Artykuł metodologiczny

VacuSIP, ulepszona metoda InEx do pomiaru in situ cząstek stałych i rozpuszczonych związków przetwarzanych przez aktywne podajniki zawiesiny

10.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54221

⸱

3 sierpnia 2016

 ,  ,  , 
1Department of Marine Ecology, Centre d’Estudis Avançats de Blanes (CEAB-CSIC), 2Department of Marine Biology and Oceanography, Institut de Ciències del Mar (ICM-CSIC), 3The School of Marine Science, Ruppin Academic Center

W tym artykule

Podsumowanie

Wprowadzamy VacuSIP, prostą, nieinwazyjną i niezawodną metodę czystego i dokładnego punktowego pobierania próbek wody. System został opracowany i oceniony pod kątem jednoczesnego zbierania wody wdychanej i wydychanej przez dozowniki zawiesiny bentosowej in situ, w celu czystego pomiaru usuwania i wydalania cząstek stałych i rozpuszczonych związków.

Streszczenie

Zawiesiny bentosowe odgrywają kluczową rolę w funkcjonowaniu ekosystemów morskich. Filtrując duże ilości wody, usuwając plankton i detrytus oraz wydalając cząstki stałe i rozpuszczone związki, służą jako ważne czynniki sprzężenia bentosowo-pelagicznego. Dokładny pomiar związków usuwanych i wydalanych przez pokarmy zawiesinowe (takie jak gąbki, worki, wieloszczety, małże) ma kluczowe znaczenie dla badania ich fizjologii, metabolizmu i ekologii żywienia oraz ma fundamentalne znaczenie dla określenia ekologicznego znaczenia strumieni składników odżywczych, w których pośredniczą te organizmy. Ocena szybkości, z jaką urządzenia do sporządzania zawiesiny przetwarzają cząstki stałe i związki rozpuszczone w przyrodzie, jest jednak ograniczona ograniczeniami obecnie dostępnych metodologii. Naszym celem było opracowanie prostej, niezawodnej i nieinwazyjnej metody, która pozwoliłaby na pobieranie próbek czystej i kontrolowanej wody z określonego punktu, takiego jak otwór prądowy w dozownikach zawiesiny bentosowej, in situ. Nasza metoda pozwala na jednoczesne pobieranie próbek wdychanej i wydychanej wody badanego organizmu za pomocą maleńkich rurek zainstalowanych na specjalnie skonstruowanym manipulatorze i starannie umieszczonych w otworze wydechowym badanego organizmu. Przekłucie przegrody w naczyniu zbiorczym za pomocą igły strzykawkowej przymocowanej do dystalnego końca każdej rurki pozwala na powolne wtłaczanie próbki wody do naczynia przez rurkę do pobierania próbek pod wpływem ciśnienia zewnętrznego. Powolna i kontrolowana częstotliwość pobierania próbek pozwala na zintegrowanie nieodłącznej niejednolitości w wodzie, zapewniając jednocześnie pobieranie próbek bez zanieczyszczeń. Przedstawiamy zalecenia dotyczące najbardziej odpowiednich urządzeń filtrujących, zbiorników zbiorczych i procedur przechowywania do analiz różnych cząstek stałych i rozpuszczonych związków. System VacuSIP oferuje niezawodną metodę ilościowego określania niezakłóconego metabolizmu dozowników zawiesinowych w warunkach naturalnych, która jest tania i łatwa do nauczenia się i zastosowania do oceny fizjologii i funkcjonalnej roli filtratorów w różnych ekosystemach.

Wprowadzenie

Zawiesiny bentosowe odgrywają istotną rolę w funkcjonowaniu ekosystemów morskich 1. Filtrując duże ilości wody 2,3, usuwają i wydalają cząstki stałe (plankton i detrytus) oraz rozpuszczone związki 1 (i zawarte w nich odniesienia) i są ważnym czynnikiem sprzężenia bentosowo-pelagicznego 4,5 i obiegu składników odżywczych 6,7. Dokładny pomiar cząstek stałych i rozpuszczonych związków usuwanych i wydalanych przez zawiesiny bentosowe (takie jak gąbki, worki, wieloszczety i małże) ma fundamentalne znaczenie dla zrozumienia ich fizjologii, metabolizmu i ekologii żywienia. Wraz z pomiarami wydajności pompowania umożliwia również ilościowe określenie strumieni składników odżywczych, w których pośredniczą te organizmy, oraz ich wpływu ekologicznego na jakość wody, a także na procesy w skali ekosystemu.

Wybór odpowiedniej metody pomiaru szybkości usuwania i produkcji cząstek stałych i rozpuszczonych przez filtry zawiesinowe jest kluczowe dla uzyskania wiarygodnych danych dotyczących ich aktywności żywieniowej 8. Jak zauważyli Riisgård i inni, niewłaściwe metodologie zniekształcają wyniki, zniekształcają warunki doświadczalne, prowadzą do nieprawidłowych szacunków spożycia i wydalania niektórych substancji oraz mogą prowadzić do błędnej kwantyfikacji strumieni składników odżywczych przetwarzanych przez te organizmy.

Dwie najczęściej stosowane metody pomiaru strumieni cząstek stałych i rozpuszczonych składników odżywczych w filtratorach obejmują albo inkubację (techniki pośrednie), albo jednoczesne zbieranie wody z otoczenia i wydychanej (techniki bezpośrednie). Techniki inkubacji opierają się na pomiarze szybkości zmian stężenia cząstek stałych i rozpuszczonych składników odżywczych w inkubowanej wodzie oraz oszacowaniu szybkości produkcji lub usuwania w porównaniu z odpowiednimi kontrolami 8. Jednak zamknięcie organizmu w komorze inkubacyjnej może zmienić jego zachowanie podczas karmienia i pompowania z powodu zmian w naturalnym reżimie przepływu, z powodu spadku stężenia tlenu i/lub stężenia pokarmu, lub z powodu nagromadzenia związków wydalniczych w wodzie inkubacyjnej 7,9 (i odniesienia do niej). Oprócz skutków zamknięcia i zmodyfikowanego zaopatrzenia w wodę, główna stronniczość technik inkubacji wynika z efektów refiltracji (zob. na przykład 10). Chociaż niektóre z tych problemów metodologicznych zostały przezwyciężone dzięki zastosowaniu odpowiedniej objętości i kształtu naczynia inkubacyjnego 11 lub wprowadzeniu systemu recyrkulacyjnego dzbana dzwonowego in situ12, technika ta często zaniża tempo usuwania i produkcji. Ilościowe określenie metabolizmu rozpuszczonych związków, takich jak rozpuszczony azot organiczny (DON) i węgiel (DOC) lub nieorganiczne składniki odżywcze, okazało się szczególnie podatne na błędy systematyczne spowodowane technikami inkubacji 13.

