Artykuł metodologiczny

Obserwacja podziału i dynamiki mitotycznej w żywym zarodku danio pręgowanego

11.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54218

⸱

15 lipca 2016

 , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Alabama at Birmingham

W tym artykule

Podsumowanie

Mitoza jest niezbędna dla każdego żywego organizmu, a defekty często prowadzą do raka i zaburzeń rozwojowych. Korzystając z tego protokołu obrazowania i danio pręgowanego jako systemu modelowego, naukowcy mogą wizualizować mitozę w żywym organizmie kręgowców i mnogość defektów, które powstają, gdy procesy mitotyczne są wadliwe.

Streszczenie

Mitoza jest kluczowa dla wzrostu i różnicowania organizmu. Proces ten jest bardzo dynamiczny i wymaga uporządkowanych zdarzeń, aby osiągnąć prawidłową kondensację chromatyny, przyłączanie mikrotubula i kinetochor, segregację chromosomów i cytokinezę w krótkim czasie. Błędy w delikatnym procesie mogą skutkować chorobami u ludzi, w tym wadami wrodzonymi i rakiem. Tradycyjne podejścia do badania ludzkich stanów choroby mitotycznej często opierają się na systemach hodowli komórkowych, które nie mają naturalnej fizjologii i kontekstu rozwojowego/tkankowego, co jest korzystne podczas badania chorób ludzkich. Protokół ten pokonuje wiele przeszkód, zapewniając sposób wizualizacji, z wysoką rozdzielczością, dynamiki chromosomów w systemie kręgowców, danio pręgowanego. Protokół ten szczegółowo opisze podejście, które można wykorzystać do uzyskania dynamicznych obrazów dzielących się komórek, które obejmują: transkrypcję in vitro, hodowlę/kolekcjonowanie danio pręgowanego, osadzanie zarodków i obrazowanie poklatkowe. Badane są również optymalizacje i modyfikacje tego protokołu. Korzystanie z H2A. F / Z-EGFP (znakuje chromatynę) i mCherry-CAAX (znakuje błonę komórkową) zarodki wstrzyknięte mRNA, wizualizuje się mitozę u AB typu dzikiego, auroraBhi1045 i esco2hi2865 zmutowanego danio pręgowanego. Obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości u danio pręgowanego pozwala na obserwację wielu mitoz w celu statystycznego ilościowego określenia defektów mitotycznych i czasu progresji mitotycznej. Ponadto obserwuje się aspekty jakościowe, które definiują nieprawidłowe procesy mitotyczne (tj. wady kongresowe, nieprawidłowa segregacja chromosomów itp.) oraz niewłaściwe wyniki chromosomowe (tj. aneuploidia, poliploidia, mikrojądra itp.). Test ten może być stosowany do obserwacji różnicowania/rozwoju tkanek i jest podatny na stosowanie zmutowanych danio pręgowanych i środków farmakologicznych. Wizualizacja tego, w jaki sposób defekty mitozy prowadzą do raka i zaburzeń rozwojowych, znacznie poprawi zrozumienie patogenezy choroby.

Wprowadzenie

Mitoza jest krytycznym procesem komórkowym niezbędnym do wzrostu, różnicowania i regeneracji w żywym organizmie. Po dokładnym przygotowaniu i replikacji DNA w interfazie, komórka jest przygotowana do podziału. Pierwsza faza mitozy, profaza, jest inicjowana przez aktywację cykliny B/Cdk1. Profaza charakteryzuje się kondensacją materiału chromatynowego w chromosomach. Rozpad otoczki jądrowej następuje na przejściu między profazą a prometafazą. W prometafazie centrosomy, centrum zarodkowania do tworzenia wrzeciona, zaczynają migrować na przeciwległe bieguny, jednocześnie wydłużając mikrotubule w poszukiwaniu przyczepienia kinetochoru. Po przyłączeniu, konwersje do przyłączenia mikrotubul typu end-on i siły naciągu orientują chromosomy, tworząc płytkę metafazową1. Jeśli wszystkie chromosomy są prawidłowo połączone, punkt kontrolny montażu wrzeciona jest spełniony, pierścienie kohezyny utrzymujące razem chromatydy siostrzane są rozszczepiane, a mikrotubule skracają się, aby przyciągnąć chromatydy siostrzane do przeciwległych biegunów podczas anafazy2,3. Ostatnia faza, telofaza, polega na wydłużeniu komórki i reformacji otoczki jądrowej wokół dwóch nowych jąder. Cytokineza kończy proces podziału poprzez oddzielenie cytoplazmy dwóch nowych komórek potomnych4-6. Zmiana kluczowych szlaków mitotycznych (tj. punkt kontrolny składania wrzeciona, duplikacja centrosomów, kohezja chromatyd siostrzanych itp.) może spowodować zatrzymanie metafazy, nieprawidłową segregację chromosomów i niestabilność genomu7-10. Ostatecznie defekty w szlakach kontrolujących mitozę mogą powodować zaburzenia rozwojowe i raka, co wymaga wizualizacji mitozy i jej defektów w żywym, kręgowym, wielokomórkowym organizmie10-16.

