Izolowanie mezangiogennych komórek progenitorowych (MPC) z ludzkiego szpiku kostnego

Summary

Tutaj opisujemy zoptymalizowany, wysoce powtarzalny protokół izolacji mezodermalnych komórek progenitorowych (MPC) od ludzkiego szpiku kostnego (hBM). MPC scharakteryzowano za pomocą cytometrii przepływowej i ekspresji gniazdyny. Wykazali oni zdolność do tworzenia wykładniczo rosnących kultur komórkowych podobnych do MSC, przy jednoczesnym zachowaniu ich potencjału angiogennego.

Abstract

W badaniu naukowym mającym na celu wyizolowanie mezenchymalnych komórek zrębowych (MSC) pochodzących z ludzkiego szpiku kostnego (hBM) do zastosowań klinicznych, zidentyfikowaliśmy nową populację komórek specjalnie wybraną do wzrostu w pożywce suplementowanej surowicą ludzką. Komórki te charakteryzują się cechami morfologicznymi, fenotypowymi i molekularnymi różniącymi się od MSC i nazwaliśmy je mezodermalnymi komórkami progenitorowymi (MPC). MPC są okrągłe, z grubym, wysoce opornym obszarem jądra; Wykazują silną, odporną na trypsynę przyczepność do plastiku. Brak rozszerzenia MPC bezpośrednio ujawnił, że są one powolne w cyklu. Jest to również sugerowane przez negatywny stosunek Ki-67 do Ki-67. Z drugiej strony, hodowla MPC w standardowej pożywce przeznaczonej do ekspansji MSC dała początek populacji gwałtownie rosnących komórek podobnych do MSC. Oprócz wykazywania mezenchymalnej zdolności różnicowania, MPC zachowały potencjał angiogenny, potwierdzając ich wielorodowy charakter progenitorowy. Tutaj opisujemy zoptymalizowany, wysoce powtarzalny protokół izolacji i charakteryzowania hBM-MPC za pomocą cytometrii przepływowej (CD73, CD90, CD31 i CD45), ekspresji gniazd i organizacji F-aktyny. Podano również protokoły mezengenicznego i angiogennego różnicowania MPC. W tym miejscu sugerujemy również bardziej odpowiednią nomenklaturę dla tych komórek, która została przemianowana na "Mezangiogenne Komórki Progenitorowe".

Introduction

Mezenchymalne komórki zrębowe (MSC) mają istotną wartość kliniczną ze względu na ich zdolność do różnicowania wieloliniowego i zdolność do wspierania hemopoezy, wydzielania czynników wzrostu/cytokin, a także do odgrywania roli w immunoregulacji¹. Przy definiowaniu terapii opartych na MSC, produkcja i zastosowanie komórek były przedmiotem szeroko zakrojonych badań klinicznych i przedklinicznych², ze szczególnym uwzględnieniem szczegółowych międzynarodowych przepisów dotyczących bezpieczeństwa i skuteczności leczenia produktami leczniczymi opartymi na komórkach (CBMP)³. Ludzkie MSCs są intensywnie hodowane w pożywkach zawierających suplementy i odczynniki pochodzenia zwierzęcego, takie jak płodowa surowica bydlęca (FBS) i bydlęca trypsyna. W związku z tym, oprócz ryzyka zakaźnego związanego z manipulacją komórkami, pacjenci są również narażeni na priony, a także zagrożenia immunologiczne związane z białkami, peptydami lub innymi biomolekułami pochodzenia zwierzęcego, które mogą utrzymywać się po pobraniu i przeszczepieniu komórek⁴.

