Bezkomórkowy test wykorzystujący ekstrakty z zarodków Xenopus laevis do badania mechanizmów regulacji wielkości jądra

Rozmiary organelli komórkowych zazwyczaj skalują się wraz z rozmiarem komórki, co zostało chyba najlepiej udokumentowane dla skalowania wielkości jądra przy rozmiarze komórki^1-10. Jest to szczególnie prawdziwe podczas embriogenezy i różnicowania komórek, kiedy często obserwuje się dramatyczne zmniejszenie zarówno rozmiaru komórki, jak i jądra^11,12. Co więcej, zmieniony rozmiar jądra jest kluczowym parametrem w diagnostyce i rokowaniu raka^13-17. Mechanizmy, które przyczyniają się do regulacji wielkości jądra, są w dużej mierze nieznane, częściowo ze względu na złożoność i zasadniczy charakter struktury i funkcji jądra. Opisana tutaj metoda została opracowana jako test in vitro do skalowania wielkości jądra, który jest podatny na manipulacje biochemiczne i wyjaśnienie mechanizmów regulacji wielkości jądra.

Ekstrakt z jaj Xenopus laevis to sprawdzony system do podsumowania i badania złożonych procesów komórkowych w kontekście in vitro. Ekstrakty te ujawniły nowe podstawowe informacje na temat kilku procesów komórkowych, w tym budowy i funkcji wrzeciona mitotycznego, retikulum endoplazmatycznego i jądra^18-22. Jedną z kluczowych zalet systemu ekstrakcji jest to, że ekstrakty z jaj X. laevis reprezentują prawie nierozcieńczoną cytoplazmę, której skład można łatwo zmienić, na przykład poprzez dodanie rekombinowanych białek lub wyczerpanie odporności. Co więcej, można manipulować istotnymi procesami, stosując leczenie, które w przeciwnym razie mogłoby być śmiertelne w kontekście in vivo. Modyfikacje procedury ekstrakcji z jaj pozwalają na izolację ekstraktów z zarodków X. laevis, a nie z jaj, a te ekstrakty z zarodków są równie podatne na manipulację biochemiczną²³. Podczas rozwoju X. laevis zapłodniony zarodek jednokomórkowy (o średnicy ~1 mm) przechodzi serię dwunastu szybkich podziałów komórkowych (etapy 1 - 8), aby wytworzyć kilka tysięcy komórek o średnicy 50 μm i mniejszych, osiągając stadium rozwojowe zwane przejściem śródblastulowym (MBT) lub stadium 8^24-26. MBT charakteryzuje się początkiem transkrypcji zygotycznej, migracją komórek, asynchronicznymi podziałami komórek, nabywaniem faz przerwy i ustalaniem rozmiarów jądra w stanie ustalonym, a nie ciągłą ekspansją jądrową, jak w zarodku przed MBT. Od stadium 4 do gastrulacji (etapy 10,5 - 12) objętość pojedynczych jąder zmniejsza się ponad 10-krotnie¹¹.

Tutaj celem jest zidentyfikowanie mechanizmów odpowiedzialnych za te zmniejszenia rozmiaru jądra podczas postępu rozwojowego. Podejście polega na tym, aby najpierw złożyć jądra w ekstrakcie z jaj X. laevis i wyizolować te jądra z cytoplazmy/ekstraktu z jaja. Jądra te są następnie ponownie zawieszane w cytoplazmie z zarodków w późnym stadium gastruli. Po okresie inkubacji jądra ekstraktu z jaja stają się mniejsze w późnym stadium ekstraktu z zarodka. Doszliśmy do wniosku, że byłby to przydatny test do identyfikacji składników cytoplazmatycznych obecnych w zarodkach w późnym stadium, które przyczyniają się do skalowania wielkości jądra rozwojowego. Korzystając z tego testu, w połączeniu z walidacją in vivo, wykazaliśmy, że kinaza białkowa C (PKC) przyczynia się do rozwojowego zmniejszenia wielkości jądra u X. laevis²³.

Wszystkie procedury i badania przeprowadzone zostały zgodnie z 8. wydaniem Przewodnika NRC dotyczącego opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Protokoły zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Wyoming (Assurance # A-3216-01).