Na przełomie lat 60-tych i 70-tych, Henry Reiswig 9,14,15 był pionierem w stosowaniu bezpośrednich technik do ilościowego określania usuwania cząstek przez gigantyczne karaibskie gąbki, poprzez oddzielne pobieranie próbek wody wdychanej i wydychanej przez organizmy in situ. Ze względu na trudności w zastosowaniu techniki Reiswiga na mniejszych karmach zawiesinowych i w trudniejszych warunkach podwodnych, większość badań w tej dziedzinie ograniczała się do laboratorium (in vitro) z zastosowaniem głównie technik inkubacji pośredniej16. Yahel i jego koledzy dostosowali technikę bezpośredniego in situ Reiswiga do pracy w warunkach na mniejszą skalę. Ich metoda, oznaczona jako InEx 16, opiera się na jednoczesnym podwodnym pobieraniu próbek wody wdychanej (In) i wydychanej (Ex) przez niezakłócone organizmy. Różne stężenia substancji (np. bakterii) w parze próbek (InEx) stanowią miarę zatrzymywania (lub produkcji) tej substancji przez zwierzę. Technika InEx wykorzystuje rurki z otwartym zakończeniem i opiera się na strumieniu prądu wytwarzanym przez aktywność pompującą badanego organizmu w celu pasywnego zastąpienia wody otoczenia w rurze zbiorczej. Podczas gdy Yahel i jego współpracownicy z powodzeniem zastosowali tę technikę w badaniu ponad 15 różnych taksonów zawiesin (np. 17), metoda ta jest ograniczona przez wysoki poziom wymaganej praktyki i doświadczenia, przez niewielki rozmiar niektórych otworów prądowych oraz przez warunki morskie.

Aby pokonać te przeszkody, opracowaliśmy alternatywną technikę opartą na kontrolowanym zasysaniu próbki wody przez maleńkie rurki (średnica zewnętrzna < 1,6 mm). Naszym celem było stworzenie prostego, niezawodnego i niedrogiego urządzenia, które umożliwiłoby czyste i kontrolowane pobieranie próbek wody in situ z bardzo określonego punktu, takiego jak otwór wylotowy dozowników zawiesiny bentosowej. Aby metoda była skuteczna, musi być nieinwazyjna, aby nie wpływać na reżim przepływu w otoczeniu ani nie modyfikować zachowania badanych organizmów. Prezentowane tutaj urządzenie określa się mianem VacuSIP. Jest to uproszczenie systemu SIP opracowanego przez Yahela i wsp. (2007) 18 w odniesieniu do punktowego pobierania próbek w głębinach morskich na podstawie ROV. VacuSIP jest znacznie tańszy niż oryginalny SIP i został przystosowany do pracy w oparciu o SCUBA. System został zaprojektowany zgodnie z zasadami przedstawionymi i przetestowanymi przez Wrighta i Stephensa (1978) 19 oraz Møhlenberga i Riisgårda (1978) 20 dla warunków laboratoryjnych.

Chociaż system VacuSIP został zaprojektowany do badań in situ metabolizmu zawiesin bentosowych, może być również używany do badań laboratoryjnych i wszędzie tam, gdzie wymagana jest kontrolowana i czysta, punktowa próbka wody. System jest szczególnie przydatny, gdy wymagana jest integracja przez dłuższy czas (min-godziny) lub filtracje in situ. VacuSIP jest z powodzeniem stosowany w laboratorium Yahel od 2011 roku, a także został wykorzystany w dwóch ostatnich badaniach strumieni składników odżywczych, w których pośredniczą gatunki gąbek karaibskich i śródziemnomorskich 21 (Morganti i wsp.).

Użycie specyficznych próbników, wydłużony czas pobierania próbek oraz warunki terenowe, w których stosuje się VacuSIP, pociągają za sobą pewne odchylenia od standardowych protokołów oceanograficznych dotyczących zbierania, filtrowania i przechowywania próbek dla wrażliwych analitów. Aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia przez system VacuSIP lub ryzyko modyfikacji próbki wody przez aktywność bakterii po pobraniu, przetestowaliśmy różne procedury filtracji i przechowywania in situ. Zbadano różne urządzenia filtrujące, naczynia zbiorcze i procedury przechowywania w celu uzyskania najbardziej odpowiedniej techniki analizy rozpuszczonych związków nieorganicznych (PO43-, NOx-, NH4+, SiO4) i organicznych (DOC + DON) oraz pobierania próbek ultraplanktonu (<10 μm) i cząstek organicznych (POC + PON). Aby jeszcze bardziej zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia, zwłaszcza w warunkach polowych, liczba etapów obsługi została zredukowana do absolutnego minimum. Format wizualny, w którym przedstawiona jest metoda, jest zorientowany na ułatwienie odtwarzalności i skrócenie czasu potrzebnego do skutecznego zastosowania techniki.

Przegląd systemu

Aby pobrać próbkę wody pompowanej in situ z dysz zawiesinowych z otworami wydechowymi tak małymi jak 2 mm, najpierw wizualizuje się aktywność pompowania każdej próbki poprzez uwolnienie przefiltrowanej wody morskiej barwionej fluoresceiną obok otworu (otworów) inhalatora i obserwowanie jej przepływu z otworu prądowego 16 (zobacz również Rysunek 2B w 18). Woda wdychana i wydychana przez badaną próbkę (prąd bieżący i wydechowy) jest następnie pobierana jednocześnie za pomocą pary maleńkich rurek zainstalowanych na specjalnie skonstruowanym manipulatorze lub na dwóch "ramionach" odwróconego elastycznego przenośnego statywu (rysunek 1 i film uzupełniający 1). Woda wdychana przez badany organizm jest zbierana poprzez ostrożne umieszczenie bliższego końca jednej rurki wewnątrz lub w pobliżu otworu wziewnego badanego organizmu. Identyczna rurka jest następnie umieszczana w kryzie prądowej. Operacja ta wymaga należytej ostrożności, aby uniknąć kontaktu lub niepokojenia zwierzęcia, np. przez ponowne zawieszenie osadu. Aby rozpocząć pobieranie próbek, nurek przekłuwa przegrodę w naczyniu zbiorczym za pomocą igły strzykawki przymocowanej do dystalnego końca każdej probówki, pozwalając zewnętrznemu ciśnieniu wody wtłoczyć próbkę wody do naczynia przez rurkę do pobierania próbek. Zasysanie jest inicjowane przez podciśnienie wytworzone wcześniej w fiolkach oraz przez różnicę ciśnień między wodą zewnętrzną a opróżnionym pojemnikiem na próbkę.

