne zwane filoproteomiką opartą na spektrometrii mas (MSPP) na kolekcji izolatów C. jejuni ssp. jejuni 13. MSPP może być stosowany jako spektrometria mas równoważna technikom podtypowania opartym na sekwencjach DNA, takim jak typowanie sekwencji wielolocus (MLST).

Gatunki Campylobacter są główną przyczyną bakteryjnego zapalenia żołądka i jelit na całym świecie14,15. W wyniku następstwa poinfekcyjnego kampylobakteriozy, a mianowicie zespołu Guillaina-Barrégo, może dojść do reaktywnego zapalenia stawów i nieswoistego zapalenia jelit16. Głównymi źródłami zakażenia są skażone mięso zwierząt gospodarskich z kurczaków, indyków, trzody chlewnej, bydła, owiec i kaczek, mleko i wody powierzchniowe15,17. W związku z tym konieczne są regularne badania nadzoru epidemiologicznego w kontekście bezpieczeństwa żywności. MLST jest "złotym standardem" w typowaniu molekularnym dla gatunków Campylobacter 18. Ponieważ metoda MLST oparta na sekwencjonowaniu Sangera jest pracochłonna, czasochłonna i stosunkowo kosztowna, typowanie MLST jest ograniczone do stosunkowo małych kohort izolowanych. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na tańsze i szybsze metody podtypowania. Potrzeba ta może zostać zaspokojona za pomocą metod spektrometrii mas, takich jak MSPP.

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół typowania MSPP przy użyciu kolekcji izolatów Campylobacter jejuni ssp. doylei i porównanie jego potencjału z MLST.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotuj bezpieczne miejsce pracy, biorąc pod uwagę warunki bezpieczeństwa biologicznego

  1. Zapoznaj się z przepisami laboratoryjnymi i bezpieczeństwa, które mają znaczenie w pracy z mikroorganizmami. Z większością mikroorganizmów chorobotwórczych dla ludzi należy obchodzić się w warunkach 2 poziomu bezpieczeństwa biologicznego, ale niektóre, takie jak Salmonella enterica serowar Typhi, wymagają 3 poziomu bezpieczeństwa biologicznego. Informacje na temat poziomu postępowania z każdym patogenem można uzyskać pod adresem www.cdc.gov/biosafety.
  2. Niezależnie od klasyfikacji zagrożenia biologicznego danego mikroorganizmu, wszystkie materiały, które miały kontakt z czynnikiem zakaźnym, należy traktować jako odpady zakaźne, które przed unieszkodliwieniem należy poddać autoklawie. Przestrzegaj regionalnych wytycznych bezpieczeństwa dotyczących materiałów niebezpiecznych i substancji biologicznych. Upewnij się, że dostępne są odpowiednie pojemniki do natychmiastowego i prawidłowego usuwania potencjalnie skażonych materiałów (zagrożeń biologicznych).
  3. Upewnij się, że sterylne narzędzia (pętle inokulacyjne), roztwory i podłoża hodowlane (płytki agarowe) są dostępne przed rozpoczęciem hodowli bakteryjnej.
  4. Umyj ręce mydłem antyseptycznym i ciepłą wodą natychmiast po kontakcie z zakaźnymi mikroorganizmami.

2. Wybierz izolaty referencyjne i kolekcjonerskie

  1. Wybierz i uzyskaj jeden standardowy izolat referencyjny sekwencjonowany genomem wraz z sekwencjami kodowanego proteomu, najlepiej w formacie FASTA. Jeśli dostępnych jest więcej szczepów ze zsekwencjonowanym genomem, uwzględnij je w analizie.
    Uwaga: Ten izolat/te izolaty zostaną później wykorzystane do przewidywania tożsamości pików masowych obserwowanych w spektrometrii mas (patrz sekcja 7).
  2. Selekcjonować i uzyskiwać różnorodne potencjalnie zróżnicowane izolaty w taki sposób, aby pokrywały filogenezę gatunków lub podgatunków będących przedmiotem zainteresowania.
    Uwaga: Izolaty te zostaną później wykorzystane do wykazania zmienności biomarkerów w populacji (patrz punkt 8).
  3. Upewnij się, że cała kolekcja i izolat referencyjny są prawidłowo oznaczone zgodnie z odpowiednim złotym standardem dla tego konkretnego organizmu18-20.
    Uwaga: Może to obejmować różne metody (pod)typowania, ale prawdopodobnie będzie to zastosowanie MLST, który nadal jest standardową metodą wykazywania różnorodności genetycznej większości gatunków drobnoustrojów.
  4. Aby wywnioskować filogenezę w kolekcji, należy obliczyć filogram na podstawie danych typowych, np. przy użyciu metody grup par nieważonych ze średnią arytmetyczną (UPGMA) w oprogramowaniu MEGA6 dla danych MLST21. Aby uzyskać dane MLST, zapoznaj się również z bazą danych MLST i przypisz typy sekwencji i odpowiednie kompleksy klonalne22.
    Uwaga: Zostanie to później wykorzystane do analizy zgodności MSPP z wcześniejszą metodą typowania opartego na złotym standardzie (patrz sekcja 9).

