Method Article

Analiza mitochondriów mózgu za pomocą seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej

DOI:

10.3791/54214

⸱

July 9th, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Virginia Tech Carilion Research Institute, 2Renovo Neural Incorporated

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wizualizacja i analiza mitochondriów z tkanki mózgowej ssaków to trudne zadanie. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób trójwymiarowa (3D) analiza rekonstrukcji z seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej (SBFSEM) może być wykorzystana do uzyskania wglądu w morfologiczną i wolumetryczną analizę tego krytycznego organcelli generującej energię.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzki mózg jest organem zużywającym dużo energii, który głównie opiera się na glukozie jako źródle paliwa. Glukoza jest katabolizowana przez mitochondria mózgu poprzez glikolizę, cykl kwasu trikarboksylowego (TCA) i szlaki fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) w celu wytworzenia energii komórkowej w postaci adenozynotrójfosforanu (ATP). Upośledzenie mitochondrialnej produkcji ATP powoduje zaburzenia mitochondrialne, które objawiają się klinicznie wyraźnymi objawami neurologicznymi i miopatycznymi. Defekty mitochondrialne występują również w zaburzeniach neurorozwojowych (np. zaburzenia ze spektrum autyzmu) i neurodegeneracyjnych (np. stwardnienie zanikowe boczne, choroby Alzheimera i Parkinsona). W związku z tym rośnie zainteresowanie tą dziedziną wykonywania analizy 3D morfologii, struktury i dystrybucji mitochondriów zarówno w stanie zdrowym, jak i chorobowym. Morfologia mitochondriów mózgu jest niezwykle zróżnicowana, a niektóre mitochondria, zwłaszcza te w regionie synaptycznym, znajdują się w zakresie średnicy <200 nm, czyli poniżej granicy rozdzielczości tradycyjnej mikroskopii świetlnej. Ekspresja ukierunkowanego na mitochondria białka zielonej fluorescencji (GFP) w mózgu znacznie poprawia wykrywanie organelli za pomocą mikroskopii konfokalnej. Nie przezwycięża jednak ograniczeń czułości wykrywania mitochondriów o stosunkowo małych rozmiarach bez przesycenia obrazów mitochondriów o dużych rozmiarach. Podczas gdy mikroskopia elektronowa z transmisją szeregową została z powodzeniem wykorzystana do scharakteryzowania mitochondriów w synapsie neuronalnej, technika ta jest niezwykle czasochłonna, zwłaszcza w przypadku porównywania wielu próbek. Technika seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej ze skaningiem blokowym (SBFSEM) obejmuje zautomatyzowany proces cięcia, obrazowania bloków tkanek i pozyskiwania danych. W tym miejscu udostępniamy protokół do wykonania SBFSEM zdefiniowanego regionu z mózgu gryzonia w celu szybkiej rekonstrukcji i wizualizacji morfologii mitochondriów. Technika ta może być również wykorzystana do dostarczenia dokładnych informacji na temat liczby, objętości, wielkości i rozmieszczenia mitochondriów w określonym regionie mózgu. Ponieważ uzyskana rozdzielczość obrazu jest wysoka (zwykle poniżej 10 nm), można również wykryć wszelkie poważne wady morfologiczne mitochondriów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria to dynamiczne organelle, które zmieniają swój kształt i położenie w zależności od sygnałów i potrzeb komórkowych, w ścisłej interakcji z cytoszkieletem komórki i w odpowiedzi na zdarzenia komórkowe, takie jak prądy wapnia w neuronach 1. Mitochondria oddziałują również z innymi organellami komórkowymi, np. retikulum endoplazmatyczne, co z kolei reguluje ich dynamikę i metabolizm2. Morfologia mitochondriów wykazuje niejednorodność w różnych typach komórek, tj. Kształt organelli waha się od rurowego do składającego się z arkuszy, worków i owali 3. Wykazano, że białka cyklu fuzji i rozszczepienia mitochondriów mogą regulować lokalizację, wielkość, kształt i rozmieszczenie mitochondriów 4. Co więcej, zmiany w kształcie mitochondriów są związane z neurodegeneracją, plastycznością neuronów, zanikiem mięśni, sygnalizacją wapniową, wytwarzaniem reaktywnych form tlenu, a także długością życia i śmiercią komórki, co sugeruje, że specyficzna dla komórki morfologia mitochondriów ma kluczowe znaczenie dla utrzymania prawidłowych funkcji komórkowych 5-11.