1. Przygotowanie ekstraktu z jaj X. laevis (na podstawie^27,28)

1. Samica żaby X. laevis jest karmiona co najmniej trzy dni, a maksymalnie dwa tygodnie przed pobraniem jaj za pomocą pojedynczego wstrzyknięcia 100 j.m. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG).
2. Na dzień przed eksperymentem wstrzyknąć zaszczepionym żabom 800 IU ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (HCG) i umieścić w temperaturze 16 °C w 1 l na żabę z 1/3x zmodyfikowanymi obrączkami Marca (MMR). Patrz Tabela 1, aby zapoznać się ze wszystkimi składami.
   Uwaga: Niektóre żaby nie składają jaj lub składają jaja złej jakości. Zazwyczaj wstrzykuje się 2-3 żaby, aby upewnić się, że co najmniej jedna żaba złoży wystarczającą liczbę jaj dobrej jakości. Przeciętna żaba składa jaja na tyle dużo, aby wyprodukować co najmniej 1 ml ekstraktu z jaj.
3. Przygotować 1 l 1/3x MMR z zimną destylowaną wodą dejonizowaną (ddH₂O), 500 ml buforu B, 1 l buforu C, 500 ml buforu D i 100 ml buforu E.
4. Przenieść złożone jaja do szklanego naczynia krystalizującego (150 x 75 mm). Używając plastikowej pipety Pasteura z odciętą końcówką, wyhoduj białe, puszyste, aktywowane jaja lub jaja poddane lizie. Jaja należy przechowywać tylko z wyraźnymi i równymi ciemnymi biegunami zwierzęcymi i białymi biegunami roślinnymi.
5. Przygotować probówki wirówkowe o wymiarach 13 x 51 mm z 1 ml buforu E uzupełnionego 355 μM cytochalazyną D dodaną tuż przed użyciem w kroku 1.7.
6. Odjedź i umyj jajka.
   1. Umyj jajka krótko zimnym 1/3x MMR w zlewce o odpowiedniej wielkości, zmieniając bufor 3 - 4 razy.
   2. Usunąć galaretki z jaj przez inkubację z buforem B. Zajmie to od 3 do 10 minut. Gdy mętne galaretki zostaną uwolnione z jaj, zmień bufor.
      Uwaga: Dejellying jest zakończone, gdy jaja wydają się ciasno upakowane w rogu naczynia, gdy są przechylone, a słupy roślinne są skierowane w dół. Jaja są znacznie bardziej kruche po dejellyingu, dlatego nie należy inkubować jaj z buforem B dłużej niż to konieczne, a kolejne mycia należy wykonywać bardzo ostrożnie.
   3. Umyj jajka krótko z 3 - 4 podmianami buforu C.
   4. Umyj jajka krótko z 2 podmianami buforu D.
   5. Umyj jajka krótko z 2 podmianami buforu E.
7. Napełnij probówki wirówkowe jajkami za pomocą szklanej pipety o szerokim otworze lub plastikowego zakraplacza. Odessać nadmiar buforu. Aby zapakować jaja i usunąć jak najwięcej buforu, odwirować w obracającym się wirniku kubełkowym o prędkości 212 x g przez 60 sekund, a następnie przy 478 x g przez 30 sekund. Odessać nadmiar buforu.
   Uwaga: Na tym etapie ważne jest, aby usunąć jak najwięcej nadmiaru bufora, aby upewnić się, że ekstrakt z jaj jest minimalnie rozcieńczony.
8. W wahadłowym wirniku kubełkowym ultrawirować pod próżnią przez 15 minut przy 12 000 x g i 4 °C, aby rozdrobnić jaja i rozdzielić je na różne warstwy, przy czym cytoplazma jest bursztynową warstwą pośrodku. Wyjmij probówki wirówkowe i natychmiast umieść je na lodzie.
9. Zbierz ekstrakt.
   1. Za pomocą igły i strzykawki o rozmiarze 18 przebij probówkę wirówkową tuż nad ciemną warstwą pigmentową na dnie probówki i usuń środkową bursztynową warstwę cytoplazmatyczną. Nie zbieraj żadnej wierzchniej warstwy lipidowej. Zbierz cytoplazmę do probówki o odpowiednim rozmiarze.
      Uwaga: Ogólnie rzecz biorąc, 1 żaba wytwarza co najmniej 1 ml ekstraktu.
   2. Uzupełnij cytoplazmę o 1/1,000 objętości 19,7 mM cytochalazyny D, 1/1,000 objętości zapasu LPC i 1/50 objętości 50-krotnego miksu energetycznego. Delikatnie odwróć rurkę, aby wymieszać. Nie należy nadmiernie pipetować ekstraktu.
   3. Trzymaj ekstrakt na lodzie i zużyj go w ciągu 3 godzin od przygotowania, aby uzyskać najlepsze rezultaty.