3. Przygotuj tabliczkę docelową MALDI

UWAGA: TFA to mocny kwas. Niewłaściwe stosowanie TFA niesie ze sobą ryzyko poważnych oparzeń skóry, uszkodzenia oczu oraz silnego podrażnienia górnych dróg oddechowych w przypadku wdychania. Dlatego należy przestrzegać rygorystycznych środków bezpieczeństwa, a podczas obchodzenia się z TFA potrzebne są odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE), w tym okulary ochronne, osłony twarzy, odpowiednie rękawice, buty, a nawet pełny kombinezon ochronny. Ewentualne narażenie na TFA musi być kontrolowane poprzez obchodzenie się z substancją w warunkach odpowiedniej wentylacji za pomocą skutecznego systemu wentylacji wyciągowej. W przypadku niewystarczającej wentylacji należy użyć respiratora z zatwierdzonym filtrem. Dodatkowo TFA jest szkodliwy dla organizmów wodnych, powodując długotrwałe skutki. Należy unikać jakiegokolwiek uwalniania tłuszczu trans ze ścieków do środowiska.

Uwaga: Zanim zauważysz próbki na tarczy MALDI, dokładnie wyczyść płytkę docelową, jeśli płytka była używana wcześniej.

  1. Przygotować 100 ml 70% wodnego roztworu etanolu, używając 30 ml wody dejonizowanej i 70 ml czystego etanolu.
  2. Przygotować 250 μl 80% wodnego roztworu kwasu trifluorooctowego (TFA), mieszając 50 μl wody dejonizowanej i 200 μl 100% TFA w probówce reakcyjnej i wirując probówkę przez 1 min.
  3. Oczyść tarczę MALDI, umieszczając ją w szklanym naczyniu i zanurzając w 70% wodnym etanolu na około 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Opłucz cel pod gorącą wodą.
  5. Za pomocą chusteczki papierowej intensywnie przetrzyj płytkę docelową 70% wodnym roztworem etanolu, aby usunąć wszystkie poprzednie próbki i inne potencjalne zanieczyszczenia.
  6. Jeśli wymagane jest dalsze czyszczenie, spłucz pod gorącą wodą, wycierając chusteczką papierową.
  7. Usuń pozostałości i potencjalnie niewidoczne zanieczyszczenia, pokrywając powierzchnię docelową cienką warstwą 80% wodnego TFA (~100 μl na 96 miejsc) i wycierając wszystkie miejsca docelowe do czysta chusteczką papierową.
  8. Na koniec opłucz cel, aby usunąć kwas, wytrzyj go do sucha chusteczką papierową i pozostaw na co najmniej 15 minut w temperaturze pokojowej, aby odparować resztki płynu.

4. Przygotowanie roztworu matrycowego kwasu α-cyjano-4-hydroksy-cynamonowego zawierającego kaliberant wewnętrzny

  1. Przygotować nasycony roztwór matrycy, rozpuszczając 10 mg kwasu α-cyjano-4-hydroksy-cynamonowego (HCCA) w 1 ml mieszaniny 50% acetonitrylu, 47,5% wody i 2,5% TFA. Pozostałości nierozpuszczonego HCCA pozostaną, jeśli roztwór jest nasycony.
  2. Dodaj rekombinowaną insulinę ludzką jako kaliber wewnętrzny. W tym celu należy przygotować roztwór podstawowy do końcowego stężenia 10 pg/μl w 50% wodnym roztworze acetonitrylu, podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszego wykorzystania.

