Method Article

Obserwacja i kwantyfikacja telomerów i powtarzających się sekwencji za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) z sondami PNA w Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/54224

⸱

August 4th, 2016

 , 
1Institute of Molecular Biology and Genetics (IMBG), Seoul National University, 2Department of Biological Sciences, Seoul National University, 3Department of Biophysics and Chemical Biology, Seoul National University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy zwięzłą procedurę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w gonadzie i zarodkach Caenorhabditis elegans w celu obserwacji i ilościowego określenia powtarzających się sekwencji. Z powodzeniem zaobserwowaliśmy i określiliśmy ilościowo dwie różne powtarzające się sekwencje, powtórzenia telomerów i szablon alternatywnego wydłużania telomerów (TALT).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telomer to struktura rybonukleoproteinowa, która chroni końce chromosomów przed nieprawidłowym fuzją i degradacją. Długość telomerów jest utrzymywana przez telomerazę lub alternatywny szlak, znany jako alternatywne wydłużanie telomerów (ALT)1. Ostatnio C. elegans pojawił się jako wielokomórkowy organizm modelowy do badania telomerów i ALT2. Wizualizacja powtarzających się sekwencji w genomie ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia biologii telomerów. Chociaż długość telomerów można zmierzyć za pomocą testu fragmentów restrykcyjnych telomerów lub ilościowego PCR, metody te zapewniają tylko uśrednioną długość telomerów. Wręcz przeciwnie, fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) może dostarczyć informacji o poszczególnych telomerach w komórkach. W tym miejscu przedstawiamy protokoły i reprezentatywne wyniki metody określania długości telomerów C. elegans za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ. Ta metoda zapewnia prostą, ale potężną procedurę in situ, która nie powoduje zauważalnych uszkodzeń morfologii. Używając znakowanego fluorescencyjnie peptydowego kwasu nukleinowego (PNA) i sondy znakowanej digoksygeniną-dUTP, byliśmy w stanie zwizualizować dwie różne powtarzalne sekwencje: powtórzenia telomerów i matrycę ALT (TALT) w zarodkach i gonadach C. elegans.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telomer chroni końcówki chromosomów przed nieprawidłowym fuzją i degradacją. Telomer ssaków składa się z bogatych w G powtórzeń heksamerycznych, TTAGGG i kompleksów schronienia. Sekwencja powtórzeń telomerów nicienia jest podobna do sekwencji ssaków (TTAGGC). Większość eukariontów wykorzystuje telomerazę do dodawania powtórzeń telomerów do swoich chromosomalnych końców. Jednak 10-15% komórek nowotworowych wykorzystuje mechanizm niezależny od telomerazy, znany jako alternatywne wydłużanie telomerów (ALT)3. Wcześniej informowaliśmy, że powtórzenia telomerów i związane z nimi sekwencje, nazwane jako TALT, były amplifikowane w telomerach zmutowanych linii telomerazy, które przetrwały krytyczną sterylność2.

Długość telomerów została zmierzona za pomocą ilościowego PCR lub Southern blot, co daje średnią długość całkowitych telomerów4,5,6,7. Odczyt liczby powtórzeń telomerów w danych sekwencjonowania całego genomu jest również wskaźnikiem całkowitej zawartości telomerów8. Chociaż analiza długości pojedynczego telomeru (STELA) może dostarczyć długości pojedynczego telomeru, nie może dostarczyć informacji przestrzennych o telomerach9. Podczas gdy białko reporterowe POT-1::mCherry dostarcza informacji przestrzennej telomerów in vivo, nie może reprezentować długości telomerów dwuniciowych, ponieważ POT-1 jest białkiem wiążącym telomeryjednoniciowe 10.

Podczas gdy wyżej wymienione metody dostarczają uśrednionych informacji o powtarzających się sekwencjach, fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) pozwala obserwować ilość i przestrzenny wzór poszczególnych interesujących sekwencji na skali chromosomalnej. Zamiast oczyszczania DNA, tkanki lub komórki są utrwalane w celu zachowania natywnej informacji przestrzennej w FISH. W związku z tym FISH jest zarówno ilościowym, jak i jakościowym narzędziem do obserwacji pojedynczych sekwencji powtórzeń, takich jak powtórzenia telomerów.