Aby obejść ten problem, wyhodowaliśmy MSC pochodzące z ludzkiego szpiku kostnego (hBM) na pożywce wolnej od zwierząt, zastępując FBS zbiorczą ludzką surowicą typu AB (PhABS). W tych warunkach, wraz z rosnącymi MSCs, zidentyfikowaliśmy nową populację komórek. Komórki te różniły się morfologicznie i fenotypowo od MSC i wykazywały charakterystyczny profil ekspresji genów, a także charakterystyczne właściwości wzrostu/adhezji. Zachowały one zarówno potencjał mezengenny, jak i angiogenny, dlatego nazwano je mezodermalnymi komórkami progenitorowymi (MPC)⁵. Następnie byliśmy w stanie zdefiniować selektywne i powtarzalne warunki hodowli w celu wytworzenia MPC o wysokim stopniu czystości⁶.

Dalej badaliśmy morfologiczne i biologiczne właściwości MPC. Okazało się, że MPC są gniazdo-dodatnie, powolne w cyklach, Ki-67-ujemne i z chromosomami charakteryzującymi się długimi telomerami⁵. Wyrażali czynniki transkrypcyjne związane z pluripotencją, Oct-4 i Nanog, a nie główne regulatory MSC Runx2 i Sox9⁷. Fenotypowo MPC wykazywały ekspresję endoglinu (CD105) na niższym poziomie niż MSC, przy jednoczesnym braku markerów mezenchymalnych CD73, CD90, CD166. MPC wykazały również charakterystyczny wzór cząsteczek adhezyjnych charakteryzujących się stałą ekspresją PECAM (CD31), integryn αL (CD11a), αM (CD11b), αX (CD11c), a także integryny β2 (CD18), która specyficznie podtrzymuje struktury podobne do podosomu⁸. W standardowych podłożach ekspansywacyjnych MSC, MPC szybko różnicowały się w MSC poprzez etap pośredni obejmujący aktywację sygnalizacji komórkowej Wnt5 / Calmodulin⁹. MPC zachowały również właściwości angiogenne, o czym świadczy ich zdolność do kiełkowania ze sferoid w hodowlach 3D białek mysiej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Potencjał angiogenny został szybko utracony po różnicowaniu MPC wzdłuż linii mezengenicznej.

Tutaj prezentujemy protokoły zoptymalizowane do izolowania i charakteryzowania wysoce oczyszczonych MPC z próbek krwi hBM. Opisano również powtarzalne protokoły różnicowania mezengenicznego i angiogennego MPC.

Protocol

UWAGA: Po pisemnej zgodzie, próbki hBM zostały pobrane podczas operacji ortopedycznej w celu wymiany stawu biodrowego. Bezpośrednio po osteotomii szyjki kości udowej, a przed rozwierceniem kości udowej, do odsysania świeżego BM użyto strzykawki o pojemności 20 ml zawierającej 500 j.I. heparyny. Protokół należy uznać za szeroko stosowany do każdego źródła BM.