5. Spektrometria mas MALDI-TOF

Uwaga: Należy stosować warunki hodowli specyficzne dla organizmów będących przedmiotem zainteresowania. Próbki do MALDI-TOF MS mogą być przygotowywane przez przygotowanie rozmazu lub ekstrakcję, w zależności od organizmu (patrz sekcja 8.4.1). Podczas gdy metoda ekstrakcji etanolem i kwasem mrówkowym zapewnia wystarczającą inaktywację patogenów, przygotowanie rozmazu musi być przeprowadzone w wystarczających warunkach bezpieczeństwa biologicznego, zgodnie z wymaganiami (patrz sekcja 1). Zwykle nie ma ryzyka infekcji po zastosowaniu matrycy, ale dla określonych patogenów wymagane są określone protokoły inaktywacji. Tak więc, na przykład, MALDI-TOF MS z gatunku Nocardia wymaga wcześniejszej lizy bakterii we wrzącej wodzie, a następnie wytrącenia białek etanolem23. EI Khéchine i wsp. opracowano procedurę inaktywacji prątków, podgrzewając kolonie bakteryjne w temperaturze 95 °C przez 1 godzinę w zakrętkach zawierających wodę i 0,5% Tween 2024.

  1. Przygotowanie wymazu
    1. Rozprowadź ilość kolonii bakterii wielkości główki od szpilki bezpośrednio na płytce docelowej MALDI ("plamka").
    2. Na każde miejsce nałożyć 1 μl regularnej matrycy HCCA lub matrycy zawierającej kaliberat wewnętrzny i pozostawić do krystalizacji w temperaturze pokojowej. W celu określenia dokładnej masy piku kalibracyjnego należy nałożyć na punkt kontrolny 1 μl wzorca testowego i 1 μl matrycy HCCA zawierającej wewnętrzny kalibert.
      Uwaga: Tutaj, jako wzorzec testowy, stosuje się ekstrakt z Escherichia coli DH5 alfa, który wykazuje charakterystyczny odcisk palca białka w MALDI-TOF MS. Jest on wzbogacony dwoma białkami, które rozszerzają górną granicę wykrywalnego zakresu masy.
  2. Metoda ekstrakcji
    1. Zebrać około pięciu kolonii z kultury agarowej z pętlą inokulacyjną i dokładnie zawiesić w 300 μl podwójnie destylowanej wody w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml. Dodać 900 μl absolutnego etanolu i dokładnie wymieszać przez wielokrotne pipetowanie, aż do całkowitego zawieszenia kolonii bakteryjnych.
      Uwaga: Na tym etapie możliwe i ugruntowane jest przechowywanie próbek w temperaturze -20 °C. Dodatkowo, inaktywacja patogenów może być testowana poprzez rozsypywanie 1-10 μl ekstraktu na odpowiednią płytkę agarową po inkubacji w optymalnych warunkach wzrostu. Na udaną inaktywację wskazuje brak wzrostu drobnoustrojów.
    2. Odwirować próbkę o masie 13 000 x g przez 1 minutę, odrzucić supernatant i wysuszyć osad w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Dokładnie zawiesić osad, pipetując w górę i w dół w 50 μl 70% kwasu mrówkowego.
    3. Dodać 50 μl acetonitrylu i wymieszać. Usunąć zanieczyszczenia przez odwirowanie przy 13 000 x g przez 2 min. Przenieść 1 μl supernatantu na próbkę na płytce docelowej MALDI i pozostawić do wyschnięcia na 5 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Na każde miejsce nałożyć 1 μl matrycy HCCA zawierającej kaliberat wewnętrzny i pozostawić do krystalizacji w temperaturze pokojowej.
  3. Zapis widm masowych
    Uwaga: Wybieranie pików z widm masowych odbywa się przy użyciu zalecanych standardowych procedur (algorytm centroidu; Stosunek sygnał/szum: 2; Rel. Próg intensywności: 2%; szerokość piku 3 m/z, odejmowanie linii bazowej: TopHat)
    1. Skalibruj przyrząd zgodnie z protokołem producenta.
    2. Dla każdego miejsca zbierz 600 widm w krokach co 100 strzałów.
      1. Przejdź do zakładki "AutoXecute" w oprogramowaniu konfiguracyjnym spektrometru mas. Otwórz "Metodę", klikając lewym przyciskiem myszy przycisk "Metoda" i wybierając metodę np. "MBT_AutoX" z menu rozwijanego.
      2. Kliknij lewym przyciskiem myszy przycisk "Edytuj..." po prawej stronie menu "Metoda", aby otworzyć "Edytor metod AutoXecute". Przejdź do zakładki "Akumulacja". Ustaw wartość "Suma" na "600", a wartość "zadowalające strzały w" _x_ "kroki strzału" na "100".
  4. Procedura kalibracji widma wewnętrznego
    Uwaga: Minutowe błędy pomiaru są nieodłącznie związane ze spektrometrią mas. W zależności od przerywanego użytkowania przyrządu, temperatury przyrządu i ponownej kalibracji, uzyskane wartości pomiarowe mogą się różnić w zależności od eksperymentu. Po kalibracji przyrządu przed pomiarem i po pomiarze, kalibracja widma do kalibru wewnętrznego jest najbardziej precyzyjnym sposobem zapewnienia porównywalności między widmami.
    1. Wykonaj następujące procedury dla każdej listy pików kalibracji:
      1. Uruchom przeglądarkę widma (np. flexAnalysis i otwórz spektrum: menu "Plik"→"Otwórz...".)
      2. Utwórz listę kontroli masy z szczytem kalibru: menu "Metoda"→"Otwórz...".
      3. Wybierz metodę: MBT_Standard.FAMSMethod →"Otwórz".
      4. Edytuj listę kontroli masy: Odznacz wszystkie kalibry.
      5. Dodaj szczyt Calibrant na dole: Etykieta szczytu: "Insulin_HIStag[M+H]+_avg"; m_z: "5808.29"; Tolerancja [ppm]: "50"; Zaznacz pole wyboru Calibert.
      6. Zapisz np. jako "Lista kalibrów MSPP".
    2. Dla każdego widma wybierz szczyt kalibru z listy, kliknij "Automatyczne przypisanie" i naciśnij "OK".