2. Przygotowanie zdemembranowanego nasienia X. laevis (adaptacja^{z 29})

Uwaga: Przedstawione tutaj objętości procedur dotyczą do 8 jąder.

1. Usunąć 0,05% benzokainy (10% bulionu benzokainowego przygotowanego w etanolu i rozcieńczonego do 0,05% w wodzie ze zbiornika żab) z 4 °C i ogrzać do temperatury pokojowej. Znieczulenie i użyczenie samców żab X. laevis w roztworze benzokainy w temperaturze pokojowej przez 20 - 30 min. Upewnij się, że śmierć nastąpi z powodu braku bicia serca poprzez badanie i wyczucie obszaru klatki piersiowej, przez brak reakcji na stymulację mechaniczną i/lub przez ścięcie głowy.
2. Wykonaj nacięcie w kształcie litery U wzdłuż brzucha. Usuń rurkową masę żółtych ciałek tłuszczowych. W górnej części nerek zlokalizuj jądra, które są owalnymi bladoróżowymi masami o długości około 1 cm²⁹. Wytnij jądra i zwiń je na bibułę, aby usunąć krew i inne tkanki.
3. Umyj jądra w buforze T. Za pomocą ciasno dopasowanego tłuczka zmiel jądra z 1 ml buforu T w probówce o pojemności 1,5 ml do uzyskania jednorodności (10 uderzeń lub więcej). Odwirować 5 - 10 sekund w mini wirówce i zebrać supernatant, usuwając duże kawałki tkanki. Powtórzyć wirowanie jeszcze raz i zebrać supernatant.
4. Przenieś roztwór zawierający plemniki do plastikowej probówki o pojemności 15 ml. Zwiększyć objętość do całkowitej objętości 2 ml za pomocą buforu T. Odwirować przy 1,411 x g przez 10 minut w temperaturze 16 °C w celu osadzenia nasienia.
5. Usunąć sklarowany osad i ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu T. Odwirować przy 1,411 x g przez 10 minut w temperaturze 16 °C. Powtórzyć ten krok raz lub dwa razy, w zależności od potrzeb, aby oczyścić osad z krwinek somatycznych i czerwonych.
6. Zawiesić osad w 100 μl buforu T i 300 μl buforu S. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
   Uwaga: Bufor S zawiera lizolecytynę, która jest odpowiedzialna za demembranację.
7. Dodać trzy objętości buforu R (przygotowanego na świeżo przed użyciem). Odwróć rurkę dokładnie raz. Wirować przy 1,411 x g przez 15 minut w temperaturze 16 °C.
8. Zawiesić osad w 400 μl buforu R, a następnie dodać dodatkowe 2 ml buforu R. Wirować przy 1,411 x g przez 15 minut w temperaturze 16 °C.
9. Zawiesić osad w buforze 50 μl T.
10. Rozcieńczyć 1 μl zdebłonowanych jąder plemników za pomocą 9 μl buforu T. Zastosować to rozcieńczenie do hemocytometru. Policz liczbę cienkich jąder plemników w kształcie litery S w jednej dużej siatce 4 x 4 i pomnóż tę liczbę przez 100, aby uzyskać stężenie zapasu w jądrach plemników na μl.
11. Rozcieńczyć zapas do 100 000 jąder plemników na μl za pomocą buforu T, co daje 200-krotny zapas. Przygotować 3 - 5 μl porcji. Błyskawiczne zamrożenie w ciekłym azocie i przechowywanie w temperaturze -80 °C.

