Artykuł metodologiczny

Szybka, wysokoprzepustowa identyfikacja gatunków materiału botanicznego za pomocą bezpośredniej analizy w czasie rzeczywistym Spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości

DOI:

10.3791/54197

⸱

2 października 2016

 , 
1Department of Chemistry, University at Albany-SUNY

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono metodę identyfikacji gatunków materiału botanicznego poprzez bezpośrednią analizę w czasie rzeczywistym - spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości i wielowymiarowa analiza statystyczna.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazujemy, że bezpośrednia analiza w spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym może być wykorzystana do tworzenia masowych profili spektralnych materiału botanicznego, i że te chemiczne odciski palców mogą być używane do identyfikacji gatunków roślin. Dane spektralne mas mogą być pozyskiwane szybko i w sposób wysokoprzepustowy bez konieczności ekstrakcji próbki, derywatyzacji lub etapów regulacji pH. Zastosowanie tej techniki pozwala uniknąć wyzwań związanych z bardziej konwencjonalnymi technikami, w tym długiego czasu analizy chromatograficznej i metod wymagających dużej ilości zasobów. Wysoka przepustowość bezpośredniej analizy w protokole spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym, w połączeniu z wielowymiarowym przetwarzaniem danych w ramach analizy statystycznej, zapewnia nie tylko charakterystykę klas roślin, ale także informacje o gatunkach i odmianach. W tym przypadku technika ta została zademonstrowana na dwóch psychoaktywnych produktach roślinnych, Mitragyna speciosa (Kratom) i Datura (Jimsonweed), które poddano bezpośredniej analizie w spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym, a następnie analizie statystycznej przetwarzania danych widma masowego. Zastosowanie tych narzędzi w połączeniu umożliwiło szybką identyfikację materiałów roślinnych na poziomie różnorodności i gatunków.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przez tysiąclecia, naturalne produkty psychoaktywne były używane w szamańskich rytuałach, nadużywane ze względu na ich właściwości zmieniające umysł i spożywane ze względu na ich właściwości lecznicze. Spożycie tych roślin i pokrewnych substancji pochodzenia roślinnego może mieć znaczenie na obszarach, na których są one endemiczne, a także mają znaczenie społeczne i gospodarcze. Ostatnio jednak nastąpił dramatyczny wzrost stosowania tych "naturalnych" narkotyków ze względu na łatwość dostępu do nich za pośrednictwem handlu internetowego. Przekonanie, że substancje te są bezpieczne w użyciu, w połączeniu ze zwiększonymi represjami wobec posiadania i używania bardziej tradycyjnych narkotyków i substancji syntetycznych, przyczyniło się do gwałtownego wzrostu nadużywania narkotyków pochodzenia roślinnego. Na ogół trudno jest odróżnić te produkty od nieszkodliwego materiału roślinnego za pomocą wizualizacji, dlatego istnieje zainteresowanie opracowaniem metod, które można zastosować do identyfikacji tych produktów. Jednak konwencjonalne metody analityczne do identyfikacji gatunków roślin są czasochłonne i niepraktyczne do wykonania. Co więcej, proces opracowywania metod jest czasochłonny i zasobożerny. Czynniki te sprawiły, że tworzenie przepisów mających na celu ograniczenie stosowania tych substancji pozostaje daleko w tyle za tempem eskalacji ich nadużywania. W związku z tym istnieje niewiele praw, które regulują produkcję, wytwarzanie, sprzedaż i konsumpcję wielu z tych naturalnych substancji psychoaktywnych, w związku z czym istnieją setki roślin nadużywania dostępnych dla użytkowników w tysiącach różnych form. 1,2

Dwa takie roślinne narkotyki to Mitragyna speciosa, powszechnie znana jako Kratom, oraz rośliny z rodzaju Datura, a mianowicie D. stramonium, D. ferox i D. inoxia. Kratom i Datura są nieplanowane w Stanach Zjednoczonych, ale Drug Enforcement Administration umieścił oba jako leki budzące obawy. 3,4 Kratom charakteryzuje się obecnością związków psychoaktywnych mitragyniny i 7-hydroksymitragyniny, a także innych niepsychoaktywnych alkaloidów, w tym mitrafiliny, paynantheiny, korynokseiny i rynchofiliny. 4-8 Właściwości psychoaktywne Datura spp. przypisuje się atropinie i skopolaminie, ale w roślinach zidentyfikowano wiele innych alkaloidów tropanowych. Zarówno Kratom, jak i Datura były zamieszane w zatrucia i zgony, a ich identyfikacja jest coraz bardziej konieczna zarówno w kontekście sądowym, jak i toksykologicznym, ponieważ nadużywanie tych produktów rośnie. 13-16