1. Izolacja komórek jednojądrzastych ludzkiego szpiku kostnego (hBM-MNCs)

1. Rozcieńczyć 5 - 10 ml świeżego BM do 50 ml, stosując buforowany fosforan roztwór soli fizjologicznej (D-PBS) firmy Dulbecco i wymieszać przez inwersję. Równomiernie rozprowadzić 25 ml w dwóch nowych stożkowych probówkach o pojemności 50 ml, dodać 25 ml D-PBS do każdej probówki i wymieszać przez odwrócenie.
2. Pozostawić probówki na 10 minut w temperaturze pokojowej w celu oddzielenia mineralnych fragmentów kości i tłuszczu od roztworu.
3. Ostrożnie usunąć pływający tłuszcz za pomocą sterylnej pipety Pasteura i przefiltrować zawiesinę komórek przez filtry 70 μm, nie naruszając osadu mineralnego fragmentu kości.
4. Ustawić cztery probówki o pojemności 50 ml z 15 ml pożywki do wirowania w nieciągłym gradionym gradimencie gęstości (1,077 g/ml). Upewnij się, że to podłoże ma temperaturę pokojową.
5. Delikatnie połóż 20 - 25 ml rozcieńczonego BM na pożywce o gradiencie gęstości. Wykonaj tę operację ostrożnie, pozwalając, aby zawiesina komórek spływała po ściankach rurki, aby zapobiec mieszaniu się warstw.
6. Przeprowadzać wirowanie w gradiencie gęstości przy 400 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej z wyłączonym hamulcem.
7. Zebrać białawy pierścień komórek znajdujących się między dwiema fazami za pomocą sterylnej pipety Pasteura i przenieść go do świeżej probówki o pojemności 50 ml.
8. Umyj komórki świeżą pożywką hodowlaną: bez czerwieni fenolowej, o niskiej zawartości glukozy (1 000 mg / l) Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, 10% (v/v) zbiorcza ludzka surowica typu AB (PhABS), 2 mM L-glutamina i antybiotyki (DMEM/10% PhABS). Wirować przy 400 x g przez 5 min.
9. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 - 10 ml świeżego DMEM/10% PhABS.
10. Przejdź do zliczania komórek. Oznaczyć liczbę białych krwinek przez rozcieńczenie 1:1 w trypanie. Zastosuj to do hemocytometru i obserwuj pod mikroskopem z kontrastem fazowym. Wyklucz małe i idealnie zaokrąglone erytrocyty i martwe komórki zabarwione na niebiesko z liczby komórek.
    UWAGA: Zdecydowanie zaleca się badanie partii PhABS pod kątem ich wydajności w odzyskiwaniu MPC. PhABS ze źródeł amerykańskich dały najlepsze wyniki, podczas gdy większość surowic różnego pochodzenia skutkowała hodowlami MPC z wyższym odsetkiem komórek podobnych do MSC.

2. Izolacja MPC od hBM-MNC

1. Ustawić hydrofobowe kolby T-75 z 15 ml świeżego DMEM/10% PhABS i pozostawić pH i temperaturę do zrównoważenia przez wstępną inkubację w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ przez 30 minut.
2. Nasiona 4 - 6 x 10⁷ hBM-MNC na kolbę i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ przez 48 godzin.
3. Odessać i wyrzucić pożywki i nieprzylegające komórki z kolb. Dodać 15 ml świeżego DMEM/10% PhABS i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ . Utrzymuj kultury przez 6 - 8 dni, zmieniając podłoże co 48 godzin.
   OPCJONALNIE: Aby zwiększyć wydajność MPC, nieprzylegające komórki z 2,3 można ponownie posiać w nowej kolbie hodowlanej i utrzymywać zgodnie z opisem dla kultur pierwotnych.
4. Odessać i wyrzucić pożywkę z kolb, przemyć świeżym DMEM i dodać 2 ml roztworu odłączającego proteazy bez zwierząt. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 - 15 minut (unikać długotrwałej inkubacji).
5. Dodać 10 ml świeżego DMEM/10% PhABS, odessać zawiesinę komórkową i odwirować przy 400 x g przez 5 minut
6. Odessać i wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 - 2 ml świeżego DMEM/10% PhABS. Przejdź do liczenia komórek zgodnie z opisem w kroku 1.10.
   UWAGA: Nie używaj trypsyny/EDTA jako odczynnika odłączającego. MPC są odporne na trypsynę. Wysoce zalecane jest morfologiczne badanie przesiewowe kultur przed pobraniem komórek w celu oceny obecności wrzecionowatych komórek podobnych do MSC. W przypadku wykrycia znacznej ilości komórek podobnych do MSC, należy zwiększyć czystość produktu komórkowego poprzez selektywne usuwanie zanieczyszczonych komórek. W tym celu trawienie trypsyny można przeprowadzić przed zbiorem MPC, dodając 2 ml trypsyny/EDTA 0,05% przez 2 minuty. Przemyć kultury dwukrotnie 5 ml DMEM/10% PhABS, a następnie przystąpić do leczenia proteazą, jak powyżej.