Aby zapewnić czyste zbieranie wydychanej wody i uniknąć przypadkowego zassania wody z otoczenia 16, częstotliwość próbkowania wody musi być utrzymywana na znacznie niższym poziomie (<10%) niż szybkość przepływu prądu. Szybkość ssania jest kontrolowana przez długość rury i jej średnicę wewnętrzną (ID). Mała średnica wewnętrzna zapewnia również znikomą objętość martwą (< 200 μl na metr wężyka). Pobieranie próbek przez dłuższy czas (od minut do godzin) umożliwia zintegrowanie nieodłącznej niejednolitości większości substancji będących przedmiotem zainteresowania. Aby zapewnić odpowiednie zachowanie próbek podczas długotrwałych podwodnych sesji pobierania próbek, a także do transportu do laboratorium, w przypadku wrażliwych analitów zaleca się filtrację in situ. Dobór naczyń do pobierania próbek, zespołu filtracyjnego i przewodów jest podyktowany badanymi organizmami i konkretnym pytaniem badawczym. Opisany poniżej protokół zakłada, że interesujący jest pełny profil metaboliczny (przegląd znajduje się na rysunku 2). Jednak modułowy charakter protokołu pozwala na łatwą modyfikację w celu dostosowania do prostszych lub nawet bardzo różnych schematów próbkowania. Aby uzyskać pełny profil metaboliczny, protokół pobierania próbek powinien obejmować następujące kroki: (1) wizualizację przepływu; (2) Pobieranie próbek odżywiania ultraplanktonem (plankton < 10 μm); (3) Pobieranie próbek wychwytu i wydalania nieorganicznych składników pokarmowych (przy użyciu wbudowanych filtrów); (4) Pobieranie próbek rozpuszczonych substancji organicznych i ich wydalanie (przy użyciu filtrów liniowych); 5) Wprowadzanie i wydalanie cząstek stałych (przy użyciu filtrów liniowych); (6) Powtórz krok 2 (karmienie ultraplanktonem w ramach kontroli jakości); (7) Wizualizacja przepływu.

Gdy jest to logistycznie wykonalne, zaleca się, aby pomiary profilu metabolicznego były połączone z szybkością pompowania (np. metoda prędkości frontu barwnika, w 16), jak również z pomiarami oddychania. Pomiary te najlepiej wykonywać na początku i na końcu sesji pobierania próbek. Do pomiaru oddechu preferowane są podwodne optody lub mikroelektrody.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Kroki przygotowawcze i procedury czyszczenia