3. Montaż jądrowy

1. Uzupełnij 100 μl ekstraktu z jaja 1,5 μl 35,5 mM cykloheksymidu (stężenie końcowe ~ 0,5 mM), 6 μl 20x roztworu podstawowego wapnia (stężenie końcowe ~ 0,6 mM) i 0,7 μl 200x plemniki (końcowe stężenie ~ 700 jąder plemników/μl). W razie potrzeby zwiększ lub zmniejsz objętość reakcji. Odwróć lub delikatnie dotknij, aby wymieszać.
   Uwaga: Ekstrakt cyklicznie z metafazy do interfazy zapewnia bardziej solidną i niezawodną platformę do montażu jądrowego.
2. Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 16 - 20 °C przez 90 minut. Mieszać, delikatnie stukając co 15 minut, aby jądra pozostały zawieszone w ekstrakcie.
3. Monitoruj postęp montażu jądrowego po 45 minutach, przygotowując dynię w następujący sposób.
   1. Odmierzyć pipetą 2 μl ekstraktu na szkiełko podstawowe i dodać 2 μl roztworu jądrowego.
   2. Nakładka z szkiełkiem nakrywkowym 22^mm2. Obraz na mikroskopie epifluorescencyjnym przy użyciu obiektywów 20 - 100X z wodą, olejem lub powietrzem i filtrem DAPI.
      Uwaga: Jądra mogą być wizualizowane za pomocą obrazowania w jasnym polu, ale są znacznie łatwiejsze do uwidocznienia za pomocą fluorescencji.
   3. Natychmiast zużyć jądra lub błyskawicznie zamrozić podwielokrotności w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      Uwaga: Dodanie 4% glicerolu do jąder przed zamrożeniem może pomóc w utrzymaniu ich integralności. Zamrożone jądra są na ogół nadal żywotne i zdolne do importu jądrowego, jednak proces zamrażania może prowadzić do zakłóceń lub bardziej kruchych strukturalnie jąder. Można stosować jądra do roku po zamrożeniu.