3. Charakterystyka komórki

1. Cytometria przepływowa
   1. Ustawić zduplikowane próbki 10⁵ świeżo oderwanych komórek w roztworze myjącym: D-PBS uzupełnionym 0,5% (v/v) albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 0,02% (w/v) azydkiem sodu. Wirować przy 400 x g przez 5 min.
      ostrożność: Azydek sodu jest toksyczny.
   2. Ponownie zawiesić granulki w 200 μl roztworu myjącego i dodać przeciwciała anty-CD90, anty-CD45, anty-CD73 i anty-CD31 sprzężone z barwnikami fluorescencyjnymi ("TEST"); równolegle ustawić kontrolki izotypu ("CTRL").
      UWAGA: Ilości przeciwciał barwiących należy określić metodą miareczkowania lub zgodnie z instrukcjami producenta.
   3. Próbki inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
   4. Wirować przy 400 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl roztworu płuczącego i uzyskać co najmniej 5 x 10⁴ zdarzenia na wielokolorowym cytometrze przepływowym ^{7 9 10}.
   5. Analizuj wyniki za pomocą wykresów kropkowych i użyj "CTRL" zarejestrowanych zdarzeń, aby ustawić quadrants.
      UWAGA: Aby zdefiniować hodowlę jako hodowlę MPC, procent komórek CD73^negCD90^negCD45 ⁺ CD31 ⁺ powinien wynosić ponad 95%. W przypadku niektórych specyficznych zastosowań, np. analizy ekspresji genów, wartość graniczna odzysku musi zostać zwiększona do 97 - 98%.
2. Wykrywanie nestyny i analiza organizacji F-aktyny
   1. Płytka świeżo wyizolowanych MPC na szkiełkach w komorze hodowlanej (20 000/cm²). Pozostawić komórki do przylegania przez nocną inkubację w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ .
   2. Umyj komórki w roztworze myjącym i utrwal w 4% (w/v) paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Aby usunąć utrwalacz, dodaj roztwór myjący, inkubuj przez 2 minuty i zalej.
   3. Powtórz pranie dwa razy.
   4. Przepuszczalność komórek w D-PBS uzupełnionym 0,05% (v/v) Triton X-100 przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
   5. Zatrzymaj reakcję za pomocą wzmacniacza sygnału bezbiałkowego (30 min w RT) lub standardowego roztworu blokującego (D-PBS uzupełniony 3% (w/v) BSA).
   6. Usuń rozwiązanie wzmacniające/blokujące sygnał.
   7. Dodać 7 μg/ml (w/v) przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko ludzkiemu gniazdu i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc w wilgotnej komorze. Równolegle należy użyć izotypowych przeciwciał kontrolnych do oceny niespecyficznych sygnałów fluorescencyjnych.
   8. Umyj szkiełka dodając D-PBS, pozostaw na 2 minuty i zalej. Powtórz dwa razy.
   9. Dodać 2 μg/ml (w/v) przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z barwnikiem fluorescencyjnym i inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę w ciemności.
   10. Umyj szkiełka jak wyżej.
   11. Dodać fluorescencyjną falloidynę (5 UI/ml), pozostawić w temperaturze pokojowej na 30 minut w ciemności i przemyć 3 razy w D-PBS.
   12. Zdjąć ścianki komory i zamontować szkiełka w wodnym podłożu montażowym uzupełnionym odczynnikiem zapobiegającym blaknięciu i 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) do wykrywania jąder. Przejdź do obrazowania ^{7 9 10}.