Zarodki zebry pręgowanego służą jako doskonały organizm modelowy do obrazowania na żywo ze względu na przezroczystą tkankę, łatwość mikroiniekcji i szybki rozwój. Ogólnym celem tego manuskryptu jest opisanie metody obrazowania na żywo 5D (wymiary X, Y, Z, czas i długość fali) mitozy17 (ryc. 1C). Wykorzystanie zmutowanych danio pręgowanych z uszkodzeniami w różnych szlakach mitotycznych pokazuje konsekwencje takich defektów. Do tego protokołu wybrano mutanty Aurora B i Esco2, aby zilustrować te defekty. Aurora B to kinaza, która jest częścią kompleksu pasażerskiego chromosomu (CPC) biorącego udział w tworzeniu wrzeciona i przyczepianiu mikrotubul. Jest również niezbędny do tworzenia bruzd rozszczepienia w cytokinezie18,19. U danio pręgowanego niedobór Aurory B prowadzi do wad w indukcji bruzdy, cytokinezie i segregacji chromosomów20. Z drugiej strony Esco2 jest acetylotransferazą, która jest niezbędna do spójności chromatyd siostrzanych21,22. Acetyluje kohezynę na części SMC3 pierścienia, stabilizując w ten sposób kohezynę, aby zapewnić prawidłową segregację chromosomów podczas przejścia metafaza-anafaza23. Utrata Esco2 u danio pręgowanego prowadzi do nieprawidłowej segregacji chromosomów, przedwczesnej separacji chromatyd siostrzanych, niestabilności genomu oraz zależnej i niezależnej apoptozy p5324,25. Ze względu na dostępność, do zilustrowania tej techniki zostaną użyte zmutowane auroraBhi1045 i esco2hi2865 (zwane dalej odpowiednio aurBm/m i esco2m/m)25-27.

Sprzężenie mikroskopii konfokalnej z maszynerią komórkową znakowaną fluorescencyjnie umożliwiło badaczom wizualizację chromatyny i dynamiki błony komórkowej podczas mitozy25,28,29. Histony znakowane fluorescencyjnie były historycznie używane do wizualizacji chromatyny. Histony to białka jądrowe złożone z czterech różnych par (H2A, H2B, H3 i H4), które są odpowiedzialne za strukturę nukleosomów tworzących chromosomy30. Podczas gdy H2B jest prawdopodobnie najczęściej używanym histonem do białek fluorescencyjnych w hodowlach myszy i komórek, zastosowanie histonu 2A, rodziny Z (H2A. F/Z) okazał się dobry do stosowania u danio pręgowanego31,32. Na przykład konkanawalina A i kinaza kazeinowa 1-gamma lokalizują się w błonie komórkowej i wcześniej wykazano skuteczność w wizualizacji błony komórkowej u jeżowców i muszki33,34. Inne badania wykazały, że białko znakowane fluorescencyjnie CAAX znakuje błonę komórkową i odniosło sukces u danio pręgowanego31. CAAX to motyw, który jest rozpoznawany przez potranslacyjne enzymy modyfikujące, takie jak farnezylotransferazy i geranylgeranylotransferazy. Modyfikacje zadane przez te enzymy powodują, że białka stają się związane z błoną, znakując w ten sposób błonę komórkową35.