Główną funkcją bioenergetyczną mitochondriów jest wytwarzanie trifosforanu adenozyny (ATP) poprzez przeprowadzanie serii reakcji metabolicznych, które obejmują całkowity rozkład składników odżywczych (tj. glukozy, kwasów tłuszczowych lub aminokwasów) poprzez cykl TCA i szlaki OXPHOS 12. Ludzki mózg stanowi tylko 2% masy ciała, jednak zużywa ~20% całkowitej wyprodukowanej energii, co czyni go niezwykle energochłonnym narządem13. Nic więc dziwnego, że dysfunkcja mitochondriów u ludzi prowadzi do dużej liczby objawów neurologicznych 14-17. Mutacje genetyczne w składnikach OXPHOS, które upośledzają wytwarzanie ATP, prowadzą do zaburzeń mitochondrialnych 17,18, które są klinicznie niejednorodną grupą zaburzeń o częstości występowania ~1 : 5 000 osób i jedną z najczęstszych przyczyn zaburzeń metabolicznych u dzieci i dorosłych. Deficyt ATP pochodzącego z mitochondriów wpływa na wiele układów narządowych, przy czym narządy wymagające dużej ilości energii, takie jak mózg, serce i mięśnie szkieletowe, są głównie dotknięte u tych pacjentów 14,17,18. W ostatnich latach wiele badań dostarczyło dowodów na dysfunkcję mitochondriów zarówno w zaburzeniach neurorozwojowych, jak i neurodegeneracyjnych 15-17,19,20. Ponieważ mitochondria są niezbędne i krytyczne dla rozwoju i funkcjonowania mózgu, konieczne jest opracowanie protokołów, które mogą analizować zmiany w morfologii, strukturze, rozmiarze, liczbie i dystrybucji mitochondriów mózgu zarówno w stanie zdrowym, jak i chorym. Wyprodukowano modele mysie z mitochondrialnie ukierunkowanym białkiem zielonej fluorescencji (GFP) w celu wizualizacji ruchów mitochondriów i lokalizacji w mózgu 21,22. Chociaż jest to niezwykle przydatne narzędzie do badania ruchliwości mitochondriów i ogólnej dystrybucji, istnieją pewne wady, do których należy ograniczona rozdzielczość i czułość mikroskopii fluorescencyjnej. Te atrybuty utrudniają śledzenie mitochondriów o stosunkowo małych rozmiarach. Podobnie, transmisyjna mikroskopia elektronowa z powodzeniem wykorzystuje się do oglądania mitochondriów synaptycznych 23, ale ta metoda jest bardzo czasochłonna. Wiadomo, że morfologia mitochondriów jest bardzo dynamiczna, ponieważ przechodzą one ciągłe cykle rozszczepienia i fuzji, a w większości komórek mitochondria utrzymują wysoce połączoną sieć 24-26. Neurony są wysoce spolaryzowanymi komórkami z wieloma dendrytami i wydłużonymi aksonami, a mitochondria, które tworzą połączoną siatkowatą sieć w ciele komórki, mogą być zmuszone do rozdzielenia się, gdy przechodzą przez te neuryty (ryc. 1). To sprawia, że mitochondria mózgu są niezwykle zróżnicowane pod względem wielkości i kształtu. Na przykład, stosując technikę seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej (SBFSEM), zaobserwowaliśmy wcześniej, że różnica w objętości lub wielkości mitochondriów pozasynaptycznych w stosunku do mitochondriów obecnych w zakończeniach nerwowych może być nawet szesnastokrotnie 27.

Istnieje kilka podejść do przeprowadzania analiz objętościowych 28, w tym sekcja szeregowa TEM 29, automatyczna taśma zbierająca ultramikrotom SEM 30, skupiona wiązka jonów SEM 31 i SBFSEM 32. Analiza SBFSEM ma tę zaletę, że ma rozdzielczość, która dostarcza danych ilościowych na temat kształtu morfologicznego, wielkości, rozmieszczenia i liczby organelli, takich jak mitochondria, w obszarach do 1 mm mózgu. Operacja techniczna jest również najmniej wymagająca, a pozyskiwanie i analiza danych odbywa się w ramach możliwości wielu laboratoriów biologicznych, które nie mają wcześniejszego doświadczenia w EM. Pojawienie się komercyjnych instrumentów do generowania seryjnych obrazów przypominających przekroje sprawiło, że ultrastrukturalna analiza 3D tkanek stała się rutynową techniką, która dodatkowo pozwala na bezstronną analizę wolumetryczną w szybki i powtarzalny sposób28. SBFSEM został po raz pierwszy opisany i zastosowany w dziedzinie neurobiologii w 2004 roku 32 w oparciu o ideę wprowadzoną przez Leightona w 1981 roku 33 . Wiele badań przeprowadzonych od tego czasu ustaliło, że technika ta jest głównym narzędziem w analizie rekonstrukcji obwodów neuronalnych 34. Ponadto, w przypadku wielu projektów na mniejszą skalę, zapewnia analizę rekonstrukcji w celu identyfikacji organelli komórkowych 27,35-39. Ponieważ uzyskane obrazy pochodzą z niskonapięciowych elektronów rozpraszania wstecznego, opracowano nowe protokoły barwienia, które łączą różne znane techniki barwienia metalami ciężkimi, aby zwiększyć rozdzielczość 40.