4. Mezengeniczne zróżnicowanie MPC

1. Płytka 2 x 10⁴/cm² świeżo wyizolowane MPC w kolbach hodowlanych T75 poddanych działaniu TC i pozostawić komórki na noc do przylegania w DMEM/10% PhABS w temperaturze 37 °C w 5% CO₂.
2. Zastąp DMEM/10% PhABS standardową zredukowaną pożywką surowicy, około 200 μl/^cm2, przeznaczoną do mezenchymalnej ekspansji komórek zrębu (pożywka MSC-RS). Hoduj komórki do konfluencji (P1-MSC), zwykle od 7 do 10 dni od indukcji. Odświeżaj podłoże co 2 dni.
3. Odessać i wyrzucić pożywkę z kolb, przemyć świeżą pożywką MSC-RS i dodać 2 ml roztworu odłączającego proteazy niezawierającego zwierząt. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 - 15 minut (unikać długotrwałej inkubacji).
4. Dodać 10 ml świeżej pożywki MSC-RS, odessać zawiesinę komórek i odwirować przy 400 x g przez 5 minut
5. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 - 2 ml świeżej pożywki MSC-RS. Przejdź do liczenia komórek zgodnie z opisem w kroku 1.10
6. Przystąp do ich subhodowli, wysiewając 3 - 5 x 10³ komórki/cm². Hoduj komórki do konfluencji (P2-MSC).
7. Pobrać komórki przez trawienie proteazy zgodnie z opisem od kroku 4.3 do kroku 4.5 i przejść do charakterystyki opisanej w sekcji 3.
   UWAGA: Odsetek^{komórek neg}CD73 ⁺ CD90 ⁺ CD45 neg CD31 niższy niż 95% wskazywałby tylko na częściowe różnicowanie i wymagałby dalszego pasażu hodowli.
8. Płytka P2-MSC w 2 x 10⁴/cm² w sześciu dobrze potraktowanych TC płytkach i rośnie do konfluencji w podłożu MSC-RS.
9. Oznacz dwie studzienki jako "Brak różnicy" i odśwież podłoże MSC-RS.
10. Oznacz dwie studzienki jako "Osteo" i zastąp pożywkę 200 μl/^cm2 standardowej pożywki osteogennej, specjalnie zaprojektowanej do różnicowania MSC.
11. Oznacz dwie studzienki jako "Adipo" i zastąp pożywkę 200 μl/^cm2 standardowego podłoża adipogenicznego, specjalnie zaprojektowanego do różnicowania MSC.
12. Utrzymuj kultury w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ poprzez wymianę całego podłoża co 48 godzin.
    UWAGA: Zdecydowanie zaleca się stosowanie standardowych, dostępnych na rynku pożywek różnicujących w celu zapewnienia odtwarzalności testu. Po 2-3 tygodniach w warunkach różnicowania w hodowlach indukowanych osteogennie pojawiają się złogi wapnia, natomiast w komórkach indukowanych adipogennie widoczne jest nagromadzenie kropelek lipidów wewnątrzkomórkowych
.
13. Odessać i wyrzucić pożywkę hodowlaną, a następnie przemyć D-PBS.
14. Utrwalić kultury, dodając 1 ml 4% (w/v) paraformaldehydu przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
15. Aby usunąć utrwalacz, dodać D-PBS, inkubować przez 2 minuty i zalać. Powtórz pranie dwa razy.
16. Zabarwić jedną studzienkę "No Diff" razem z dwoma studzienkami oznaczonymi "Osteo" w roztworze fluorescencyjnym specyficznym dla hydroksyapatytu i jedną "No Diff" razem z dwoma dołkami oznaczonymi "Adipo" w roztworze czerwieni nilowej o stężeniu 200 nM. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej^11,12.
17. Usuń roztwory barwiące i dwukrotnie umyj w D-PBS.
18. Usunąć D-PBS, dodać D-PBS uzupełniony 50% (v/v) gliceryną i przystąpić do obrazowania^{7 9 10}.

