Artykuł metodologiczny

Generowanie i identyfikacja makrofagów i komórek dendrytycznych pochodzących z GM-CSF

17.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54194

⸱

25 czerwca 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Microbiology and Immunology, University of British Columbia

W tym artykule

Podsumowanie

Komórki szpiku kostnego hodowane za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów granulocytów (GM-CSF) generują heterogeniczną hodowlę zawierającą makrofagi i komórki dendrytyczne (DC). Metoda ta kładzie nacisk na wykorzystanie wiązania MHCII i hialuronianu (HA) w celu odróżnienia makrofagów od DC w kulturze GM-CSF. Makrofagi w tej kulturze mają wiele podobieństw do makrofagów pęcherzykowych.

Streszczenie

Makrofagi i komórki dendrytyczne (DC) to wrodzone komórki odpornościowe występujące w tkankach i narządach limfatycznych, które odgrywają kluczową rolę w obronie przed patogenami. Trudno jest je jednak wyizolować w wystarczającej liczbie, aby można je było szczegółowo zbadać, dlatego opracowano modele in vitro. Hodowle in vitro makrofagów i komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego są dobrze ugruntowanymi i cennymi metodami badań immunologicznych. W tym miejscu opisano metodę hodowli i identyfikacji zarówno DC, jak i makrofagów z pojedynczej hodowli pierwotnych komórek szpiku kostnego myszy przy użyciu czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów granulocytów makrofagów (GM-CSF). Protokół ten opiera się na ustalonej procedurze opracowanej po raz pierwszy przez Lutza i wsp. w 1999 r. dla DC pochodzących ze szpiku kostnego. Hodowla jest niejednorodna, a MHCII i fluoresceinowany hialuronian (FL-HA) są używane do odróżniania makrofagów od niedojrzałych i dojrzałych DC. Te makrofagi pochodzące z GM-CSF stanowią wygodne źródło makrofagów pochodzących z badań in vitro, które bardzo przypominają makrofagi pęcherzykowe zarówno pod względem fenotypu, jak i funkcji.

Wprowadzenie

Opisano kilka metod hodowli in vitro w celu generowania makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM) i DC pochodzących ze szpiku kostnego (BMDC) przy użyciu jednego lub kombinacji czynników wzrostu. BMDM mogą być generowane przez hodowlę komórek szpiku kostnego przy użyciu czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) lub GM-CSF1,2. W przypadku BMDC dodanie liganda FLT3 do hodowli szpiku kostnego powoduje powstanie nieprzylegających klasycznych i plazmocytoidalnych DC (odpowiednio CD11chigh/MHCIIhigh i CD11clo, B220+) po 9 dniach w hodowli3,4. W przeciwieństwie do tego, nieprzylegające komórki wytworzone po 7 do 10 dniach w hodowli z samym GM-CSF5,6, GM-CSF i IL-47 lub GM-CSF i ligandemFLT3 8,9 generują BMDC bardziej przypominające zapalne DC (wysoki CD11c,wysoki MHCII CD11b+)10. Chociaż te kultury in vitro są wykorzystywane do generowania makrofagów lub DC, nie jest jasne, czy każda kultura daje początek czystym populacjom. Na przykład, chociaż komórki przylegające w kulturach GM-CSF są opisywane jako makrofagi5, nieprzylegające komórki z tej samej hodowli są używane jako DC6,11-13, przy założeniu, że są one jednorodne, a wszelka obserwowana zmienność wynika z różnych etapów rozwoju14,15. Ponadto badania wykazały, że GM-CSF jest niezbędnym czynnikiem wzrostu dla rozwoju makrofagów pęcherzykowych in vivo16,17 i może być stosowany in vitro do generowania makrofagów pęcherzykowych16,17,18.