4. Przygotowanie ekstraktu z zarodka X. laevis

1. Nakłonić samice żab X. laevis do składania jaj w sposób opisany w ppkt 1.1 i 1.2.
2. Wyizolować jądra od samców żab X. laevis, jak opisano w ppkt 2.2. Zanurzyć jądra w pożywce L15 uzupełnionej 50 j.m./ml penicyliny i streptomycyny w szklanej szalce Petriego o wymiarach 35 x 10 mm. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni.
3. Zbieraj i zapładniaj jaja.
   1. Zbieraj świeżo złożone jaja, trzymając żaby nad szklaną szalką Petriego wielokrotnego użytku i promuj składanie jaj, wywierając delikatny nacisk na dolną część pleców w pobliżu kloaki. Zbyt mocne ściskanie żaby może spowodować obrażenia, prowadzące do wzdęcia brzucha i wymagające eutanazji²⁹.
   2. Podeprzyj naczynie pod kątem około 45°, pozwól, aby jajka zebrały się na krawędzi naczynia, usuń cały nadmiar bufora i dodaj tyle 1/3x MMR, aby ledwo przykryć jajka. Jaja należy zapłodnić w ciągu 15 minut od pobrania.
   3. Za pomocą ciasno dopasowanego tłuczka zmaceruj i homogenizuj 1/4 jądra w probówce o pojemności 1,5 ml z 500 μl modyfikowanej soli fizjologicznej Bartha o wysokiej zawartości soli (MBS o wysokiej soli). Dodaj zmacerowane jądra do jaj i pozwól zapłodnieniu nastąpić w temperaturze pokojowej przez 15 - 20 minut, a następnie zalej jaja 1/3x MMR.
      Uwaga: Skuteczność jąder zmniejsza się wraz z czasem przechowywania, dlatego do pomyślnego zapłodnienia może być potrzebnych więcej tkanki jąder w przypadku korzystania z jąder, które były przechowywane dłużej niż tydzień.
   4. Potwierdź zapłodnienie, sprawdzając, czy nie ma skurczu ciemno zabarwionego bieguna zwierzęcego i obracając zarodki z ich zwierzęcymi biegunami skierowanymi do góry, zwykle około 20 - 30 minut po dodaniu zmiażdżonych jąder. Spodziewaj się, że pierwsze rozszczepienie komórek nastąpi w ciągu 90 minut.
   5. Za pomocą szklanej pipety o szerokim otworze należy pilnie usunąć martwe (białe i opuchnięte lub nierównomierne rozmieszczenie żółtka i pigmentu), zlizowane lub niezapłodnione jaja (tj. nie rozszczepione), ponieważ szybko wywołają one śmierć sąsiednich zarodków.
   6. W dowolnym miejscu od 1 do 2,5 godziny po zapłodnieniu, zarodki dejelly w 2 - 3% cysteiny rozpuszczone w 1/3 x MMR i dostosowane do pH 7,9 z 10 N KOH. Wykonaj dwie zmiany bufora, z których każda trwa 3-4 minuty. Dokładnie umyj zarodki 6 - 10 krótkimi zmianami 1/3x MMR, aby usunąć wszelkie ślady cysteiny.
      Uwaga: Zarodki odjeżlarzane mają błonę witelinową i nie są tak kruche jak jaja w kolorze dejelli.
4. Za pomocą szklanej pipety o szerokim otworze przenieś zdrowe, zapłodnione (tj. rozszczepione) zarodki na szalkę Petriego zawierającą świeżą 1/3x MMR i pozwól im rozwinąć się do pożądanego stadium w temperaturze pokojowej lub, jeśli preferowany jest wolniejszy rozwój, w temperaturze 16 °C. Kontynuuj usuwanie martwych lub zlizowanych zarodków, na które wskazuje brak pierwszego podziału lub biały, opuchnięty wygląd.
5. Sprawdzić stopień zaawansowania zarodków, sprawdzając, czy blastopor jest prawie całkowicie zamknięty i porównując je z rysunkami zarodków w stadium dostępnym w materiałach referencyjnych²⁴.
   Uwaga: Zarodki hodowane w temperaturze 16 °C osiągają stadium 11,5 - 12 w ciągu około 12 godzin.
6. Inkubować zarodki w stadium 11,5 - 12 w świeżym 1/3x MMR uzupełnionym cykloheksymidem 0,5 mM przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby zatrzymać zarodki w późnej interfazie.
7. Za pomocą szklanej lub plastikowej pipety o szerokim otworze przenieść co najmniej 15 (najlepiej 30 lub więcej) zarodków zatrzymanych w interfazie do probówki mikrowirówkowej.
   Uwaga: 15 zarodków wystarcza do wyprodukowania około 20 μl ekstraktu. Skaluj w górę zgodnie z potrzebami.
8. Dodać 1 ml buforu do lizy jaj (ELB) uzupełnionego 1 μl bulionu LPC. Delikatnie odwróć, aby umyć zarodki, pozwól zarodkom opaść na dno probówki i usuń bufor. Powtórz ten krok prania jeszcze dwa razy.
9. Ponownie zawiesić zarodki w 500 μl ELB plus 0,5 μl zapasu LPC, 5 μl 19,7 mM cykloheksymidu i 5 μl 35,5 mM cytochalazyny D (w celu zahamowania polimeryzacji aktyny). Wirować przy 200 x g przez 1 minutę w mikrowirówce stołowej.
10. Usuń nadmiar buforu i za pomocą tłuczka dokładnie zmiażdż zarodki. Wirować w obracającym się wirniku kubełkowym przez 10 minut przy 10 000 x g i temperaturze 16 °C.
11. Nakłuć warstwę lipidową od góry końcówką pipety o pojemności 200 μl. Za pomocą czystej końcówki pipety o pojemności 200 μl usunąć środkową cytoplazmatyczną warstwę koloru bursztynowego do probówki o odpowiedniej wielkości.
12. Uzupełnij ekstrakt z zarodków o 1/50 objętości 50-krotności mieszanki energetycznej (w celu zapewnienia systemu regeneracji ATP), 1/100 objętości 35,5 mM cykloheksamidu, 1/500 objętości 19,7 mM cytochalazyny D i 1/1,000 objętości zapasu LPC.
13. Przygotować dynię zgodnie z opisem w ppkt 3.3, aby uwidocznić endogenne jądra zarodkowe w ekstrakcie.
    Uwaga: W tym momencie ekstrakt z zarodków można zamrozić wraz z jądrami endogennymi. Podwielokrotność w celu skrócenia cykli zamrażania/rozmrażania i przechowywania w temperaturze -80 °C.
14. Aby usunąć jądra z ekstraktu z zarodka, należy rozcieńczyć ekstrakt równą objętością ELB zawierającą 1/50 objętości 50x miksu energetycznego, 1/100 objętość 35,5 mM cykloheksamidu, 1/500 objętość 19,7 mM cytochalazyny D i 1/1 000 objętości zapasu LPC. Wirować w obrotowym wirniku kubełkowym o sile 17 000 x g przez 15 minut w temperaturze 16 °C.
15. Zebrać sklarowany osad, uważając, aby nie pozostały lipidy na górze. Nie należy naruszać granulowanych jąder na dnie probówki. Przygotować dynię zgodnie z opisem w ppkt 3.3, aby upewnić się, że większość jąder została usunięta. Użyć świeżego ekstraktu lub porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C.
16. Aby podgrzać inaktywowany ekstrakt z zarodków do eksperymentów kontrolnych, należy podgrzać 30-100 μl porcji ekstraktu w temperaturze 56 °C przez 30 minut za pomocą termocyklera. Przed użyciem pozwól, aby inaktywowany termicznie ekstrakt powrócił do temperatury pokojowej.