W tym artykule przedstawiamy protokół do wykorzystania obrazowania 3D mikroskopii elektronowej i analizy wolumetrycznej mitochondriów mózgu w oparciu o metody, które wcześniej były używane przez nas i innych 38,39,41. Zastosowane metody przetwarzania tkanek były zgodne z wcześniejszymi opisami Deerincka i wsp. 40.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie etyczne: Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) w Virginia Tech.

Ostrzeżenie: Należy podjąć ekstremalne środki ostrożności podczas obchodzenia się i utylizacji kilku składników używanych w tym protokole. Przed użyciem należy ustalić i przestrzegać lokalnych wytycznych instytucjonalnych oraz praktyk w zakresie zdrowia i bezpieczeństwa, w szczególności w odniesieniu do tetratlenku osmu, który jest lotny i niezwykle trujący, octanu uranylu, który jest zarówno metalem ciężkim, jak i źródłem radioaktywności, oraz azotanu ołowiu, który jest trucizną metali ciężkich. Tiokarbohydrazyd (TCH) może ulegać rozkładowi, tworząc wybuchowe i trujące gazy, jeśli jest niewłaściwie obchodzony. Wiele instytucji będzie miało główny zakład EM, w którym odczynniki te są rutynowo wykorzystywane i mogą udzielić pomocy.