Ze względu na wcześniejsze użycie u danio pręgowanego, ten protokół zdecydował się na użycie H2A. F/Z i CAAX do znakowania chromatyny i błony komórkowej. Zastosowanie tej metody pozwoli badaczowi monitorować mitozę na poziomie poszczególnych komórek, obserwować dynamikę poszczególnych chromosomów, a także jednocześnie monitorować wiele podziałów komórkowych, które mogą wpływać na różnicowanie i rozwój tkanek. W tym artykule skupimy się na obrazowaniu dynamiki segregacji chromosomów podczas mitozy na poziomie pojedynczej komórki. W tym manuskrypcie zostanie zilustrowana i omówiona umiejętność obserwacji kilku podziałów mitotycznych, obliczania czasu podziału i rozszyfrowywania fenotypów mitotycznych. Korzystając z tych parametrów, można zebrać fizjologicznie istotne dane i zastosować je do kilku stanów chorobowych dotkniętych defektami mitotycznymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Transkrypcja in vitro

  1. Linearyzacja wektorów pCS2-H2A.F/Z-EGFP i/lub pCS2-mCherry-CAAX za pomocą trawienia enzymu restrykcyjnego NotI31. Korzystając z zestawu do transkrypcji RNA in vitro, wygeneruj 5-calowe produkty mRNA z każdej matrycy, zgodnie z protokołem producenta.
  2. Oczyść zakryte mRNA za pomocą zestawu do oczyszczania. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Elute za pomocą H2O, wolnego od RNaz.
  3. Oznaczyć stężenie RNA przez absorbancję przy 260 nm za pomocą spektrofotometru. (OD260 x rozcieńczenie x 40 μg/ml).
  4. Rozcieńczyć RNA do 100 ng/μl dla każdego H2A. F/Z-EGFP i mCherry-CAAX z H2O, wolnym od RNaz. Jeśli stężenie RNA jest zbyt niskie, fluorescencja będzie zmniejszona lub nieobecna. Jaśniejsze próbki zmniejszą obawy związane z fototoksycznością i fotowybielaniem. Z drugiej strony, zbyt duża ilość RNA może być toksyczna i/lub powodować efekty niezamierzone.
    Uwaga: Pozostałe oczyszczone mRNA należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C.

2. Hodowla danio pręgowanego, pobieranie zarodków i wstrzykiwanie mRNA 36-38

  1. Zmontuj zbiorniki hodowlane z barierą, aby podzielić zbiornik na dwa regiony i napełnij każdy zbiornik hodowlany wodą z systemu akwakultury używaną w obiekcie danio pręgowanego.
  2. Aby zapobiec przedwczesnemu rozmnażaniu, na noc przed rozmnażaniem umieść dwie samce po jednej stronie bariery, a dwie samice po drugiej stronie.
  3. Następnego dnia przygotowaną wcześniej mieszaninę mRNA rozmrozić na lodzie. Zastąp wodę w zbiornikach hodowlanych świeżą wodą z systemu akwakultury i usuń bariery. Natychmiast po pociągnięciu barier należy rozgrzać formę wtryskową do temperatury 28,5 °C i ustawić sprzęt do mikrowtrysku.
    Uwaga: Informacje na temat form wtryskowych można znaleźć w Gerlach36.
  4. Zbieraj jajka co 10 - 15 minut za pomocą sitka do herbaty i płucz jajka na czystej szalce Petriego o wymiarach 100 x 15 mm z E3 Blue (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mMMgSO4, 10-5% błękitu metylenowego). E3 Blue służy do zapobiegania rozwojowi grzybów i zapewnienia prawidłowego rozwoju larw ryb. Więcej informacji na temat krycia i pobierania zarodków można znaleźć w Gerlach36 i Porazinkski37.
  5. Osadź jednokomórkowe zarodki w rozgrzanej formie iniekcyjnej i wstrzyknij RNA do żółtka w żądanej liczbie zarodków (ryc. 1A). Weź pod uwagę naturalną śmierć zarodków i zarodki niezapłodnione, wykonując zastrzyki embrionalne na 15% więcej zarodków niż jest to potrzebne w eksperymencie. Dodatkowe informacje na temat mikroiniekcji zarodków danio pręgowanego można znaleźć w Gerlach36 i Porazinkski37.
    UWAGA: W przypadku pierwszego użycia mRNA należy przeprowadzić analizę krzywej dawki, aby określić optymalną dawkę dla fluorescencji i żywotności (zdefiniowanej jako brak poważnych wad rozwojowych do 5 dpf) przed wykonaniem obrazowania 5D. 150 - 200 ng/μl wstrzyknięte do zarodków to często optymalne stężenie, dlatego jest dobrym punktem wyjścia do końcowego stężenia.
  6. Ostrożnie wyekstrahuj wstrzyknięte zarodki z formy za pomocą zmodyfikowanej 9-calowej szklanej pipety Pasteura. Aby zmodyfikować pipetę, rozpuść końcówkę za pomocą palnika Bunsena, aż utworzy kulę.
  7. Umieścić wstrzyknięte zarodki na szalce Petriego o wymiarach 100 x 15 mm w kolorze niebieskim E3 i umieścić w inkubatorze o temperaturze 28,5 °C.
  8. Sześć godzin po wstrzyknięciu usuń z płytek martwe lub niezapłodnione zarodki i dodaj czysty E3 Blue. Umieścić zarodki w temperaturze 28,5 °C.