Ogólnie rzecz biorąc, tradycyjne metody używane do analizy materiału kryminalistycznego narkotyków, takie jak testy kolorów, mikroskopia oraz spektroskopia Ramana i podczerwieni, są używane w charakterze domniemanego reguły/wykluczenia. Techniki z łącznikami, takie jak GC-MS i chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (LC-MS), są metodami analizy konfirmacyjnej opartymi na porównaniu profili wykrytych analitów ze standardami bibliotecznymi Naukowej Grupy Roboczej ds. Analizy Skonfiskowanych Narkotyków (SWGDRUG). 17 Etapy obróbki próbki, które są wykonywane przed analizą, w tym sproszkowanie, ekstrakcja, derywatyzacja i odparowanie, mogą wydłużyć czas pracy i zafałszować próbkę,9,11,18,19 sprawiając, że analiza leków botanicznych jest mniej niż prosta w porównaniu z innymi tradycyjnymi narkotykami, takimi jak kokaina lub heroina. Co więcej, dla każdego produktu będącego przedmiotem zainteresowania należy opracować indywidualne programy chromatograficzne, co sprawia, że implementacja standardowych protokołów operacyjnych dla każdego gatunku lub odmiany nadużywanego narkotyku roślinnego jest wysoce niepraktyczna w rutynowych badaniach.

Bezpośrednia analiza w spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym to technika spektrometrii mas z jonizacją otoczenia, która pozwala obejść niektóre wyzwania związane z konwencjonalnymi metodami analitycznymi. Gazy, ciecze, ciała stałe, proszki, płytki TLC i materiał roślinny mogą być analizowane bezpośrednio za pomocą bezpośredniej analizy w spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym, a zarówno związki polarne, jak i niepolarne można łatwo wykryć w złożonych matrycach. 20-22 Ponadto badania wykazały, że związki psychoaktywne można szybko zidentyfikować w materiale roślinnym poprzez bezpośrednią analizę w spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym, a informacje dotyczące poszczególnych gatunków można uzyskać dzięki statystycznemu przetwarzaniu danych widma masowego. 22-26

Tutaj pokazujemy, że bezpośrednia analiza w spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym może być wykorzystana do szybkiej oceny różnych materiałów roślinnych (np. roślin, proszków, ekstraktów i nasion) pod kątem ich składników psychoaktywnych, oraz że gatunki i odmiany produktów pochodzenia roślinnego mogą być określane w szybki i wysokoprzepustowy sposób. Przedstawiono analizę materiału botanicznego istotnego z punktu widzenia kryminalistyki bez konieczności przeprowadzania etapów przygotowania próbki lub długiego czasu trwania analizy chromatograficznej, a także identyfikację gatunków roślin.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie materiałów roślinnych

  1. Kratom świeży materiał liści
    1. Użyj dziurkacza o średnicy 6 mm, aby stworzyć jednolite kawałki materiału z liści Kratom z rośliny M. speciosa. Powtórz 5 razy.
  2. Ekstrakcja proszku kratom
    1. Zmieszać 5 ml etanolu i 5 ml wody destylowanej, aby uzyskać mieszaninę rozpuszczalników 1:1 do ekstrakcji.
    2. W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml zawiesić niewielką ilość (~ 5 mg) proszku Kratom Bali w 1 ml mieszaniny rozpuszczalnika 1:1 EtOH:H 2O. Powtórz 5 razy.
    3. Sonikować próbki ekstraktu z proszku Kratom Bali w kąpieli ultradźwiękowej przez 30 minut w temperaturze otoczenia.
    4. Odwirować próbki ekstraktu w proszku Kratom Bali przez 2 minuty przy 750 x g w temperaturze otoczenia.
    5. Zdekantować rozpuszczalnik z pozostałości proszku do dalszej analizy.
  3. Przygotowanie nasion datury
    1. Pokrój nasiona D. stramonium na pół w poprzek płaszczyzny poprzecznej za pomocą żyletki. Powtórz przy użyciu 5 różnych nasion.
    2. Powtórz dla nasion D. inoxia i D. ferox.

2. Bezpośrednia analiza parametrów źródła jonów w czasie rzeczywistym

  1. Temperatura nagrzewnicy gazowej
    1. Ustaw temperaturę nagrzewnicy gazowej źródła jonów na 350 °C.
  2. Tryb jonowy
    1. Analizę należy przeprowadzić w trybie jonów dodatnich przy napięciu sieciowym 250 V.
  3. Natężenie przepływu helu gazowego
    1. Ustaw natężenie przepływu helu gazowego na 2.0 l/sek.

3. Parametry spektrometru masowego czasu przelotu

  1. Napięcia kryzy
    1. Ustaw napięcie kryzy 1 na 20 V, a napięcie kryzy 2 na 5 V.
  2. Soczewka pierścieniowa i napięcie szczytowe
    1. Ustaw napięcie soczewki pierścieniowej na 5 V i zmień napięcie szczytowe na 600 V.
  3. Akwizycja widma mas
    1. Ustaw szybkość akwizycji widma masowego na 1 widmo na sekundę w zakresie mas m/z 60-800.
  4. Zdolność rozdzielcza spektrometru mas
    1. Ustaw zdolność rozdzielczą spektrometru mas na 6000 FWHM.

