Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Transdukcja retrowirusowa komórek progenitorowych szpiku kostnego w celu wytworzenia myszy retrogenicznych receptora komórek T

9.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54196

⸱

11 lipca 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy szybki i elastyczny protokół dla systemu ekspresji in vivo opartego na pojedynczym receptorze limfocytów T (TCR). Wektory retrowirusowe są wykorzystywane do transdukcji komórek progenitorowych szpiku kostnego w celu zbadania rozwoju i funkcji pojedynczych komórek T in vivo jako alternatywy dla myszy transgenicznych TCR.

Streszczenie

Sygnalizacja receptora limfocytów T (TCR) jest niezbędna w rozwoju i różnicowaniu limfocytów T odpowiednio w grasicy i na obrzeżach. Szeroki wachlarz TCR dowodzi, że badanie specyficznej odpowiedzi antygenowej jest trudne. Dlatego transgeniczne myszy TCR zostały zmuszone do zbadania pozytywnej i negatywnej selekcji grasicy, a także aktywacji, proliferacji i tolerancji obwodowych limfocytów T. Jednak stosunkowo niewiele myszy transgenicznych TCR zostało wygenerowanych specyficznych dla danego antygenu. W związku z tym brakowało badań z udziałem TCR o różnym powinowactwie do tego samego peptydu antygenowego. Stworzenie nowej linii transgenicznej TCR może zająć sześć lub więcej miesięcy. Dodatkowo, wszelkie konkretne krzyżówki wsteczne mogą zająć dodatkowe sześć miesięcy. Aby umożliwić szybsze wytwarzanie i badania przesiewowe wielu TCR, opracowano protokół transdukcji retrowirusowej szpiku kostnego z stechiometryczną ekspresją łańcuchów TCRα i TCRβ oraz generacją myszy retrogenicznych. Każda mysz retrogeniczna jest zasadniczo założycielem, praktycznie negując efekt założyciela, podczas gdy czas generowania retrogenicznego TCR jest skrócony z sześciu miesięcy do około sześciu tygodni. Tutaj przedstawiamy szybką i elastyczną alternatywę dla transgenicznych myszy TCR, która może być wyrażana na dowolnie wybranym tle z dowolnym konkretnym TCR.

Wprowadzenie

Receptor receptorów limfocytów T (TCR) u ludzi i myszy został oszacowany na 1 x 108 i 2 x 106 unikalnych TCR odpowiednio1,2. Ta duża różnorodność pozwala limfocytom T rozpoznawać szeroką gamę epitopów antygenowych pochodzących z własnych peptydów, a także z patogenów prezentowanych przez główny kompleks zgodności tkankowej (MHC) na komórkach prezentujących antygen (APC). Subtelne różnice w oddziaływaniach TCR z unikalnymi kompleksami peptyd-MHC decydują o tym, czy limfocyt T ulegnie apoptozie, anergii, aktywacji, różnicowaniu, produkcji cytokin lub cytotoksyczności. Jednak ze względu na duży repertuar TCR, analiza tego, jak konkretny TCR zareaguje na określony antygen, wymaga zastosowania pojedynczych systemów TCR.

Różne transgeniczne myszy TCR zostały wygenerowane w celu zbadania funkcji pojedynczego TCR w modelu in vivo 3-9. Istnieją jednak zastrzeżenia dotyczące myszy transgenicznych TCR, w tym koszt, czas potrzebny na wygenerowanie pojedynczej myszy transgenicznej i tak zwany efekt założyciela losowej insercji transgenu do DNA linii zarodkowej10. W związku z tym wygenerowano stosunkowo niewiele transgenicznych myszy TCR dla danego antygenu, a funkcjonalne implikacje wysokiego i niskiego powinowactwa TCR do tego samego epitopu są rzadko poruszane. Aby zaspokoić potrzebę szybkiego podejścia do badań przesiewowych i badania wielu TCR indywidualnie lub w połączeniu, myszy retrogenne ("retro" od retrowirusa i "genetyczne" od transgenicznych) zostały wykorzystane jako alternatywa dla myszy transgenicznychTCR 11-13.