3. Przygotowanie i osadzanie żywych zarodków danio pręgowanego do obrazowania (Rysunek 1B)

  1. Dwie godziny przed obrazowaniem należy przebadać wstrzyknięte zarodki pod kątem GFP za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego. Umieść jasnozielone zarodki z ekspresją GFP na nowej szalce Petriego o wymiarach 100 x 15 mm z E3 Blue.
  2. Zagotuj roztwór podstawowy 1% niskotopliwej agarozy, dodając 1 g niskotopliwej agarozy do 100 ml E3 Blue. Po użyciu agarozy przykryj kolbę folią aluminiową. Roztwór podstawowy pozostaje przydatny przez okres do jednego miesiąca.
  3. Podwielokrotność 3 ml stopionego agaru przelać do probówki hodowlanej o wymiarach 17 x 100 mm. Utrzymuj agarozę w cieple, umieszczając probówkę hodowlaną w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C, aż będzie gotowa do użycia. Przygotuj 15 mM roztwór trikainy w wodzie dejonizowanej, aby znieczulić zarodki danio pręgowanego36.
    UWAGA: Jeśli pożądane jest obrazowanie we wcześniejszych punktach czasowych, stężenie agaru można zmniejszyć nawet do 0,3%39.
  4. Przynieś 15 mM trikainy, przesiane zarodki, niskotopliwą agarozę, E3 Blue i 35-milimetrową szklaną nakrywkową nasadkę do hodowli pod mikroskopem rozwarstwiającym. Ostrożnie usuń kosmówkę zarodka za pomocą pęsety #5. Zrób to dla trzech zarodków.
  5. Umieścić zarodki z odciętą kosmówką w osobnym pojemniku do znieczulenia. Do tego celu często używa się pokrywki dolnego naczynia szkiełka nakrywkowego. Za pomocą pipety transferowej dodać trzy krople (około 150 μl) 15 mM trikainy do naczynia z 5 ml E3 blue (w przypadku używania pokrywki dolnego naczynia szkiełka nakrywkowego) lub do momentu, gdy zarodki zostaną wystarczająco znieczulone. Ponadto dodaj 3-4 krople (około 150 - 200 μl) 15 mM roztworu trikainy do 1% stopionej probówki agarozowej.
  6. Za pomocą pipety p200 z odciętą 1 cm końcówką pipety, przenieść znieczulone zarodki do naczynia z dnem szkiełka nakrywkowego. Usuń nadmiar roztworu E3 Blue:Tricaine.
  7. Powoli dodaj 5 - 10 μl niskotopliwego roztworu agarozy:Trikainy na zarodki, trzymając każdą kroplę oddzielnie, aby upewnić się, że zarodki nie zbliżą się przypadkowo do siebie.
    Ostrzeżenie: Jeśli agaroza jest zbyt ciepła, uszkodzi zarodek. Dobra temperatura do utrzymania agaru to 42 °C.
  8. Za pomocą igły 21 G 1 1/2 delikatnie ustaw zarodek w agarozie w żądanej pozycji. W przypadku korzystania z mikroskopu odwróconego do obrazowania poklatkowego należy ustawić obszar zainteresowania (ROI) jak najbliżej szkiełka nakrywkowego.
    Uwaga: Do celów ogólnych obszar ogonowy zapewnia łatwą orientację i przejrzystość ze względu na stosunkowo cienką tkankę (ryc. 1A). Można wykorzystać inne tkanki, takie jak warstwa nabłonkowa otaczająca żółtko i fałdy płetw28,29. Tkanki te zapewniają dużą przejrzystość, jednak te obszary mają tylko kilka warstw komórek grubości. Dla celów tego protokołu korzystne jest zobrazowanie obszaru ogona, aby uzyskać jak najwięcej podziałów komórkowych.
  9. Odczekaj kilka minut na częściowe zestalenie się agaru. Użyj igły, aby rozbić mały kawałek agaru, aby sprawdzić jego zestalenie. Gdy kawałek agaru można oderwać od kropli, przejdź do następnego kroku.
  10. Przykryj całe szkiełko nakrywkowe niskotopliwym agarem, tworząc kopułę nad osadzonymi zarodkami. Poczekaj, aż agar zastygnie przed przesunięciem naczynia w celu obrazowania konfokalnego (ryc. 1A).
  11. Podczas procesu krzepnięcia agaru (trwa około 10 minut) należy przygotować 3 ml roztworu E3 Blue z pięcioma kroplami (około 250 μl) 15 mM Trikainy, które należy umieścić na osadzonych zarodkach podczas obrazowania.