Poza przestrzeganiem zaleceń lekarskich, procedury generowania makrofagów i DC z hodowli szpiku kostnego traktowanych GM-CSF są bardzo podobne, co sugeruje, że w hodowlach szpiku kostnego GM-CSF może istnieć niejednorodność. Wydaje się, że tak właśnie jest, ponieważ dwa artykuły donoszą o obecności BMDM we frakcji nieprzylegającej kultur BMDC. W jednym z artykułów zidentyfikowali populację komórek jako CD11c+, CD11b+, MHCIImid, MerTK+ i CD115+, które wyrażały sygnaturę ekspresji genów, która najbardziej przypominała makrofagi pęcherzykowe i miała zmniejszoną zdolność do aktywacji limfocytów T19. W drugim artykule wykorzystano MHCII i FL-HA do identyfikacji populacji pęcherzykowej makrofagów (CD11c+, MHCIImid/low, FL-HAhigh), która różniła się od niedojrzałych (CD11c+, MHCIImid, FL-HAlow) i dojrzałych DC (CD11c+, MHCIIhigh), zarówno fenotypowo, jak i funkcjonalnie18. Oba te prace ilustrują, że hodowle GM-CSF BMDC są niejednorodne, zawierają zarówno makrofagi, jak i populacje DC, co wskazuje, że należy zachować ostrożność podczas interpretacji danych z kultur BMDC.

Ten protokół opisuje, jak izolować szpik kostny, hodować komórki szpiku kostnego w GM-CSF i identyfikować populację makrofagów pęcherzykowych od niedojrzałych i dojrzałych DC w hodowli szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu wiązania FL-HA i ekspresji MHCII. Procedura ta opiera się na ustalonej procedurze Lutza i wsp. 6 i jest w stanie wygenerować 5 - 10 x 106 nieprzylegających komórek w 7 dniu hodowli 10 ml. Hodowla nadaje się do użytku od 7 do 10 dni i daje niejednorodną populację makrofagów, niedojrzałych i dojrzałych DC, a także niektórych przodków w 7 dniu. Zapewnia to prostą metodę hodowli i izolowania in vitro makrofagów pęcherzykowych w dużych ilościach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Myszy zostały poddane eutanazji zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami dotyczącymi etycznych badań na zwierzętach zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej.

