Artykuł metodologiczny

Bezkomórkowy test wykorzystujący ekstrakty z zarodków Xenopus laevis do badania mechanizmów regulacji wielkości jądra

7.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54173

⸱

8 sierpnia 2016

 , 
1Department of Molecular Biology, University of Wyoming

W tym artykule

Podsumowanie

Mechanizmy skalowania komórkowego i wewnątrzkomórkowego pozostają nieuchwytne. Stosowanie ekstraktów z zarodków Xenopus staje się coraz bardziej powszechne w celu wyjaśnienia mechanizmów regulacji wielkości organelli. Metoda ta opisuje przygotowanie ekstraktu z zarodka i nowatorski test skalowania jądrowego, za pomocą którego można zidentyfikować mechanizmy regulacji wielkości jądra.

Streszczenie

Fundamentalnym pytaniem w biologii komórki jest to, jak regulowane są rozmiary komórek i organelli. Od dawna wiadomo, że rozmiar jądra na ogół skaluje się wraz z rozmiarem komórki, zwłaszcza podczas embriogenezy, kiedy dochodzi do dramatycznego zmniejszenia rozmiarów zarówno komórki, jak i jąder. Mechanizmy regulacji wielkości jądra są w dużej mierze nieznane i mogą być istotne w przypadku raka, w którym zmieniony rozmiar jądra jest kluczowym parametrem diagnostycznym i prognostycznym. Podejścia in vivo do identyfikacji regulatorów wielkości jądra są skomplikowane ze względu na zasadniczą i złożoną naturę funkcji jądrowych. Opisane tutaj podejście in vitro do badania kontroli wielkości jądra wykorzystuje normalne zmniejszenie rozmiaru jądra, które występuje podczas rozwoju Xenopus laevis. Najpierw jądra są składane w ekstrakcie z jaj X. laevis. Następnie jądra te są izolowane i ponownie zawieszane w cytoplazmie z zarodków w późnym stadium rozwoju. Po 30-90 minutowym okresie inkubacji powierzchnia jądrowa zmniejsza się o 20-60%, zapewniając użyteczny test do identyfikacji składników cytoplazmatycznych obecnych w zarodkach w późnym stadium, które przyczyniają się do rozwojowego skalowania wielkości jądra. Główną zaletą tego podejścia jest względna łatwość, z jaką ekstrakty z jaj i zarodków mogą być biochemicznie manipulowane, co pozwala na identyfikację nowych białek i działań regulujących rozmiar jądra. Podobnie jak w przypadku każdego podejścia in vitro, walidacja wyników w systemie in vivo jest ważna, a mikroiniekcja zarodków X. laevis jest szczególnie odpowiednia w tych badaniach.

Wprowadzenie

Rozmiary organelli komórkowych zazwyczaj skalują się wraz z rozmiarem komórki, co zostało chyba najlepiej udokumentowane dla skalowania wielkości jądra przy rozmiarze komórki1-10. Jest to szczególnie prawdziwe podczas embriogenezy i różnicowania komórek, kiedy często obserwuje się dramatyczne zmniejszenie zarówno rozmiaru komórki, jak i jądra11,12. Co więcej, zmieniony rozmiar jądra jest kluczowym parametrem w diagnostyce i rokowaniu raka13-17. Mechanizmy, które przyczyniają się do regulacji wielkości jądra, są w dużej mierze nieznane, częściowo ze względu na złożoność i zasadniczy charakter struktury i funkcji jądra. Opisana tutaj metoda została opracowana jako test in vitro do skalowania wielkości jądra, który jest podatny na manipulacje biochemiczne i wyjaśnienie mechanizmów regulacji wielkości jądra.

Ekstrakt z jaj Xenopus laevis to sprawdzony system do podsumowania i badania złożonych procesów komórkowych w kontekście in vitro. Ekstrakty te ujawniły nowe podstawowe informacje na temat kilku procesów komórkowych, w tym budowy i funkcji wrzeciona mitotycznego, retikulum endoplazmatycznego i jądra18-22. Jedną z kluczowych zalet systemu ekstrakcji jest to, że ekstrakty z jaj X. laevis reprezentują prawie nierozcieńczoną cytoplazmę, której skład można łatwo zmienić, na przykład poprzez dodanie rekombinowanych białek lub wyczerpanie odporności. Co więcej, można manipulować istotnymi procesami, stosując leczenie, które w przeciwnym razie mogłoby być śmiertelne w kontekście in vivo. Modyfikacje procedury ekstrakcji z jaj pozwalają na izolację ekstraktów z zarodków X. laevis, a nie z jaj, a te ekstrakty z zarodków są równie podatne na manipulację biochemiczną23. Podczas rozwoju X. laevis zapłodniony zarodek jednokomórkowy (o średnicy ~1 mm) przechodzi serię dwunastu szybkich podziałów komórkowych (etapy 1 - 8), aby wytworzyć kilka tysięcy komórek o średnicy 50 μm i mniejszych, osiągając stadium rozwojowe zwane przejściem śródblastulowym (MBT) lub stadium 824-26. MBT charakteryzuje się początkiem transkrypcji zygotycznej, migracją komórek, asynchronicznymi podziałami komórek, nabywaniem faz przerwy i ustalaniem rozmiarów jądra w stanie ustalonym, a nie ciągłą ekspansją jądrową, jak w zarodku przed MBT. Od stadium 4 do gastrulacji (etapy 10,5 - 12) objętość pojedynczych jąder zmniejsza się ponad 10-krotnie11.