4. Obrazowanie konfokalne 5D żywych zarodków danio pręgowanego40,41

UWAGA: Zobacz Ariga40 i O'Brien41, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wykonywania obrazowania 5D przy użyciu innych systemów konfokalnych. Aby zapoznać się z definicjami interwału Z, stosu Z, głębokości Z, przedziału czasu i 5D, patrz rysunek 1C.

  1. Otwórz oprogramowanie do obrazowania i ustaw mikroskop na soczewkę obiektywową 60X NA 1.4. Nałóż olejek immersyjny na soczewkę obiektywu i umieść naczynie hodowlane w uchwycie na szkiełku na stoliku mikroskopu. Za pomocą kontrolera osi wyśrodkuj interesujący zarodek nad soczewką obiektywu i skieruj soczewkę obiektywu do góry, aby spotkała się z naczyniem hodowlanym.
  2. Kliknij ikonę okularu i przełącz się na filtr GFP w mikroskopie. Skoncentruj się na zwrocie z inwestycji. Skupienie się na tkance znajdującej się najbliżej szkiełka nakrywkowego zapewni najlepsze wyniki obrazowania.
  3. Usuń blokadę. Wybierz kanały GFP i mCherry (wstępnie ustawione długości fal w oprogramowaniu) i ustaw opcję uśredniania linii na normalną.
  4. Użyj polecenia "View/Acquisition Controls/A1 Scan Area", aby otworzyć narzędzie A1 Scan Area (Obszar skanowania A1).
  5. Rozpocznij skanowanie. Za pomocą kontrolera osi ustaw zarodek tak, aby obszar skanowania był wypełniony jak największą ilością danio pręgowanego. Moc lasera nie musi być w tym momencie optymalna. Zmniejsz moc lasera, aby uniknąć niepotrzebnego fotowybielania.
  6. Użyj polecenia "View/Acquisition Controls/ND acquisition" (Widok/Kontrola namierzania/Pozyskiwanie ND), aby otworzyć panel sterowania akwizycją ND.
  7. Rozpocznij skanowanie, aby ustawić parametry stosu Z. Ustaw górny limit stosu Z na miejsce, w którym komórki nie są aktywne, a dolny limit na miejsce, w którym komórki nie są już widoczne. Pozostawić 3 μm przestrzeni nad próbką na wzrost i ruch komórek, które mogą rozszerzać się w polu obrazowania. Stos Z dla figur pokazanych w tym protokole obejmował głębokość Z 40 μm w ogonie zarodka.
  8. Ustaw rozmiar kroku interwału Z na 2 μm. Średnio komórka ma średnicę 10 μm; W związku z tym 2 μm da pięć interwałów danych obrazowych, które będą analizowane dla każdej komórki.
    UWAGA: Głębia obrazu, którą można uzyskać, zależy od interwału Z. Rozdzielczość Z jest poświęcana, aby uzyskać ogólną głębię w wymiarze Z, aby zobrazować jak najwięcej komórek przechodzących mitozę (duża głębokość Z). Odwrotność jest prawdziwa, ponieważ zmniejszając rozmiar kroku, uzyskuje się rozdzielczość Z, podczas gdy poświęcana jest głębokość Z (mała głębokość Z).
  9. Dostosuj moc lasera obrazu, HV i poziomy przesunięcia. Do eksperymentów zademonstrowanych w tym protokole należy użyć następujących poziomów mocy lasera, HV i przesunięcia ustawionych odpowiednio na odpowiednich poziomach dla kanału GFP; 2 - 5, 120 - 140 i -9 do -11. W przypadku kanału mCherry należy użyć odpowiednio następujących poziomów mocy lasera, HV i przesunięcia; 3 - 6, 120 - 140 i -3 do -8. Po ustawieniu parametrów wyłącz skanowanie, aby zapobiec niepotrzebnej ekspozycji lasera, która może spowodować fototoksyczność i fotowybielanie próbki.
  10. Wybierz ikonę uśredniania 2x linii. "Bez uśredniania" daje ziarnisty obraz, podczas gdy "4-krotne uśrednianie linii" drastycznie wydłuża czas skanowania. Zastosowanie 2-krotnego uśredniania linii zapewnia najlepszą jakość obrazu i najszybszy czas skanowania.
  11. Wybierz odpowiedni przedział czasu i czas trwania niezbędny do przeprowadzenia eksperymentu. W przypadku podziałów typu dzikiego dwuminutowe interwały czasowe przez 2 godziny są najlepsze do określenia czasu trwania mitozy (używane na rysunkach 1, 2, 3A i 3B). Podziały, które aktywują punkt kontrolny zespołu wrzeciona na dłużej niż 30 minut, są bardziej odpowiednie dla pięciominutowych odstępów przez cztery godziny w celu zachowania fluorescencji, jak pokazano na rysunku 3C.
  12. Zaznacz pole "zapisz do pliku" i nazwij plik, aby automatycznie zapisywać plik w miarę jego pobierania. Dokładnie sprawdź, czy wszystkie parametry są ustawione poprawnie i naciśnij "rozpocznij bieg".
  13. Po zakończeniu pobierania, aby wyświetlić plik w formacie trójwymiarowym, kliknij ikonę progu głośności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 2 demonstruje możliwość obserwacji wielu podziałów komórkowych przy użyciu szerokiego pola widzenia ogona zarodka danio pręgowanego typu dzikiego AB. W odstępie czasu 14 min obrazowano ponad siedem komórek w fazie mitozy (Film 1). W ciągu dwugodzinnego przebiegu czasowego zarejestrowano ponad 40 zdarzeń mitotycznych. Średnio zaobserwowano 50 dzielących się komórek w embrionach AB i 30 dzielących się komórek w embrionach aurBm/m