1. Przygotowanie tkanki mózgowej i obrazowanie SBFSEM

  1. Znieczulić młodą (~2 - 4 miesiące) czarną mysz C57 (szczep C57BL/6J) za pomocą 4 - 5% izofluranu zgodnie z wytycznymi instytucji. Potwierdź znieczulenie, monitorując utratę napięcia mięśniowego, brak dobrowolnych ruchów i reakcje na bodźce awersyjne, takie jak szczypanie ogona.
  2. Przypnij mysz do tacki sekcyjnej i wykonaj nacięcie na skórze wzdłuż brzusznej linii środkowej. Wykonaj dalsze nacięcia w skórze, aby odsłonić klatkę piersiową myszy. Naciąć przeponę i ostrożnie wypreparować jamę klatki piersiowej wzdłuż obwodu, aby odsłonić bijące serce, a następnie wykonać nacięcie na prawym przedsionku.
  3. Za pomocą kaniuli motylkowej kanuluj lewą komorę. Wykonać perfuzję myszy przezskórnie przy użyciu 10 - 20 ml buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS) o pH 7,2, aż do potwierdzenia wykrwawienia przez zmianę koloru wątroby.
    Uwaga: Zmiana koloru wątroby służy jako wskazówka do określenia stopnia wykrwawienia. Upewnij się, że kolor wątroby zmienia się z czerwonawo-brązowego na bladoróżowy.
  4. Perfuzję myszy przeszyderczo za pomocą 10 - 20 ml 2% aldehydu glutarowego i 4% paraformaldehydu wykonanego w 0,10 M buforze kakodylowym (pH 7,2), aby szybko utrwalić tkankę mózgową od wewnątrz. Fiksacja jest monitorowana poprzez obserwację usztywnienia ogona.
    Uwaga: Przygotować 0,10 M bufor kakodylowy (pH 7,2), rozpuszczając 2,14 g kakodylanu sodu w 80 ml wody, dodać kwas solny w celu dostosowania pH i zwiększyć objętość do 100 ml wodą.
  5. Po perfuzji odciąć głowę myszy, wypreparować mózg, a następnie utrwalić w 0,10 M buforze kakodylanu sodu (pH 7,2) zawierającym 2% aldehydu glutarowego i 4% paraformaldehydu przez 48 godzin w temperaturze 4 oC.
  6. Po 48 godzinach wykonaj 400 μm wycinki koronalne za pomocą wibratomu, a następnie ostrożnie wypreparuj obszar zainteresowania w mózgu (na przykład hipokamp) pod mikroskopem preparacyjnym 42. Ostrożnie przytnij tkankę i zrób zdjęcie, aby zachować orientację.
    Uwaga: Metody barwienia tkanek po przetworzeniu w SBFSEM łączą w sobie różne metody barwienia metalami ciężkimi w celu poprawy rozdzielczości i opierają się na metodzie opracowanej wcześniej przez Deerinck i wsp. 40.
  7. Przemyć tkanki utrwalone aldehydem glutarowym 3 razy po 5 minut każda w 0,1 M buforze kakodylowym (pH 7,2).
  8. Przygotować 0,1% roztwór kwasu garbnikowego, rozpuszczając kwas garbnikowy w 0,1 M buforze kakodylanu sodu (pH 7,2). Obracać aż do rozpuszczenia i w razie potrzeby przefiltrować przez filtr 0,45 μm.
  9. Uzupełnić tkanki kakodylanem buforowanym 0,1% kwasem garbnikowym przez inkubację w 1 ml odczynnika przez 30 - 60 minut w temperaturze RT.
    Uwaga: Czas inkubacji zależy od wielkości tkanki, ale 30 minut najlepiej sprawdza się w przypadku większości tkanek.
  10. Umyj chusteczki 3 razy po 5 minut w buforze kakodylowym (pH 7,2).
  11. Rozpuścić 0,3 g żelazocyjanku potasu i 0,86 g kakodylanu sodu w 10 ml destylowanegoH2O(dH2O). Roztwór żelazocyjanku potasu należy przechowywać na lodzie. Tuż przed użyciem dodać 10 ml 4% tetratlenku osmu (OsO4).
  12. Tkanki barwić 2% roztworem żelazocyjanku osmu przez 90 minut na lodzie. Prać 3 razy po 5 minut w dH2O.
  13. Przygotować 1% roztwór tiokarbohydrazydu (TCH), rozpuszczając 0,1 g TCH w 10 mldH2O. Rozpuścić w temperaturze 60 °C, mieszając co 10 minut, aż do całkowitego rozpuszczenia. Przestrzegać środków ostrożności podczas obchodzenia się z TCH, szczególnie uważać, aby nie używać metali, podgrzewać do wysokiej temperatury lub dopuszczać do wyschnięcia roztworu.
  14. Próbki należy traktować świeżo przygotowanym 1% TCH przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć 3 razy po 5 minut w dH2O.