  1. Roztwór czyszczący
    1. Przez cały czas należy nosić odzież ochronną, fartuch laboratoryjny i rękawice. Kroki przygotowawcze należy przeprowadzić w czystym pomieszczeniu, wolnym od kurzu i dymu.
    2. Przygotować 5-10% roztwór kwasu solnego (HCl) z użyciem świeżej, wysokiej jakości wody dwukrotnie destylowanej.
    3. Przygotować 5% wysoce rozpuszczalną zasadniczą mieszaninę roztworu surfaktantów anionowych i niejonowych (patrz Lista materiałów) z użyciem świeżej, wysokiej jakości wody dwukrotnie destylowanej.
    4. Wszystkie roztwory przechowywać w czystych pojemnikach mytych kwasem.
  2. Kroki przygotowawcze i procedury czyszczenia (w laboratorium)
    UWAGA: Jeśli związki fosforu nie są przedmiotem zainteresowania, mycie HCl można zastąpić myciem wysokiej jakości kwasem fosforowym (H3PO4) (stężenie końcowe 8% H3PO4 ).
    1. Przez cały czas należy nosić odzież ochronną, fartuch laboratoryjny i rękawice.
    2. Aparat do pobierania próbek (z wyjątkiem liniowego stalowego uchwytu filtra Swinney) przemyć obficie wodą o wysokiej czystości. Aparaturę pozostawić do namoczenia w 5-10% roztworze HCl przez noc. Aparaturę ponownie przepłukać obficie wysokiej jakości wodą dwukrotnie destylowaną.
    3. Liniowe stalowe uchwyty filtrów Swinney przemyć obficie wodą o wysokiej czystości. Uchwyty filtrów pozostawić do namoczenia w 5% wysoce rozpuszczalnej zasadniczej mieszaninie roztworu surfaktantów anionowych i niejonowych przez noc. Ponownie przepłukać je obficie wysokiej jakości wodą dwukrotnie destylowaną.
    4. Wysuszyć całą aparaturę do pobierania próbek, owinąć ją w folię aluminiową i przechowywać w czystym pudełku do czasu użycia.
  3. Kontrola szybkości zasysania
    1. Szybkość pobierania próbek kontrolować poprzez regulację długości i średnicy wewnętrznej rurki wlotowej, zgodnie z planowaną głębokością pracy i temperaturą wody. Jako wytyczną stosować poniższe równanie (pochodne równania Hagena-Poiseuille'a stosowanego dla w pełni rozwiniętego przepływu laminarnego w rurze): figure-protocol-1 gdzie F= szybkość przepływu (cm3 min-1), ΔP = różnica ciśnień (bar), r = promień wewnętrzny rurki wlotowej (cm), K = 2.417 x 10-9 (sec-2), L = długość rurki (cm), V = lepkość wody (g cm-1 sec-1). Więcej szczegółów znajduje się w Tabeli 1.
    2. Szybkość pobierania próbek powinna być niższa niż 1% szybkości pompowania badanego zwierzęcia.
      UWAGA: Stosowanie pojemników ewakuowanych, czasami o nieznanej próżni, stwarza dodatkowe komplikacje. Dlatego wysoce zalecane jest przeprowadzenie testu polowego. Przy głębokości 10 m i wodzie morskiej o temperaturze ~22 °C (40 PSU), rurka wlotowa o długości 50 cm i średnicy wewnętrznej 254 µm zapewnia średnią szybkość zasysania ~26 µl sec-1 (1.56 ml min-1).
  4. Naczynia do pobierania próbek
    1. Do próbek o małej objętości (3-20 ml, np. ultraplanktonu do cytometrii przepływowej) stosować sterylne plastikowe probówki z wstępnie wytworzoną próżnią.
      UWAGA: Sterylne plastikowe probówki z wstępnie wytworzoną próżnią są rutynowo stosowane do standardowych badań krwi u ludzi; należy upewnić się, że użyte probówki sterylne nie zawierają dodatków. Te próżniowe sterylne plastikowe probówki najlepiej pobierać przy użyciu sterylnego, jednorazowego uchwytu do probówek z ekscentrycznym złączem Luer. Chociaż jest to najbezpieczniejszy i najefektywniejszy aparat do pobierania próbek, posiada on nieco większą objętość martwą w porównaniu do zwykłej igły.
    2. Do większych próbek wody, takich jak składniki odżywcze i rozpuszczone substancje organiczne, stosować szklane fiolki o pojemności 40 lub 60 ml, spełniające kryteria Agencji Ochrony Środowiska (EPA) dla analiz lotnych związków organicznych. Fiolki te posiadają zakrętkę z polipropylenu z silikonową przegrodą pokrytą PTFE.
    3. Do jeszcze większych objętości stosować butelki po penicylinie z gumowymi korkami lub kolby próżniowe.
    4. Do próbek krzemionki stosować fiolki z polietylenu o wysokiej gęstości (fiolki HDPE).
    5. Aby zwiększyć objętość próbki i zmniejszyć ryzyko wysunięcia korka podczas wynurzania, przed nurkowaniem ewakuować (odpowietrzyć) elementy 1.4.2-1.4.4 za pomocą pompy próżniowej. Próżnię można wytworzyć ręcznie za pomocą ręcznej pompy próżniowej lub nawet wysysając powietrze strzykawką. Jednak dla najlepszych wyników zaleca się zastosowanie dobrej pompy próżniowej. Standardowe liofilizatory zapewniają wysoką próżnię.
      UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność przy używaniu dużych kolb próżniowych, aby upewnić się, że szybsza początkowa szybkość zasysania nie zanieczyści pobranych próbek wody.
  5. Procedury czyszczenia naczyń
    1. Do analizy rozpuszczonych związków organicznych i NH4+ stosować nowe, wstępnie oczyszczone fiolki EPA.
    2. Fiolki (szklane i HDPE) do analizy innych składników odżywczych płukać w następujący sposób:
      1. Przepłukać fiolki (szklane i HDPE) oraz zakrętki polipropylenowe wysokiej jakości wodą dwukrotnie destylowaną. Zamontować nową silikonową przegrodę.
      2. Namoczyć fiolki (szklane i HDPE) w 10% HCl przez co najmniej 3 dni i przepłukać obficie wysokiej jakości wodą dwukrotnie destylowaną.
      3. Wypalić szklane fiolki w temperaturze 450 °C przez 4 h i pozwolić im ostygnąć w piecu. Zamontować zakrętkę i owinąć w folię aluminiową do czasu użycia.
  6. Filtry
    1. Do filtracji wszystkich próbek rozpuszczonych związków organicznych (np. DOC, DON) oraz do zbierania organicznych cząstek stałych (np. POC, PON) stosować szklanowłókniste filtry bez spoiwa. Każdy filtr szklany zapakować w oddzielną kopertę z folii aluminiowej. Wypalić w temperaturze 400 °C przez 2 h, aby odparować pozostałości organiczne, i przechowywać w czystym i suchym naczyniu do czasu użycia.
    2. Do pobierania nieorganicznych składników odżywczych (np. PO43-, NOx-, NH4+) stosować albo szklanowłókniste filtry bez spoiwa (jak opisano wyżej), albo membrany z poliwęglanu o porach 0,2 µm. Te drugie czyścić po zamontowaniu w uchwycie filtra, jak wyjaśniono poniżej (1.7.3).
    3. Do pobierania krzemionki stosować filtry z membran poliwęglanowych o porach 0,2 µm. Czyścić je po zamontowaniu w uchwycie filtra, jak wyjaśniono poniżej (1.7.3).
  7. Przygotowanie zestawu do filtracji
    1. Wysoce rozpuszczalną zasadniczą mieszaninę roztworu surfaktantów anionowych i niejonowych oraz wysokiej jakości wodę dwukrotnie destylowaną przefiltrować przez filtr 0,2 µm przed użyciem ich do czyszczenia zestawu do filtracji.
    2. Zestaw do filtracji dla składników odżywczych i rozpuszczonych związków organicznych innych niż krzemionka:
      1. Umieścić wypalony szklanowłóknisty filtr bez spoiwa wewnątrz oczyszczonego liniowego stalowego uchwytu filtra Swinney.
      2. Za pomocą oczyszczonej kwasem strzykawki przepuścić 100 ml 5% wysoce rozpuszczalnej zasadniczej mieszaniny roztworu surfaktantów anionowych i niejonowych, a następnie 100 ml wysokiej jakości wody dwukrotnie destylowanej przez cały zestaw.
    3. Zestaw do filtracji dla SiO4:
      1. Umieścić filtr poliwęglanowy wewnątrz oczyszczonego poliwęglanowego uchwytu filtra (uchwyt PC).
      2. Za pomocą oczyszczonej kwasem strzykawki przepuścić 30 ml 5% HCl i 30 ml wysokiej jakości wody dwukrotnie destylowanej przez cały zestaw.
  8. Montaż systemu
    1. Złożyć system do pracy podwodnej, używając rurek PEEK (polieteroeteroketon) o średnicy zewnętrznej (OD) 1,6 mm i średnicy wewnętrznej (ID) 254 µm lub 177 µm.
    2. Do przycięcia rurek na wymaganą długość użyć ostrego noża lub przecinaka do PEEK.
    3. Na końcu dystalnym (od strony pojemnika na próbkę) każdą rurkę wyposażyć w męskie złącze Luer przymocowane do igły strzykawki. Należy postępować zgodnie z instrukcją producenta i wyrównać płaską stronę nieściągowej tulejki niebieskiej z końcem rurki przed dokręceniem zielonej nakrętki.
    4. Przymocować rurki PEEK do „ramion” statywu lub specjalnie zbudowanego manipulatora za pomocą taśmy izolacyjnej.
    5. Do męskiego złącza Luer przymocować jednorazową igłę strzykawki. Igłę należy pozostawić z nasadką ochronną, aby zapobiec obrażeniom.
    6. Wyraźnie oznaczyć sprzęt do pobierania próbek i zastosować kodowanie kolorystyczne dla wszystkich komponentów wlotowych i wylotowych (np. zielony=Wlot, czerwony=Wylot).
    7. W podobny sposób zakodować kolorystycznie naczynia do pobierania próbek, używając zestawów sparowanych naczyń ponumerowanych sekwencyjnie.