5. Test kurczenia się jądra i immunofluorescencja

1. Wyizolować jądra złożone w ekstrakcie jajowym, rozcieńczając 25 - 150 μl wstępnie złożonych jąder w 1 ml ELB w probówce o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 1 600 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C w mikrowirówce stołowej. Usunąć bufor, uważając, aby nie naruszyć delikatnej osady jąder na dnie probówki.
2. Zawiesić jądra w objętości ekstraktu z zarodka równej pierwotnej objętości ekstraktu z jaja użytej w ppkt 5.1. Do reakcji kontrolnych należy użyć ELB lub ekstraktu inaktywowanego termicznie, w zależności od potrzeb.
3. Delikatnie postukaj w probówkę, aby rozbić osad i ponownie zawiesić jądra. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 90 minut, delikatnie stukając w probówkę, aby mieszać co 15 - 30 minut. Uwaga: Większość kurczenia się jądra następuje w ciągu pierwszych 30 minut.
4. Monitoruj postęp kurczenia się jądra atomowego, przygotowując dynię.
   1. Odmierzyć pipetą 2 μl ekstraktu na szkiełko podstawowe i dodać 2 μl roztworu jądrowego.
   2. Nakładka z szkiełkiem nakrywkowym 22^mm2. Obraz pod mikroskopem epifluorescencyjnym.
5. Postukaj w probówkę, aby ponownie zawiesić jądra tuż przed dodaniem 500 μl utrwalacza składającego się z ELB, 15% glicerolu i 2,6% paraformaldehydu. Natychmiast odwróć rurkę i umieść rurkę na rotatorze na 15 minut w temperaturze pokojowej.
6. Przygotuj probówki do wirowania, wyposażając szklane probówki o okrągłym dnie o pojemności 15 ml w plastikowe wkładki z okrągłym dnem (projekt i schematy dostępne na życzenie). Dodać 5 ml buforu z poduszką jądrową. Wrzuć okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm do tuby, upewniając się, że leży płasko na plastikowej wkładce.
7. Delikatnie ułóż roztwór zawierający utrwalone jądra na wierzchu poduszki jądrowej za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze. Wirować w obracającym się wirniku kubełkowym przez 15 minut przy 1 000 x g i temperaturze 16 °C.
8. Użyj aspiratora, aby usunąć cały bufor i pociągnij plastikową wkładkę do górnej części tuby. Usunąć szkiełko nakrywkowe za pomocą cienkich kleszków, zwracając uwagę na stronę szkiełka nakrywkowego, na którą zostały odwrócone jądra. Post-fix w zimnym metanolu (przechowywanym w temperaturze -20°C) przez 5 min w temperaturze pokojowej.
9. Przenieś szkiełko nakrywkowe stroną z jądrem do góry na arkusz plastikowej folii parafinowej wyściełającej dużą plastikową szalkę Petriego. Umieść mokre jednorazowe chusteczki wzdłuż boku naczynia, aby zapobiec odwodnieniu.
10. Uwodnić jądra na szkiełku nakrywkowym za pomocą 500 μl PBS-NP40 (1x PBS plus 0,1% NP40) i odessać po 5 - 10 sekundach.
11. Ostrożnie nałożyć 75 μl PBS-3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) na szkiełko nakrywkowe. Pozostawić na 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub na noc w temperaturze 4 °C.
12. Usunąć roztwór blokujący i inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem (np. mAb414 przeciwko jądrowemu kompleksowi porowemu, 1:1,000) rozcieńczonym w PBS-3% BSA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Przemyć pięcioma natychmiastowymi zmianami PBS-NP40.
13. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w PBS-3% BSA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć pięcioma natychmiastowymi zmianami PBS-NP40.
14. Inkubować z 10 μg/ml Hoechst rozcieńczonym w PBS-3% BSA przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć pięć razy PBS-NP40. Usuń cały nadmiar bufora.
15. Zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełku za pomocą 5 μl środka mocującego zapobiegającego blaknięciu. Uszczelnij przezroczystym lakierem do paznokci. Obraz natychmiast za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego z obiektywami 20 - 100x lub przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszego obrazowania.
    Uwaga: Przeprowadzić kwantyfikację zgodnie z wcześniejszym opisem²³.