4. Analiza materiałów roślinnych

  1. Analiza liścia kratomu
    1. Naciśnij "Start Run" w oprogramowaniu sterującym spektrometrem mas. Zawiesić czad materiału roślinnego między źródłem jonów a wlotem spektrometru mas (około 2 cm od wlotu) za pomocą pęsety, aż do uzyskania widma. Powtórz 5 razy z oddzielnymi kawałkami materiału roślinnego.
    2. Skalibruj widmo za pomocą glikolu polietylenowego 600 (PEG).
      1. Zanurz zamknięty koniec rurki kapilarnej do pomiaru temperatury topnienia w wzorcu PEG. Zawiesić powlekaną kapilarnę między źródłem jonów a wlotem spektrometru masowego.
    3. Po przeanalizowaniu standardu PEG należy wybrać przycisk "Stop", aby zakończyć przebieg analityczny.
    4. Naciśnij "Start Run" w oprogramowaniu sterującym spektrometrem mas. Zawiesić niewielką ilość wysuszonego materiału liściowego między źródłem jonów a wlotem spektrometru mas za pomocą pęsety, aż do uzyskania widma. Powtórz 5 razy, za każdym razem analizując nowy materiał roślinny.
    5. Skalibruj widmo za pomocą PEG.
      1. Zanurz zamknięty koniec kapilary w standardzie PEG. Zawiesić powlekaną kapilarnę między źródłem jonów a wlotem spektrometru masowego.
    6. Po przeanalizowaniu standardu PEG należy wybrać przycisk "Stop", aby zakończyć przebieg analityczny.
  2. Analiza proszku Kratom
    1. Naciśnij "Start Run" w oprogramowaniu sterującym spektrometrem mas. Zanurz zamknięty koniec kapilary o temperaturze topnienia w proszku Kratom.
    2. Zawiesić powlekaną kapilarnę między źródłem jonów a wlotem spektrometru masowego do momentu uzyskania widma. Powtórz analizę 5 razy z nową kapilarą za każdym razem.
    3. Skalibruj widmo za pomocą PEG.
      1. Zanurz zamknięty koniec kapilary w standardzie PEG. Zawiesić powlekaną kapilarnę między źródłem jonów a wlotem spektrometru masowego.
    4. Po przeanalizowaniu standardu PEG należy wybrać przycisk "Stop", aby zakończyć przebieg analityczny.
  3. Analiza ekstraktu z kratomu
    1. Zanurz zamknięty koniec rurki kapilarnej w ekstrakcie.
    2. Zawiesić rurkę kapilarną w uchwycie na 12 próbek na szynie liniowej przymocowanej do spektrometru mas. Powtórz 5 razy z innym ekstraktem za każdym razem.
    3. Naciśnij "Start Run" w oprogramowaniu sterującym spektrometrem mas. Korzystając z panelu sterowania, wybierz przycisk ">", aby przesuwać szynę liniową przez strumień jonów z prędkością 1 mm/s w celu zebrania widm.
    4. Skalibruj widmo za pomocą PEG.
      1. Zanurz zamknięty koniec kapilary w standardzie PEG. Zawiesić powlekaną kapilarnę między źródłem jonów a wlotem spektrometru masowego.
    5. Po przeanalizowaniu standardu PEG należy wybrać przycisk "Stop", aby zakończyć przebieg analityczny.
  4. Analiza nasion Datura
    1. Naciśnij "Start Run" w oprogramowaniu sterującym spektrometrem mas. Zawiesić połówkę nasion Datury między źródłem jonów a wlotem spektrometru mas za pomocą pęsety, aż do zebrania widma. Upewnij się, że strona cięcia jest zorientowana w stronę źródła jonów. Powtórz 5 razy, za każdym razem analizując nową połówkę nasion.
    2. Skalibruj widmo za pomocą PEG.
      1. Zanurz zamknięty koniec kapilary w standardzie PEG. Zawiesić powlekaną kapilarnę między źródłem jonów a wlotem spektrometru masowego.
    3. Po przeanalizowaniu standardu PEG należy wybrać przycisk "Stop", aby zakończyć przebieg analityczny.
    4. Powtórzyć kroki 4.4.1–4.4.3 dla każdego gatunku datury.

5. Przetwarzanie danych

  1. Tłumaczenie plików danych
    1. W oprogramowaniu do przetwarzania danych wybierz Plik, "Przetłumacz pliki DART" z włączoną "automatyczną kalibracją", aby utworzyć skalibrowane pliki danych.
    2. Kliknij lewym przyciskiem myszy i przeciągnij ramkę wokół pierwszego piku na chromatogramie i wybierz "Średnia", aby utworzyć uśrednione widmo.
    3. Kliknij prawym przyciskiem myszy i przeciągnij ramkę wokół obszaru, w którym nie pobrano próbki, a następnie wybierz "Uśrednij całe pole jako tło", aby odjąć tło od uśrednionego spektrum.
    4. Zapisz widmo masowe jako plik .txt.
    5. Powtórzyć kroki 5.1.1-5.1.4 dla każdego piku na chromatogramie, aby utworzyć uśrednione widmo dla każdej kontrpróby w pliku.
    6. Powtórz kroki 5.1.2-5.1.5 dla każdego zebranego pliku.