Tutaj celem jest zidentyfikowanie mechanizmów odpowiedzialnych za te zmniejszenia rozmiaru jądra podczas postępu rozwojowego. Podejście polega na tym, aby najpierw złożyć jądra w ekstrakcie z jaj X. laevis i wyizolować te jądra z cytoplazmy/ekstraktu z jaja. Jądra te są następnie ponownie zawieszane w cytoplazmie z zarodków w późnym stadium gastruli. Po okresie inkubacji jądra ekstraktu z jaja stają się mniejsze w późnym stadium ekstraktu z zarodka. Doszliśmy do wniosku, że byłby to przydatny test do identyfikacji składników cytoplazmatycznych obecnych w zarodkach w późnym stadium, które przyczyniają się do skalowania wielkości jądra rozwojowego. Korzystając z tego testu, w połączeniu z walidacją in vivo, wykazaliśmy, że kinaza białkowa C (PKC) przyczynia się do rozwojowego zmniejszenia wielkości jądra u X. laevis23.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury i badania przeprowadzone zostały zgodnie z 8. wydaniem Przewodnika NRC dotyczącego opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Protokoły zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Wyoming (Assurance # A-3216-01).

1. Przygotowanie ekstraktu z jaj X. laevis (na podstawie27,28)

  1. Samica żaby X. laevis jest karmiona co najmniej trzy dni, a maksymalnie dwa tygodnie przed pobraniem jaj za pomocą pojedynczego wstrzyknięcia 100 j.m. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG).
  2. Na dzień przed eksperymentem wstrzyknąć zaszczepionym żabom 800 IU ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (HCG) i umieścić w temperaturze 16 °C w 1 l na żabę z 1/3x zmodyfikowanymi obrączkami Marca (MMR). Patrz Tabela 1, aby zapoznać się ze wszystkimi składami.
    Uwaga: Niektóre żaby nie składają jaj lub składają jaja złej jakości. Zazwyczaj wstrzykuje się 2-3 żaby, aby upewnić się, że co najmniej jedna żaba złoży wystarczającą liczbę jaj dobrej jakości. Przeciętna żaba składa jaja na tyle dużo, aby wyprodukować co najmniej 1 ml ekstraktu z jaj.
  3. Przygotować 1 l 1/3x MMR z zimną destylowaną wodą dejonizowaną (ddH2O), 500 ml buforu B, 1 l buforu C, 500 ml buforu D i 100 ml buforu E.
  4. Przenieść złożone jaja do szklanego naczynia krystalizującego (150 x 75 mm). Używając plastikowej pipety Pasteura z odciętą końcówką, wyhoduj białe, puszyste, aktywowane jaja lub jaja poddane lizie. Jaja należy przechowywać tylko z wyraźnymi i równymi ciemnymi biegunami zwierzęcymi i białymi biegunami roślinnymi.
  5. Przygotować probówki wirówkowe o wymiarach 13 x 51 mm z 1 ml buforu E uzupełnionego 355 μM cytochalazyną D dodaną tuż przed użyciem w kroku 1.7.
  6. Odjedź i umyj jajka.
    1. Umyj jajka krótko zimnym 1/3x MMR w zlewce o odpowiedniej wielkości, zmieniając bufor 3 - 4 razy.
    2. Usunąć galaretki z jaj przez inkubację z buforem B. Zajmie to od 3 do 10 minut. Gdy mętne galaretki zostaną uwolnione z jaj, zmień bufor.
      Uwaga: Dejellying jest zakończone, gdy jaja wydają się ciasno upakowane w rogu naczynia, gdy są przechylone, a słupy roślinne są skierowane w dół. Jaja są znacznie bardziej kruche po dejellyingu, dlatego nie należy inkubować jaj z buforem B dłużej niż to konieczne, a kolejne mycia należy wykonywać bardzo ostrożnie.
    3. Umyj jajka krótko z 3 - 4 podmianami buforu C.
    4. Umyj jajka krótko z 2 podmianami buforu D.
    5. Umyj jajka krótko z 2 podmianami buforu E.
  7. Napełnij probówki wirówkowe jajkami za pomocą szklanej pipety o szerokim otworze lub plastikowego zakraplacza. Odessać nadmiar buforu. Aby zapakować jaja i usunąć jak najwięcej buforu, odwirować w obracającym się wirniku kubełkowym o prędkości 212 x g przez 60 sekund, a następnie przy 478 x g przez 30 sekund. Odessać nadmiar buforu.
    Uwaga: Na tym etapie ważne jest, aby usunąć jak najwięcej nadmiaru bufora, aby upewnić się, że ekstrakt z jaj jest minimalnie rozcieńczony.
  8. W wahadłowym wirniku kubełkowym ultrawirować pod próżnią przez 15 minut przy 12 000 x g i 4 °C, aby rozdrobnić jaja i rozdzielić je na różne warstwy, przy czym cytoplazma jest bursztynową warstwą pośrodku. Wyjmij probówki wirówkowe i natychmiast umieść je na lodzie.
  9. Zbierz ekstrakt.
    1. Za pomocą igły i strzykawki o rozmiarze 18 przebij probówkę wirówkową tuż nad ciemną warstwą pigmentową na dnie probówki i usuń środkową bursztynową warstwę cytoplazmatyczną. Nie zbieraj żadnej wierzchniej warstwy lipidowej. Zbierz cytoplazmę do probówki o odpowiednim rozmiarze.
      Uwaga: Ogólnie rzecz biorąc, 1 żaba wytwarza co najmniej 1 ml ekstraktu.
    2. Uzupełnij cytoplazmę o 1/1,000 objętości 19,7 mM cytochalazyny D, 1/1,000 objętości zapasu LPC i 1/50 objętości 50-krotnego miksu energetycznego. Delikatnie odwróć rurkę, aby wymieszać. Nie należy nadmiernie pipetować ekstraktu.
    3. Trzymaj ekstrakt na lodzie i zużyj go w ciągu 3 godzin od przygotowania, aby uzyskać najlepsze rezultaty.