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zastosowanie tej metody pozwala wywnioskować rozpad otoczki jądrowej, utworzenie płytki metafazowej przez przyłączenie mikrotubula – kinetochor oraz segregację chromatyd siostrzanych w celu utworzenia dwóch nowych komórek in vivo i w sposób zależny od czasu. Możliwość obserwacji mitozy u danio pręgowanego jest korzystniejsza w porównaniu ze stałymi próbkami i systemami hodowli komórkowych, ponieważ komórki są obrazowane w naturalnej fizjologii, tkanka jest przezroczysta, co pozwala na zastosowanie białek fluores...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Kristen Kwan za wektory pCS2-H2A.F/Z-EGFP i pCS2-mCherry-CAAX. Dziękujemy Chrisowi Rodeschowi za udzielenie nam korepetycji z obrazowania na żywo u danio pręgowanego. Dziękujemy Shawnowi Williamsowi, Erikowi Malarkeyowi i Bradowi Yoderowi za pomoc w obrazowaniu konfokalnym w UAB i High Resolution Imaging Facility w UAB. Zakład Obrazowania w Wysokiej Rozdzielczości jest wspierany przez UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) oraz Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. jest wspierany przez National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105) oraz granty pilotażowe od American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) i UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. jest wspierany przez Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wektory pCS2Prezent od K. KwanaDla plazmidu zainteresowania
Enzym restrykcyjny NotI-HFNew England BioLabsR3189SDo trawienia restrykcyjnego plazmidu
Zestaw mMessage SP6Life TechnologiesAM1340Do transkrypcji in vitro
Zestaw RNeasy MiniQiagen74104Do oczyszczania mRNA
100 x 15 mm szalki PetriegoFisher ScientificFB0875712Do przechowywania zarodków
forma do mikroiniekcjidomowej robotyDo trzymania zarodków podczas mikroiniekcji
Agaroza IIAmresco0815-25GDo osadzania zarodków
TricaineSigma-AldrichE10521-10GDo znieczulania zarodków
Chlorek soduSigma-AldrichS9888Dla wody zarodkowej (E3 Blue), rozpuszczonej w UltraPure H2O
Chlorek potasuSigma-AldrichP3911Dla wody dla zarodków (E3 Blue), rozpuszczona w UltraPure H2O
Chlorek wapnia dwuwodnySigma-AldrichC8106Do wody dla zarodków (E3 Blue), rozpuszczony w UltraPure H2O
Siarczan magnezuFisher ScientificM7506Do wody zarodkowej (E3 Blue), rozpuszczonej w UltraPure H2O
Methyle BlueHydrate Sigma-AldrichMB1Do wody dla zarodków (E3 Blue), rozpuszczonej w UltraPure H2O
100 mm probówce hodowlanejFisher Scientific50-819-812Do stopionego agaru
35 mm szklane naczynie hodowlane na dnie szkiełka nakrywkowego MatTek CorpP35G-0-20-C Nr 0, szkło 20 mm, Do osadzania zarodków
#5 pęsetaDumont72701-DDo dekorionacji zarodków
Igła 21 G 1 1/2 BectonDickinson305167Do pozycjonowania zarodków w agarze
Mikroskop preparacyjnyNikon AZ100Do badań przesiewowych i osadzania zarodków wystarczy dowolny zakres preparacyjny
konfokalnyNikon A1 +Do obrazowania poklatkowego
Oprogramowanie konfokalneNIS Elements AR 4.13.00Do akwizycji i przetwarzania obrazów
Mikroskop