Ten protokół zapewnia skuteczną metodę jednoczesnego wykrywania zarówno telomerów, jak i innych powtórzeń, opartą na ulepszeniach od wcześniej opisanych metod 11,12. Larwy lub dorosłe osobniki C. elegans to organizmy wielokomórkowe o wysoce zróżnicowanych komórkach. Niejednorodność komórek utrudnia analizę ilościową dużej liczby plamek telomerowych. Aby zmaksymalizować liczbę analizowanych komórek, zarodki są izolowane i rozprowadzane na szkiełkach pokrytych polilizyną dla FISH. Ponadto protokół ten można również łączyć z immunofluorescencją.

Jako dowód, że protokół działa, pokazujemy, że możliwe jest obserwowanie i ilościowe określanie dwóch różnych powtarzających się sekwencji. Sonda DNA przeciwko TALT1 została wygenerowana za pomocą prostego PCR zawierającego digoksygeninę-dUTP. Następnie ta sonda TALT1 i znakowana fluorescencyjnie sonda telomerowa PNA zostały jednocześnie zhybrydyzowane. Następnie digoksygeninę wykryto za pomocą kanonicznych metod immunofluorescencji. Przedstawiamy tutaj reprezentatywne obrazy, w których TALT1 kolokalizował się z telomerem u osób, które przeżyły trt-1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Etykietowanie sond za pomocą digoksygeniny-dUTP metodą PCR

  1. Wykonaj znakowanie PCR za pomocą 10-krotnej mieszanki dNTP zawierającej digoksygeninę-dUTP, jak opisano wcześniej13.
  2. Oczyść produkt PCR za pomocą oczyszczania z kolumną wirową zgodnie z instrukcją producenta.
    1. Jeżeli sonda jest krótsza niż 200 pz, należy usunąć z mieszaniny reakcyjnej wolną digoksygeninę-dUTP za pomocą chromatografii kolumny spinowej, a nie oczyszczania w kolumnie spinowej.

2. Przygotowanie preparatów pokrytych polilizyną

Uwaga: Cała procedura trwa około 2 godzin. Większość kroków odbywa się w temperaturze pokojowej, z wyjątkiem etapu suszenia.

  1. Czyszczenie szkiełek
    1. Umieść szkiełka w plastikowym pojemniku i krótko spłucz je wodą destylowaną (DW). Usuń wodę i napełnij pojemnik DW zawierającym 1% środka do czyszczenia szkła.
    2. Mieszać szkiełka przez 15 minut przy 50 obr./min w temperaturze pokojowej (RT). Umyj szkiełka DW 3 razy po 5 minut w temperaturze RT.
    3. Myć szkiełka 70% etanolem przez 15 minut z mieszaniem. Wyrzuć 70% etanolu i umieść szkiełka na suchym bloku o temperaturze 65 °C i susz na powietrzu przez 15 minut.
  2. Powłoka polilizynowa szkiełek wielodołkowych
    Uwaga: Powłoka polilizynowa szkła szkiełkowego jest ważnym krokiem, ponieważ zapewnia przyczepność próbki podczas całej procedury barwienia. Źle pokryty szkiełko spowoduje utratę próbki.
    1. Rozcieńczyć podstawowy roztwór polilizyny do 0,01% (w/v) w wodzie destylowanej. Dodać 20 μl rozcieńczonego 0,01% (m/v) polilizyny do studzienek czystego szkiełka podstawowego.
    2. Inkubować szkiełko podstawowe przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Umieść szkiełka na suchym bloku w temperaturze 65 °C i susz na powietrzu przez 1 godzinę.
    4. Przechowuj szkiełka polilizynowe w pudełku bezpyłowym.