2. Przygotowanie zdemembranowanego nasienia X. laevis (adaptacjaz 29)

Uwaga: Przedstawione tutaj objętości procedur dotyczą do 8 jąder.

  1. Usunąć 0,05% benzokainy (10% bulionu benzokainowego przygotowanego w etanolu i rozcieńczonego do 0,05% w wodzie ze zbiornika żab) z 4 °C i ogrzać do temperatury pokojowej. Znieczulenie i użyczenie samców żab X. laevis w roztworze benzokainy w temperaturze pokojowej przez 20 - 30 min. Upewnij się, że śmierć nastąpi z powodu braku bicia serca poprzez badanie i wyczucie obszaru klatki piersiowej, przez brak reakcji na stymulację mechaniczną i/lub przez ścięcie głowy.
  2. Wykonaj nacięcie w kształcie litery U wzdłuż brzucha. Usuń rurkową masę żółtych ciałek tłuszczowych. W górnej części nerek zlokalizuj jądra, które są owalnymi bladoróżowymi masami o długości około 1 cm29. Wytnij jądra i zwiń je na bibułę, aby usunąć krew i inne tkanki.
  3. Umyj jądra w buforze T. Za pomocą ciasno dopasowanego tłuczka zmiel jądra z 1 ml buforu T w probówce o pojemności 1,5 ml do uzyskania jednorodności (10 uderzeń lub więcej). Odwirować 5 - 10 sekund w mini wirówce i zebrać supernatant, usuwając duże kawałki tkanki. Powtórzyć wirowanie jeszcze raz i zebrać supernatant.
  4. Przenieś roztwór zawierający plemniki do plastikowej probówki o pojemności 15 ml. Zwiększyć objętość do całkowitej objętości 2 ml za pomocą buforu T. Odwirować przy 1,411 x g przez 10 minut w temperaturze 16 °C w celu osadzenia nasienia.
  5. Usunąć sklarowany osad i ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu T. Odwirować przy 1,411 x g przez 10 minut w temperaturze 16 °C. Powtórzyć ten krok raz lub dwa razy, w zależności od potrzeb, aby oczyścić osad z krwinek somatycznych i czerwonych.
  6. Zawiesić osad w 100 μl buforu T i 300 μl buforu S. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
    Uwaga: Bufor S zawiera lizolecytynę, która jest odpowiedzialna za demembranację.
  7. Dodać trzy objętości buforu R (przygotowanego na świeżo przed użyciem). Odwróć rurkę dokładnie raz. Wirować przy 1,411 x g przez 15 minut w temperaturze 16 °C.
  8. Zawiesić osad w 400 μl buforu R, a następnie dodać dodatkowe 2 ml buforu R. Wirować przy 1,411 x g przez 15 minut w temperaturze 16 °C.
  9. Zawiesić osad w buforze 50 μl T.
  10. Rozcieńczyć 1 μl zdebłonowanych jąder plemników za pomocą 9 μl buforu T. Zastosować to rozcieńczenie do hemocytometru. Policz liczbę cienkich jąder plemników w kształcie litery S w jednej dużej siatce 4 x 4 i pomnóż tę liczbę przez 100, aby uzyskać stężenie zapasu w jądrach plemników na μl.
  11. Rozcieńczyć zapas do 100 000 jąder plemników na μl za pomocą buforu T, co daje 200-krotny zapas. Przygotować 3 - 5 μl porcji. Błyskawiczne zamrożenie w ciekłym azocie i przechowywanie w temperaturze -80 °C.