6. Sprawdź procedurę kalibracji wewnętrznej

  1. Doświadczalnie określić dokładną masę piku kalibracyjnego.
    1. Przygotować dwa miejsca z 1 μl wzorca testowego każde (krok 5.1.1). Na pierwszy z nich nałożyć 1 μl zwykłej matrycy HCCA, a na drugi 1 μl matrycy z kolcami kalibru.
    2. Uzyskać widma masowe z każdego miejsca (sekcja 5.3) i wewnętrznie skalibrować do pików wzorca testowego (sekcja 5.4).
    3. Nałóż na siebie oba widma, otwierając je za pomocą przeglądarki widma (np. flexAnalysis i otwarte widmo: menu "Plik"→"Otwórz...") i znajdując pik o oczekiwanej masie (insulina m/z = 5 808,29), który powinien być obecny w widmie z dodatkiem kalibru, ale nie w widmie uzyskanym za pomocą zwykłej matrycy.
  2. Sprawdź, czy pik kalibru nie jest przesłonięty przez żaden inny biomarker organizmu będącego przedmiotem zainteresowania.
    1. Przygotować dwie plamki (sekcja 5.1) ze szczepem odniesienia i pokryć pierwsze z nich matrycą regularną o pojemności 1 μl, a drugie matrycą o pojemności 1 μl z kolcami.
    2. Zdobądź widma masowe z obu punktów (sekcja 5.3) i nałóż powstałe widma, otwierając je za pomocą przeglądarki widma (np. flexAnalysis i otwarte widmo: menu "Plik"→"Otwórz..."). Upewnij się, że pik kalibru jest wyraźnie widoczny w widmie uzyskanym za pomocą matrycy wzbogaconej i nie jest przesłonięty przez inny sąsiedni sygnał. Jeśli tak nie jest, wybierz inny kaliber dla tego konkretnego organizmu.
      Uwaga: Użycie kolczastego kalibru wewnętrznego znacznie zwiększa precyzję określania zmian mas biomarkerów. Za pomocą tej metody można wykryć różnice mas do 1 Da. Alternatywnie, również masy niezmiennicze pochodzące z organizmów mogą być używane jako kalibranty. Jednak z definicji wszystkie masy pochodzące od organizmów należy uznać za potencjalnie zmienne, chyba że udowodniono inaczej.