  15. Rozcieńczyć 4% OsO4 do 2% dH2O, zabarwić tkanki 2% wodnym tetratlenkiem osmu przez inkubację przez 1 godzinę. Umyć chusteczki 3 razy po 5 minut z dH2O.
  16. Inkubować próbki O/N w 1% octanie uranylu w dH2O w temperaturze 4 °C.
  17. Przygotować roztwór asparaginianu ołowiu Waltona (zgodnie z opisem Deerinck i wsp. 40).
    1. Rozpuścić 0,998 g L-asparaginianu w 250 ml dH2O, a następnie dodać 10 N wodorotlenku potasu (KOH) kroplami, aż pH osiągnie 5,5. Po dostosowaniu pH dodać 0,066 g azotanu ołowiu do 10 ml bulionu z kwasu asparaginowego i podgrzewać do 60 °C przez 30 minut.
  18. Opłukać tkanki wdH2Oi inkubować z barwnikiem asparaginianowo-ołowiowym Waltona przez 30 minut w piecu o temperaturze 60 °C. Prać 3 razy po 5 minut w dH2O.
  19. Próbki należy odwodnić za pomocą stopniowanej serii alkoholi przy użyciu schłodzonych roztworów 20%, 50%, 75%, 85% i 95% etanolu przez 5 minut każde, a następnie 100% etanolu 3 razy po 10 minut.
    Uwaga: Użyj 100% etanolu ze świeżo otwartej butelki, ponieważ otwarty etanol pochłania wodę z powietrza i powoduje niepowodzenie osadzania. Konieczne będą dłuższe inkubacje w przypadku większych próbek tkanek.
  20. Próbki przemyć 2 razy po 15 minut w tlenku propylenu.
  21. Przygotuj żywicę do zatapiania tworzyw sztucznych przy użyciu 25 ml żywicy, 10,5 ml DDSA (bezwodnik bursztynowy dodecenylu), 15,5 ml NMA (bezwodnik nadic metylu) i 1 ml DMP-30 (2,4,6-Tris dimetyloaminometylofenol). Wymieszaj żywicę, potrząsając. Odwiruj i odstaw żywicę, aż bąbelki się rozpuszczą.
    Uwaga: Jest to standardowa receptura o średniej twardości. Można stosować inne rodzaje żywic z tworzywa sztucznego do mikroskopii elektronowej (EM), ale należy je wcześniej przetestować z nieistotną próbką kontrolną, ponieważ nie wszystkie żywice działają w przypadku SBFSEM.
  22. Inkubować tkanki O/N w mieszance żywicy i tlenku propylenu w proporcji 50: 50 w fiolce, która jest początkowo zakryta, a następnie odkrztuszona po 2 godzinach, tak aby tlenek propylenu odparował w ciągu około 8 - 10 godzin.
  23. Przenieś chusteczki do 100% świeżej żywicy do zatapiania w czystych fiolkach na 2 godziny.
  24. Próbki należy zatopić w świeżej żywicy do zatapiania, w płaskich formach zawierających zadrukowane etykiety papierowe i utwardzić je w piecu w temperaturze 60 °C przez 48 godzin. Po około 1 godzinie ponownie sprawdź ułożenie i wyrównanie tkanek i w razie potrzeby wyreguluj.
  25. Przytnij próbki do obszaru zainteresowania i zamontuj na aluminiowym kołku za pomocą żelującego kleju cyjanoakrylowego lub przewodzącej żywicy epoksydowej, a następnie pokryj pastą ze srebra koloidalnego po bokach bloku, aby zapewnić przewodzącą ścieżkę do aluminiowego kołka.
  26. Badaj próbki tkanek za pomocą systemu skaningowego mikroskopu elektronowego wyposażonego w komorowy stolik ultramikrotomowy i detektor elektronów rozproszonych wstecznie o niskim kV 32,
    Uwaga: Odbyć szkolenie w zakresie obsługi skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) i stać się autoryzowanym użytkownikiem. Alternatywnie możliwa może być współpraca z naukowcem lub ośrodkiem centralnym w przypadku małych projektów. Szkolenie w zakresie promieniowania może być również wymagane, ponieważ SEM generują promieniowanie rentgenowskie.
  27. Aby zobrazować próbki, należy użyć następujących ustawień: 2,25 kV, przy rozdzielczości 5 - 10 nm/piksel, z rozmiarami pola od 80 do 250 μm w x,y (możliwe inne rozmiary pola) i grubość warstwy 50 - 100 nm, z łączną liczbą 250 - 600 warstw w okresie 16 - 20 godzin.
    Uwaga: Ustawienia różnią się znacznie w zależności od różnych mikroskopów, poszczególnych próbek i żądanej rozdzielczości. Dzięki tym ustawieniom powstaną obrazy, które będą łatwe do zinterpretowania dla wielu próbek.