3. Montaż jądrowy

  1. Uzupełnij 100 μl ekstraktu z jaja 1,5 μl 35,5 mM cykloheksymidu (stężenie końcowe ~ 0,5 mM), 6 μl 20x roztworu podstawowego wapnia (stężenie końcowe ~ 0,6 mM) i 0,7 μl 200x plemniki (końcowe stężenie ~ 700 jąder plemników/μl). W razie potrzeby zwiększ lub zmniejsz objętość reakcji. Odwróć lub delikatnie dotknij, aby wymieszać.
    Uwaga: Ekstrakt cyklicznie z metafazy do interfazy zapewnia bardziej solidną i niezawodną platformę do montażu jądrowego.
  2. Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 16 - 20 °C przez 90 minut. Mieszać, delikatnie stukając co 15 minut, aby jądra pozostały zawieszone w ekstrakcie.
  3. Monitoruj postęp montażu jądrowego po 45 minutach, przygotowując dynię w następujący sposób.
    1. Odmierzyć pipetą 2 μl ekstraktu na szkiełko podstawowe i dodać 2 μl roztworu jądrowego.
    2. Nakładka z szkiełkiem nakrywkowym 22mm2. Obraz na mikroskopie epifluorescencyjnym przy użyciu obiektywów 20 - 100X z wodą, olejem lub powietrzem i filtrem DAPI.
      Uwaga: Jądra mogą być wizualizowane za pomocą obrazowania w jasnym polu, ale są znacznie łatwiejsze do uwidocznienia za pomocą fluorescencji.
    3. Natychmiast zużyć jądra lub błyskawicznie zamrozić podwielokrotności w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      Uwaga: Dodanie 4% glicerolu do jąder przed zamrożeniem może pomóc w utrzymaniu ich integralności. Zamrożone jądra są na ogół nadal żywotne i zdolne do importu jądrowego, jednak proces zamrażania może prowadzić do zakłóceń lub bardziej kruchych strukturalnie jąder. Można stosować jądra do roku po zamrożeniu.