5. Test kiełkowania sferoidów MPC

1. Aby wytworzyć sferoidy 3D, należy umieścić 20 μl kropli świeżo wyizolowanej zawiesiny MPC (1,5 x 10⁴ komórek/kroplę) na wewnętrznej powierzchni pokrywki szalki Petriego.
   UWAGA: Ponieważ obchodzenie się z kroplami może doprowadzić do ich pęknięcia, zdecydowanie zaleca się układanie ich w nadmiarze.
2. Ostrożnie użyj pokrywki, aby ponownie zamknąć szalkę Petriego zawierającą D-PBS, aby zapobiec parowaniu wiszących kropli. Inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO_{2 przez} noc, aby umożliwić komórkom agregację w sferoidy 3D.
3. Ustawić gęsty żel z mysich białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), dodając 300 μl porcji standardowych białek ECM na wstępnie schłodzonej 24-dołkowej płytce hodowlanej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
4. Ostrożnie przechylić pokrywkę szalki Petriego i delikatnie zebrać sferoidy za pomocą sterylnej pipety Pasteura.
5. Ułożyć sferoidy na żelu białkowym ECM, dodać 700 μl podwielokrotności standardowej pożywki do wzrostu komórek śródbłonka bogatej w VEGF i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ .
6. Po 24 godzinach i po 7 dniach posiewu zrób zdjęcia kultur 3D przy 4-krotnym powiększeniu. Oceń kiełkowanie ze sferoid za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, mierząc odległość promieniową między ostatnią inwazyjną komórką a krawędzią sferoidy. Powtórz pomiary w co najmniej 20 różnych kierunkach. Średnią odległość uznaje się za dodatnią, gdy 50 μm lub więcej.

Results

Opisane tutaj warunki selektywnej hodowli pozwoliły na izolację nowej, prawie monomorficznej populacji komórek jako 1,0% hBM-MNC (0,5 - 2,0 x 10⁶ hBM-MNC z 5 - 10 ml świeżych próbek BM)^5,6. Zidentyfikowaliśmy te duże (40 - 60 μm średnicy), zaokrąglone, spokojne komórki Ki-67-ujemne jako MPC⁵. Morfologicznie charakteryzują się charakterystycznym kształtem jajka sadzonego z grubym obszarem rdzenia otoczonym płaskim, cienkim obwodem ukazującym wiele filopodiów przy większej mocy powiększenia (białe strzałki na rycinie 1 A.1). Często obserwuje się wydłużenie biegunowe zewnętrznej granicy komórki (czarne strzałki na rysunku 1 A.1). Taka morfologia wyraźnie różni się od typowego wrzecionowatego wyglądu mezenchymalnych komórek zrębowych zgłaszanych w standardowych hodowlach MSC. Cytometria przepływowa wykazała, że ponad 95% świeżo wyizolowanych MPC wykazuje ekspresję CD31 i CD45, podczas gdy mezenchymalne markery CD90 i CD73¹³ były niewykrywalne (ryc. 1, A.2). Uważamy, że ten ograniczony zestaw czterech antygenów jest wskaźnikiem dla MPC. Kolejnymi cechami wyróżniającymi MPC są kropkowany rozkład F-aktyny ujawniający szereg struktur podobnych do podosomu (czerwony na rysunku 1 A.3) oraz intensywna ekspresja nestyny (zielona na rysunku 1 A.3), która nie jest wykrywana w komórkach wybarwionych izotypowym przeciwciałem kontrolnym (dane nie pokazane).

Hodowla MPC w standardowym pożywce RS przeznaczonej do ekspansji MSC powoduje szybkie różnicowanie się w wykładniczo rosnące komórki podobne do MSC (Rysunek 1 B.1). Po dwóch przejściach komórki w końcu zmieniają swój fenotyp z CD73^neg, CD90^negCD45 ⁺ CD31 ⁺ na CD73 ⁺ CD90 ⁺ CD45^negCD31^neg (Figura 1 B.2). W tym procesie MPC reorganizują F-aktynę we włókna stresowe, podczas gdy ekspresja gniazdyny zostaje ograniczona do kilku rzadkich komórek (ryc. 1, B.3). Różnicowanie mezengeniczne MPC do określonego fenotypu podobnego do MSC zachodzi poprzez dwa odrębne etapy ujawniające się przez różne morfologie komórek. Po tygodniu w pożywce MSC RS szczątkowa populacja komórek podobnych do MPC jest nadal wykrywalna w zlewającej się warstwie płaskich, wielokątnych komórek wielogałęziowych (P1-MSCs na rysunku 2 A). Dalsze pasażowanie jest wymagane do uzyskania prawie monomorficznej kultury wrzecionowatych komórek podobnych do MSC (P2-MSC na rysunku 2 A). Te wykładniczo rosnące komórki mogą łatwo różnicować się w osteoblasty lub adipocyty po przeniesieniu do selektywnej pożywki przez co najmniej 2 tygodnie, potwierdzając w ten sposób ich charakter MSC. W kulturach indukowanych osteogennie złogi wapnia można wykryć za pomocą barwnika kolorymetrycznego Alizaryny-S lub specyficznych barwników fluorescencyjnych (zielony na rysunku 2 B). Po indukcji adipogennej komórki wykazują nagromadzenie kropelek lipidów, co ujawnia kolorymetryczna czerwień olejowa lub fluorescencyjne barwienie czerwieni nilowej (czerwone na rysunku 2 B).