2. Analiza zestawu danych obrazowania

Uwaga: Oprogramowanie Image J/Fiji służy do analizy zestawu danych i opiera się na wtyczce TrakEM2. Etapy wstępnego przetwarzania mogą być wykonywane przy użyciu różnych programów i mogą być obszerne lub niewielkie, w zależności od poziomu doświadczenia i uzyskanych stosów. Główne transformacje przy użyciu oprogramowania open source (ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015) są opisane tutaj.

  1. Konwertuj obrazy do 8-bitowego formatu tiff z oryginalnych, zastrzeżonych obrazów 16-bitowych, otwierając oprogramowanie i wybierając pozycje menu Image→Type→8 bit.
    1. Jeśli automatyczna konwersja kontrastu/jasności na tym etapie nie jest idealna dla obrazów, otwórz ponownie obrazy 16-bitowe i naciśnij Image→Adjust→Brightness/Contrast. Wybierz zakres, który działa dla wszystkich obrazów, a następnie naciśnij przycisk Zastosuj. Następnie wykonaj konwersję. Uwaga: W przypadku niektórych SEM-ów ten krok może wymagać oprogramowania producenta mikroskopu.
    2. W razie potrzeby, ze względu na niedopuszczalne przemieszczanie się obrazu między plasterkami (np. dryf spowodowany ładowaniem), zarejestruj/wyrównaj stosy obrazów (pozycje menu Plugins→Registration→Linear StackAlignmentWithSIFT). W większości programów rejestracyjnych ustawia się tryb "tylko tłumaczenie", a nie "sztywny korpus".
      Uwaga: Wiele podejść i programów może działać: wtyczka rejestracyjna SIFT działa dla wielu aplikacji i istnieje wersja wirtualnego stosu.
      1. W razie potrzeby powiększ rozmiar płótna przed rejestracją (Image→Adjust→CanvasSize) lub zmniejsz go do obszaru zainteresowania (Image→Crop).
        Uwaga: Może wystąpić pewien dryf lub splay, a wypróbowanie innych wtyczek lub oprogramowania może przynieść lepsze wyniki. Dostępne są również opcje ręczne (np. ImageJ/FIJI, Wtyczki→Rejestracja→ManualLandmarkSelection).
    3. W razie potrzeby przeskaluj obrazy do mniejszego, łatwiejszego w obsłudze rozmiaru (np. 25%) za pomocą ImageJ (Image→Scale).
  2. Uruchom oprogramowanie, wybierz File→import→image sequence, a następnie wybierz pliki tiff.
  3. Uruchom wtyczkę, wybierając File→new→TrakEM2 (Puste). Otworzą się dwa okna; Jeden zarządza projektem i area_lists, a drugi zarządza śledzeniem i jest określany jako "płótno".
  4. Załaduj stos obrazów do wtyczki, klikając prawym przyciskiem myszy import płótna. Wybierz import i kliknij importuj stos. W opcjach wyskakujących okienek zaznacz pole dla virtual stacks.
    Uwaga: Chociaż stosy obrazów są już otwarte w oprogramowaniu, należy je również otworzyć we wtyczce. Komputer może działać płynniej, jeśli zaznaczone jest pole wirtualne stosy.
  5. Po utworzeniu mipmap i załadowaniu stosu kliknij prawym przyciskiem myszy, aby nazwać projekt w oknie wtyczki. Kliknij prawym przyciskiem myszy "nowy projekt" w kolumnie szablonu i wybierz "dodaj nowego dziecko" dla tego projektu. Kliknij ponownie prawym przyciskiem myszy, aby wybrać "area_list".
  6. Ustaw skalę osi Z projektu tak, aby zgadzała się z oryginalnymi ustawieniami mikrografu elektronowego, klikając prawym przyciskiem myszy płótno, a następnie kliknij przycisk Wyświetl i wybierz kalibrację. Ustaw również skalę Z, wybierając wszystkie warstwy w oknie wtyczki, kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać skalę Z i grubość.
  7. Kliknij i przeciągnij "projekt" i wszystkie "potomki" do sekcji obiektów projektu, aby utworzyć "listy obszarów" w zakładce "Przestrzeń Z" w oknie płótna.
  8. Wybierz "listę obszarów" i kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać i ustawić kolor. Teraz użyj narzędzia pędzel malarski, aby śledzić obiekty, takie jak mitochondria, na obrazach z mikrofotografii elektronowej. Użyj "Shift + kliknięcie", aby wypełnić zamknięty okrąg, "Ctrl + przewijanie", aby powiększać i pomniejszać, oraz "Alt + kliknięcie", aby zamienić kursor pędzla w gumkę.
  9. Wybierz dwa obszary o wymiarach ~10 - 15 μm na 10 - 15 μm w lewym górnym i prawym dolnym rogu obrazu i zidentyfikuj wszystkie mitochondria w tych obszarach, aby umożliwić bezstronne pobieranie próbek mitochondriów w każdym zestawie danych.