2. Praca pod wodą

  1. Przygotowanie miejsca pracy
    1. Wstępna analiza i wybór okazów
      UWAGA: Ze względu na złożony charakter protokołu pobierania próbek pod wodą, poświęcenie niezbędnego czasu na przygotowania zapewni efektywne nurkowanie pobierające.
      1. Przeprowadź analizę miejsca pracy i dokonaj niezbędnych przygotowań z wyprzedzeniem.
      2. Wybierz i zaznacz odpowiednie organizmy docelowe, do których można uzyskać stosunkowo łatwy dostęp. Ponieważ nie wszystkie organizmy muszą być aktywne w czasie nurkowania, przygotuj więcej stanowisk roboczych, niż planujesz pobrać próbek.
    2. Instalacja podpór bazowych
      1. W przypadku pracy na wyrównanym podłożu:
        1. Zamontuj oryginalny szybkozłączny klips elastycznego statywu  na obciążnikach nurkowych 1 kg i po prostu umieść go obok zwierzęcia docelowego.
      2. W przypadku pracy na ścianach pionowych:
        1. Podczas etapu przygotowania miejsca pracy (2.1.1) zamontuj płyty wsporcze bazy dla systemu VacuSIP, haki na sprzęt akcesoryjny oraz wieszaki dla tacy transportowej z naczyniami zbierającymi.
        2. W przypadku użycia elastycznych statywów przenośnych, użyj śrub lub dwuskładnikowej żywicy epoksydowej, aby przymocować płyty PVC 10x10 cm obok każdego zwierzęcia docelowego. Każda płyta musi posiadać otwór do zamocowania szybkozłącznych klipsów elastycznego statywu przenośnego.
        3. Po utwardzeniu żywicy i solidnym przymocowaniu płyt bazowych do ściany, wkręć szybkozłączny klips, który będzie służył jako stabilny punkt mocowania elastycznego statywu przenośnego dla systemu VacuSIP.
  2. Instalacja VacuSIP
    1. Sprawdź, czy okaz pompuje wodę, uwalniając przefiltrowany barwnik fluoresceiny obok otworu wlotowego i potwierdź, że barwnik wydostaje się przez otwór wylotowy, zgodnie z opisem w Yahel et al. (2005) 16.
    2. Zainstaluj urządzenie VacuSIP i umieść rurkę pobierającą wlotową (IN) wewnątrz otworu wlotowego lub tuż obok niego (w odległości ~5 mm). Upewnij się, że rurka wlotowa nie znajduje się w pobliżu innego otworu wylotowego.
    3. Ostrożnie skieruj rurkę pobierającą wylotową (EX) w stronę osculum/syfonu wylotowego i bardzo delikatnie wprowadź ją do środka, aż zostanie umieszczona 1-5 mm wewnątrz osculum/syfonu wylotowego (patrz Rysunek 1 i Wideo uzupełniające 1). Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie dotknąć i nie zakłócić w inny sposób pobieranego organizmu.
    4. Przed i w trakcie pobierania próbek dwukrotnie sprawdź położenie obu rurek.
    5. Po pobraniu próbek sprawdź, czy okaz nadal pompuje wodę, zgodnie z powyższym opisem (2.2.1).
      UWAGA: Ponieważ podczas manipulowania jednym ramieniem statywu może dojść do ruchu drugiego, upewnij się, że najpierw umieścisz rurkę pobierającą wlotową, a następnie rurkę wylotową, która wymaga bardziej precyzyjnej manipulacji. Przy zachowaniu tej kolejności, nawet jeśli manipulacja rurką wylotową spowoduje ruch rurki wlotowej, nie wpłynie to na pobieranie próbek.
  3. Modułowa procedura pobierania próbek pod wodą
    UWAGA: W zależności od pytania badawczego, każdy z poniższych kroków eksperymentalnych może być wykonany jako oddzielny eksperyment. Pełny protokół pobierania profilu metabolicznego opisany poniżej jest czasochłonnym procesem, wymagającym do 8 godzin na jeden okaz (przegląd w Rysunek 2 i Tabela 2). Ponieważ warunki i przepisy dotyczące nurkowania różnią się w zależności od miejsc poboru, regionów i instytucji, plany nurkowania nie są zawarte w tym protokole. Niemniej jednak, należy poświęcić szczególną uwagę i skrupulatnie zaplanować przebieg nurkowania. Należy szczególnie dbać o unikanie nasycenia i profilów nurkowych typu „yoyo”. Jeśli to możliwe, zaleca się przeprowadzanie tych eksperymentów na niewielkiej głębokości (< 10 m). Rebreathery z obiegiem zamkniętym mogą być bardzo przydatne w przypadku tak długich schematów pobierania próbek.
    1. Zanim rozpocznie się właściwe pobieranie próbek, upewnij się, że nie pozostały widoczne ślady fluoresceiny i że zawiesina osadów opadła lub została zniesiona prądem. 
       