Składanie jąder w ekstrakcie z jaj

Pierwszymi krokami tego protokołu są przygotowanie ekstraktu z jaja X. laevis (Protokół 1) i zdemembranowanych jąder plemników (Protokół 2). Odczynniki te są następnie używane do składania jąder de novo (Protokół 3). Rysunek 1 przedstawia reprezentatywne dane. Dodatek wapnia napędza mejotyczny ekstrakt z jaj w interfazę, a cykloheksymid utrzymuje ekstrakt zatrzymany w interfazie. Po 30 - 45 minutach od rozpoczęcia reakcji początkowo cienkie jądra plemników w kształcie litery S powinny zacząć gęstnieć w masy chromatyny w kształcie ślimaka. Pomyślne utworzenie nienaruszonej otoczki jądrowej można ocenić przez import i przechowywanie fluorescencyjnie oznakowanego ładunku importowego, takiego jak GST-GFP-NLS (dane nie pokazane) lub przez barwienie krawędzi kompleksu porów jądrowych za pomocą mAb414, który rozpoznaje FG-repeat zawierające nukleozyny (Figura 1A). Po złożeniu jądra kształt jądra powinien stać się bardziej zaokrąglony, a objętość jądra powinna wzrosnąć w miarę rozszerzania się otoczki jądrowej i importowania białek jądrowych (ryc. 1B-C). Brak zaobserwowania tworzenia się nienaruszonej otoczki jądrowej lub wzrostu jądra wskazuje na niską jakość ekstraktu z jaj. W takim przypadku najlepiej zacząć od nowa z nową partią jaj.

Usuwanie jąder endogennych z ekstraktu z zarodka
Kolejnym krokiem jest przygotowanie ekstraktu z zarodka w późnym stadium rozwoju (Protokół 4). Po wstępnym przygotowaniu ekstraktu, a przed usunięciem jąder, najlepiej jest przygotować dynię barwioną metodą Hoechst o małej porcji ekstraktu. Wizualizacja wielu małych jąder zarodkowych jest dobrym wskaźnikiem sukcesu w przygotowaniu ekstraktu (ryc. 2A). Ponieważ endogenne jądra embrionalne mogą zakłócać dalszą analizę, ważne jest również, aby sprawdzić podwielokrotność ekstraktu po usunięciu jąder przez rozcieńczenie i odwirowanie. W porównaniu z pierwszą dynią, w ekstrakcie powinno pozostać bardzo niewiele jąder (ryc. 2B). Jeśli nadal obecnych jest wiele jąder, wymagana jest druga runda wirowania.