Motyw konsensusu peptydu 2A występujący w kilku wirusach składa się z 2A-Asp-Val/Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro, w którym następuje rozszczepienie między glicyną 2A a proliną 2B od aktywności hydrolazy działającej cis, co powoduje przeskakiwanie rybosomów podczas translacji10,14-16. Szczegółowy schemat przedstawiający rozszczepienie różnych peptydów 2A (F2A, E2A, T2A i P2A) znajduje się w odnośnikach 10 - 12. W ten sposób można połączyć 2 cistrony (TCR alfa i TCR beta), co skutkuje translacją stechiometryczną w jednym wektorze. Wykorzystując to podejście, jesteśmy w stanie wyrazić i bezpośrednio porównać wiele specyficznych dla antygenu TCR in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Dokładamy wszelkich starań, aby zminimalizować dyskomfort lub stres zwierząt podczas napromieniania i iniekcji do żył ogonowych. Myszy są wykorzystywane jako źródło komórek w tych eksperymentach; W związku z tym nie ma żadnych procedur ani manipulacji poza eutanazją. Myszy zostaną poddane eutanazji przez wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy w celu potwierdzenia śmierci. Procedura ta jest zgodna z zaleceniami Panelu ds. Eutanazji Amerykańskiego Towarzystwa Lekarzy Weterynaryjnych.

1. Przygotuj konstrukt retrowirusowy

  1. Subklonacja łańcuchów alfa i beta receptora komórek T (TCR), oddzielonych łącznikiem 2A, do retrowirusowego wektora11 opartego na MSCV (przykład pMIAII lub pMIGII)11.
    UWAGA: Łącznik 2A pozwala na stechiometryczną i zgodną ekspresję łańcuchów TCR alfa i beta z pojedynczej otwartej ramki odczytu. Wektor zawiera kasetę z białkiem fluorescencyjnym IRES (ametryną lub GFP), która służy do śledzenia transdukowanych komórek i wydajności transdukcji. Szczegółowy protokół można znaleźć w Holst et al.11
  2. Wyizoluj DNA plazmidu za pomocą komercyjnie uzyskanego zestawu do przygotowania osocza lub podobnego produktu. Stosować stężenie robocze 1 - 2 μg μl-1.

2. Generacja linii komórkowych producentów retrowirusów

  1. Wykorzystaj dwuetapowy proces do produkcji retrowirusowych linii komórkowych producenta.
    UWAGA: Aby uzyskać szczegółowy protokół, zobacz Holst i wsp.Rozdział 11.
    1. Wygeneruj retrowirusa przez przejściową transfekcję komórek 293T z trzema plazmidami (pVSVG, pEQ-Pam3(-E) i wektorem zainteresowania11) i weź retrowirusowy supernatant z komórek 293T w celu transdukcji ekotropowej retrowirusowej linii komórkowej GP + E86.
    2. Wyizoluj górne 40% komórek wytwarzających GP+E86 z ekspresją fluorescencyjną za pomocą FACS i rozmnażaj transdcuced-GP+E86 komórki produkcyjne jako źródło wirusa.
      UWAGA: Wytwarzanie producentów o wysokim mianie ma kluczowe znaczenie dla wydajnej transdukcji komórek szpiku kostnego. Aby zapoznać się z pełnym protokołem, zapoznaj się z Holst et al.11

3. Transfer genów komórek macierzystych za pośrednictwem retrowirusa (Dzień -5)

  1. Rozmrozić i wyhodować 0,5 -1,0 x 106 każdej linii komórkowej producenta GP+E86 w kompletnym DMEM 10% (vol/vol) FBS, aby umożliwić wystarczający wzrost dla dwóch zlewających się płytek 150-mm do dnia 0 tego protokołu.
    UWAGA: Rozmrożenie 0,5 - 1,0 x 106 każdej linii komórkowej producenta GP+E86 na 10-centymetrowej płytce pozwoli na 30 - 50% konfluencję w dniu 5. Pozwala to również na 5 dni hodowli w celu rozszerzenia linii komórkowych producentów GP+E86 do dwóch zlewających się płytek o średnicy 150 mm do dnia 0.
    1. Hodowla retrowirusowej linii komórkowej producenta w kompletnych pożywkach do hodowli tkankowych zawierających 5% surowicy cielęcej fety i cyprofloksacynę (10 μg/ml) w celu uniknięcia zanieczyszczenia mykoplazmą.
      UWAGA: Należy przerwać stosowanie cyprofloksacyny podczas wytwarzania supernatantu wirusa do transdukcji szpiku kostnego. Należy unikać nadmiernego wzrostu linii komórkowej producenta, ponieważ wpłynie to negatywnie na wydajność transdukcji szpiku kostnego.