Bibliografia

  1. Musacchio, A., Hardwick, K. G. The spindle checkpoint: structural insights into dynamic signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 731-741 (2002).
  2. Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
  3. Rieder, C. L., Cole, R. W., Khodjakov, A., Sluder, G. The checkpoint delaying anaphase in response to chromosome monoorientation is mediated by an inhibitory signal produced by unattached kinetochores. J Cell Biol. 130 (4), 941-948 (1995).
  4. Hayles, J., Nurse, P. A review of mitosis in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Exp Cell Res. 184 (2), 273-286 (1989).
  5. Pederson, T. Historical review: an energy reservoir for mitosis, and its productive wake. Trends Biochem Sci. 28 (3), 125-129 (2003).
  6. Sobel, S. G. Mini review: mitosis and the spindle pole body in Saccharomyces cerevisiae. J Exp Zool. 277 (2), 120-138 (1997).
  7. Thompson, S. L., Compton, D. A. Chromosome missegregation in human cells arises through specific types of kinetochore-microtubule attachment errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (44), 17974-17978 (2011).
  8. Duijf, P. H., Benezra, R. The cancer biology of whole-chromosome instability. Oncogene. 32 (40), 4727-4736 (2013).
  9. Lara-Gonzalez, P., Taylor, S. S. Cohesion fatigue explains why pharmacological inhibition of the APC/C induces a spindle checkpoint-dependent mitotic arrest. PLoS One. 7 (11), 49041(2012).
  10. Araujo, A., Baum, B., Bentley, P. The role of chromosome missegregation in cancer development: a theoretical approach using agent-based modelling. PLoS One. 8 (8), 72206(2013).
  11. Deardorff, M. A., et al. HDAC8 mutations in Cornelia de Lange syndrome affect the cohesin acetylation cycle. Nature. 489 (7415), 313-317 (2012).
  12. Chetaille, P., et al. Mutations in SGOL1 cause a novel cohesinopathy affecting heart and gut rhythm. Nat Genet. 46 (11), 1245-1249 (2014).
  13. Kaiser, F. J., et al. Loss-of-function HDAC8 mutations cause a phenotypic spectrum of Cornelia de Lange syndrome-like features, ocular hypertelorism, large fontanelle and X-linked inheritance. Hum Mol Genet. 23 (11), 2888-2900 (2014).
  14. Snape, K., et al. Mutations in CEP57 cause mosaic variegated aneuploidy syndrome. Nat Genet. 43 (6), 527-529 (2011).
  15. Suijkerbuijk, S. J., et al. Molecular causes for BUBR1 dysfunction in the human cancer predisposition syndrome mosaic variegated aneuploidy. Cancer Res. 70 (12), 4891-4900 (2010).
  16. Vega, H., et al. Roberts syndrome is caused by mutations in ESCO2, a human homolog of yeast ECO1 that is essential for the establishment of sister chromatid cohesion. Nat Genet. 37 (5), 468-470 (2005).
  17. Andrews, P. D., Harper, I. S., Swedlow, J. R. To 5D and beyond: quantitative fluorescence microscopy in the postgenomic era. Traffic. 3 (1), 29-36 (2002).
  18. Nigg, E. A. Mitotic kinases as regulators of cell division and its checkpoints. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (1), 21-32 (2001).
  19. Carlton, J. G., Caballe, A., Agromayor, M., Kloc, M., Martin-Serrano, J. ESCRT-III governs the Aurora B-mediated abscission checkpoint through CHMP4C. Science. 336 (6078), 220-225 (2012).
  20. Yabe, T., et al. The maternal-effect gene cellular island encodes aurora B kinase and is essential for furrow formation in the early zebrafish embryo. PLoS Genet. 5 (6), 1000518(2009).
  21. Hou, F., Zou, H. Two human orthologues of Eco1/Ctf7 acetyltransferases are both required for proper sister-chromatid cohesion. Mol Biol Cell. 16 (8), 3908-3918 (2005).
  22. Ivanov, D., et al. Eco1 is a novel acetyltransferase that can acetylate proteins involved in cohesion. Curr Biol. 12 (4), 323-328 (2002).
  23. Beckouet, F., et al. An Smc3 acetylation cycle is essential for establishment of sister chromatid cohesion. Mol Cell. 39 (5), 689-699 (2010).
  24. Monnich, M., Kuriger, Z., Print, C. G., Horsfield, J. A. A zebrafish model of Roberts syndrome reveals that Esco2 depletion interferes with development by disrupting the cell cycle. PLoS One. 6 (5), 20051(2011).