6. Analiza statystyczna

  1. Analiza głównych składowych
    1. W sekcji Klasyfikacja oprogramowania do analizy spektralnej (patrz Lista materiałów), w zakładce "Konfiguracja" utwórz klasy do przetwarzania danych, wybierając opcję "Dodaj klasę".
    2. Zaimportuj pliki tekstowe z danymi, wybierając opcję "Dodaj plik(i)".
    3. Przypisz pliki danych do odpowiedniej klasy zakładu, wybierając pliki tekstowe i "Ustaw klasę dla wybranych plików".
    4. Wybierz masy elementów do dyskryminacji z MS z zestawu treningowego i ustaw próg % na 1%.
    5. Ustaw tolerancję masy (mmu) na 10 i wybierz opcję "Buduj wektory z plików danych".
    6. W sekcji "Obliczenia" przeprowadź analizę składowych głównych, zaznaczając pole Wykres 3D PCA i wybierz opcję "Oblicz".
    7. Wykonaj krzyżową walidację typu leave-one-out, wybierając pozycję "Weryfikuj (WOLNO!"). "
  2. Generuj mapę cieplną
    1. Na karcie Wykres częstotliwości w oprogramowaniu do analizy spektralnej wygeneruj mapę cieplną danych, wybierając opcję "Mapa ciepła".
    2. Wybierz "Próg zapisanych danych", aby ustawić próg obfitości na 1%.
    3. Wyeksportuj mapę skupień do arkusza kalkulacyjnego, wybierając opcję "Zapisz mapę skupień w programie Excel".
    4. W programie arkusza kalkulacyjnego zapisz wyeksportowaną mapę skupień jako plik .txt.
  3. Hierarchiczna analiza grupowania
    1. Zaimportuj mapę skupień jako plik .txt do oprogramowania Cluster 3.0.
    2. Na karcie hierarchicznej Klastra 3.0, w obszarze Geny i tablice, zaznacz pola "Klaster" i "Oblicz wagi". Ustaw wartość odcięcia na 0,1 i wykładnik na 1. Wybierz grupowanie z pojedynczym połączeniem, aby przeprowadzić analizę.
    3. Wyświetl wygenerowany plik danych .cdt w widoku drzewa Java.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywna bezpośrednia analiza w trybie miękkiej jonizacji w trybie dodatnich jonów w czasie rzeczywistym - dane spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości produktów Kratom i nasion Datura są pokazane na rysunkach 2 i 3. We wszystkich czterech próbkach wykryto różne związki wcześniej wyizolowane z M. speciosa, w tym mitragyninę (C23H30N2O4 + H+, m/z 399.2284) i 7-hydroksymitragyninę (C23H30N2O5 + H+, m/z 415.2233), a odpowiednie dane z pomiaru masy przedstawiono w tabeli 1. 4-8 Reprezentatywne dane dotyczące datury przedstawiono na rycinie 3, a w trzech gatunkach wykryto biomarkery sygnatury, w tym atropinę (C17H23NO3 + H+, m/z 290.1756) i skopolaminę (C17H21NO4 + H+, m/z 304.1549). Dane z pomiarów masy powiązane z rysunkiem 3 przedstawiono w tabeli 2. 9-12 Tożsamości związków potwierdzono poprzez określenie składu pierwiastkowego, dopasowanie izotopów i porównania z doniesieniami w literaturze. 23-24

Renderingi mapy cieplnej bezpośredniej analizy w czasie rzeczywistym w widmach spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości Kratom i Datura są zilustrowane na rysunku 4. Przedstawione dane wykorzystano w analizie głównych składowych (PCA) w celu rozróżnienia między dwiema klasami leków pochodzenia roślinnego (ryc. 5). Wykres PCA został skonstruowany przy użyciu dziesięciu mas cech (wymienionych w tabeli 3), z niebieskimi okręgami reprezentującymi dane Kratom i czerwonymi kwadratami reprezentującymi dane Datura. Wybrane masy cech odpowiadały różnym alkaloidom obecnym w Datura lub Mitragyna spp., w tym związkom psychoaktywnym: atropinie, skopolaminie, mitragyninie i 7-hydroksyamitragyninie. 23-24 Trzy główne składniki odpowiadały za 75,26% wariancji, a walidacja krzyżowa typu leave-one-out (LOOCV) wynosiła 100%. Wykres PCA wyraźnie pokazuje, że dane Kratom i dane Datura są dobrze oddzielone od siebie. Analiza PCA wykazała również, że poszczególne odmiany Kratom i różne gatunki Datura mogą być identyfikowane i odróżniane od siebie (ryc. 6). LOOCV wynosił 94,29%, przy czym trzy główne składowe pokrywały 75,26% wariancji. Dwie odmiany Kratom (Bali w niebieskich kółkach i Rifat w czerwonych kwadratach) grupują się razem, co wskazuje, że należą do gatunku M. speciosa, ale są oddzielone od siebie, co pokazuje, że reprezentują różne odmiany. Co więcej, gatunki Datura grupują się razem i są oddzielone od danych M. speciosa, ale każdy z poszczególnych gatunków Datura (D. inoxia w zielonych trójkątach, D. stramonium w różowych kwadratach i D. ferox w turkusowych okręgach) jest wyraźnie zróżnicowany. Pomimo tego, że punkt danych dla D. stramonium wydaje się być wartością odstającą, nasiona są prawidłowo klasyfikowane jako D. stramonium, a nie D. inoxia przy użyciu PCA. Co najważniejsze, różnica w kolorze nasion między D. stramonium i D. inoxia potwierdza, że są to różne gatunki i że punktem danych, o którym mowa, nie może być D. inoxia.