3. Utrwalenie robaków na szkle szkiełka (Rysunek 1)

  1. Przygotowanie zarodków dla FISH
    Uwaga: Zbierz robaki przed spożyciem całego pokarmu bakteryjnego, obserwując pożywkę wzrostową pod mikroskopem. Głód zmniejsza produkcję jaj przez dorosłe robaki i zwiększa wylęganie się jaj. Szczegółowe metody opisano w 14,15.
    1. Hoduj robaki na szalce Petriego o średnicy 50 mm zgodnie ze standardowymi metodami14.
    2. Po spożyciu całego pokarmu bakteryjnego przetnij podłoże agarowe na ćwiartkę szpatułką. Wysterylizuj szpatułkę przed cięciem, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
    3. Umieść cały kawałek agaru na 100 mm pożywce do hodowli nicieni (NGM). Odwróć kawałek agaru do góry nogami, aby robaki dotarły do świeżego pokarmu bakteryjnego.
    4. Po 48 do 72 godzinach zbierz robaki za pomocą bufora M9. Dodać 3 - 5 ml buforu M9 na płytkę NGM. Odpipetuj bufor M9 na powierzchni NGM, aby umyć robaki.
    5. Zebrać płyn z robakami i dodać do probówki o pojemności 15 ml.
      Uwaga: Jeśli po zbiorach pozostaną resztki agaru, odwiruj robaki w 30% roztworze sacharozy. Podczas gdy szczątki są granulowane, robaki unoszą się na powierzchni.
    6. Dodać bufor M9 do uzupełnienia objętości do 15 ml. Osadzać robaki przez odwirowanie przy 300 x g przez 3 minuty i usunąć większość buforu M9. Powtórz ten krok jeszcze 2 razy.
      Uwaga: Jeśli robaki nadal unoszą się na wodzie po odwirowaniu, ustaw poziom hamowania wirówki na wartość = 1.
    7. Zassać bufor M9. Dodaj roztwór wybielający do robaków. Na 0,5 ml robaków dodać 6,5 ml DW, 2 ml podchlorynu, 1 ml 5 M KOH.
    8. Inkubuj robaki z kołysaniem w temperaturze RT przez 3 minuty przy 50 obr./min. Wiruj robaki przez 15 sekund, aby mechanicznie ścinać robaki i odsłaniać jaja.
    9. Obserwuj probówkę pod mikroskopem preparacyjnym podczas wybielania. Upewnij się, że robaki są przecięte na pół, a jaja uwolnione. Gdy większość dorosłego ciała zostanie rozpuszczona, dodać bufor M9 w celu uzupełnienia objętości do 15 ml.
    10. Wirować przy 300 x g przez 3 min. Odessać większość M9 i dodać świeży bufor M9, aby uzupełnić objętość do 15 ml. Powtórzyć etap mycia 3 razy.
      Uwaga: Unikaj używania nadmiernej ilości robaków, ponieważ utrudniają one proces wybielania. Całkowity czas reakcji powinien być krótszy niż 8 minut do prania. Nadmiernie wybielone jaja wytwarzają silną autofluorescencję.
    11. Dodać buforowaną fosforanem sól fizjologiczną z polisorbatem-20 (PBST) do 200 μl i 200 μl 4% paraformaldehydu (PFA), aby uzyskać 2% PFA.
      Uwaga: Ponieważ PFA jest rakotwórczy, przed użyciem PFA należy nosić odzież ochronną, rękawice i osłonę oczu.
    12. Dodać 40 μl jaj w 2% PFA do studzienki z szkiełka pokrytego polilizyną.
    13. Umieść szkiełka w wilgotnej komorze i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Zamknij wilgotną komorę zaraz po umieszczeniu szkiełek w środku.
      Uwaga: Jajka osiadają na dnie szkiełka podczas mocowania.
  2. Przygotowanie wypreparowanych gonad dla RYB
    1. Dorosłe robaki wyhodowane na płytce NGM o średnicy 50 mm należy zebrać, pipetując 1 ml buforu M9. Zbieraj robaki, zanim wyczerpie się pokarm bakteryjny.
    2. Umyj robaki z wszelkich bakterii za pomocą buforu M9, 2 razy.
      Uwaga: Szczątki bakterii mogą zakłócać wypreparowane gonady w wyniku przywierania do szkiełek pokrytych polilizyną.
    3. Osadzać robaki przez odwirowanie przy 300 x g. Usunąć M9 i przenieść robaki na pustą płytkę NGM za pomocą mikropipety.
    4. Dodać 30 μl buforu M9 zawierającego 2 mM lewamizol do studzienki z szkiełkiem poddanym działaniu polilizyny.
    5. Dodać 500 μl buforu M9 do probówki o pojemności 1 ml. Użyj tego bufora, aby przenieść robaki za pomocą pipety doustnej.
    6. Napełnić końcówkę pipety doustnej buforem M9, umieszczając kapilar w probówce o pojemności 1 ml zawierającej bufor M9.
    7. Pod mikroskopem preparacyjnym umieść końcówkę pipety ustnej tuż przed głową dorosłego robaka i przeciągnij pipetę ustną tak, aby główka robaków weszła do pipety ustnej. Gdy głowa robaka wejdzie do końcówki, całe ciało robaka zostanie wciągnięte do końcówki.
    8. Przenieś robaki do szkiełka pokrytego polilizyną za pomocą pipety doustnej.
    9. Za pomocą brzytwy odetnij głowę lub czubek ogona robaków na zjeżdżalni. Kiedy robak zostanie przecięty, gonady wyskoczą. Gonady przykleją się do slajdów.
      1. Przygotuj co najmniej 30 robaków w jednym dołku. Więcej studni można wykorzystać na kolejne 30 robaków.
    10. Umieścić szkiełko w wilgotnej komorze i odessać bufor M9 za pomocą pipety doustnej.
    11. Utrwalić próbkę, dodając 20 μl 2% PFA w temperaturze pokojowej przez 15 minut w wilgotnej komorze.