  10. Na "płótnie" obserwuj i śledź mitochondria we wszystkich sekcjach. Uwaga: Mitochondria to dość ciemne/gęsto wyglądające organelle, o podobnej wielkości średnicy i luźno cylindryczne. Unikalne cristae utworzone przez błonę wewnętrzną są łatwo rozpoznawalne wewnątrz tej organelli.
  11. Po zakończeniu śledzenia kliknij prawym przyciskiem myszy area_list pod zakładką Przestrzeń Z, wybierz "Pokaż w 3D". Spowoduje to uruchomienie wtyczki przeglądarki 3D, aby wyświetlić rekonstrukcję 3D obrysowanego obrazu.
    1. Aby wykonać pomiary objętości mitochondriów, wybierz obiekt w przeglądarce 3D, kliknij zakładkę "Edycja" i wybierz "Właściwości obiektu". Oszacowanie objętości mitochondriów jest wymienione wraz z kilkoma innymi pomiarami.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykazujemy, że morfologia i rozmiar mitochondriów mózgu są niejednorodne w różnych podprzedziałach neuronalnych. Mikroskopia konfokalna na kulturach neuronalnych o niskiej gęstości transdukowanych lentiwirusem eksprymującym mitochondrialne białko zielonej fluorescencji wykazało, że mitochondria znajdujące się w somie neuronalnej tworzą siatkowatą sieć, podczas gdy te znajdujące się w dystalnych neurytach wykazują dyskretną wydłużoną morfologię (ryc. 1 A-B). Za pomocą tech...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Złożoność układu nerwowego stanowi poważne wyzwanie w rekonstrukcji dużych objętości tkanek oraz analizie morfologii i rozmieszczenia organelli, takich jak mitochondria, z odpowiednią rozdzielczością. Wiele komórek, w tym neurony, oligodendrocyty i astrocyty z licznymi procesami rozszerzonymi w trzech wymiarach, oddziałuje w tkance mózgowej 43. Ponieważ mitochondria znajdują się zarówno w somie komórek, jak i odległych procesach, morfologia mitochondriów jest niezwykle pleomorficzna w układzie nerwowym (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. Emily K Benson jest płatnym pracownikiem Renovo Neural Inc., a Grahame J. Kidd pełni funkcję dyrektora naukowego 3DEM w Renovo Neural Inc., która jest komercyjnym dostawcą usług i analiz SEM typu serial block-face.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Sidneyowi Walkerowi za pomoc techniczną. Prace te zostały częściowo wsparte grantem z Narodowego Instytutu Zdrowia (1R01EY024712-01A1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Myszy C57BL/6J Laboratorium Jacksona 664
IsofluraneVETone, nazwa handlowa Fluriso501017
Taca preparcyjnaFisher scientific S65105 
Nożyczki preparacyjneTed Pella Inc.1316
Kaniula motylaExel International26704
Bufor fosforanowy sól fizjologicznaSigma-AldrichP4417-100TAB
Filtr (0,45 mikrona)EMD MiliporeNC0813356
Mikroskop preparacyjnyOlympusSZ61
do cięcia wibratomuTed Pella Inc.Vibratome 3000
Kakodylan soduEMS12300
Kwas garbnikowyEMS21700
Żelazocyjanek potasuJ.T. Baker14459-95-1
Tetratlenek osmu 4% roztwórEMS19150
TiokarbohydrazydEMS21900
Kwas L-asparaginowySigma-AldrichA93100
Wodorotlenek potasuAcros Organics43731000
Azotan ołowiuEMS17900
EMbed-812 ZESTAW DO OSADZANIAEMS14120Zawiera żywicę Embed 812 , DDSA, NMA i DMP-30.
Aldehyd glutarowy 25% klasy EMPolysciences Inc.1909
ParaformaldehydEMS19202
Octan uranyluEMS22400
EtanolEMS15055
Tlenek propylenuEMS20400
Forma do zatapianiaEMS70907
Aluminiowa próbka szpilkiEMS70446
Srebro koloidalne PłynEMS12630
RazorEMS72000
Super Glue (Loctite Gel Control)Loctite234790Sklepy z narzędziami/rękodziełem oferują ten przedmiot
Przewodząca żywica epoksydowaTed Pella Inc.16043
Skaningowy mikroskop elektronowyZeissSigma VP
Ultramikrotom komorowy dla SEMGatan Inc.3View2Może być zaprojektowany dla innych SEMów
Mikroskop do przycinania do przygotowania szpilekGatan Inc.dostarczany w ramach systemu
Detektor elektronów wstecznie rozproszonych Low kVGatan Inc.Pakiet przetwarzania 3V-BSED
ImageJ/ Fidżi ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf
http://rsb.info.nih.gov/ij/
http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf
http://fiji.sc/TrakEM2
System 3View