Grupowanie hierarchiczne (Rysunek 7) zostało przeprowadzone bez apriorycznego wyboru mas cech. Zamiast tego cała grupa zestawów danych spektralnych obejmujących zakres mas m/z 60-800 została zaimportowana do oprogramowania do grupowania genomu o otwartym kodzie źródłowym i stworzono dendrogram zawierający te dane. Wyniki HCA ujawniły również zróżnicowanie klas, gatunków i odmian wyłącznie w oparciu o bezpośrednią analizę danych pochodzących ze spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym i potwierdziły te z analizy PCA. Dwie klasy leków pochodzenia roślinnego, Kratom i Datura, zostały rozdzielone na indywidualne klady dendrogramu. Co więcej, odmiany Rifat i Bali Kratom zostały wyizolowane do indywidualnych podkladów w klasie Kratom. Podobnie, D. inoxia, D. ferox i D. stramonium zostały podzielone na własne klady według gatunków w klasie Datura.

figure-results-1
Rysunek 1. Zdjęcia produktów M. speciosa (Kratom) i nasion Datura spp. a: Bali Kratom suszone liście; b: Bali Kratom w proszku; c: Rifat Kratom żywa roślina; d: nasiona D. stramonium; e: nasiona D. inoxia; f: D. nasiona ferox. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Bezpośrednia analiza w czasie rzeczywistym spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości widma jonów dodatnich produktów M. speciosa (Kratom). a: świeży liść ryfatu; b: Suszone liście z Bali; c: proszek z Bali; d: Ekstrakt w proszku z Bali. Dane pomiarowe masy związane z tymi widmami przedstawiono w tabeli 1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Bezpośrednia analiza w czasie rzeczywistym spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości, widma jonów dodatnich nasion Datura spp. a: D. ferox; b: D. inoxia; c: D. stramonium. Dane pomiarowe masy związane z tymi widmami przedstawiono w tabeli 2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4. Renderowanie mapy cieplnej bezpośredniej analizy w widmach spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym materiałów roślinnych Kratom i Datura. Szczyty o wysokiej intensywności są pokazane w kolorze ciemnoczerwonym, a szczyty o niższej intensywności są oznaczone jaśniejszymi odcieniami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5. Wykres analizy głównych składowych (PCA) produktów Kratom i Datura skonstruowany przy użyciu bezpośredniej analizy w czasie rzeczywistym pochodzących ze spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości. Trzy główne komponenty (PC) odpowiadały za 75,26% zmienności, a krzyżowa walidacja typu leave-one-out (LOOCV) wyniosła 100%. Masy cech używane dla PCA są wymienione w tabeli 3. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6. Wykres analizy głównych składowych (PCA) produktów Kratom i Datura przy użyciu bezpośredniej analizy danych spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym. Zadania klasowe opierały się na odmianie (Kratom) lub gatunku (Datura) materiałów roślinnych. Trzy główne komponenty (PC) odpowiadały za 75,26% wariantu, a walidacja krzyżowa typu leave-one-out (LOOCV) wyniosła 94,29%. Masy cech używane dla PCA są wymienione w tabeli 3. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7. Wyniki hierarchicznego grupowania uzyskane przy użyciu bezpośredniej analizy danych pochodzących ze spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym z analizy materiałów roślinnych Kratom i Datura. Dwie klasy roślin są wyraźnie oddzielone na dwie odrębne gałęzie w dendrogramie (pokazane w niebieskich i czerwonych nawiasach odpowiednio dla Kratom i Datura). Gatunki nasion Datura są również oddzielone od siebie (pokazane w zielonych, turkusowych i różowych przerywanych polach odpowiednio dla D. inoxia, D. ferox i D. stramonium). Materiały roślinne Kratom są oddzielone według odmian (pokazanych w czerwonych i niebieskich przerywanych polach odpowiednio dla Rifat i Bali). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Tabela 1. Dane pomiaru masy związane z widmami miękkiej jonizacji produktów Kratom przedstawione na rysunku 2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej tabeli.

figure-results-9
Tabela 2. Dane pomiarowe masy związane z widmami miękkiej jonizacji nasion Datury przedstawione na rysunku 3. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej tabeli.

figure-results-10
Tabela 3. Masy cech używane do wykresu analizy głównych składowych produktów Kratom i Datura pokazanych na rysunkach 5 i 6.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do identyfikacji narkotyków pochodzenia roślinnego jest coraz bardziej potrzebna ze względu na dramatyczny wzrost marketingu, sprzedaży i konsumpcji nieplanowanych substancji psychoaktywnych. 2 Tradycyjne metody identyfikacji materiału botanicznego zwykle obejmują charakterystykę cech fizycznych połączoną z analizą składników chemicznych metodami chromatografii i spektrometrii mas z łącznikiem. Oba te podejścia stanowią jednak wyzwanie dla usprawnionej analizy. Cechy fizyczne roślin są często niszczone, gdy rośliny są suszone, proszkowane lub ekstrahowane podczas procesu produkcyjnego i w związku z tym często trudno jest odróżnić jeden rodzaj produktu psychotropowego pochodzenia roślinnego od innego na podstawie samych cech fizycznych. 23 Analiza metodami chromatograficzno-spektrometrycznymi mas może umożliwić identyfikację związków psychoaktywnych w matrycach roślinnych, ale przygotowanie próbki i opracowanie metody jest czasochłonne i zasobochłonne, a tworzenie nowych protokołów dla każdej klasy lub gatunku nadużywanego narkotyku pochodzenia roślinnego jest niepraktyczne w wielu laboratoriach chemii sądowej.