4. Przygotowanie ekstraktu z zarodka X. laevis

  1. Nakłonić samice żab X. laevis do składania jaj w sposób opisany w ppkt 1.1 i 1.2.
  2. Wyizolować jądra od samców żab X. laevis, jak opisano w ppkt 2.2. Zanurzyć jądra w pożywce L15 uzupełnionej 50 j.m./ml penicyliny i streptomycyny w szklanej szalce Petriego o wymiarach 35 x 10 mm. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni.
  3. Zbieraj i zapładniaj jaja.
    1. Zbieraj świeżo złożone jaja, trzymając żaby nad szklaną szalką Petriego wielokrotnego użytku i promuj składanie jaj, wywierając delikatny nacisk na dolną część pleców w pobliżu kloaki. Zbyt mocne ściskanie żaby może spowodować obrażenia, prowadzące do wzdęcia brzucha i wymagające eutanazji29.
    2. Podeprzyj naczynie pod kątem około 45°, pozwól, aby jajka zebrały się na krawędzi naczynia, usuń cały nadmiar bufora i dodaj tyle 1/3x MMR, aby ledwo przykryć jajka. Jaja należy zapłodnić w ciągu 15 minut od pobrania.
    3. Za pomocą ciasno dopasowanego tłuczka zmaceruj i homogenizuj 1/4 jądra w probówce o pojemności 1,5 ml z 500 μl modyfikowanej soli fizjologicznej Bartha o wysokiej zawartości soli (MBS o wysokiej soli). Dodaj zmacerowane jądra do jaj i pozwól zapłodnieniu nastąpić w temperaturze pokojowej przez 15 - 20 minut, a następnie zalej jaja 1/3x MMR.
      Uwaga: Skuteczność jąder zmniejsza się wraz z czasem przechowywania, dlatego do pomyślnego zapłodnienia może być potrzebnych więcej tkanki jąder w przypadku korzystania z jąder, które były przechowywane dłużej niż tydzień.
    4. Potwierdź zapłodnienie, sprawdzając, czy nie ma skurczu ciemno zabarwionego bieguna zwierzęcego i obracając zarodki z ich zwierzęcymi biegunami skierowanymi do góry, zwykle około 20 - 30 minut po dodaniu zmiażdżonych jąder. Spodziewaj się, że pierwsze rozszczepienie komórek nastąpi w ciągu 90 minut.
    5. Za pomocą szklanej pipety o szerokim otworze należy pilnie usunąć martwe (białe i opuchnięte lub nierównomierne rozmieszczenie żółtka i pigmentu), zlizowane lub niezapłodnione jaja (tj. nie rozszczepione), ponieważ szybko wywołają one śmierć sąsiednich zarodków.
    6. W dowolnym miejscu od 1 do 2,5 godziny po zapłodnieniu, zarodki dejelly w 2 - 3% cysteiny rozpuszczone w 1/3 x MMR i dostosowane do pH 7,9 z 10 N KOH. Wykonaj dwie zmiany bufora, z których każda trwa 3-4 minuty. Dokładnie umyj zarodki 6 - 10 krótkimi zmianami 1/3x MMR, aby usunąć wszelkie ślady cysteiny.
      Uwaga: Zarodki odjeżlarzane mają błonę witelinową i nie są tak kruche jak jaja w kolorze dejelli.
  4. Za pomocą szklanej pipety o szerokim otworze przenieś zdrowe, zapłodnione (tj. rozszczepione) zarodki na szalkę Petriego zawierającą świeżą 1/3x MMR i pozwól im rozwinąć się do pożądanego stadium w temperaturze pokojowej lub, jeśli preferowany jest wolniejszy rozwój, w temperaturze 16 °C. Kontynuuj usuwanie martwych lub zlizowanych zarodków, na które wskazuje brak pierwszego podziału lub biały, opuchnięty wygląd.
  5. Sprawdzić stopień zaawansowania zarodków, sprawdzając, czy blastopor jest prawie całkowicie zamknięty i porównując je z rysunkami zarodków w stadium dostępnym w materiałach referencyjnych24.
    Uwaga: Zarodki hodowane w temperaturze 16 °C osiągają stadium 11,5 - 12 w ciągu około 12 godzin.
  6. Inkubować zarodki w stadium 11,5 - 12 w świeżym 1/3x MMR uzupełnionym cykloheksymidem 0,5 mM przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby zatrzymać zarodki w późnej interfazie.
  7. Za pomocą szklanej lub plastikowej pipety o szerokim otworze przenieść co najmniej 15 (najlepiej 30 lub więcej) zarodków zatrzymanych w interfazie do probówki mikrowirówkowej.
    Uwaga: 15 zarodków wystarcza do wyprodukowania około 20 μl ekstraktu. Skaluj w górę zgodnie z potrzebami.
  8. Dodać 1 ml buforu do lizy jaj (ELB) uzupełnionego 1 μl bulionu LPC. Delikatnie odwróć, aby umyć zarodki, pozwól zarodkom opaść na dno probówki i usuń bufor. Powtórz ten krok prania jeszcze dwa razy.
  9. Ponownie zawiesić zarodki w 500 μl ELB plus 0,5 μl zapasu LPC, 5 μl 19,7 mM cykloheksymidu i 5 μl 35,5 mM cytochalazyny D (w celu zahamowania polimeryzacji aktyny). Wirować przy 200 x g przez 1 minutę w mikrowirówce stołowej.
  10. Usuń nadmiar buforu i za pomocą tłuczka dokładnie zmiażdż zarodki. Wirować w obracającym się wirniku kubełkowym przez 10 minut przy 10 000 x g i temperaturze 16 °C.
  11. Nakłuć warstwę lipidową od góry końcówką pipety o pojemności 200 μl. Za pomocą czystej końcówki pipety o pojemności 200 μl usunąć środkową cytoplazmatyczną warstwę koloru bursztynowego do probówki o odpowiedniej wielkości.
  12. Uzupełnij ekstrakt z zarodków o 1/50 objętości 50-krotności mieszanki energetycznej (w celu zapewnienia systemu regeneracji ATP), 1/100 objętości 35,5 mM cykloheksamidu, 1/500 objętości 19,7 mM cytochalazyny D i 1/1,000 objętości zapasu LPC.
  13. Przygotować dynię zgodnie z opisem w ppkt 3.3, aby uwidocznić endogenne jądra zarodkowe w ekstrakcie.
    Uwaga: W tym momencie ekstrakt z zarodków można zamrozić wraz z jądrami endogennymi. Podwielokrotność w celu skrócenia cykli zamrażania/rozmrażania i przechowywania w temperaturze -80 °C.
  14. Aby usunąć jądra z ekstraktu z zarodka, należy rozcieńczyć ekstrakt równą objętością ELB zawierającą 1/50 objętości 50x miksu energetycznego, 1/100 objętość 35,5 mM cykloheksamidu, 1/500 objętość 19,7 mM cytochalazyny D i 1/1 000 objętości zapasu LPC. Wirować w obrotowym wirniku kubełkowym o sile 17 000 x g przez 15 minut w temperaturze 16 °C.
  15. Zebrać sklarowany osad, uważając, aby nie pozostały lipidy na górze. Nie należy naruszać granulowanych jąder na dnie probówki. Przygotować dynię zgodnie z opisem w ppkt 3.3, aby upewnić się, że większość jąder została usunięta. Użyć świeżego ekstraktu lub porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  16. Aby podgrzać inaktywowany ekstrakt z zarodków do eksperymentów kontrolnych, należy podgrzać 30-100 μl porcji ekstraktu w temperaturze 56 °C przez 30 minut za pomocą termocyklera. Przed użyciem pozwól, aby inaktywowany termicznie ekstrakt powrócił do temperatury pokojowej.