1. Pozyskiwanie jednokomórkowego zawiesiny szpiku kostnego z kości udowej i piszczelowej myszy

  1. Włączyć szafę bezpieczeństwa biologicznego (BSC) 15 minut przed rozpoczęciem procedury, aby oczyścić powietrze z szafy i umożliwić stabilizację przepływu powietrza, a następnie oczyścić/spryskać powierzchnię BSC 70% etanolem. Utrzymuj wszystko tak sterylne, jak to możliwe przez cały czas trwania protokołu. Nie przecinaj kości w niesterylnych warunkach.
  2. Przygotuj narzędzia do preparacji, mocząc je w 70% etanolu (1 para nożyczek preparacyjnych, 2 pary kleszczy), zbilansowany roztwór soli Hanka z 5% płodową surowicą cielęcą (HBSS-FCS), sterylne szalki Petriego (100 mm x 15 mm), strzykawki 1 ml, igły o rozmiarze 261/2, stożkowe probówki zbiorcze (15 ml lub 50 ml) i ręczniki papierowe w BSC.
  3. Poddaj mysz eutanazji przy użyciu protokołów zatwierdzonych przez komisję etyczną ds. badań na zwierzętach instytucji. Wnieś do BSC, połóż na jednym lub dwóch ręcznikach papierowych i spryskaj mysz 70% etanolem.
  4. W BSC otworzyć sterylną szalkę Petriego w sposób aseptyczny, nanieść 10 ml HBSS-FCS na podstawę i 1-2 ml na pokrywkę.
  5. Połóż mysz na brzuchu tyłem do góry i unieś skórę wokół odcinka piersiowego palcami ręki niedominującej. Użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie w miejscu, w którym skóra jest uniesiona.
  6. Przytrzymaj oba końce cięcia, po jednym końcu każdą ręką i ostrożnie rozsuń skórę wokół myszy od pleców do brzucha, kontynuuj ciągnięcie, aż dwa końce nacięcia spotkają się na brzuchu.
  7. Odwróć mysz do brzucha do góry i jedną ręką pociągnij dolną połowę skóry w dół w kierunku nogi, odciągaj skórę, aż nogi zostaną odsłonięte.
  8. Przytrzymaj stopę myszy i przetnij ścięgna Achillesa powyżej stawu skokowego oraz więzadła łączące mięśnie ze stopą na dolnym końcu kości piszczelowej za pomocą nożyczek. To rozluźnia stopę od kości nóg
    9. .
  9. Trzymając nogę za stopę, przetnij mięśnie i więzadła nożycami wokół stawu kolanowego na dolnym końcu kości udowej, aby odciąć mięśnie ud od dolnej części nogi. Użyj kleszczy, aby delikatnie odciągnąć rozluźnione mięśnie od powierzchni strzałkowej i udowej. Należy uważać, aby nie przeciąć tętnicy udowej, aby uniknąć obfitego krwawienia.
  10. Jedną ręką trzymając się stopy, dociśnij otwarte nożyczki na górnym końcu kości udowej w stawie biodrowym, obróć nogę i delikatnie pociągnij, aby oddzielić kość udową od stawu biodrowego, używając nożyczek, aby wykonać ostatnie cięcie, aby uwolnić nogę od ciała.
  11. Od tego momentu trzymaj tkankę tylko sterylnymi kleszkami. Z jednej strony chwyć nogę, a z drugiej oderwij stopę.