Bezpośrednia analiza w spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym pozwala ominąć niektóre z tych wyzwań, ponieważ złożone matryce, takie jak liście, proszki, ekstrakty i nasiona, mogą być analizowane przy niewielkim przygotowaniu próbki. Pomimo złożonych matryc pobranych tu materiałów, składniki psychoaktywne były łatwe do zidentyfikowania, nawet przy stężeniach nanogramów,21 ze względu na wysoką czułość spektrometru masowego. Wykazano, że nasiona, liście i proszki są łatwo analizowane przez bezpośrednią analizę w spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym, a w ten sam sposób można również pobierać próbki z wielu innych rodzajów materiałów, w tym płytek TLC, waluty, tabletek, kwiatów, włókien mikroekstrakcji do fazy stałej (SPME), a nawet osłonek pęcherzykowych owadów. 21-22 Dzięki dokładnej analizie masy, określeniu składu pierwiastkowego i dopasowaniu izotopów, można zidentyfikować biomarkery i związki będące przedmiotem zainteresowania, niezależnie od tego, czy związki te są zawarte w liściu, nakrapiane na płytce TLC czy pokryte rurką kapilarną.

Bezpośrednia analiza w metodologii spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym może być wykorzystana do usprawnionej analizy, ponieważ istnieje bardzo niewiele parametrów, które muszą być modyfikowane z eksperymentu na eksperyment. Analiza może być przeprowadzana w trybie jonów dodatnich lub jonów ujemnych, a w obu przypadkach można wykryć cząsteczki o wielkości do 3,000 amu. Jonizacja w trybie jonów dodatnich zachodzi przez transfer protonów z aktywowanych klastrów wody,21 a każdy związek o powinowactwie do protonów wyższym niż woda zostanie zjonizowany. Tutaj zastosowano tryb jonów dodatnich ze względu na wysokie powinowactwo protonów alkaloidów, co powoduje, że są one łatwo jonizowane przez protonowanie. Analiza w trybie jonów ujemnych może być wykorzystana do skutecznego wykrywania węglowodorów (jako adduktówO2 )21, materiałów wybuchowych27 i kwasów organicznych, takich jak artesunat, w lekach na malarię. 28 Ze względu na metodę jonizacji transferu protonów i niemożność wytworzenia wielokrotnie naładowanych jonów, bezpośrednia analiza w spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym jest ograniczona głównie do analizy małych cząsteczek o mocy do 3000 amu.

Poza trybem jonizacji ważnym parametrem jest temperatura źródła jonów, a odpowiednia temperatura w dużej mierze zależy od analizowanej próbki. Na przykład ważne jest, aby używać niższych temperatur (~250 °C) do analizy włókien SPME, aby zapobiec zniszczeniu materiału powłokowego na włóknie, podczas gdy wyższe temperatury (~500 °C) powinny być używane do analizy aminokwasów w celu desorpcji i późniejszej jonizacji. W tym przypadku przeprowadzono analizy materiału roślinnego w temperaturze 350 °C, ponieważ pozwala to na jonizację alkaloidów i innych interesujących związków bez powodowania pirolizy związków w matrycy roślinnej.

Bezpośrednia analiza w analizie spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym nie tylko umożliwia identyfikację składników psychoaktywnych materiału roślinnego w oparciu o dokładne masy, określenie składu pierwiastkowego i dopasowanie izotopów, ale także tworzy unikalne chemiczne odciski palców, które można wykorzystać do identyfikacji gatunków za pomocą wielowymiarowej analizy statystycznej z wysoce powtarzalnymi wynikami, nawet w przypadku mniejszych zbiorów danych. Wielowymiarowa analiza statystyczna została zastosowana do szerokiej gamy bezpośrednich analiz danych spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym, w tym danych pochodzących z drewna, osłonek mlecznych, nasion, materiału liściowego i zapasów paliwa biodiesel, co pokazuje wszechstronność i odtwarzalność metody. 22-26 Wysoka przepustowość bezpośredniej analizy w spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym umożliwia pozyskiwanie dużych ilości danych widma masowego w krótkim czasie, a przy użyciu tej metody można łatwo uzyskać dużą liczbę powtórzeń potrzebnych do analizy statystycznej. Bezpośrednia analiza w zestawie danych spektrometrii mas spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym Datura i Kratom składała się z ponad 100 indywidualnych widm, które zostały zebrane przy całkowitej inwestycji czasu w czasie krótszym niż godzina. Uzyskanie tej samej liczby widm przy użyciu GC-MS z programem temperatury pieca wynoszącym 30 minut zajęłoby około 50 godzin, bez uwzględnienia dodatkowego czasu na etapy przygotowania próbki, takie jak ekstrakcja lub derywatyzacja.