4. Utrwalenie i przepuszczalność

  1. Umieść aluminiowy blok na suchym lodzie i przechowuj go w głębokiej zamrażarce (-80 °C). Przechowywać metanol i aceton w temperaturze -20 °C.
  2. Po etapie utrwalania PFA 3.1.15 lub 3.2.11 usunąć utrwalacz za pomocą mikropipety, pozostawiając ~5 μl utrwalacza
    3. .
  3. Umieść kolejny szkiełko pokryte polilizyną na szkiełku podstawowym. Usuń utrwalacz ręcznikiem papierowym, jeśli roztwór jest nadmierny. Nie przesuwaj slajdów, gdy są ze sobą sklejone.
  4. Zamrozić szkiełka na aluminiowym bloku na co najmniej 15 minut.
    Uwaga: Próbki można przechowywać przez co najmniej 2 - 3 dni.
  5. Podczas zamrażania szkiełek umieść słoiki z zimnym metanolem i acetonem na lodzie.
  6. Wyjmij szkiełka i przekręć je, aby zawiesić próbkę. Wyrzuć górny suwak. Natychmiast zanurz szkiełko w lodowatym metanolu na 5 minut.
  7. Przenieś szkiełka do lodowatego acetonu na 5 minut.
  8. Umyj szkiełka 3 razy PBST przez 5 minut, aby usunąć resztki utrwalacza. Przejdź do następnego kroku lub przechowuj szkiełka w 100% etanolu w temperaturze 4 °C.
    Uwaga: Próbki można przechowywać przez co najmniej 2 - 3 dni.