    nuta: Nie powinno to wymagać dużej siły, ponieważ więzadła łączące są przecinane w kroku 1.9. Alternatywnie przeciąć kość piszczelową tuż nad kostką, gdzie kość jest zrośnięta.
  12. Przytrzymaj nogę za dystalny koniec kości udowej jednym zestawem kleszczy, a bliższy koniec kości piszczelowej i strzałkowej drugim, ostrożnie zegnij kość piszczelową i strzałkową w przeciwnym kierunku niż staw kolanowy, aby oddzielić je od kości udowej i rzepki.
  13. Użyj kleszczy, aby ściągnąć pozostałe więzadła i mięśnie nadal przyczepione do kości podudzi. Tutaj usuń kość strzałkową wraz z tkankami łącznymi za pomocą kleszczy, ponieważ jest zbyt mała, aby można ją było przepłukać dla komórek szpiku kostnego. Umieść oczyszczoną piszczel na odwróconej pokrywie szalki Petriego.
  14. Przytrzymaj dolny koniec kości udowej jednym zestawem kleszczy, a rzepkę drugim, zegnij rzepkę i otaczające tkanki w przeciwnym kierunku do stawu w celu usunięcia. Następnie oczyść pozostałe tkanki łączne z kości udowej; odciągnij je kleszczami i umieść na odwróconej pokrywie szalki Petriego. Wyrzuć rzepkę.
  15. W razie potrzeby powtórz 1,7 - 1,13 z drugą nogą. W razie potrzeby przenieść kości do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,6 ml zawierających 1 ml sterylnego HBSS-FCS w celu transportu.
  16. Umieścić kości na odwróconej pokrywie szalki Petriego z 1-2 ml HBSS-FCS, użyć kleszczy do oczyszczenia wszelkich resztek tkanki nadal przyczepionej do kości piszczelowej i udowej, a następnie przenieść kości na podstawę szalki Petriego zawierającej 10 ml HBSS-FCS. Alternatywnie, oczyść kości i usuń przyczepioną tkankę mięśniową za pomocą tkanki nasączonej 70% etanolem.
  17. Przetnij każdą z kości na pół nożyczkami. Podczas cięcia częściowo przykryj szalkę Petriego sterylną pokrywką, aby upewnić się, że kości pozostaną w naczyniu. Alternatywnie, odetnij koniec każdej kości, aby umożliwić spłukiwanie w następnym kroku.
  18. Umieścić igłę 261/2 G na strzykawce o pojemności 1 ml i pobrać 1 ml HBSS-FCS z płytki Petriego. Włóż końcówkę igły do końca kawałka kości i wypłucz komórki szpiku kostnego (miękką czerwoną tkankę wewnątrz kości). Włóż igłę w głowę kości i otwarty koniec, aż cały szpik zostanie usunięty w kolorze czerwonym. Obserwuj, że kości są koloru białego.
  19. Przepuścić kilka razy widoczne grudki szpiku kostnego przez strzykawkę, aby utworzyć zawiesinę jednokomórkową.
  20. Wyrzuć zaczerwienione kości. Za pomocą pipety o pojemności 10 ml dobrze wymieszać zawiesinę komórek i przenieść do probówki zbiorczej. Przepłukać szalkę Petriego 5 ml HBSS-FCS w celu zebrania resztek komórek w naczyniu. Umieść komórki na lodzie.
    nuta: Zawiesina komórek szpiku kostnego jest nadal żywotna, jeśli jest przechowywana przez 2 - 3 godziny w temperaturze 4 °C.