4. Wstrzyknij myszom-dawcom 5-Fluorouracyl (5-FU) (Dzień -3)

  1. Zważ myszy dawców (w wieku od 5 do 12 tygodni), aby określić wymaganą ilość 5-FU. Używanie myszy w wieku poniżej 5 tygodni powoduje niską wydajność szpiku kostnego. Aby zapewnić ekspresję pojedynczego TCR, jako dawców szpiku kostnego należy użyć szczepu myszy z niedoborem limfocytów T, takiego jak myszy z niedoborem SCID, RAG lub TCR alfa.
  2. Pracując w kapturze do hodowli tkankowej, rozcieńczyć 5-FU sterylnym PBS, aby uzyskać wystarczającą ilość 10 mg ml-1 roztworu roboczego 5-FU, aby dostarczyć 0,15 mg 5-FU na gram masy ciała.
  3. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 37 G wstrzyknąć dootrzewnowo 0,15 mg 5-FU na gram masy ciała na mysz dawcę.
    UWAGA: Użyj 1 myszy dawcy na jednego biorcę, aby rozpocząć i dostosować liczbę myszy dawców zgodnie z wydajnością komórek. Alternatywną metodą leczenia 5-FU w celu wzbogacenia i wyizolowania komórek progenitorowych szpiku kostnego jest ujemna selekcja komórek dodatnich w linii, jak opisano w Viret i wsp.

5. Procedura ekstrakcji szpiku kostnego (Dzień 0)

  1. Zaopatrz się w nożyczki preparacyjne i kleszcze do izolacji kości. Przygotować pożywkę (HBSS uzupełnioną o 5% FCS (obj./ob.)) w celu zebrania kości w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Przechowywać 50 ml stożkowego podłoża zawierającego na lodzie. Eutanazja myszy przez wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy w celu potwierdzenia śmierci. Uszczypnij łapę, aby upewnić się, że nie zostaną wykryte żadne odruchy.
  2. Wysterylizuj miejsce operacyjne i narzędzia chirurgiczne etanolem lub metanolem. Ostrożnie usuń kość udową, piszczelową, kość ramienną i obręcz miedniczną, najpierw przecinając obręcz miedniczną i pod nią. Przyciąć z powrotem wzdłuż kości udowej do kości piszczelowej. Usuń wszystkie otaczające tkanki za pomocą nożyczek i kleszczy, aby uzyskać czyste kości. Utrzymuj nawodnienie kości w HBSS + 5% (vol/vol) FBS.
  3. Oddziel kości, przecinając stawy, upewniając się, że odciąłeś oba końce każdej kości. Wprowadzić igłę o rozmiarze 25 dołączoną do 10-milimetrowej strzykawki zawierającej HBSS + 5% (obj./obj.) FBS. Zastosuj nacisk i przepłucz cały szpik kostny przez sitko o średnicy 70 μm spoczywające w stożku o pojemności 50 ml.
  4. Okresowo przepychać szpik kostny przez filtr 70 μm za pomocą tłoka ze strzykawki o pojemności 1 ml lub 3 ml. Przepłukać sitko HBSS + 5% (vol/vol) FBS. Zapewni to zawiesinę pojedynczej komórki, która jest wolna od fragmentów kości i tkanek. Utrzymuj sterylność komórek, wykonując zabieg w sterylnym kapturze.
  5. Odwirować komórki szpiku kostnego w temperaturze 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.