    2. Ultraplankton (w tym kroku nie instaluje się filtra!)
      1. Użyj igły, aby przebić septa próżniowych sterylnych rurek plastikowych IN (wlotowych) i EX (wylotowych). Zweryfikuj, czy woda wpływa z planowaną prędkością i pobierz próbki wody o objętości 2-6 ml.
      2. Po wynurzeniu przechowuj próbki w lodówce z lodem. W laboratorium utrwal je za pomocą 1% paraformaldehydu + 0,05% glutaraldehydu klasy EM (stężenie końcowe) lub 0,2% glutaraldehydu klasy EM. Zamroź probówki kriogeniczne w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu analizy.
    3. Pobieranie i przechowywanie krzemianów
      1. Zainstaluj wstępnie oczyszczony liniowy stalowy uchwyt filtra PC zawierający membranę poliwęglanową 0,2 µm pomiędzy igłą a męskim złączem Luer na końcowym odcinku rurki.
      2. Przebij korek z septem wstępnie oczyszczonych fiolek z polietylenu o wysokiej gęstości (fiolki HDPE), aby rozpocząć pobieranie próbek. Zweryfikuj, czy oba próbniki kapią i pobierz 15 ml wody do każdej fiolki.
      3. Próbki przechowuj w chłodni (4 °C) do czasu analizy. Jeśli analiza nie może rozpocząć się w ciągu dwóch tygodni, przechowuj je w temperaturze -20 °C. Do analizy upewnij się, że próbki zostały rozmrożone w 50 °C przez co najmniej 50 min, aby rozpuścić żele krzemionkowe.
        UWAGA: Membranę można zachować do mikroskopii lub analizy DNA, jeśli jest to wymagane.
    4. Nieorganiczne formy rozpuszczone (PO43-, NOx-, NH4+)
      1. Zastąp zespół filtra PC wstępnie oczyszczonym liniowym uchwytem filtra ze stali nierdzewnej, który zawiera wstępnie wypalony filtr szklany.
      2. Przed pobieraniem próbek upewnij się, że co najmniej 20 ml próbek wody morskiej przeszło przez cały system filtracji, używając fiolek EPA, HDPE lub innego naczynia próżniowego, aby rozpocząć ssanie. Zmierz objętość pobranej wody przed jej odrzuceniem.
      3. Przebij korek z septem odpowiednich szklanych fiolek EPA, aby rozpocząć pobieranie próbek, zweryfikuj, czy oba próbniki kapią i pobierz 25-30 ml do analizy azotanów i fosforanów.
      4. Zmień na nowe szklane fiolki EPA do analizy amoniaku, zweryfikuj, czy oba próbniki kapią i pobierz 20 ml do każdej fiolki.
      5. Próbki przechowuj w lodówce z lodem i przechowuj w -20 °C do czasu analizy.
        UWAGA: Jeśli interesuje tylko filtrat, w krokach 2.3.3 i 2.3.4 można użyć jednorazowych filtrów strzykawkowych.
    5. Pobieranie i przechowywanie organicznych form rozpuszczonych (DOC+DON)
      UWAGA: Przez cały czas manipulacji przechowuj próbki jak najbardziej pionowo, tak aby woda z próbki nie miała kontaktu z silikonowymi septami.
      1. Kontynuuj używanie zespołu filtra ze stali nierdzewnej i pobierz 20 ml próbek wody morskiej do nowych szklanych fiolek EPA, jak opisano powyżej.
      2. Po wynurzeniu przechowuj próbki w lodówce z lodem. W laboratorium użyj wstępnie wypalonej szklanej pipety Pasteura, aby utrwalić próbki kwasem ortofosforowym (dodaj 5-6 kropli 25% kwasu klasy trace metal grade do 20 ml próbki, stężenie końcowe 0,04%) lub kwasem solnym (dodaj 2 krople stężonego kwasu klasy trace metal grade do 20 ml próbki, stężenie końcowe 0,1%) i przechowuj w chłodni.
      3. Próbki przechowuj w chłodni (4 °C) do czasu analizy. Jeśli próbki nie zostaną przeanalizowane w ciągu tygodnia od pobrania, przechowuj je w -20 °C do czasu analizy.
    6. Materiał organiczny cząsteczkowy (POC, PON, POP)
      1. Kontynuuj używanie zespołu filtra ze stali nierdzewnej i przefiltruj co najmniej 500 ml wody morskiej do ewakuowanej kolby próżniowej 250 ml. W razie potrzeby wymień kolby.
      2. Po wynurzeniu użyj strzykawki wypełnionej powietrzem, aby usunąć całą pozostałą wodę morską z uchwytu filtra, owiń go w folię aluminiową i przechowuj w lodówce z lodem. W laboratorium wyjmij filtry z uchwytów filtrów i przechowuj w -20 °C do czasu analizy.

figure-protocol-2
Rycina 1. Przykład prawidłowych instalacji VacuSIP: (A) pobieranie próbek z tunikata Polycarpa mytiligera (Zatoka Akaba, Morze Czerwone) przy użyciu manipulatora wykonanego na zamówienie, z kodem kolorystycznym: zielony dla próbek wody wdychanej i żółty dla próbek wody wydychanej (zdjęcie: Tom Shelizenger i Yuval Yacobi); (B) pobieranie próbek z gąbki Agelas oroides (północno-zachodnie Morze Śródziemne) o szerokości osculum 3 mm, przy użyciu urządzenia VacuSIP. Zastosowany kod kolorystyczny to żółty dla próbek wody wdychanej i czerwony dla próbek wody wydychanej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-protocol-3
Rysunek 2. Przegląd techniki VacuSIP opisanej w sekcji protokołu. Prace laboratoryjne przedstawiono w żółtych polach, a prace terenowe w polach niebieskich. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-protocol-4
Tabela 1. Ogólne średnie prędkości pobierania próbek (ml min -1) uzyskane przy użyciu różnych pojemników do zbierania wody i różnych poziomów próżni: kolby nie były próżniowane (none); szklane fiolki EPA i fiolki HDPE były próżniowane do połowy ich objętości (½ volume); sterylne probówki plastikowe były uprzednio próżniowane przez producenta. Praca na głębokości 5-8 m, temperatura wody 18-22 °C, przy użyciu rurek PEEK o długości 79 cm i średnicy wewnętrznej 25 µm.

figure-protocol-5
Tabela 2. Przegląd naczyń do pobierania prób, utrwalaczy, zestawów filtrów przepływowych, metod przechowywania i analiz opisanych w sekcji protokołu. Analizowane związki to: liczebność ultraplanktonu (plankton < 10 µm), krzemiany (SiO4), fosforany (PO43-), azotyny + azotany (NO2- + NO3-), rozpuszczona materia organiczna (DOM), amon (NH4+) i zawiesinowa materia organiczna (POM).  Wszystkie naczynia do pobierania prób posiadają nakrętki z silikonową przegrodą i są odpowietrzane przed pobraniem próbki. Utrwalacze to: paraformaldehyd + glutaraldehyd (Glut + Parafor), kwas ortofosforowy (H3PO4) i kwas solny (HCl). Stosowane zestawy filtrów przepływowych to: poliwęglanowe uchwyty do filtrów i membrany poliwęglanowe 0.2 µm (PC filter holder + PC membrane) oraz stalowe uchwyty do filtrów i filtry z włókna szklanego bez spoiwa GFF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Optymalizacja metod pobierania wody morskiej

Wybór fiolek kolektorskich i procedura czyszczenia

Naczynia zbiorcze kompatybilne z systemem VacuSIP powinny posiadać septum umożliwiające rozpoczęcie pobierania próbek poprzez przekłucie igłą strzykawki. Muszą one wytrzymać podwyższone ciśnienie podwodne (2-3 bary na typowych głębo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kroki przygotowawcze