5. Test kurczenia się jądra i immunofluorescencja

  1. Wyizolować jądra złożone w ekstrakcie jajowym, rozcieńczając 25 - 150 μl wstępnie złożonych jąder w 1 ml ELB w probówce o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 1 600 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C w mikrowirówce stołowej. Usunąć bufor, uważając, aby nie naruszyć delikatnej osady jąder na dnie probówki.
  2. Zawiesić jądra w objętości ekstraktu z zarodka równej pierwotnej objętości ekstraktu z jaja użytej w ppkt 5.1. Do reakcji kontrolnych należy użyć ELB lub ekstraktu inaktywowanego termicznie, w zależności od potrzeb.
  3. Delikatnie postukaj w probówkę, aby rozbić osad i ponownie zawiesić jądra. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 90 minut, delikatnie stukając w probówkę, aby mieszać co 15 - 30 minut. Uwaga: Większość kurczenia się jądra następuje w ciągu pierwszych 30 minut.
  4. Monitoruj postęp kurczenia się jądra atomowego, przygotowując dynię.
    1. Odmierzyć pipetą 2 μl ekstraktu na szkiełko podstawowe i dodać 2 μl roztworu jądrowego.
    2. Nakładka z szkiełkiem nakrywkowym 22mm2. Obraz pod mikroskopem epifluorescencyjnym.
  5. Postukaj w probówkę, aby ponownie zawiesić jądra tuż przed dodaniem 500 μl utrwalacza składającego się z ELB, 15% glicerolu i 2,6% paraformaldehydu. Natychmiast odwróć rurkę i umieść rurkę na rotatorze na 15 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Przygotuj probówki do wirowania, wyposażając szklane probówki o okrągłym dnie o pojemności 15 ml w plastikowe wkładki z okrągłym dnem (projekt i schematy dostępne na życzenie). Dodać 5 ml buforu z poduszką jądrową. Wrzuć okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm do tuby, upewniając się, że leży płasko na plastikowej wkładce.
  7. Delikatnie ułóż roztwór zawierający utrwalone jądra na wierzchu poduszki jądrowej za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze. Wirować w obracającym się wirniku kubełkowym przez 15 minut przy 1 000 x g i temperaturze 16 °C.
  8. Użyj aspiratora, aby usunąć cały bufor i pociągnij plastikową wkładkę do górnej części tuby. Usunąć szkiełko nakrywkowe za pomocą cienkich kleszków, zwracając uwagę na stronę szkiełka nakrywkowego, na którą zostały odwrócone jądra. Post-fix w zimnym metanolu (przechowywanym w temperaturze -20°C) przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  9. Przenieś szkiełko nakrywkowe stroną z jądrem do góry na arkusz plastikowej folii parafinowej wyściełającej dużą plastikową szalkę Petriego. Umieść mokre jednorazowe chusteczki wzdłuż boku naczynia, aby zapobiec odwodnieniu.
  10. Uwodnić jądra na szkiełku nakrywkowym za pomocą 500 μl PBS-NP40 (1x PBS plus 0,1% NP40) i odessać po 5 - 10 sekundach.
  11. Ostrożnie nałożyć 75 μl PBS-3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) na szkiełko nakrywkowe. Pozostawić na 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub na noc w temperaturze 4 °C.
  12. Usunąć roztwór blokujący i inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem (np. mAb414 przeciwko jądrowemu kompleksowi porowemu, 1:1,000) rozcieńczonym w PBS-3% BSA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Przemyć pięcioma natychmiastowymi zmianami PBS-NP40.
  13. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w PBS-3% BSA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć pięcioma natychmiastowymi zmianami PBS-NP40.
  14. Inkubować z 10 μg/ml Hoechst rozcieńczonym w PBS-3% BSA przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć pięć razy PBS-NP40. Usuń cały nadmiar bufora.
  15. Zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełku za pomocą 5 μl środka mocującego zapobiegającego blaknięciu. Uszczelnij przezroczystym lakierem do paznokci. Obraz natychmiast za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego z obiektywami 20 - 100x lub przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszego obrazowania.
    Uwaga: Przeprowadzić kwantyfikację zgodnie z wcześniejszym opisem23.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Montaż jąder w ekstrakcie z komórek jajowych