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kasahara, A., Scorrano, L. Mitochondria: from cell death executioners to regulators of cell differentiation. Trends Cell Biol. 24, 761-770 (2014).
  2. Friedman, J. R., et al. ER tubules mark sites of mitochondrial division. Science. 334, 358-362 (2011).
  3. Bereiter-Hahn, J., Voth, M., Mai, S., Jendrach, M. Structural implications of mitochondrial dynamics. Biotechnol J. 3, 765-780 (2008).
  4. Campello, S., Scorrano, L. Mitochondrial shape changes: orchestrating cell pathophysiology. EMBO Rep. 11, 678-684 (2010).
  5. Trimmer, P. A., et al. Abnormal mitochondrial morphology in sporadic Parkinson's and Alzheimer's disease cybrid cell lines. Exp Neurol. 162, 37-50 (2000).
  6. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases. Hum Mol Genet. 18, 169-176 (2009).
  7. Li, Z., Okamoto, K., Hayashi, Y., Sheng, M. The importance of dendritic mitochondria in the morphogenesis and plasticity of spines and synapses. Cell. 119, 873-887 (2004).
  8. Romanello, V., et al. Mitochondrial fission and remodelling contributes to muscle atrophy. EMBO J. 29, 1774-1785 (2010).
  9. Szabadkai, G., et al. Drp-1-dependent division of the mitochondrial network blocks intraorganellar Ca2+ waves and protects against Ca2+-mediated apoptosis. Mol Cell. 16, 59-68 (2004).
  10. Yu, T., Robotham, J. L., Yoon, Y. Increased production of reactive oxygen species in hyperglycemic conditions requires dynamic change of mitochondrial morphology. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 2653-2658 (2006).
  11. Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat Cell Biol. 9, 99-105 (2007).
  12. Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., 3rd,, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25, 158-170 (2015).
  13. Macke, J. H., et al. Contour-propagation algorithms for semi-automated reconstruction of neural processes. J Neurosci Methods. 167, 349-357 (2008).
  14. Parikh, S. The neurologic manifestations of mitochondrial disease. Dev Disabil Res Rev. 16, 120-128 (2010).
  15. Frye, R. E., Rossignol, D. A. Mitochondrial dysfunction can connect the diverse medical symptoms associated with autism spectrum disorders. Pediatr Res. 69, 41-47 (2011).
  16. Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1366, 211-223 (1998).
  17. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial disorders in the nervous system. Annu Rev Neurosci. 31, 91-123 (2008).
  18. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial respiratory-chain diseases. N Engl J Med. 348, 2656-2668 (2003).
  19. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Hum Mol Genet. 20, 4515-4529 (2011).
  20. Anitha, A., et al. Downregulation of the expression of mitochondrial electron transport complex genes in autism brains. Brain Pathol. 23, 294-302 (2013).
  21. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Methods. 4, 559-561 (2007).
  22. Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 10515-10520 (2015).
  23. Shepherd, G. M., Harris, K. M. Three-dimensional structure and composition of CA3→CA1 axons in rat hippocampal slices: implications for presynaptic connectivity and compartmentalization. J Neurosci. 18, 8300-8310 (1998).
  24. Wang, C., et al. Dynamic tubulation of mitochondria drives mitochondrial network formation. Cell Res. 25 (10), 1108-1120 (2015).
  25. Glancy, B., et al. Mitochondrial reticulum for cellular energy distribution in muscle. Nature. 523, 617-620 (2015).
  26. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics in mammals. Curr Top Dev Biol. 59, 119-144 (2004).
  27. Chavan, V., et al. Central presynaptic terminals are enriched in ATP but the majority lack mitochondria. PLoS One. 10, e0125185(2015).
  28. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  29. Harris, K. M., et al. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. J Neurosci. 26, 12101-12103 (2006).
  30. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68(2014).
  31. Bushby, A. J., et al. Imaging three-dimensional tissue architectures by focused ion beam scanning electron microscopy. Nat Protoc. 6, 845-858 (2011).
  32. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329(2004).
  33. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scan Electron Microsc. , 73-76 (1981).
  34. Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
  35. Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. J Microsc. 259, 155-164 (2015).
  36. Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J Mol Cell Cardiol. 76, 1-11 (2014).
  37. Miyazaki, N., Esaki, M., Ogura, T., Murata, K. Serial block-face scanning electron microscopy for three-dimensional analysis of morphological changes in mitochondria regulated by Cdc48p/p97 ATPase. J Struct Biol. 187, 187-193 (2014).
  38. Traka, M., et al. WDR81 is necessary for purkinje and photoreceptor cell survival. J Neurosci. 33, 6834-6844 (2013).
  39. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9953-9958 (2014).
  40. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , University of California San Diego. San Diego, CA. Available at http://ncmir.ucsd.edu/sbfsem-protocol.pdf (2010).
  41. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of Ranvier. J Neurosci. 31, 7249-7258 (2011).
  42. Hammer, S., Monavarfeshani, A., Lemon, T., Su, J., Fox, M. A. Multiple Retinal Axons Converge onto Relay Cells in the Adult Mouse Thalamus. Cell Rep. 12, 1575-1583 (2015).
  43. Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162, 648-661 (2015).
  44. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2, 920-931 (2005).
  45. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  46. Bohorquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J Vis Exp. , e52918(2015).
  47. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. J Microsc. 218, 52-61 (2005).
  48. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7, e38011(2012).
  49. Helmstaedter, M., Mitra, P. P. Computational methods and challenges for large-scale circuit mapping. Curr Opin Neurobiol. 22, 162-169 (2012).
  50. Helmstaedter, M., Briggman, K. L., Denk, W. High-accuracy neurite reconstruction for high-throughput neuroanatomy. Nat Neurosci. 14, 1081-1088 (2011).
  51. Saalfeld, S., Cardona, A., Hartenstein, V., Tomancak, P. CATMAID: collaborative annotation toolkit for massive amounts of image data. Bioinformatics. 25, 1984-1986 (2009).
  52. Giuly, R. J., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Method: automatic segmentation of mitochondria utilizing patch classification, contour pair classification, and automatically seeded level sets. BMC Bioinformatics. 13, 29(2012).
  53. Jakobs, S., Wurm, C. A. Super-resolution microscopy of mitochondria. Curr Opin Chem Biol. 20, 9-15 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Serial Block Face Scanning Electron MicroscopyMitochondrial Morphology AnalysisBrain Mitochondria ImagingElectron Microscopy TechniqueMitochondria Volume MeasurementMitochondria Distribution StudyMitochondria Number QuantificationRodent Brain Tissue PreparationUltrastructural Characteristics AnalysisMitochondria Compartment Classification

Related Articles