6. Posiew szpiku kostnego (Dzień 0)

  1. Zdekantować lub odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml buforu do czerwonej krwi na bazie chlorku amonu (lub równoważnika buforu do lizy RBC) w 50 ml probówce stożkowej. Po 1 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej wygasić bufor do lizy krwinek czerwonych, dodając 10 ml kompletnego DMEM 20% (vol/vol) FBS.
  2. Odwirować komórki przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Zdekantować lub odessać supernatant i ponownie zawiesić szpik kostny w 5 ml kompletnego DMEM 20% (vol/vol) FBS. Policz komórki za pomocą komory liczącej Neubauera.
    UWAGA: Ogólna wydajność powinna wynosić około 5 - 10 x 106 komórek na mysz; Jednak wydajność może się różnić w zależności od różnych szczepów myszy.
  4. Płytki komórek szpiku kostnego o gęstości 4 x 10 7 komórek na płytkę 150 mm w 30 ml kompletnego DMEM 20% (vol/vol) FBS uzupełnionego IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1) i SCF (50 g ml-1).
    UWAGA: Używaj świeżo rozmrożonych cytokin. Nie należy stosować cytokin, które zostały zamrożone i rozmrożone więcej niż jeden raz lub przechowywane w temperaturze 4 °C przez ponad 2 tygodnie.
  5. Szpik kostny inkubować przez noc (około 24 godzin) w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .

7. Retrowirusowa hodowla komórkowa producenta (Dzień 0)

  1. Płytka: 3 x 10,6 retrowirusowych komórek producenckich na płytce 150 mm w 18 ml kompletnym DMEM 20% (vol/vol) FBS.
  2. Inkubować retrowirusowe komórki produkcyjne w temperaturze 37 °C przez noc. Należy przewidzieć jedną 150-milimetrową płytkę na 15 milionów komórek szpiku kostnego (około 2-3 myszy dawcy).

8. Retrowirusowy supernatant (Dzień 1)

  1. Następnego dnia (około 24 godziny później) należy pobrać retrowirusowy supernatant z płytek producenta (ustawionych w kroku 7), pobierając retrowirusowy supernatant bezpośrednio z płytki o średnicy 150 mm za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i filtrując za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μm.
  2. Ostrożnie zastąpić usunięty retrowirusowy supernatant 18 ml świeżego kompletnego DMEM 20% (vol/vol) FBS.
  3. Uzupełnić przefiltrowany supernatant retrowirusowy IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1), MSCF (50 g ml-1) i bromkiem heksadimetryny (polibren) (6 μg ml-1).
    UWAGA: Bromek heksadimetryny powinien być świeży co 2 miesiące, aby uniknąć spadku skuteczności transdukcji retrowirusowej.

9. Pobieranie szpiku kostnego (Dzień 1)

  1. Po wykonaniu kroku 8.3 należy pobrać komórki szpiku kostnego z kroku 6.4 i przenieść podłoże zawierające nieprzylegające komórki do sterylnych probówek o pojemności 50 ml.
  2. Energicznie umyć płytki 10 ml PBS i zebrać w 50 ml stożkowym roztworze z kroku 9.1. W razie potrzeby powtórz krok prania.
  3. Odwirować komórki przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, zdekantować supernatant, ponownie zawiesić komórki w małej objętości (1 - 3 ml) pełnego DMEM 20% (vol/vol) FBS i policzyć. Spodziewaj się 50 - 75% powrotu do zdrowia od dnia 0. Zawiesić szpik kostny w stężeniach 1 x 106 komórek na 1 ml retrowirusowego supernatantu zawierającego cytokiny i bromek heksadimetryny.

10. Transdukcja szpiku kostnego (Dzień 1)

  1. Mieszaninę retronatywnego supernatantu i szpiku kostnego należy umieścić na płytce w objętości 3 ml na basenik na sześciodołkowej płytce do hodowli tkankowej. Owiń płytki folią spożywczą, aby zminimalizować wymianę gazu podczas wirowania w kroku 10.2.
  2. Wirować owinięte płytki sześciodołkowe w temperaturze 1 000 x g przez 60 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Po zakończeniu wirowania zdejmij folię i umieść płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °CCO 2 na 24 godziny.