Pierwsze kroki niniejszego protokołu polegają na przygotowaniu ekstraktu z jaj X. laevis (Protokół 1) oraz jąder plemników pozbawionych błon (Protokół 2). Odczynniki te są następnie wykorzystywane do montażu jąder de novo (Protokół 3). Rycina 1 przedstawia reprezentatywne dane. Dodanie wapnia wprowadza zablokowany w mejozie ekstrakt ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiono nowatorską metodę badania mechanizmów regulacji wielkości jądra podczas rozwoju X. laevis . Postęp rozwojowy wiąże się z dramatycznymi zmianami w fizjologii komórki, metabolizmie, tempie podziału i migracji, a także zmianami w rozmiarach komórek i struktur wewnątrzkomórkowych. Te zróżnicowane procesy są złożone i niezbędne, dlatego trudno jest zbadać tylko jeden z tych aspektów rozwoju w warunkach in vivo . Opisany tutaj ekstrakt z zarodków X. laevis i test kurczenia się jądra poz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Członkowie laboratoriów Levy'ego i Gatlina, a także koledzy z Wydziału Biologii Molekularnej, służyli pomocnymi radami i dyskutowali. Rebecca Heald zapewniła wsparcie na wczesnych etapach opracowywania tego protokołu. Prace te były wspierane przez NIH/NIGMS (R15GM106318) i American Cancer Society (RSG-15-035-01-DDC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sondy molekularneIgG przeciw mysim osłomA10037
Sól disodowa ATPSigma AldrichA2383
BenzokainaSigma AldrichE1501
Albumina surowicy bydlęcejSigma AldrichA3059
CaCl2Sigma AldrichC3306
WirówkaBeckmanJ2-21M
Wirnik wirówkiBeckmanJS 13.1
chymosatynaSigma AldrichC7268
fosforan kreatyny disodowyCalbiochem2380
cykloheksymidSigma AldrichC6255
cytochalazyna DSigma AldrichC8273
jednorazowe chusteczki (chusteczki kimwipe)Sigma AldrichZ188956
L-cysteinaSigma AldrichW326306
EGTASigma AldrichE4378
FormaldehydSigma AldrichF8775
Szklane naczynie krystalizujące (150 x 75 mm)VWR89090-662
GlicerolMacron5094-16
HEPESSigma AldrichH4034
Hoechst - trichlorowodorek bisBenzimide H 33342Sigma AldrichB2261
HCG - Ludzka gonadotropina kosmówkowa Prospechor-250-c
L15 MediaSigma AldrichL4386
leupeptynaSigma AldrichL2884
LizolecytynaSigma AldrichL1381
mAb414Abcamab24609
MgCl2EMDMX0045-2
MgSO4 Sigma AldrichM9397
MaltozaSigma AldrichM5885
NP40BDH56009
Paraformaldehydowamikroskopia elektronowa Sciences15710
Penicylina + StreptomycynaSigma AldrichPp0781
pepstatynaSigma AldrichP5318
RURYSigma AldrichP6757
Plastikowa folia parafinowa (parafilm)Sigma AldrichP7793
KClSigma AldrichP9541
KH2PO4Mallinckrodt70100
KOHBaker5 3140
PMSG - Surowica klaczy ciężarnej GonadotropinaProspechor-272-a
NaClSigma AldrichS3014
NaHCO3FisherBP328
Na2HPO4EMDSX0720-1
NaOHEMDSX0590
TłuczekThomas Scientific3411D56
Rurki szklane z okrągłym dnem, 15 mlCorex8441
Przeciwciało wtórne (Alexa Fluor 568 osioł anty-mysie IgG)ThermoFisherA10037
sacharozaCalbiochem8550
termocyklerBio-RadT100
UltrawirówkaBeckmanL8-80M
Wirnik ultrawirówkiBeckmanSW 50.1
Vectashield (medium montażowe zapobiegające blaknięciu)VectorH-1000
Alexa Fluor 568