7. Zidentyfikuj jony biomarkerów w szczepie referencyjnym

  1. Zmierz widmo masowe szczepu referencyjnego, używając matrycy wzbogaconej wewnętrznym kalibrem.
    1. Rozprowadzić ilość kolonii bakteryjnej wielkości główki od szpilki (sekcja 5.1) lub 1 μl ekstraktu z białka bakteryjnego (sekcja 5.2) bezpośrednio na płytce docelowej MALDI ("plamka").
    2. Pokryć każde miejsce 1 μl matrycy HCCA zawierającej kalibert wewnętrzny i pozostawić płytkę docelową do krystalizacji w temperaturze pokojowej (sekcja 5.1.2/5.2.4).
    3. Zapisać widma masowe odkształcenia odniesienia (ppkt 5.3).
  2. Wewnętrznie skalibrować widmo referencyjne do masy kalibru (tutaj: insulina w m/z = 5 806,29), a następnie wstępnie przetworzyć poprzez odejmowanie linii podstawowej (TopHat) i wygładzanie (parametry: SavitzkyGolay; szerokość: 2 m/z, 10 cykli).
    1. Uruchom przeglądarkę widma (np. flexAnalysis i otwórz spektrum: menu "Plik"→"Otwórz...".)
    2. Wybierz metodę: menu rozwijane "Metoda" →"Otwórz...", kliknij lewym przyciskiem myszy wybraną metodę, np. "MBT_Standard.FAMSMethod"→ "Otwórz".
    3. Skalibruj widmo, wybierając "Wewnętrzne..." z menu rozwijanego "Kalibruj". Otworzy się okno z listą pików kalibru (sekcja 5.4). Kliknij lewym przyciskiem myszy szczyt kalibru (insulina) →kliknij lewym przyciskiem myszy "OK". Wybierz "Widma procesu" z menu rozwijanego "Proces".
    4. Aby odjąć linię bazową, aktywuj widmo na liście widm po prawej stronie. Wybierz "Odejmij linię bazową widma masy" z menu rozwijanego "Proces".
    5. Aby wygładzić widmo, aktywuj widmo na liście widm po prawej stronie. Wybierz "Linia bazowa gładkiego widma masy" z menu rozwijanego "Proces".
  3. Na podstawie danych sekwencjonowania genomu szczepu referencyjnego obliczyć teoretyczną monoizotopową masę cząsteczkową każdego z kodowanych białek, tłumacząc sekwencję DNA na odpowiednią sekwencję aminokwasów za pomocą edytora dopasowania sekwencji. Skopiuj i wklej tę sekwencję białka do pola wejściowego w portalu zasobów bioinformatycznych ExPASy (http://web.expasy.org/compute_pi/). i naciśnij "Kliknij tutaj", aby obliczyć pI/Mw. W przypadku C. jejuni ssp. doylei oblicza się masę 14 wykrywalnych biomarkerów.
  4. Skopiuj wyniki do arkusza kalkulacyjnego, w którym jedna kolumna zawiera identyfikator genu, a druga masę cząsteczkową. Posortuj wiersze według obliczonej masy cząsteczkowej, aby ułatwić wyszukiwanie mas. Uwaga: Inne kolumny są opcjonalne; Adnotacja funkcjonalna może być szczególnie przydatna później do interpretacji.
  5. Wstawić drugą kolumnę do arkusza kalkulacyjnego dla masy cząsteczkowej postaci odmetionizowanej, odejmując 135 Da od monoizotopowej masy cząsteczkowej. Uwaga: Dzieje się tak, ponieważ niektóre białka ulegają modyfikacji potranslacyjnej przez proteolityczne usunięcie N-końcowej metioniny.
  6. Przypisz każdą główną zmierzoną masę biomarkera do obliczonych mas ze szczepu referencyjnego, wyszukując zmierzoną masę z tabeli genomu przygotowanej powyżej (Tabela 1).
  7. Jeśli jonów biomarkerowych nie można przypisać do przewidywanych produktów genów, należy rozważyć inne modyfikacje potranslacyjne (metylacja, acetylacja, prenylacja itp.; patrz http://www.abrf.org/delta-mass w celu zapoznania się z kompilacją modyfikacji i związanych z nimi zmian masy). Dla każdej innej znanej modyfikacji potranslacyjnej, która jest często obserwowana w organizmach będących przedmiotem zainteresowania, należy dodać kolejną kolumnę do tabeli i ponownie obliczyć masę cząsteczkową analogiczną do procesu dla postaci zdemetioninowanej.
  8. Skonfiguruj kolejną kartę arkusza kalkulacyjnego i zapisz masę i identyfikator dla każdego jonu biomarkera w osobnej kolumnie tabeli.