11. Retrowirusowy supernatant i transdukcja (Dzień 2)

  1. Po 24 godzinach pobrać świeży supernatant wirusa z linii komórkowej producenta wirusa. Przefiltrować retrowirusowy supernatant za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i filtra strzykawkowego 0,45 μm. Uzupełnić przefiltrowany supernatant retrowirusowy o IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1) i SCF (50 g ml-1) oraz bromek heksadimetryny (6 g ml-1).
  2. Następnie ostrożnie wyjąć pipetą lub odessać górne 2 ml pożywki z każdej studzienki sześciodołkowej płytki zawierającej komórki szpiku kostnego.
    UWAGA: Pracuj ostrożnie, aby nie zassać szpiku kostnego, który zwykle jest skoncentrowany w środku studzienki. Alternatywnie, usunięty supernatant można odwirować w celu odzyskania utraconych komórek szpiku kostnego.
  3. Do każdej studzienki w 6-dołkowej płytce szpiku kostnego dodać 3 ml świeżego supernatantu wirusowego zawierającego cytokiny i bromek heksadimetryny. Owinąć płytki folią i powtórzyć transdukcję wirowania przy 1 000 x g przez 60 minut w temperaturze 37 °C. Rozpakować płytki i inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc (około 24 godziny).

12. Dodanie świeżo uzupełnionego DMEM (Dzień 3)

  1. Po upływie 24 godzin wyjąć górne 2 ml pożywki z każdej studzienki sześciodołkowej płytki zawierającej komórki szpiku kostnego, jak w kroku 11.2. Zastąp usunięte podłoże świeżym DMEM 20% (vol/vol) FBS uzupełnionym końcowymi stężeniami IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1) i SCF (50 g ml-1).
  2. Inkubować płytki szpiku kostnego w inkubatorze CO 2 o temperaturze 37 °Cprzez kolejne 24 godziny.

13. Żniwo transdukowanego szpiku kostnego (Dzień 4)

  1. Po 24 godzinach należy pobrać komórki szpiku kostnego z płytek sześciodołkowych. Energicznie umyj płytki PBS, aby usunąć wszystkie nieprzylegające komórki.
    1. Odwirować komórki przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zdekantować supernatant.
    2. Zawiesić szpik kostny w małej objętości (1 ml) PBS + 0,5% (vol/vol) inaktywowanego termicznie FBS. Utrzymuj komórki na lodzie.
  2. Pobrać 10 μl próbki każdego stanu szpiku kostnego i policzyć komórki za pomocą komory zliczającej Neubauera. Zakładając 1 - 2 dawców na biorcę, wydajność będzie wystarczająca do przeniesienia co najmniej 4 x 106 komórek na mysz biorcy. Ponownie zawiesić szpik kostny w wystarczającej objętości PBS + 0,5% (vol/vol) inaktywowanego termicznie FBS, aby wstrzyknąć 200 - 300 μl na mysz.
    1. Wstrzyknąć dożylnie co najmniej 2 x 106 komórek o skuteczności transdukcji 25% (można wstrzyknąć do 8 x 106 komórek) na mysz.
      UWAGA: Rutynowo wstrzykujemy pięć myszy biorców na dwie 6-dołkowe płytki komórek szpiku kostnego. Jeśli wydajność jest znacznie niższa, należy użyć większej liczby myszy dawców, aż do uzyskania wystarczającej liczby szpiku kostnego. W celu uzyskania optymalnej rekonstytucji, każdemu biorcy należy wstrzyknąć co najmniej 5 x 105 transdukowanych (fluorescencyjnie dodatnich).
  3. Za pomocą mikropipetora pobrać 10 μl próbki każdego stanu szpiku kostnego i przeanalizować wydajność transdukcji za pomocą cytometrii przepływowej w oparciu o ekspresję markera fluorescencyjnego (ryc. 1A)11,
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, odsetek komórek fluorescencyjnie dodatnich wynosi od 25% do 70%, w zależności od konstrukcji i miana retrowirusa. Liczba transdukowanych komórek szpiku kostnego niezbędnych do odtworzenia myszy napromieniowanej subletalnie może się różnić w zależności od wydajności transdukcji. Im niższa wydajność transdukcji, tym więcej komórek szpiku kostnego jest potrzebnych i odwrotnie, im wyższa skuteczność transdukcji szpiku kostnego, tym mniejsza liczba komórek potrzebnych do rekonstytucji. Skuteczność transdukcji poniżej 25% jest nieoptymalna i może prowadzić do niewystarczającej rekonstytucji i przeżycia. Aby zapewnić optymalną regenerację szpiku kostnego i wydajność transdukcji, należy używać świeżo przygotowanych pożywek do hodowli tkankowych i cytokin. Podczas ekspresji nowego TCR z wykorzystaniem systemu retrogenicznego, wybór tego TCR in vivo jest nieznany. W zależności od indywidualnego powinowactwa do TCR, selekcja TCR w grasicy i ekspresji obwodowych limfocytów T będzie się różnić17.