Typowanie MPC zostało potwierdzone przez test angiogenezy kiełkowania. MPC wykazały zdolność do inwazji (ponad 50 μm) mysiego żelu białkowego ECM ze sferoid 3D po 24-godzinnym bodźcu VEGF (Figura 2 C). Po tygodniu wykryto inwazyjne komórki w odległości 300 - 600 μm. I odwrotnie, zdolność do inwazji została utracona w P2-MSC po różnicowaniu mezengenicznym (Figura 2 D).

Rysunek 1. Świeżo izolowane MPC mają charakterystyczne cechy. Hodowla hBM-MNC w DMEM/10% PhABS przez siedem dni daje populację spoczynkowych MPC (A) łatwo odróżnialnych od MSCs (B) pod względem morfologii (A.1, B.1, podziałki skali = 100 μm), fenotypu (A.2, B.2), rozkładu F-aktyny (czerwony w A.3, B.3) i ekspresji gniazdyny (zielony w A.3, B.3, paski skali = 20 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. MPC różnicują się w standardowe MSC i wykazują angiogenezę kiełkowania in vitro. Zastąpienie DMEM/PhABS dostępnym na rynku medium RS przeznaczonym do ekspansji MSC wyzwala mezengeniczną indukcję MPC. Po tygodniu w hodowli nadal wykrywalnych jest niewiele resztkowych MPC (P1-MSC), podczas gdy dalsze przejście w pożywce MSC-RS prowadzi do populacji zlejących się komórek podobnych do MSC (P2-MSC, paski skali A = 100 μm). P2-MSCs pod wpływem odpowiednich bodźców ostatecznie różnicują się w osteocyty lub adipocyty, co ujawnia się odpowiednio przez odkładanie się wapnia (kolor zielony w B) i akumulację kropelek lipidów (kolor czerwony w B, podziałka = 200 μm). MPC wykazują konsekwentne kiełkowanie ze sferoid w mysim żelu białkowym ECM (C) w różnicy z P2-MSC (D, paski skali = 1,0 mm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

W ostatnich dziesięcioleciach MSCs były szeroko badane i oceniane przedklinicznie pod kątem możliwego zastosowania w leczeniu różnych zaburzeń kostno-stawowych, immunologicznych, neurologicznych, sercowo-naczyniowych, żołądkowo-jelitowych i hematologicznych^14,15. Łatwa i niedroga izolacja multipotencjalnych MSCs z wielu różnych tkanek, w połączeniu z brakiem ich znaczącej immunogenności¹⁶, przyczynia się do tego, że komórki te są jedną z najciekawszych populacji komórek do zastosowania w terapiach komórkowych. Niemniej jednak bardzo niska częstotliwość w tkance pochodzenia stanowi duże ograniczenie w stosowaniu MSCs w klinikach, wymuszając ekspansję tych komórek in vitro przed infuzją lub przeszczepem.