2. Posiewanie i hodowla komórek szpiku kostnego (BMC)

  1. Przygotuj następujące odczynniki i materiały eksploatacyjne.
    1. Przygotuj bufor do lizy czerwonych krwinek (RBC), wytwarzając 0,84% chlorku amonu w końcowym roztworze 2 mM Tris pH 7,2, a następnie sterylizuj, filtrując przez filtr 0,2 mikrona.
    2. Przygotuj pożywkę BMC, dodając 10% FCS, 20 mM HEPES, 1x aminokwas endogenny, 55 μM 2-merkaptoetanolu, 50 U/ml penicyliny i streptomycyny, 1 mM pirogronianu sodu i 2 mM L-glutaminy do pożywki RPMI 1640.
    3. Uzyskać dostępny w handlu rekombinowany GM-CSF lub użyć supernatantu zawierającego GM-CSF z komórek szpiczaka plazmocytowego AG8.653 transfekowanych genemGM-CSF 20. Oznaczyć stężenie GM-CSF w supernatancie metodą ELISA i dodać równoważnik 20 ng/ml do pożywki BMC.
  2. Obracaj komórki szpiku kostnego w ilości 314 x g przez 5 minut. Osad jest czerwony z powodu erytrocytów. W BSC odessać supernatant za pomocą sterylnej szklanej pipety Pasteura podłączonej do odsysania próżniowego, poluzować osad przez stukanie, a następnie dodać 10 ml buforu do lizy RBC. Wirować w celu ponownego zawieszenia komórek i inkubować w buforze do lizy RBC w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  3. Dodać 10 ml HBSS-FCS, a następnie wirować komórki w temperaturze 314 x g przez 5 minut i odsysać supernatant. Obserwuj osad komórki w kolorze białym. Zawieś komórki w żądanej objętości nośnika BMC.
  4. Policz ponownie zawieszone komórki za pomocą hemocytometru po zabarwieniu martwych komórek 0,4% błękitem trypanowym.
    nuta: Jeśli używany jest szpik kostny z jednej nogi (pojedynczej kości piszczelowej i udowej), ponownie zawiesić w 5 ml pożywki BMC, pobrać 10 μl zawiesiny komórek i rozcieńczyć ją 70 μl 0,4% błękitu trypanowego, dobrze wymieszać i przenieść 10 μl rozcieńczenia 1/8 komórek do komory hemocytometru. Policz żywe komórki w czterech kwadrantach: średnia z czterech kwadrantów liczy x współczynnik rozcieńczenia x 104 = liczba komórek na ml. Kość udowa i piszczelowa z jednej nogi na ogół dają około 2 - 4 x 107 komórek po lizie RBC.
  5. Oszacuj liczbę 10 ml szalek z kulturami szpiku kostnego potrzebnych do dalszych doświadczeń na podstawie całkowitej liczby komórek potrzebnych do eksperymentów na końcu hodowli.
    nuta: Każda potrawa wymaga 2 x 106 komórek szpiku kostnego przy początkowym wysiewie i daje 5 - 10 x 106 komórek w 7 dniu.
    1. Podwielokrotnić całkowitą liczbę komórek do posiewu w nowej probówce, odwirować z prędkością 314 x g przez 5 minut, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w ilości 4 x 106 komórek/ml w pożywce BMC.
  6. Przygotować nową sterylną szalkę Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm z 9,5 ml pożywki BMC zawierającej 200 ng GM-CSF (rekombinowanego lub z GM-CSF zawierającego supernatant). Dodać 500 μl komórek szpiku kostnego o wymiarach 4 x 106 komórek/ml do środka szalki Petriego, aby uzyskać końcowe stężenie 2 x 105 komórek/ml w 10 ml.
    UWAGA: Ważne jest, aby używać sterylnej szalki Petriego, a nie szalki do hodowli tkankowych. Ponadto, podczas dodawania komórek, upewnij się, że komórki pozostają skoncentrowane w środku i zminimalizuj zakłócenia szalek po wysiewie i podczas zmiany podłoża. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . To jest dzień 0 w kulturze.
  7. W dniu 3 dodaj 10 ml świeżej pożywki BMC zawierającej 200 ng GM-CSF do każdej szalki z komórkami. Należy zachować ostrożność, aby zminimalizować zakłócenia w działaniu komórek skoncentrowanych w zawiesinie. Całkowita objętość hodowli komórkowej wynosi teraz 20 ml.
  8. Obserwuj komórki pod mikroskopem świetlnym w 100-krotnym powiększeniu. Obserwuj liczne komórki nieprzylegające (okrągłe) i kilka komórek przylegających (płaskie). Można zobaczyć komórki w grupach po trzy lub cztery przypominające płatki kwiatu, co wskazuje na proliferację.
  9. W dniu 6 wykonaj połowiczną wymianę nośnika. Ostrożnie wyjąć 10 ml pożywki do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml, odwirowywać do 314 x g przez 5 minut, odessać i odrzucić supernatant.
  10. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml świeżej pożywki BMC zawierającej 20 ng/ml GM-CSF, delikatnie odwirować i dodać do oryginalnego naczynia do hodowli komórkowych na łączną objętość 20 ml. Obserwuj komórki pod mikroskopem.
    nuta: Hodowla dnia 7 powinna znajdować się w 70% lub więcej w zbiegu z przylegającymi płaskimi komórkami i gęstymi chmurami okrągłych, nieprzylegających komórek.