14. Napromienianie myszy, iniekcja szpiku kostnego i pielęgnacja

  1. Napromieniać myszy dzień przed wstrzyknięciem szpiku kostnego (tego samego dnia, co krok 13). Stosować następujące dawki: myszy C57BL/6 (i inne szczepy typu dzikiego), 900 radów; Szmaciane myszy 1-/-, 500 radów; myszy SCID, 300 radów).
    1. Umieścić myszy biorcze na amoksycylinie (50 mg/kg/dobę) lub innym antybiotykowym leczeniu wodą przed napromienianiem i utrzymywać antybiotyki przez pierwsze dwa tygodnie po wstrzyknięciu szpiku kostnego.
      UWAGA: Optymalna dawka napromieniania może wymagać empirycznego określenia.
  2. Do wstrzyknięcia należy załadować komórki z kroku 13.1 do strzykawki o pojemności 1 ml za pomocą igieł bezpośrednio przed wstrzyknięciem, a następnie zmienić igłę na 27 do wstrzykiwań, usunąć powietrze, aby uniknąć zatoru powietrznego. Podgrzej myszy pod lampą grzewczą i wstrzyknij dożylnie 0,2 ml szpiku kostnego na mysz.
    UWAGA: Nie pozwól, aby komórki pozostawały w strzykawce przez dłuższy czas, ponieważ komórki osiądą.
  3. Monitoruj myszy co tydzień, aby upewnić się, że pozostają zdrowe.
  4. Po 5-6 tygodniach należy wykrwawić myszy, aby sprawdzić rekonstytucję na podstawie koekspresji GFP+/ametrine+ i TCR (Figura 1B)11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wydajność transdukcji szpiku kostnego jest sprawdzana w kroku 13.3 protokołu przed wstrzyknięciem szpiku do żyły ogonowej drogą dożylną (i.v.). Na reprezentatywnym rysunku przedstawiającym transdukcję szpiku kostnego (Rycina 1A) około 10 μl pobranego szpiku kostnego dodano do 10 μl PBS i przeanalizowano pod kątem ekspresji ametryny. Zazwyczaj odsetek komórek fluorescencyjnie dodatnich wynosi od 25% do 70%, w zależności od konstruktu i miana retrowirusa. Po 6 tygodniach od...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W protokole wyszczególniamy kilka kluczowych kroków w celu zapewnienia optymalnego zdrowia szpiku kostnego, wydajności transdukcji i rekonstytucji. Pierwszym krytycznym krokiem jest wytworzenie i właściwe utrzymanie komórek produkcyjnych wirusa GP+E86. Używaj linii komórkowych wytwarzających wczesne pasaże i utrzymuj konfluencję na poziomie 80% lub niższym przed użyciem. Tworząc świeże komórki produkcyjne wirusa GP+E86, upewnij się, że komórki 293T wcześnie pasują i rosną w kulturze przez 24 - 48 godzin. Posiew zbyt wiel...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z NIH (5K22A1119151-01 i 1R56DK104903-01) dla M.L.B, Pilot/Feasibility Program of the Diabetes Research Center (P30-DK079638) at BCM, JDRF 1-FAC-2014-243-A-N APF, ADA 1-15-JF-07, AAI Careers in Immunology Fellowship to M.B. oraz The Robert and Janice McNair Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM, wysoka glukoza + glutaminaCorning Cellgro10-013-CVModyfikacja Eagle's Medium firmy Dulbecco z 4,5 g/L glukozy, L-glutaminą i pirogronianem sodu
FBSAtlanta BiologicalS11550
Trypsyna-VerseneLonza17-161F
0,45 i #181; m filtr strzykawkowyThermo Scientific194-2545
polybreneSigmaH9268-10GSterylny filtrowany w dH2O
Ciprofloksacyna VWRAAJ61970-06
5-fluorouracyl (5-FU)VWRAAA13456-06
Pirogronian soduCorning Cellgro25-000-CI
MEM Aminokwasy endogenneCorning Cellgro25-025-CI
HEPES 1 M roztwórCorning Cellgro25-060-CI
2-merkaptoetanolGibco firmy Life Technologies21985-023
Pen/StreptCorning Cellgro30-002-CI
L-glutaminaCorning Cellgro25-005-CI
150 mm szalki do hodowli tkankowychGreiner Bio-one639160
Płaska płytka 6-dołkowa poddana kulturze TisueGreiner Bio-one657160
70 µ m nylonowe sitka komórkoweFalcon352350
Mysz IL-3InvitrogenPMC0033
Human IL-6Invitrogen 
Czynnik macierzysty myszyInvitrogenPMC2113L
10x PBSCorning Cellgro46-D13-CM
HANKS BuforCorning Cellgro21020147
BD 10 ml StrzykawkaBD300912
BD 1 ml StrzykawkaBD309659
27 G x 1/2 BD Precyzyjna igła do ślizguBD
30 G x 1/2 BD Igła do precyzyjnego ślizguBD305106
PHC0063305109