8. Ocena zmienności biomarkerów w populacji

  1. Skalibrować widma masowe uzyskane z izolatów zbiorczych, tak jak to zrobiono dla szczepu(-ów) odniesienia (ppkt 5.4.2).
  2. Zidentyfikuj warianty biomarkerów w widmach masowych. Masa wariantowa charakteryzuje się brakiem masy znanej z widma odniesienia i pojawieniem się nowej masy, której nie ma w odniesieniu do masy. Różnica mas musi być zgodna z pojedynczą wymianą aminokwasów (tabela 2) lub ich kombinacją.
  3. Przy jednym izolacie w rzędzie należy zapisać zmierzoną masę dla każdego biomarkera i przewidywanej izoformy w odpowiednich kolumnach tabeli.
    Uwaga: Rzadko pewne przesunięcia masy można przypisać kilku różnym wymianom aminokwasów, np. zarówno N wymieniane przez D, jak i Q wymieniane przez E i odwrotnie, powodują przesunięcie masy o 0,985 Da (Tabela 2). Tego nieodłącznego problemu nie da się rozwiązać za pomocą samej spektrometrii mas. W związku z tym różne izoformy na poziomie sekwencji białek o tej samej masie muszą być traktowane jako pojedynczy typ MSPP. Równoległe sekwencjonowanie Sangera poszczególnych genów jonów biomarkerowych potwierdziło, że problem ten nie wystąpił podczas typowania MSPP kolekcji izolatów C. jejuni ssp. doylei wykorzystanej w tym badaniu.
  4. Potwierdź nowe typy MSPP poprzez amplifikację PCR i sekwencjonowanie odpowiednich genów biomarkerów. To z kolei służy również jako potwierdzenie, że tożsamość biomarkera została przypisana prawidłowo.
    1. Hodowla izolatów bakteryjnych w optymalnych warunkach wzrostu. Hodowla szczepów C. jejuni ssp. doylei na agarze Columbia uzupełnionym 5% krwią owczą w temperaturze 37 °C w warunkach mikroaerofilnych (5%O2, 10% CO2, 85% N2). Inkubować przez ok. 48 godzin. Użyj oddzielnej płytki agarowej dla każdego izolatu, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
    2. Ekstrahować genomowe DNA izolatów bakteryjnych za pomocą odpowiedniego zestawu do ekstrakcji DNA / zautomatyzowanej maszyny zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Amplifikować odpowiednie geny biomarkerów za pomocą starterów wymienionych w tabeli 3. Wszystkie reakcje PCR należy przeprowadzić w następujących warunkach: denaturacja w temperaturze 94 °C przez 30 sekund; wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 30 sekund; wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 30 sek.
    4. Określ sekwencję DNA każdego amplikonu za pomocą sekwencjonowania Sangera przy użyciu odpowiedniej ilości genomowego DNA (zwykle 600-700 ng DNA wystarcza przy stężeniu ok. 100 ng/μl) i jednego ze starterów amplifikacyjnych (zwykle odbywa się to za pomocą usługodawcy).
  5. W oddzielnej tabeli (zob. Tabela 4) należy zapisać wydedukowaną sekwencję białka dla każdej nowej izoformy, korzystając z odpowiedniego narzędzia do translacji (np. Transseq: http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/) 25.

9. Oblicz filogenezę opartą na MSPP i porównaj z Standardem Złota

  1. Połącz poszczególne sekwencje aminokwasowe biomarkerów należące do typu MSPP izolatów w jedną ciągłą sekwencję za pomocą edytora wyrównania sekwencji, takiego jak BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html)26 lub arkusza kalkulacyjnego biomarkerów.
  2. Oblicz filogenezę przez grupowanie, tak jak to zrobiono dla danych typowania według złotego standardu, np. Grupowanie UPGMA 21.
  3. Porównaj filogenezę opartą na MSPP z tą uzyskaną przy użyciu złotego standardu 4,13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poprzednio udało nam się wprowadzić schemat MSPP dla C. jejuni ssp. jejuni13. W tym przypadku naszym celem było rozszerzenie metody na podgatunek rodzeństwa C. jejuni ssp. doylei. W tym specyficznym otoczeniu pozyskano siedem izolatów C. jejuni ssp. doylei z belgijskiej kolekcji mikroorganizmów/Laboratorium Mikrobiologii UGent BCCM/LMG Gandawa w Belgii. Wszystkie siedem izolatów użytych do naszych analiz było pochodzenia lud...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najważniejszym krokiem na drodze do ustanowienia schematu MSPP jest jednoznaczne genetyczne określenie tożsamości jonów biomarkerowych. Jeżeli bez wątpienia nie jest możliwe zidentyfikowanie biomarkera, należy go wykluczyć ze schematu13.