3. Zbieranie i przygotowanie BMDC i BMDM do cytometrii przepływowej

  1. Przechowywać wszystkie w temperaturze 4 °C.
  2. Zbieraj komórki od 7 do 10 dnia. Aby pobrać komórki, należy najpierw przenieść 10 ml supernatantu do stożkowej probówki zbiorczej o pojemności 50 ml, następnie przechylić naczynie w pionie o około 30 stopni i umyć naczynie, pipetując pozostałe 10 ml kultury od góry naczynia. Powtórz to pranie 5 razy, za każdym razem obracając naczynie o jedną trzecią.
  3. Przenieść pozostałe 10 ml komórek do tej samej probówki zbiorczej i wyrzucić płytkę oraz przylegające komórki.
    nuta: Mycie usunie nieprzylegające i luźno przylegające komórki; Płaskie przylegające komórki są odporne na pranie. Zazwyczaj oczekuje się, że od 5 do 10 x 106 nieprzylegających komórek z jednej płytki w 7 dniu i 2 - 5 x 106 komórek w 10 dniu, chociaż Lutz i wsp. zgłoszono 10 x 106 komórek w dniu 10. Przylegające komórki nie są zwykle pobierane. Jeśli jednak komórki te muszą zostać porównane z komórkami nieprzylegającymi, można je usunąć w następujący sposób. Dodać 5 ml 0,7 mM EDTA w 1x PBS o pH 7,4 do naczynia po usunięciu nieprzylegających komórek, inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut, pipetować w górę i w dół, aby usunąć przylegające komórki i zebrać do oddzielnej probówki.
  4. Odwirowywać zebrane komórki w temperaturze 314 x g przez 5 minut i odessać supernatant. Zawiesić ponownie w 5 ml sterylnej pożywki BMC w temperaturze 4 °C, delikatnie zmieszać i policzyć za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru.
    nuta: Z każdej szalki uzyska się 5 - 10 x 106 nieprzylegających komórek z hodowli w dniu 7. Od teraz wszystkie kroki wykonuj w temperaturze 4 °C.
  5. Do analizy metodą cytometrii przepływowej przenieść 2 x 105 komórek dla każdej próbki do 5 ml polistyrenowych probówek okrągłodennych, dodać 300 μl buforu FACS w temperaturze 4 °C (1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 2 mM EDTA i 2% albumina surowicy bydlęcej) do każdej próbki.
  6. Odwiruj komórki w temperaturze 314 x g przez 5 minut i odessaj supernatant. Obserwuj widoczny biały, nieprzezroczysty osad na dnie probówki.
  7. Zawiesić komórki w 100 μl nieznakowanego receptora Fc Ab w celu zablokowania wiązania receptora Fc (użyć 1/10 supernatantu z linii komórkowej szpiczaka 2,4G2) i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Następnie dodać 300 μl buforu FACS do każdej próbki, delikatnie odwirować, a następnie odwirować komórki w dół przy 314 x g przez 5 minut i odessać supernatant.
  8. Ponownie zawieś komórki w 100 μl CD11c-PeCy7 w stężeniu 0,2 μg/ml, Gr1-Pacific Blue w stężeniu 0,25 μg/ml, MHCII-APC w stężeniu 0,05 μg/ml i FL-HA w stężeniu około 2 μg/ml w celu identyfikacji makrofagów i DCs.
    nuta: FL-HA został przygotowany we własnym zakresie przy użyciu fluoresceiny i soli sodowej kwasu hialuronowego z grzebieniem koguta, jak opisano wcześniej21.
  9. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C, aby umożliwić związanie się z powierzchnią komórki. Dodać 300 μl buforu FACS do każdej próbki, delikatnie odwirować, a następnie wirować komórki w temperaturze 314 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant. UWAGA: Jeśli przeciwciała biotynylowane są używane w 3.8, powtórzyć 3.8 - 9 z fluorescencyjną streptawidyną.
  10. Umyć komórki kolejnymi 300 μl buforu FACS, delikatnie wirować, aby wymieszać i wirować komórki w temperaturze 314 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu FACS zawierającego 0,1 - 0,2 μg na ml jodku propidyny lub DAPI w celu oznakowania komórek niezdolnych do życia. Komórki są teraz gotowe do analizy cytometrycznejprzepływowej 22.