Fiolki zbiorcze do analizy DOM i składników odżywczych

Ponieważ naczynia kolektora mogą wchodzić w interakcje z rozpuszczonymi mikroskładnikami, a ścianki próbnika mogą być substratem dla rozwoju bakterii 30-34, przetestowano różne fiolki do zbierania DOM i składników odżywczych. Borokrzemian nie jest zalecany do oznaczania ilościowego krzemionki 33,35, ponieważ szklane butelki mog...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Manelowi Bolivarowi za pomoc w pracach terenowych. Jesteśmy wdzięczni "Parc Natural del Montgrì, les Illes Medes i el Baix Ter" za wsparcie dla naszych badań i pozwolenia na pobieranie próbek. Podwodny manipulator został zaprojektowany przez Ayelet Dadon-Pilosof i wyprodukowany przez pana Pilosofa. Prace te były wspierane przez projekt rządu hiszpańskiego CSI-Coral [grant nr CGL2013-43106-R dla RC i MR] oraz przez stypendium F.P.U od "Ministerio de Educaciòn, Cultura y Deporte (MECD)" dla TM. Jest to wkład grupy badawczej Marine Biogeochemistry and Global Change finansowanej przez rząd Katalonii [numer grantu 2014SGR1029] oraz grantu ISF 1280/13 i grantu BSF 2012089 dla G. Yahela.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
GorillaPod, OryginalnyJobyGP000001elastyczny statyw przenośny 
Tuleja bezkołnierzowaIDEX Zdrowie & Nauka P-200X1/16" w kolorze niebieskim/pk
Nakrętka męskaIDEX Zdrowie & NaukaP-205X 1/16" w kolorze zielonym/10  pk
Kobieta na Kobieta LuerIDEX Zdrowie & Nauka P-658
Żeńsko-męski Luer IDEXZdrowie & Nauka P-655
Rurka Peek (254  &mikro; m ID)IDEX Zdrowie & Nauka 15311/16" OD x 0,01  w identyfikatorze x 5  długość stopy. Można użyć alternatywnego identyfikatora.
Żywica epoksydowa dwuskładnikowaIVEGOR9257Dobrze wymieszaj żywicę dwuskładnikową przed użyciem
(TOC) EPA FiolkiCole -Parmer03756-2040 ml szklane fiolki. Wyprodukowany również przez Thomas Scientific (numer ref. 9711F09).
Fiolki HDPEWheaton986701 (E78620)Fiolki z polietylenu o wysokiej gęstości 20 ml
Vacuette Z bez dodatkuGreiner bio-one455001próżni wstępnej producenta 
Butelki na próbki przegrody nosowejThomas Scientific1755C01Butelki szklane 250 ml 
Osłona przegrody 1WheatonW240844SP (E7865R)22-400 do fiolek HDPE 
Septum Cap 2WheatonW240846 (1078-5553)24-400 do szklanych fiolek i butelek. Wyprodukowany również przez Thermo Scientific National (nr ref. 03-377-42).
Liniowe uchwyty filtrów Swinney ze stali nierdzewnejPall516-9067średnicy 13 mm
Podkładka uszczelniająca PTFE Pall 516-8064pierścień do uchwytów filtrów ze stali nierdzewnej
TCLP Filtry szklanePall 516-9126Filtry z włókna szklanego bez spoiwa, 13  mm średnicy, wielkość porów 0,7  &mikro;
m Uchwyty filtrów z poliwęglanuCole -Parmer17295średnicy 13 mm
Filtry membranowe IsoporeMilliporeGTTP0130013  mm średnicy, wielkość porów 0,2  &mikro;
m Rozwiązanie Contrad 70 Decon Labs1002wysoce rozpuszczalna zasadowa mieszanina anionowego i niejonowego roztworu środka powierzchniowo czynnego 
Sterylne filtry strzykawkoweVWR International Eurolab S.L.514-0061P25  mm średnicy, wielkość porów 0,2  &mikro; m
FluoresceinSigma-Aldrich(stary ref.28802) 46955-100G100  g
Holdex, jednorazowy, sterylnyGreiner bio-one450263sterylny, jednorazowy uchwyt na probówki z przemieszczonym środkiem luer do
sterylnych igiełIcoGammaPlus51600,7  mm x 30  mm
Cryovials NalgeneNalgeneV5007 (Kat. Nr 5000-0020)2  ml
Pudełko kartonowe Cryobox RubilaborM-600145x145x55  mm p/mikrorurka 1,5  ml
Kwas OrtofosforowySigma79617 lub Alternatywnie użyj Ultra-Czysty Kwas Solny, końcowe uzgodnienie 0,1%
ParaformaldehydSigmaP6148500  g
Aldehyd glutarowyMerck8,206,031,00025%, 1 L
Ręczna pompa próżniowa Bü rkle 5620-2181 lub alternatywnie użyj standardowej laboratoryjnej pompy
o o Vacuette próżniowej