Schemat C. jejuni ssp. doylei obejmuje 14 różnych jonów biomarkerowych. Są one o 5 mniej w porównaniu ze schematem MSPP C. jejuni ssp. jejuni 13. Najistotniejszą różnicą pomiędzy wykrywalnymi biomarkera...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni Hannah Kleinschmidt za doskonałe wsparcie techniczne. Artykuł został sfinansowany przez program wsparcia otwartego dostępu Deutsche Forschungsgemeinschaft oraz fundusz wydawniczy Georg August Universität Göttingen.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
acetonitrylSigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy34967
System Autoflex III TOF/TOF 200Bruker Daltonics, Brema, NiemcyGT02554 G201Spektrometr
mas standard testu bakteryjnego BTSBruker Daltonics, Brema, Niemcy604537
BioTools 3.2 SR1Bruker Daltonics, Brema, Niemcy263564Pakiet oprogramowania
Standard testu bakteriologicznego Bruker IVDBruker Daltonics, Brema, Niemcy82901905 probówek
Campylobacter jejuni subsp. doylei izolat Belgia koordynowane zbieranie mikroorganizmów/Laboratorium Mikrobiologii UGent BCCM/LMG Gandawa, BelgiaLMG8843ATCC 49349; IMVS 1141; NCTC 11951; szczep 093
Campylobacter jejuni subsp. doylei izolat Belgia koordynowany zbiór mikroorganizmów/Laboratorium Mikrobiologii UGent BCCM/LMG Gandawa, BelgiaLMG9143Goossens Z90
Campylobacter jejuni subsp. doylei izolat Belgia koordynowane zbieranie mikroorganizmów/Laboratorium Mikrobiologii UGent BCCM/LMG Gandawa, BelgiaLMG7790ATCC 49350; CCUG 18265; Kasper 71; LMG 8219; NCTC 11847
Campylobacter jejuni subsp. doylei izolat Belgia koordynowane zbieranie mikroorganizmów/Laboratorium Mikrobiologii UGent BCCM/LMG Gandawa, BelgiaLMG9243Goossens N130
Campylobacter jejuni subsp. doylei izolat Belgia koordynowane zbieranie mikroorganizmów/Laboratorium Mikrobiologii UGent BCCM/LMG Gandawa, BelgiaLMG8871NCTC A603/87
Campylobacter jejuni subsp. doylei izolat Belgia koordynowany zbiór mikroorganizmów/Laboratorium Mikrobiologii UGent BCCM/LMG Gandawa, BelgiaLMG9255Goossens B538
Campylobacter jejuni subsp. doylei izolat Belgia koordynowane zbieranie mikroorganizmów/Laboratorium Mikrobiologii UGent BCCM/LMG Gandawa, BelgiaLMG8870NCTC A613/87
Columbia baza agarowa Merck, Darmstadt, Niemcy1.10455 .0500500 g
Kompas do FlexSeries 1.2 SR1Bruker Daltonics, Brema, Niemcy251419Pakiet oprogramowania
defibrynowana krew owcza Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, NiemcySR0051
etanolSigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy02854 Kwas
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, NiemcyF0507
Matryca HCCABruker Daltonics, Brema, Niemcy604531
Bibułki papieroweKimtech Science przez Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy
MALDI Biotyper 2.0Bruker Daltonics, Brema, Niemcy259935Pakiet oprogramowania
Mast Cryobank FiolkiMast Diagnostica, Reinfeld, NiemcyTarcza ze stali polerowanej CRYO/B
MSP 96Bruker Daltonics, Brema, Niemcy224989
Zestaw QIAamp DNA Mini Qiagen, Hilden, Niemcy51304
rekombinowana insulina ludzkaSigma-Aldrich, Taufkirchen, NiemcyI2643
kwas trifluorooctowySigma-Aldrich, Taufkirchen, NiemcyT6508
woda, klasa biologii molekularnejSigma-Aldrich, Taufkirchen, NiemcyW4502
mrówkowy Fluka Z188956