    nuta: Zobacz wyniki i rysunek 3, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat populacji i sposobu bramkowania komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schemat blokowy podsumowujący główne etapy tej metody przedstawiono na Rysunku 1. Gęstość i morfologia hodowli szpiku kostnego w różnych punktach czasowych hodowli przedstawiono na Rysunku 2. W 1. dniu komórki są małe i nieliczne, ale do 3. dnia liczba komórek wzrasta, niektóre stają się większe, a kilka zaczyna przylegać. Do 6. dnia widoczna jest wyraźna frakcja adherentna i nieadherentna (Rysunek 2A). Hodowlę można zebrać między 7. a 10...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym manuskrypcie przedstawiamy metodę generowania makrofagów i DC pochodzących z GM-CSF z pojedynczej hodowli szpiku kostnego myszy, która została zaadaptowana z Lutz i wsp. 6. Ekspresja MHCII i wiązanie FL-HA rozróżnia niedojrzałe DC i makrofagi w tej kulturze (patrz ryc. 3C), co wcześniej było trudne. To, wraz z innym raportem Helfta i wsp. 19, wykazuje heterogeniczność w kulturach BMDC indukowanych przez GM-CSF, które wcześniej uważano tylko za DC. Helft i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w finansowym konflikcie interesów.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (CIHR) (Grant MOP-119503) oraz Kanadyjską Radę Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC). NSERC wspierał również letnie stypendia dla Y.D. i A.A. YD jest wspierany przez University of British Columbia (UBC) z 4-letnim stypendium, AA jest wspierany przez CIHR z nagrodą magisterską dla absolwentów (CGS-M). Dziękujemy Calvinowi Roskelleyowi za pomoc przy mikroskopie użytym do wygenerowania obrazów na rysunku 2. Dziękujemy również za wsparcie ze strony Zakładów Cytometrii Zwierząt i Cytometrii Przepływowej UBC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cytometr przepływowyBD LSR-II
Automatyczny mikroskop odwrócony Leica DMI4000 B
Wirówka Thermo FisherST-40R
Szafka bezpieczeństwa biologicznegoNuaireNU-425-600
Strzykawka 1 mlBD309659
26 1/2 Gauge IgłaBD305111
50 ml Rurka stożkowa Corning357070*
Probówki Eppendorf marki Falcon (1,5 ml)CorningMCT-150-C
5 ml polistyrenowe probówki z okrągłym dnemCorning352052
Narzędzia do preparowaniaNarzędzia do nauki precyzyjnej *Różne *Nożyczki preparacyjne, kleszcz Dumont i kleszcz standardowy 
Hemocytometr Reichert1490
Sterylna 100 mm x 15 mm szalka PetriegoCorning351029*Marka Falcon
2-merkaptoetanolThermo Fisher21985-023
Chlorek amonuBDHBDH0208-500G
Albumina bydlęcaBioreagenty FisherBP1600-1
Brefeldin ASigmaB7651-5MG
EDTASigmaE5134-1KGKwas etylenodiaminotetraoctowy
Surowica bydlęcapłodu Thermo Fisher16000-044
Zbilansowany roztwór soli HankaThermo Fisher14175-095 
HEPESThermo Fisher15630-080Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy
L-GlutaminaSigmaG8540-100G
LPS UltrapureInvivogentlrl-3pelps
MEM Roztwór aminokwasów endogennych Thermo Fisher11140-050
Penicylina/Streptomycyna 100xThermo Fisher15140-122
Fosforan potasu jednozasadowyBDHBDH0268-500G
Chlorek potasuBDHBDH9258-500G
Rekombinowany GM-CSFPeprotech315-03-A
Kogut Grzebień Hialuronian sodu SigmaH5388-1G*Służy do produkcji fluoresceinowanego hialuronianu
RPMI-1640 Thermo Fisher21870-076Bez pirogronianu sodu, bez glutaminy. Ciepłe media do 37  ° C przed użyciem.
Chlorek soduFisher 5271-10   
Fosforan sodu dwuzasadowySigma50876-1 kg
Pirogronian soduSigmaP5290-100G
Tris(hydroksymetylo)aminometanBioodczynnikiFishera BP152-5
Trypan BlueSigmaT8154
Receptor anty-FC (nieznakowany), supernatant do hodowli tkankowychNieNie dotyczy Klon: 2.4G2
Anty-CD11c PeCy7eBioscience25-0114-82Klon: N418
Anty-Gr-1 efluor450eBioscience48-5931-82Klon: RB6-8C5
Anty-MHCII APCeBioscience17-5321-82Klon: M5 / 114.15.2
Biotynylowany anty-MerTKAbcamBAF591Kozia poliklonalna IgG
Streptawidyna PEeBioscience12-4317-87
Jodek propidiumSigmaP4170-25MG
DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindol)SigmaD9542-5MG
dotyczy