Bibliografia

  1. Gili, J. M., Coma, R. Benthic suspension feeders: their paramount role in littoral marine food webs. Trends. Ecol. Evol. 13 (8), 316-321 (1998).
  2. Reiswig, H. In situ pumping activities of tropical Demospongiae. Mar. Bio. 9, 38-50 (1971).
  3. McMurray, S., Pawlik, J., Finelli, C. Trait-mediated ecosystem impacts: how morphology and size affect pumping rates of the Caribbean giant barrel sponge. Aquat. Bio. 23 (1), 1-13 (2014).
  4. Pile, A. J., Young, C. M. The natural diet of a hexactinellid sponge: benthic-pelagic coupling in a deep-sea microbial food web. Deep-Sea Res. Pt. I. 53 (7), 1148-1156 (2006).
  5. Nielsen, T., Maar, M. Effects of a blue mussel Mytilus edulis bed on vertical distribution and composition of the pelagic food web. Mar. Ecol. Prog. Ser. 339, 185-198 (2007).
  6. De Goeij, J. M., et al. Surviving in a marine desert: the sponge loop retains resources within coral reefs. Science. 342, 108-110 (2013).
  7. Maldonado, M., Ribes, M., van Duyl, F. C. Nutrient Fluxes Through Sponges. Biology, Budgets, and Ecological Implications. Advances in Marine Biology. 62, (2012).
  8. Riisgård, H. U. On measurement of filtration rates in bivalves - the stony road to reliable data: review and interpretation. Mar. Ecol. Prog. Ser. 211, 275-291 (2001).
  9. Reiswig, H. M. Water transport, respiration and energetics of three tropical marine sponges. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 14, 231-249 (1974).
  10. Jiménez, E., Ribes, M. Sponges as a source of dissolved inorganic nitrogen: nitrification mediated by temperate sponges. Limnol. Oceanogr. 52 (3), 948-958 (2007).
  11. Diaz, M. C., Ward, B. Sponge-mediated nitrification in tropical benthic communities. Mar. Ecol. Prog. Ser. 156, 97-107 (1997).
  12. Ribes, M., Coma, R., Gili, J. Natural diet and grazing rate of the temperate sponge Dysidea avara (Demospongiae, Dendroceratida) throughout an annual cycle. Mar. Ecol. Prog. Ser. 176, 179-190 (1999).
  13. Jiménez, E. Nutrient fluxes in marine sponges: methodology, geographical variability and the role of associated microorganisms. , Universitat Politècnica de Catalunya. Barcelona. PhD thesis (2011).
  14. Reiswig, H. M. Particle feeding in natural populations of three marine demosponges. Biol. Bull. 141 (3), 568-591 (1971).
  15. Reiswig, H. M. In situ pumping activities of tropical Demospongiae. Mar. Biol. 9 (1), 38-50 (1971).
  16. Yahel, G., Marie, D., Genin, A. InEx - a direct in situ method to measure filtration rates, nutrition, and metabolism of active suspension feeders. Limnol. Oceanogr-meth. 3, 46-58 (2005).
  17. Genin, A., Monismith, S. S. G., Reidenbach, M. A., Yahel, G., Koseff, J. R. Intense benthic grazing of phytoplankton in a coral reef. Limnol. Oceanogr. 54 (2), 938-951 (2009).
  18. Yahel, G., Whitney, F., Reiswig, H. M., Leys, S. P. In situ feeding and metabolism of glass sponges (Hexactinellida , Porifera) studied in a deep temperate fjord with a remotely operated submersible. Limnol. Oceanogr. 52 (1), 428-440 (2007).
  19. Wright, S. H., Stephens, G. C. Removal of amino acid during a single passage of water across the gill of marine mussels. J. Exp. Zool. 205, 337-352 (1978).
  20. Møhlenberg, F., Riisgård, H. U. Efficiency of particle retention in 13 species of suspension feeding bivalves. Ophelia. 17 (2), 239-246 (1978).
  21. Mueller, B., et al. Natural diet of coral-excavating sponges consists mainly of dissolved organic carbon (DOC). PLoS ONE. 9 (2), e90152(2014).
  22. Gasol, J. M., Moran, X. A. G. Effects of filtration on bacterial activity and picoplankton community structure as assessed by flow cytometry. Aquat. Microb. Ecol. 16 (3), 251-264 (1999).
  23. Koroleff, F. Determination of reactive silicate. New Baltic Manual, Cooperative Research Report Series A. 29, 87-90 (1972).
  24. Murphy, J., Riley, J. P. A. Modified single solution method for the determination of phosphate in in natural waters. Anal. Chim. Acta. 27, 31-36 (1962).
  25. Shin, M. B. Colorimetric method for determination of nitrite. Ind.Eng.Chem. 13 (1), 33-35 (1941).
  26. Wood, E. D., Armstrong, F. A. J., Richards, F. A. Determination of nitrate in sea water by cadmium-copper reduction to nitrite. J. Mar. Biol. Assoc. U. K. 47 (1), 23-31 (1967).
  27. Sharp, J. H., et al. A preliminary methods comparison for measurement of dissolved organic nitrogen in seawater. Mar. Chem. 78 (4), 171-184 (2002).
  28. Sharp, J. H. Marine dissolved organic carbon: Are the older values correct. Mar. Chem. 56 (3-4), 265-277 (1997).
  29. Holmes, R. M., Aminot, A., Kerouel, R., Hooker, B. A., Peterson, B. J. A simple and precise method for measuring ammonium in marine and freshwater ecosystems. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 56 (10), 1801-1808 (1999).
  30. Degobbis, D. On the storage of seawater samples for ammonia determination. Limnol. Oceanogr. 18 (1), 146-150 (1973).
  31. Tupas, L. M., Popp, B. N., Karl, D. M. Dissolved organic carbon in oligotrophic waters: experiments on sample preservation, storage and analysis. Mar. Chem. 45, 207-216 (1994).
  32. Yoro, S. C., Panagiotopoulos, C., Sempéré, R. Dissolved organic carbon contamination induced by filters and storage bottles. Water Res. 33 (8), 1956-1959 (1999).
  33. Zhang, J. Z., Fischer, C. J., Ortner, P. B. Laboratory glassware as a contaminant in silicate analysis of natural water samples. Water Res. 33 (12), 2879-2883 (1999).
  34. Yoshimura, T. Appropriate bottles for storing seawater samples for dissolved organic phosphorus (DOP) analysis: a step toward the development of DOP reference materials. Limnol. Oceanogr-meth. 11 (4), 239-246 (2013).
  35. Strickland, J. D. H., Parsons, T. R. A practical handbook of seawater analysis. , Fisheries Research Board of Canada. Ottawa. (1968).
  36. Eaton, A. D., Grant, V. Freshwater sorption of ammonium by glass frits and filters: implications for analyses of brackish and freshwater. Limnol. Oceanogr. 24 (2), 397-399 (1979).
  37. Norrman, B. Filtration of water samples for DOC studies. Mar. Chem. 41 (1-3), 239-242 (1993).
  38. Carlson, C. A., Ducklow, H. W. Growth of bacterioplankton and consumption of dissolved organic carbon in the Sargasso Sea. Aquat. Microb. Ecol. 10 (1), 69-85 (1996).
  39. Grasshoff, K., Ehrhardt, M., Kremling, K. Methods of Seawater Analysis. Second, Revised and Extended Edition. , (1999).
  40. Perea-Blázquez, A., Davy, S. K., Bell, J. J. Nutrient utilisation by shallow water temperate sponges in New Zealand. Hydrobiologia. 687 (1), 237-250 (2012).
  41. Perea-Blázquez, A., Davy, S. K., Bell, J. J. Estimates of particulate organic carbon flowing from the pelagic environment to the benthos through sponge assemblages. PLoS ONE. 7 (1), e29569(2012).
  42. Pile, A. J., Patterson, M. R., Witman, J. D. In situ grazing on plankton <10 µm by the boreal sponge Mycale lingua. Mar. Ecol. Prog. Ser. 141, 95-102 (1996).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bentyczne filtratoryzwi zki cz steczkowemetoda VacuSIPpobieranie pr bek wodyfiltratorycytometria przep ywowafiolki EPArurki PEEK

Powiązane artykuły