Bibliografia

  1. Qi, Q., et al. Diversity and clonal selection in the human T-cell repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13139-13144 (2014).
  2. Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D., Schoettle, L. N., Blattman, J. N., Antia, R. Estimating the diversity, completeness, and cross-reactivity of the T cell repertoire. Frontiers in immunology. 4, 485(2013).
  3. Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
  4. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  5. Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J Exp Med. 186, 1663-1676 (1997).
  6. Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
  7. Pauza, M. E., et al. T-cell receptor transgenic response to an endogenous polymorphic autoantigen determines susceptibility to diabetes. Diabetes. 53, 978-988 (2004).
  8. Jasinski, J. M., et al. Transgenic insulin (B:9-23) T-cell receptor mice develop autoimmune diabetes dependent upon RAG genotype, H-2g7 homozygosity, and insulin 2 gene knockout. Diabetes. 55, 1978-1984 (2006).
  9. Kersh, G. J., et al. TCR transgenic mice in which usage of transgenic alpha- and beta-chains is highly dependent on the level of selecting ligand. Journal of immunology. 161, 585-593 (1998).
  10. Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. TCR retrogenic mice: A rapid, flexible alternative to TCR transgenic mice. Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).
  11. Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).
  12. Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice. Nat Methods. 3, 191-197 (2006).
  13. Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer. Nat Protoc. 8, 1837-1840 (2013).
  14. Donnelly, M. L., et al. Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein 'cleavage' mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal 'skip'. J Gen Virol. 82, 1013-1025 (2001).
  15. Atkins, J. F., et al. A case for "StopGo": reprogramming translation to augment codon meaning of GGN by promoting unconventional termination (Stop) after addition of glycine and then allowing continued translation (Go). RNA. 13, 803-810 (2007).
  16. Doronina, V. A., et al. Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon. Mol Cell Biol. 28, 4227-4239 (2008).
  17. Bettini, M., et al. TCR affinity and tolerance mechanisms converge to shape T cell diabetogenic potential. Journal of immunology. 193, 571-579 (2014).
  18. Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. J Immunol Methods. 410, 3-17 (2014).
  19. Brehm, M. A., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized mouse models to study human diseases. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 17, 120-125 (2010).
  20. Chaplin, P. J., et al. Production of interleukin-12 as a self-processing 2A polypeptide. J Interferon Cytokine Res. 19, 235-241 (1999).
  21. Collison, L. W., et al. The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function. Nature. 450, 566-569 (2007).
  22. Holst, J., et al. Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity. Nature immunology. 9, 658-666 (2008).
  23. Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci Transl Med. 3, 95ra73(2011).
  24. VanSeggelen, H., et al. T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice. Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Łańcuchy alfa i beta TCRmotyw peptydowy 2Aekstrakcja szpiku kostnegolizy erytrocytówanaliza cytometrycznazbiór supernatantu wirusowegoprotokół transdukcji przez wirowanie
Transdukcja retrowirusowa komórek progenitorowych szpiku kostnego w celu wytworzenia myszy retrogenicznych receptora komórek T
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.