5. Hybrydyzacja stałych komórek

  1. Dodać 20 μl roztworu RNazy (PBST zawierającego 10 μg/ml RNazy A). Inkubować szkiełko w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  2. Przemyć szkiełko dwukrotnie w 2x soli fizjologicznej i cytrynianu sodu z polisorbatem-20 (2x SSCT) przez 15 min każde.
  3. Dodać 20 μl roztworu do hybrydyzacji i umieścić wilgotną komorę w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Po upływie 1 godziny usunąć roztwór hybrydyzacyjny przez pipetowanie.
  4. Przed usunięciem roztworu hybrydyzacyjnego przygotuj sondę. Jeśli sonda jest dwuniciowym DNA, denaturuj sondy poprzez ogrzewanie w temperaturze 95 °C przez 5 minut na suchym bloku. Po podgrzaniu krótko schłodzić sondę na lodzie.
  5. Do próbki dodać 10 μl roztworu hybrydyzacyjnego zawierającego sondy. W przypadku sondy PNA należy użyć stężenia w stosunku 1: 2,000, a w przypadku sondy z oznaczeniem cyfrowym należy użyć stężenia w stosunku 1:200. Przykryj próbkę szkłem nakrywkowym.
  6. Połóż ręcznik papierowy nasączony wodą na bloku grzewczym (80 °C). Umieść plastikową osłonę pudełka na bloku grzewczym, aby zachować wilgotność i temperaturę.
  7. Po ustabilizowaniu się temperatury bloku grzewczego (do 80 °C) umieścić szkiełko do próbek na rozgrzanym ręczniku papierowym i przykryć próbki plastikową pokrywą pudełka. Denaturacja próbki przez 3 minuty.
  8. Szkiełka należy inkubować przez noc w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C.

6. Mycie i immunofluorescencja

  1. Podgrzać roztwór myjący do hybrydyzacji (2x SSC, 50% formamidu) do temperatury 37 °C.
  2. Przemyć próbkę w PBST dwukrotnie w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Zdjąć szkło nakrywkowe.
  3. Przemyć próbkę w roztworze do przemywania hybrydyzacji w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  4. Umyć szkiełko do pobierania próbek w PBST 3 razy w temperaturze pokojowej. Uwaga: Wszystkie kolejne kroki należy wykonać w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej.
  5. Dodać 20 μl roztworu blokującego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.
  6. Usunąć roztwór blokujący i dodać sprzężony z FITC roztwór przeciwciała anty-digoksygeniny (1:200) przez 3 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.

7. Montaż i obserwacja

  1. Przemyć szkiełko podstawowe za pomocą PBST 2 razy przez 15 minut każdy.
  2. Dodać 10 μl roztworu montażowego z DAPI. Włóż szklankę nakrywkową i delikatnie dociśnij. Usuń nadmiar roztworu ręcznikiem papierowym.
  3. Aby zapobiec parowaniu roztworu montażowego, uszczelnij krawędzie szkła nakrywkowego lakierem do paznokci.
  4. Obserwuj pod mikroskopem konfokalnym. Wyklucz zarodki z wysokim tłem. Skoncentruj się na polu z 4 - 20 jądrami.
  5. Rób zdjęcia zgodnie z instrukcjami producenta za pomocą obiektywu 100x.
    Uwaga: Wzbudz próbkę laserem 405 nm dla DAPI, laserem 555 nm dla cy3, laserem 488 nm dla FITC.

8. Kwantyfikacja sygnału telomerowego

Uwaga: Oznaczanie ilościowe przeprowadzono w sposób opisany wcześniej16. Wszystkie obrazy, które mają być porównywane, powinny być wykonane z tymi samymi ustawieniami, w tym czasem naświetlania i źródłem światła.