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  2. Bader, O. MALDI-TOF-MS-based species identification and typing approaches in medical mycology. Proteomics. 13 (5), 788-799 (2013).
  3. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
  4. Zautner, A. E., et al. Discrimination of multilocus sequence typing-based Campylobacter jejuni subgroups by MALDI-TOF mass spectrometry. BMC Microbiol. 13, 247(2013).
  5. Reil, M., et al. Recognition of Clostridium difficile PCR-ribotypes 001, 027 and 126/078 using an extended MALDI-TOF MS system. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 30 (11), 1431-1436 (2011).
  6. Kuhns, M., Zautner, A. E., et al. Rapid discrimination of Salmonella enterica serovar Typhi from other serovars by MALDI-TOF mass spectrometry. PLoS One. 7 (6), e40004(2012).
  7. Wolters, M., et al. MALDI-TOF MS fingerprinting allows for discrimination of major methicillin-resistant Staphylococcus aureus lineages. Int J Med Microbiol. 301 (1), 64-68 (2011).
  8. Josten, M., et al. Analysis of the matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrum of Staphylococcus aureus identifies mutations that allow differentiation of the main clonal lineages. J Clin Microbiol. 51 (6), 1809-1817 (2013).
  9. Lu, J. J., Tsai, F. J., Ho, C. M., Liu, Y. C., Chen, C. J. Peptide biomarker discovery for identification of methicillin-resistant and vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strains by MALDI-TOF. Anal Chem. 84 (13), 5685-5692 (2012).
  10. Novais, A., et al. MALDI-TOF mass spectrometry as a tool for the discrimination of high-risk Escherichia coli clones from phylogenetic groups B2 (ST131) and D (ST69, ST405, ST393). Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2014).
  11. Matsumura, Y., et al. Detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia coli ST131 and ST405 clonal groups by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 52 (4), 1034-1040 (2014).
  12. Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF Mass Spectrometry Strain Typing during a Large Outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), e101924(2014).
  13. Zautner, A. E., Masanta, W. O., Weig, M., Groß, U., Bader, O. Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP): A novel microbial typing Method. Scientific Reports. 5, (2015).
  14. The global view of campylobacteriosis. WHO. World Health Organisation (WHO), , Available from: http://www.who.int/foodsafety/publications/campylobacteriosis/en/ (2013).
  15. Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
  16. Zautner, A. E., et al. Seroprevalence of campylobacteriosis and relevant post-infectious sequelae. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (6), 1019-1027 (2014).
  17. Zautner, A. E., Herrmann, S., Groß, U. Campylobacter jejuni - The Search for virulence-associated factors. Archiv Fur Lebensmittelhygiene. 61 (3), 91-101 (2010).
  18. Dingle, K. E., et al. Multilocus sequence typing system for Campylobacter jejuni. J Clin Microbiol. 39 (1), 14-23 (2001).
  19. Dingle, K. E., et al. Molecular characterization of Campylobacter jejuni clones: a basis for epidemiologic investigation. Emerg Infect Dis. 8 (9), 949-955 (2002).
  20. Cody, A. J., et al. Real-time genomic epidemiological evaluation of human Campylobacter isolates by use of whole-genome multilocus sequence typing. J Clin Microbiol. 51 (8), 2526-2534 (2013).
  21. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol Biol Evol. 30 (12), 2725-2729 (2013).
  22. Jolley, K. A., Chan, M. S., Maiden, M. C. mlstdbNet - distributed multi-locus sequence typing (MLST) databases. BMC Bioinformatics. 5, 86(2004).
  23. Verroken, A., et al. Evaluation of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry for Identification of Nocardia Species. J Clinl Microbiol. 48 (11), 4015-4021 (2010).
  24. El Khéchine, A., Couderc, C., Flaudrops, C., Raoult, D., Drancourt, M. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry Identification of Mycobacteria in Routine Clinical Practice. PLoS ONE. 6 (9), e24720(2011).
  25. Goujon, M., et al. A new bioinformatics analysis tools framework at EMBL-EBI. Nucleic Acids Research. 38, Web Server issue 695-699 (2010).
  26. Hall, T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series. 41, 95-98 (1999).
  27. Jolley, K. A., et al. Ribosomal multilocus sequence typing: universal characterization of bacteria from domain to strain. Microbiology. 158, 1005-1015 (2012).
  28. Suarez, S., et al. Ribosomal proteins as biomarkers for bacterial identification by mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. J Microbiol Methods. 94 (3), 390-396 (2013).
  29. Teramoto, K., et al. Phylogenetic classification of Pseudomonas putida strains by MALDI-MS using ribosomal subunit proteins as biomarkers. Anal Chem. 79 (22), 8712-8719 (2007).
  30. Teramoto, K., Kitagawa, W., Sato, H., Torimura, M., Tamura, T., Tao, H. Phylogenetic analysis of Rhodococcus erythropolis based on the variation of ribosomal proteins as observed by matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry without using genome information. J Biosci Bioeng. 108 (4), 348-353 (2009).
  31. Bernhard, M., Weig, M., Zautner, A. E., Gross, U., Bader, O. Yeast on-target lysis (YOTL), a procedure for making auxiliary mass spectrum data sets for clinical routine identification of yeasts. J Clin Microbiol. 52 (12), 4163-4167 (2014).
  32. Stark, T., et al. Mass spectrometric profiling of Bacillus cereus strains and quantitation of the emetic toxin cereulide by means of stable isotope dilution analysis and HEp-2 bioassay. Anal Bioanal Chem. 405 (1), 191-201 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

MALDI TOF MStypowanie na poziomie szczepuanaliza jon w biomarker wrelacje filoproteomicznebia ka rybosomalneprzygotowanie roztworu matrycyprotok wirowaniapozyskiwanie widm masowych

Powiązane artykuły