Bibliografia

  1. Conklin, E. Cell size and nuclear size. J. Exp. Embryol. 12, 1-98 (1912).
  2. Wilson, E. B. The Cell in Development and Heredity. , The Macmillan Company. 727-733 (1925).
  3. Levy, D. L., Heald, R. Nuclear size is regulated by importin alpha and Ntf2 in Xenopus. Cell. 143 (2), 288-298 (2010).
  4. Chan, Y. H., Marshall, W. F. Scaling properties of cell and organelle size. Organogenesis. 6 (2), 88-96 (2010).
  5. Walters, A. D., Bommakanti, A., Cohen-Fix, O. Shaping the nucleus: Factors and forces. J Cell Biochem. 113 (9), 2813-2821 (2012).
  6. Webster, M., Witkin, K. L., Cohen-Fix, O. Sizing up the nucleus: nuclear shape, size and nuclear-envelope assembly. J Cell Sci. 122 (Pt 10), 1477-1486 (2009).
  7. Edens, L. J., White, K. H., Jevtic, P., Li, X., Levy, D. L. Nuclear size regulation: from single cells to development and disease. Trends Cell Biol. 23 (4), 151-159 (2013).
  8. Jevtic, P., Edens, L. J., Vukovic, L. D., Levy, D. L. Sizing and shaping the nucleus: mechanisms and significance. Curr Opin Cell Biol. 28, 16-27 (2014).
  9. Levy, D. L., Heald, R. Mechanisms of intracellular scaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 113-135 (2012).
  10. Vukovic, L. D., Jevtic, P., Edens, L. J., Levy, D. L. New insights into the mechanisms and functions of nuclear size regulation. Int Rev Cell Mol Biol. 322, 1-59 (2016).
  11. Jevtic, P., Levy, D. L. Nuclear size scaling during Xenopus early development contributes to midblastula transition timing. Curr Biol. 25 (1), 45-52 (2015).
  12. Hara, Y., Iwabuchi, M., Ohsumi, K., Kimura, A. Intranuclear DNA density affects chromosome condensation in metazoans. Mol Biol Cell. 24 (15), 2442-2453 (2013).
  13. Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nat Rev Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).
  14. Jevtic, P., Levy, D. L. Mechanisms of nuclear size regulation in model systems and cancer. Adv Exp Med Biol. 773, 537-569 (2014).
  15. Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
  16. Blom, J. H., Ten Kate, F. J., Schroeder, F. H., van der Heul, R. O. Morphometrically estimated variation in nuclear size. A useful tool in grading prostatic cancer. Urol Res. 18 (2), 93-99 (1990).
  17. Dey, P. Cancer nucleus: morphology and beyond. Diagn Cytopathol. 38 (5), 382-390 (2010).
  18. Cross, M. K., Powers, M. A. Learning about cancer from frogs: analysis of mitotic spindles in Xenopus egg extracts. Dis Model Mech. 2 (11-12), 541-547 (2009).
  19. Voeltz, G. K., Prinz, W. A., Shibata, Y., Rist, J. M., Rapoport, T. A. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124 (3), 573-586 (2006).
  20. Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
  21. Edens, L. J., Levy, D. L. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , John Wiley & Sons, Inc. 325-345 (2014).
  22. Levy, D. L., Heald, R. Biological Scaling Problems and Solutions in Amphibians. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (1), a019166(2016).
  23. Edens, L. J., Levy, D. L. cPKC regulates interphase nuclear size during Xenopus development. J Cell Biol. 206 (4), 473-483 (2014).
  24. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , 2nd edn, North-Holland Publishing Company. (1967).
  25. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30 (3), 687-696 (1982).
  26. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
  27. Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
  28. Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nat Protoc. 1 (5), 2305-2314 (2006).
  29. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).
  30. Khan, M. A., et al. Quantitative alterations in nuclear structure predict prostate carcinoma distant metastasis and death in men with biochemical recurrence after radical prostatectomy. Cancer. 98 (12), 2583-2591 (2003).
  31. Tan, P. H., Goh, B. B., Chiang, G., Bay, B. H. Correlation of nuclear morphometry with pathologic parameters in ductal carcinoma in situ of the breast. Mod Pathol. 14 (10), 937-941 (2001).
  32. Zeimet, A. G., et al. DNA ploidy, nuclear size, proliferation index and DNA-hypomethylation in ovarian cancer. Gynecol Oncol. 121 (1), 24-31 (2011).
  33. Theerthagiri, G., Eisenhardt, N., Schwarz, H., Antonin, W. The nucleoporin Nup188 controls passage of membrane proteins across the nuclear pore complex. J Cell Biol. 189 (7), 1129-1142 (2010).
  34. Wuhr, M., et al. Evidence for an upper limit to mitotic spindle length. Curr Biol. 18 (16), 1256-1261 (2008).
  35. Loughlin, R., Wilbur, J. D., McNally, F. J., Nedelec, F. J., Heald, R. Katanin contributes to interspecies spindle length scaling in Xenopus. Cell. 147 (6), 1397-1407 (2011).
  36. Wilbur, J. D., Heald, R. Mitotic spindle scaling during Xenopus development by kif2a and importin. eLife. 2, e00290(2013).
  37. Kieserman, E. K., Heald, R. Mitotic chromosome size scaling in Xenopus. Cell Cycle. 10 (22), 3863-3870 (2011).
  38. Maresca, T. J., Freedman, B. S., Heald, R. Histone H1 is essential for mitotic chromosome architecture and segregation in Xenopus laevis egg extracts. J Cell Biol. 169 (6), 859-869 (2005).
  39. MacCallum, D. E., Losada, A., Kobayashi, R., Hirano, T. ISWI remodeling complexes in Xenopus egg extracts: identification as major chromosomal components that are regulated by INCENP-aurora B. Mol Biol Cell. 13 (1), 25-39 (2002).
  40. Goehring, N. W., Hyman, A. A. Organelle growth control through limiting pools of cytoplasmic components. Curr Biol. 22 (9), R330-R339 (2012).
  41. Du Toit, A. Development: Honey, I shrunk the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 633(2014).
  42. Buchner, K. The role of protein kinase C in the regulation of cell growth and in signalling to the cell nucleus. J Cancer Res Clin Oncol. 126 (1), 1-11 (2000).
  43. Mochly-Rosen, D., Das, K., Grimes, K. V. Protein kinase C, an elusive therapeutic target. Nat Rev Drug Discov. 11 (12), 937-957 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekstrakty z Xenopustest kurczenia si j der kom rkowychprzygotowanie ekstraktu z jajizolacja ekstraktu z zarodkamanipulacja ekstraktem cytoplazmatycznymprotok sk adania j draetapy wirowaniawizualizacja mikroskopowamikroiniekcja zarodk w

Powiązane artykuły