  1. Wyeksportuj obraz w .tif formacie.
  2. Pobierz i zainstaluj oprogramowanie do analizy obrazu.
  3. Uruchom oprogramowanie do analizy obrazu i kliknij przycisk Zgadzam się.
  4. Kliknij przycisk Otwórz. Otwórz obrazy z telomerem FISH, klikając dwukrotnie plik obrazu.
  5. Kliknij [edytuj] - [wybierz region przetwarzania], wybierz interesujący Cię region, klikając lewym przyciskiem myszy i przeciągając. Wyklucz wszystkie niespecyficzne barwienia.
  6. Kliknij [pomiar] - [punktowe gęstości optyczne], wybierz kanał z sygnałem telomerowym i wprowadź nazwę pliku, aby zapisać wyniki w .txt pliku.
    Uwaga: Kolumna wyników jest w następującej kolejności: fluorescencja plamki, intensywność tła plamki i obszar plamki.
  7. Skopiuj wartości i odejmij intensywność tła plamki od fluorescencji plamki. Wartości mogą być teraz analizowane statystycznie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wcześniej informowano, że osoba, która przeżyła ALT, może wyłonić się z mutacji z niedoborem telomerazy, trt-1(ok410), z niską częstotliwością poprzez replikację wewnętrznie zlokalizowanych sekwencji 'Template of ALT' (TALT) do utrzymania telomerów2. Za pomocą sondy PNA byliśmy w stanie uwidocznić telomery w wypreparowanych gonadach (ryc. 2A). Słaby sygnał telomerów wykryto zarówno u trt-1 (ok410), jak i u osoby, która przeżyła ALT. Sygnał roz...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Główną zaletą naszego protokołu jest prostota zabiegu bez zauważalnego uszkodzenia morfologii struktury komórkowej. W tym protokole zoptymalizowano kilka kroków dla C. elegans FISH. Kluczowe kroki dla powodzenia FISH obejmują etykietowanie sond, utrwalanie zarodków i penetrację. Metoda etykietowania digoksygenina-dUTP zapewnia łatwą w użyciu metodę etykietowania za pomocą PCR lub translacji nick. Aby oznaczyć długą sekwencję docelową, preferowane jest tłumaczenie nicków. W takim przypadku sondy powinny być trawi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zmutowane szczepy robaków zostały dzięki uprzejmości Centrum Genetyki Caenorhabditis. Badania te zostały wsparte grantem Korea Health Technology R&D Project za pośrednictwem Koreańskiego Instytutu Rozwoju Przemysłu Zdrowotnego (KHIDI), finansowanym przez Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej Republiki Korei (numer grantu: HI14C1277).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sonda PNAPANAGENEna zamówienie
Anty-Digoxigenin-Fluoresceina, fragmenty FabRoche11207741910użycia 1:200 rozcieńczony w PBST
Digoxigenin-dUTPRoche11573152910
Albumina surowicy bydlęcejSIGMA-ALDRICHA-7906
ParaformaldehydSIGMA-ALDRICHP-6148przygotować 4% paraformaldehydu przez ogrzewanie w DW z kilkoma kroplami NaOH. dodaj 0,1 objętości 10x PBS.
VectashieldVector LaboratoriesH-1200
Hybrydowy roztwór3x SSC, 50% formamidu, 10% (w/v) siarczan dekstranu, 50 μ g/ml heparyny, 100 i #956; g/ml drożdżowego tRNA , 100 μ g/ml sonikowane plemniki łososia DNA
Hybrydizaiton roztwór2x SSC, 50% formamid
Formamid BIONEERC-9012toksyczny
MetanolCarlo Erba
AcetonCarlo Erba
HeparynaSIGMA-ALDRICHH3393zrobić 10 mg/ml dla roztworu podstawowego
SiarczandekstranuSIGMA-ALDRICH67578
10x PBSDla 1 L DW : 80 g NaCl, 2,0 g KCl, 27 g Na2HPO4• 7H2O, 2,4 g KH2PO
PBST1x PBS, 0,1% tween-20
Polisorbat 20SIGMA-ALDRICHP-2287Nazwa handlowa to Tween-20
Roztwór poli-L-lizyny (0,1% w/v)SIGMA-ALDRICHP-8920przed użyciem przygotować świeży roztwór 0,01% w/v
M93 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O do 1 l
roztworu20% podchlorynu sodu, 0,5 M KOH
Bufor1x PBST, 1 mM EDTA, 0,1% BSA, 0,05% Azydek sodu (toksyczny)
RoztwórBufor przeciwciał z 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA)
ilustracja Microspin G-50GE healthcare27-53310-01
20x SSCAby uzyskać 1 L, 175,3 g NaCl, 88,2 g cytrynianu sodu, H2O do 1 L, dostosować pH do 7,0
2x SSCT2x SSC, 0,1% tween-20
10x mieszanka1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0,65 mM dTTP, 0,35 mM Kolumny oczyszczające DIG-11-dUTP
PCRCosmo genetechCMR0112
Płyn do mycia szyb / ULTRA CLEANDukssan czyste chemikalia8AV721
Szkiełko wielodołkoweMP biomedyczne
PożywkiPrzygotować 1 l, 3 g NaCl, 17 g agaru, 2,5 g peptonu, H2O do 974 ml. Autoklaw i schłodzić kolbę. Dodać 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 4 mg/ml cholesterolu w etanolu, 1 ml 1 M MgSO4, 25 ml 1 M KPO4.
lewamizolSIGMA-ALDRICH196142
RazorFeatherblade No. 11
Rnase AEnzynomics
BSASIGMA-ALDRICHA7906
Mikrosop konfokalnyZeissLSM 510EC Plan-Neofluar 100X.
KomoraPlastikowe pudełko wypełnione ręcznikiem papierowym nasączonym
oprogramowaniem do analizy obrazu DW Dr. Peter LandsdorpTFL-telohttp://www.flintbox.com/public/project/502
niestandardowe płuczący wybielającego przeciwciał blokujący digoksygeniny i dUTP 96041205 hodowlane nicieni Jako soczewkę obiektywową zastosowano wilgotna