  25. Percival, S. M., et al. Variations in dysfunction of sister chromatid cohesion in esco2 mutant zebrafish reflect the phenotypic diversity of Roberts syndrome. Dis Model Mech. 8 (8), 941-955 (2015).
  26. Amsterdam, A., Hopkins, N. Retroviral-mediated insertional mutagenesis in zebrafish. Methods Cell Biol. 77, 3-20 (2004).
  27. Amsterdam, A., et al. Identification of 315 genes essential for early zebrafish development. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).
  28. Jeon, H. Y., Lee, H. Depletion of Aurora-A in zebrafish causes growth retardation due to mitotic delay and p53-dependent cell death. FEBS J. 280 (6), 1518-1530 (2013).
  29. Jeong, K., Jeong, J. Y., Lee, H. O., Choi, E., Lee, H. Inhibition of Plk1 induces mitotic infidelity and embryonic growth defects in developing zebrafish embryos. Dev Biol. 345 (1), 34-48 (2010).
  30. Bonenfant, D., Coulot, M., Towbin, H., Schindler, P., van Oostrum, J. Characterization of histone H2A and H2B variants and their post-translational modifications by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 5 (3), 541-552 (2006).
  31. Kwan, K. M., et al. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
  32. Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
  33. Davidson, G., et al. Casein kinase 1 gamma couples Wnt receptor activation to cytoplasmic signal transduction. Nature. 438 (7069), 867-872 (2005).
  34. Smith, R. M., et al. Exocytotic insertion of calcium channels constrains compensatory endocytosis to sites of exocytosis. J Cell Biol. 148 (4), 755-767 (2000).
  35. Reid, T. S., Terry, K. L., Casey, P. J., Beese, L. S. Crystallographic analysis of CaaX prenyltransferases complexed with substrates defines rules of protein substrate selectivity. J Mol Biol. 343 (2), 417-433 (2004).
  36. Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. J Vis Exp. (101), e52943(2015).
  37. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J Vis Exp. (46), (2010).
  38. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  39. Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20812-20817 (2009).
  40. Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation. J Vis Exp. (43), (2010).
  41. O'Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (24), (2009).
  42. Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nat Cell Biol. 16 (5), 386-394 (2014).
  43. Gorbsky, G. J. Cohesion fatigue. Curr Biol. 23 (22), 986-988 (2013).
  44. Daum, J. R., et al. Cohesion fatigue induces chromatid separation in cells delayed at metaphase. Curr Biol. 21 (12), 1018-1024 (2011).
  45. Germann, S. M., et al. TopBP1/Dpb11 binds DNA anaphase bridges to prevent genome instability. J Cell Biol. 204 (1), 45-59 (2014).
  46. Chan, K. L., North, P. S., Hickson, I. D. BLM is required for faithful chromosome segregation and its localization defines a class of ultrafine anaphase bridges. EMBO J. 26 (14), 3397-3409 (2007).
  47. Wuhr, M., Obholzer, N. D., Megason, S. G., Detrich, H. W., Mitchison 3rd,, J, T. Live imaging of the cytoskeleton in early cleavage-stage zebrafish embryos. Methods Cell Biol. 101, 1-18 (2011).
  48. Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).
  49. Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. CDK-dependent phosphorylation and nuclear exclusion coordinately control kinetochore assembly state. J Cell Biol. 201 (1), 23-32 (2013).
  50. Scott, E. S., O'Hare, P. Fate of the inner nuclear membrane protein lamin B receptor and nuclear lamins in herpes simplex virus type 1 infection. J Virol. 75 (18), 8818-8830 (2001).
  51. Shankaran, S. S., Mackay, D. R., Ullman, K. S. A time-lapse imaging assay to study nuclear envelope breakdown. Methods Mol Biol. 931, 111-122 (2013).
  52. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  53. Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
  54. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  55. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
  56. Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9 (12), 114632(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie na ywomikroskopia konfokalnadynamika chromosom wH2A F Z EGFPmCherry CAAXmutant kinazy Aurora Bmutant Esco2obrazowanie poklatkowe

Powiązane artykuły