Analiza głównych składowych może być wykorzystana do podkreślenia różnic między zestawami substancji roślinnych w oparciu o obecność i intensywność wybranych mas cech. Przetwarzanie analizy statystycznej zapewnia identyfikację gatunków, a także informacje o odmianach. Inne metody analizy statystycznej, takie jak hierarchiczna analiza skupień (HCA), mogą być również stosowane bez apriorycznego wyboru mas cech. Wyniki HCA kompleksowych chemicznych odcisków palców pokazują, że nienadzorowana analiza statystyczna może być z powodzeniem stosowana do identyfikacji gatunkowej nadużywanych narkotyków pochodzenia roślinnego. 25

Dyskryminację gatunkową materiału botanicznego w kryminalistyce poprzez bezpośrednią analizę w spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym wykazano przy użyciu identyfikacji związków psychotropowych i innych biomarkerów w widmach mas miękkojonizacyjnych oraz zastosowaniu wielowymiarowej analizy statystycznej. Zastosowanie dwóch rodzajów analiz statystycznych ujawniło nie tylko, że można zidentyfikować klasę nadużywanego narkotyku pochodzenia roślinnego, ale także, że różnorodność i gatunek tego narkotyku można określić na podstawie unikalnych chemicznych odcisków palców zaobserwowanych w wyniku bezpośredniej analizy w spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym. Przedstawiona tutaj metoda umożliwia szybką, wysokoprzepustową identyfikację substancji zmieniających umysł w sposób, który pozwala obejść wyzwania napotykane w konwencjonalnych metodach analitycznych i zapewnia laboratoriom kryminalistycznym środki do charakteryzowania i identyfikacji psychoaktywnego materiału roślinnego bez konieczności opracowywania metod wymagających dużego czasu i zasobów. Protokół ten można rozszerzyć na zróżnicowanie gatunkowe wielu innych materiałów pochodzenia roślinnego. 22-26

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują RAM za grant Uniwersytetu w Albany-SUNY Presidential Initiatives Fund na badania i stypendia w dziedzinie kryminalistyki i cyberbezpieczeństwa, grant National Science Foundation (Grant #1310350) oraz grant National Institute of Justice (Grant #2015-DN-BX-K057). Dziękujemy również Justine E. Giffen za wykonanie zdjęć materiałów roślinnych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Spektrometr masowy AccuTOFJEOL USA, Inc.
DART-SVP Źródło jonówIonSense, Inc.DART-SVP
IonSense, Inc.HW-10029
Dziurkacz (6 mm)SwinglineA7074005
Jednolitrowa kompaktowa myjka ultradźwiękowaCole-PalmerEQ-08849-00
1,5 ml probówki do mikrowirówek EppendorfFisher Scientific02-682-550
Wirówka AccuSpin Micro 17RFisher Scientific13-100676
#9 Żyletka ze stali nierdzewnejStanley11-515
Uchwyt na końcówkę zanurzeniowąIonSense, Inc.SCT-70003
Końcówki do zanurzaniaIonSense, Inc.DPT-110
Kapilarna temperatura topnieniaKrackeler Scientific1-9530-3
Glikol polietylenowy (600)Sigma Aldrich81180
Rifat Kratom Live Plant WorldDostawa nasion Kolekcja KratomLIVEKRATOMPLANT
Bali Kratom Suszony liśćKról KratomOZKRAPCOM
Bali Kratom w proszkuKratom Nasiona KingOZKRAPCOMPOW
em>Datura stramoniumHorizon Herbs LLCPDATUJ
em>Datura inoxia nasionaHorizon Herbs LLCPDATUM
Datura ferox nasionaGeorgia Vines255/737
Etanol, bezwodnyKrackeler Scientific1328-E402-4L
Oprogramowanie do analizy spektralnej Mass Mountaineermass-spec-software.comMM-20030-PCA-DVD
TSSPro3 Oprogramowanie do przetwarzania/redukcji danychShrader Labs
Cluster 3.0http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htmOpen Source Oprogramowanie
JavaTreeview http://jtreeview.sourceforge.net/Open Source Oprogramowanie
System szyn liniowych <<