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reddel, R. R., Bryan, T. M., Murnane, J. P. Immortalized cells with no detectable telomerase activity. A review. Biochemistry-Moscow. 62, 1254-1262 (1997).
  2. Seo, B., et al. Telomere maintenance through recruitment of internal genomic regions. Nat Commun. 6, 8189(2015).
  3. Cesare, A. J., Reddel, R. R. Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications. Nat Rev Genet. 11, 319-330 (2010).
  4. Meier, B., et al. trt-1 is the Caenorhabditis elegans catalytic subunit of telomerase. Plos Genetics. 2, 187-197 (2006).
  5. Cawthon, R. M. Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 30, 47(2002).
  6. Raices, M., Maruyama, H., Dillin, A., Karlseder, J. Uncoupling of longevity and telomere length in C. elegans. PLoS Genet. 1, 30(2005).
  7. Southern, E. M. Detection of Specific Sequences among DNA Fragments Separated by Gel-Electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98, 503(1975).
  8. Lee, M., et al. Telomere extension by telomerase and ALT generates variant repeats by mechanistically distinct processes. Nucleic Acids Res. 42, 1733-1746 (2014).
  9. Cheung, I., et al. Strain-specific telomere length revealed by single telomere length analysis in Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 32, 3383-3391 (2004).
  10. Shtessel, L., et al. Caenorhabditis elegans POT-1 and POT-2 repress telomere maintenance pathways. G3. 3, Bethesda. 305-313 (2013).
  11. Duerr, J. Immunohistochemistry. WormBook (The C. elegans Research Community). , (2006).
  12. Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Meiosis: Volume 2, Cytological Methods. , Springer. 171-195 (2009).
  13. Emanuel, J. R. Simple and efficient system for synthesis of non-radioactive nucleic acid hybridization probes using PCR. Nucleic acids research. 19, 2790(1991).
  14. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  15. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J Vis Exp. , e4019(2012).
  16. Poon, S. S. S., Martens, U. M., Ward, R. K., Lansdorp, P. M. Telomere length measurements using digital fluorescence microscopy. Cytometry. 36, 267-278 (1999).
  17. Ferreira, H. C., Towbin, B. D., Jegou, T., Gasser, S. M. The shelterin protein POT-1 anchors Caenorhabditis elegans telomeres through SUN-1 at the nuclear periphery. J Cell Biol. 203, 727-735 (2013).
  18. Lee, M. H., Schedl, T. RNA in situ hybridization of dissected gonads. WormBook. , 1-7 (2006).
  19. Tabara, H., Motohashi, T., Kohara, Y. A multi-well version of in situ hybridization on whole mount embryos of Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 24, 2119-2124 (1996).
  20. Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Curr Protoc Cell Biol. 18, Unit 18 14(2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Telomere FISHPNA ProbesC elegansFluorescence In Situ HybridizationTelomere LengthAlternative Lengthening of TelomeresTelomere QuantificationFluorescent MicroscopyProbe HybridizationAntibody Staining

Related Articles