Bibliografia

  1. Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J Immunol. 178 (8), 5245-5252 (2007).
  2. Lari, R., et al. Macrophage lineage phenotypes and osteoclastogenesis--complexity in the control by GM-CSF and. Bone. 40 (2), 323-336 (2007).
  3. Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
  4. Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
  5. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  6. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  7. Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. J Immunol. 162 (1), 168-175 (1999).
  8. Berthier, R., Martinon-Ego, C., Laharie, A. M., Marche, P. N. A two-step culture method starting with early growth factors permits enhanced production of functional dendritic cells from murine splenocytes. J Immunol Methods. 239 (1-2), 95-107 (2000).
  9. Brasel, K., et al. Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice. Blood. 90 (9), 3781-3788 (1997).
  10. Segura, E., Amigorena, S. Inflammatory dendritic cells in mice and humans. Trends Immunol. 34 (9), 440-445 (2013).
  11. West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305 (5687), 1153-1157 (2004).
  12. Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
  13. Goodridge, H. S., et al. Activation of the innate immune receptor Dectin-1 upon formation of a 'phagocytic synapse. Nature. 472 (7344), 471-475 (2011).
  14. Shalek, A. K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation. Nature. 510 (7505), 363-369 (2014).
  15. Vander Lugt, B., et al. Transcriptional programming of dendritic cells for enhanced MHC class II antigen presentation. Nat Immunol. 15 (2), 161-167 (2014).
  16. Shibata, Y., et al. GM-CSF regulates alveolar macrophage differentiation and innate immunity in the lung through PU.1. Immunity. 15 (4), 557-567 (2001).
  17. Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and Macrophage-CSF Dependent Macrophage Responses by In Vitro Models. J Immunol. 188 (11), 5752-5765 (2012).
  18. Poon, G. F., et al. Hyaluronan Binding Identifies a Functionally Distinct Alveolar Macrophage-like Population in Bone Marrow-Derived Dendritic Cell Cultures. J Immunol. 195 (2), 632-642 (2015).
  19. Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
  20. Stockinger, B., Zal, T., Zal, A., Gray, D. B. cells solicit their own help from T cells. J. Exp. Med. 183 (3), 891-899 (1996).
  21. de Belder, A. N., Wik, K. O. Preparation and properties of fluorescein-labelled hyaluronate. Carbohydr Res. 44 (2), 251-257 (1975).
  22. Stewart, C. C., Stewart, S. J. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , Wiley, J., & Sons, Inc. Champter 6, Unit 6.2 (2001).
  23. Dearman, R. J., Cumberbatch, M., Maxwell, G., Basketter, D. A., Kimber, I. Toll-like receptor ligand activation of murine bone marrow-derived dendritic cells. Immunology. 126 (4), 475-484 (2009).
  24. Abdi, K., Singh, N. J., Matzinger, P. Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: 'Exhausted' or Alert and Waiting. J Immunol. 188 (12), 5981-5989 (2012).
  25. Contreras, I., et al. Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions. PLoS Negl Trop Dis. 8 (9), (2014).
  26. Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid. J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).
  27. Grauer, O., et al. Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique. Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).
  28. Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
  29. Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Makrofagi pochodne z GM CSFhodowla szpiku kostnegor nicowanie kom rek dendrytycznychekspresja MHCIIwi zanie FL HAkom rki CD11c dodatnieizolacja szpiku kostnegoanaliza cytometrycznaprotok hodowli kom rkowej

Powiązane artykuły