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Authority, E.F.S. EFSA Compendium of botanicals that have been reported to contain toxic, addictive, psychotropic or other substances of concern onrequest of EFSA. EFSA Journal. 7, 1-100 (2009).
  2. The challenge of new psychoactive substances: list of plant-based substances (20 Substances). , UNODC. 101-102 (2013).
  3. Kratom (Mitragyna speciosa Korth). , US Drug Enforcement Administration. Available from: http://www.deadiversion.usdoj.gov/drug_chem_info/kratom.pdf (2013).
  4. Jimson Weed (Datura stramonium). , US Drug Enforcement Administration. Available from: http://www.deadiversion.usdoj.gov/drug_chem_info/jimson_w.pdf (2013).
  5. Jansen, K., Prast, C. Ehtnopharmacology of Kratom and the Mitragyna alkaloids. J. Ethnopharmacol. 23, 115-119 (1988).
  6. Matsumoto, K. Pharmacological Studies on 7-Hydroxymitragynine, Isolated from the Thai Herbal Medicine Mitragyna speciosa: Discovery of an Orally Active Opioid Analgesic. , Chiba University. (2006).
  7. Matsumoto, K., et al. Involvement of µ-opioid receptors in antinociception and inhibition of gastrointestinal transit induced by 7-hydroxymitragynine, isolated from Thai herbal medicine Mitragyna speciosa. Eur. J. Pharmacol. 549, (2006).
  8. Matsumoto, K., et al. Antinociceptive effect of 7-hydroxymitragynine in mice: Discovery of an orally active opioid analgesic from the Thai medicinal herb Mitragyna speciosa. Life Sciences. 74, 2143-2155 (2004).
  9. El Bazaoui, A., Stambouli, H., Bellimam, M. A., Soulaymani, A. Determination of tropane alkaloids in seeds of Datura stramonium L. by GC/MS and LC/MS. Ann. Toxicol. Anal. 21, 183-188 (2009).
  10. Friedman, M., Levin, C. E. Composition of Jimson Weed (Datura stramonium) seeds. J. Agr. Food Chem. 37, 998-1005 (1989).
  11. Philipof, S., Berkhov, S. GC-MS Investigation of tropane alkaloids in Datura stramonium. Z Naturforsch. 57, 559-561 (2002).
  12. Preissel, U., Preissel, H. -G. Brugmansia and Datura: Angel's Trumpets and Thorn Apples. , Firefly Books. (2002).
  13. Boumba, V. A., Mitselou, A., Vougiouklakis, T. Fatal poisoning from ingestion of Datura stramonium seeds. Vet. Hum. Toxicol. 46, 81-82 (2004).
  14. Kronstrand, R., Roman, M., Thelander, G., Eriksson, A. Unintentional Fatal Intoxications with Mitragynine and O-Desmethyltramadol from the Herbal Blend Krypton. J. Anal. Toxicol. 35, 242-247 (2011).
  15. Neerman, M., Frost, R., Deking, J. A drug fatality involving Kratom. J. Forensic Sci. 58, 278-279 (2013).
  16. Steenkamp, P. A., Harding, N. M., Van Heerden, F. R., Van Wyk, B. -E. Fatal Datura poisoning: Identification of atropine and scopolamine by high performance liquid chromatography / photodiode array / mass spectrometry. Forensic Sci. Int. 145, 31-39 (2004).
  17. Scientific Working Group for the Analysis of Seized Drug Recommendations. , Scientific Working Group for the Analysis of Seized Drugs. (2014).
  18. Kikura-Hanajiri, R., et al. Simultaneous analysis of mitragynine, 7-hydroxymitragynine, and other alkaloids in the psychotropic plant "Kratom" (Mitragyna speciosa) by LC-ESI-MS. Forensic Toxicol. 27, 67-74 (2009).
  19. Wang, M., et al. Comparison of three chromatographic techniques for the detection of mitragynine and other indole and oxindole alkaloids in Mitragyna speciosa (Kratom) plants. J. Separation Sci. , (2014).
  20. Cody, R. Observation of molecular ions and analysis of nonpolar compounds with the Direct Analysis in Real Time ion source. Anal. Chem. 81, 1101-1107 (2009).
  21. Cody, R., Laramee, J., Durst, H. D. Versatile new ion source for the analysis of materials in open air under ambient conditions. Anal. Chem. 77, 2297-2302 (2005).
  22. Musah, R. A., et al. A High Throughput Ambient Mass Spectrometric Approach to Species Identification and Classification from Chemical Fingerprint Signatures. Sci. Rep. 5, (2015).
  23. Lesiak, A. D., Cody, R. B., Dane, A. J., Musah, R. A. Rapid detection by direct analysis in real time-mass spectrometry (DART-MS) of psychoactive plant drugs of abuse: The case of Mitragyna speciosa aka "Kratom". Forensic Sci. Int. 242, 210-218 (2014).
  24. Lesiak, A. D., Cody, R. B., Dane, A. J., Musah, R. A. Plant Seed Species Identification from Chemical Fingerprints: A High-Throughput Application of Direct Analysis in Real Time Mass Spectrometry. Anal. Chem. , (2015).
  25. Espinoza, E. O., et al. Distinguishing wild from cultivated agarwood (Aquilaria spp.) using direct analysis in real time and time of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28, 281-289 (2014).
  26. Lancaster, C., Espinoza, E. Evaluating agarwood products for 2-(2-phenylethyl)chromones using direct analysis in real time time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 26, 2649-2656 (2012).
  27. Sisco, E., Dake, J., Bridge, C. "Screening for trace explosives by AccuTOF™-DART®: An in-depth validation study.". Forensic Sci. Int. 232, 160-168 (2013).
  28. Fernandez, F. M., et al. Characterizatoin of solid counterfeit drug samples by desorption electrospray ionization and direct analysis in real time coupld to time-of-flight mass spectrometry. Chem. Med. Chem. 1, 702-705 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Direct Analysis Real TimeBotanical Material IdentificationMultivariate Statistical AnalysisAmbient Ionization Mass SpectrometryPrinciple Component AnalysisHierarchical Clustering AnalysisKratom Leaf MaterialDatura Seeds AnalysisPEG Calibration Method

Powiązane artykuły