Test zmniejszania się jądra
Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne wyniki dla testu kurczenia się jądrowego (Protokół 5). Jądra ekstraktu z jaj ponownie zawieszone w ekstrakcie z zarodka w późnym stadium stają się z czasem mniejsze (ryc. 3B). Dobrą kontrolą ujemną dla testu jest inkubacja jąder z ekstraktem z zarodka, który został inaktywowany termicznie (ryc. 3A). Ponieważ jądra nie kurczą się w inaktywowanym termicznie ekstrakcie, daje to pewną pewność, że obserwowane kurczenie się jądra przy nietraktowanym ekstrakcie zarodkowym nie jest konsekwencją efektów osmotycznych. Obserwowany zakres zmniejszenia wielkości jąder różni się w zależności od konkretnej partii jąder ekstraktu z jaj, a także od jakości ekstraktu z zarodka. Z naszego doświadczenia wynika, że zawsze obserwuje się kurczenie się jądra (np. w ponad 40 różnych ekstraktach zarodkowych), jednak ważne jest, aby powtórzyć te eksperymenty wiele razy z różnymi jądrami i ekstraktami, aby uwzględnić nieodłączną zmienność testu. Rysunek 4 przedstawia schemat całego protokołu.

Rysunek 1. Kurs czasu montażu jądrowego w ekstrakcie z jaj X. laevis. Jądra zostały złożone de novo w ekstrakcie z jaj X. laevis, jak opisano w Protokole 3. Podwielokrotności z tej samej reakcji utrwalono i uwidoczniono za pomocą immunofluorescencji przy użyciu przeciwciała przeciwko jądrowemu kompleksowi porowemu (NPC) (mAb414) w: A) 30 min, B) 60 min i C) 90 min po rozpoczęciu składania jądrowego. Protokół immunofluorescencji jest opisany w Protokole 5. Podziałka wynosi 25 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Usunięcie jąder z ekstraktu z zarodka X. laevis. Ekstrakt z zarodka X. laevis został przygotowany z zarodków w stadium 11,5 - 12, jak opisano w Protokole 4. Niewielką porcję ekstraktu utrwalono i wybarwiono za pomocą Hoechst: A) przed usunięciem jąder i B) po usunięciu jąder przez odwirowanie. Podziałka wynosi 25 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Reprezentatywne dane z testu kurczenia się jądrowego. Jądra zostały złożone de novo w ekstrakcie z jaj X. laevis uzupełnionym rekombinowanym GFP-LB3 (w celu uwidocznienia blaszki jądrowej). Jak opisano w Protokole 5, jądra ekstraktu z jaja wyizolowano i ponownie zawieszono w ekstrakcie z zarodka w stadium 11.5 - 12, z którego usunięto endogenne jądra zarodkowe. Obrazowanie poklatkowe na żywo wykonywano w odstępach 30 sekund przez 90 minut. Panele rycinowe pokazują obrazy uzyskane w odstępach 6-minutowych dla jąder inkubowanych w: A) ekstrakcie z zarodków w późnym stadium (LEE) i B) ekstrakcie z zarodków inaktywowanych termicznie (HI). Obrazy z kursów czasowych przebiegają od lewej do prawej. Podziałka wynosi 25 μm. C) Dane dotyczące kurczenia się jądra z 46 różnych ekstraktów z jaj i zarodków. Słupki pokazują średnie dla > 240 jąder. Słupki błędów są odchyleniem standardowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Schemat testu kurczenia się jądrowego. Każde kolorowe pole reprezentuje jeden protokół. Kolor czerwony oznacza przygotowanie ekstraktu z jaj X. laevis (Protokół 1). Kolor niebieski oznacza przygotowanie zdemembranowanego plemnika X. laevis (Protokół 2). Kolor różowy oznacza montaż jądrowy de novo w ekstrakcie z jaj (Protokół 3). Kolor zielony oznacza przygotowanie ekstraktu z zarodków X. laevis (Protokół 4). Kolor fioletowy oznacza protokół testu kurczenia się jądra i immunofluorescencję (protokół 5). Fragmenty tej figurki zostały ponownie wykorzystane z23 roku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1. . Składy wszystkich wymienionych w niniejszym protokole zostały opisane w niniejszej tabeli.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.