Rozszerzone hodowle MSC wykazały wysoki stopień niejednorodności i zmienności^17-19 , co utrudnia osiągnięcie konsensusu w sprawie protokołów produkcji i charakterystyki MSC. Co więcej, ostatnie badania sugerują obecność wielu przodków MSC in vivo w szerokim zakresie tkanek, co przyczynia się do niejednorodności hodowli^10,20. W rzeczywistości zaproponowano, że określone warunki hodowli mogą selekcjonować lub po prostu promować określone subpopulacje przodków MSCs obecnych, w różnym odsetku, w "surowych" i nieprzetworzonych próbkach, takich jak szpik kostny (hBM-MNC) lub tkanka tłuszczowa (frakcja naczyniowa zrębu)². W związku z tym zmienność populacji komórek inicjujących MSC wraz z dużą liczbą stosowanych protokołów wzbogacania/izolacji i hodowli stanowi dużą przeszkodę w określeniu wykonalnych terapii opartych na MSC.

Istotnym czynnikiem wpływającym na niejednorodność kultur MSC jest suplementacja surowicy²¹. W naszych rękach zastąpienie FBS PhABS w kulturach pierwotnych z hBM-MNC, w połączeniu z wysiewem o wysokiej gęstości na hydrofobowych tworzywach sztucznych, doprowadziło do wyizolowania nowej, wysoce przylegającej populacji komórek o odrębnych cechach biologicznych nazwanych MPCs^5,6. Zaobserwowaliśmy, że dodanie niewielkich procentów PhABS do pierwotnych kultur FBS również umożliwiło izolację MPC, co sugeruje obecność środków indukujących MPC w ludzkiej surowicy⁶. W chwili obecnej protokół izolacji/charakterystyki MPC jest unikalną dostępną metodą uzyskiwania prawie czystych MPC. Protokół został starannie dostosowany i jest wysoce powtarzalny w celu zapewnienia wysokiej jakości badań przesiewowych preparatów MPC przed dalszymi zastosowaniami.

MPC mogą być wykorzystywane jako źródło do produkcji MSC, ograniczając w ten sposób zmienność wynikającą z zastosowania niefrakcjonowanego materiału wyjściowego. Dokładna definicja wielu etapów charakteryzujących różnicowanie mezengeniczne MPC, o których stwierdzono⁹ , pozwoliłaby na zsynchronizowaną ekspansję komórek mezenchymalnych. Niemniej jednak ten ostatni warunek może być zrealizowany wyłącznie przy użyciu wysoce oczyszczonej populacji MPC, w konsekwencji charakterystyka produktów komórkowych otrzymanych za pomocą opisanego tutaj protokołu, wyników o kluczowym znaczeniu. Doniesiono, że ta metoda izolacji pozwala na odzysk MPC o czystości na ogół około 95%. Jednak zmienność dawcy/pacjenta wraz ze zmiennością związaną z różnymi partiami zastosowanej surowicy ludzkiej może prowadzić do znacznego odsetka komórek podobnych do MSC wyizolowanych razem z MPC w warunkach selektywnych.

Nie jest jasne, czy te "zanieczyszczające" komórki podobne do MSC mogą powstawać z innych różnych komórek progenitorowych in vivo opisanych w szpiku kostnym²² , czy też z niekontrolowanego i spontanicznego różnicowania MPC. W każdym razie, stały odsetek komórek podobnych do MSC w produktach MPC niweczy możliwość zastosowania tych komórek jako jednorodnego materiału wyjściowego do ekspansji MSC. Dlatego tutaj zaproponowano prostą i niedrogą metodę, opartą na odporności MPC na trawienie trypsyny, zwiększającą czystość produktów MPC. Podobne, a nawet lepsze wyniki w oczyszczaniu kultur MPC można osiągnąć poprzez sortowanie komórek fluorescencyjnych lub magnetycznych, które powoduje zubożenie CD73 i/lub CD90, ale znacznie wydłuża czas procesu i zwiększa koszty.

Co więcej, MPC wykazywały ekspresję markerów związanych z pluripotencją i nestyny, które szybko utraciły się podczas różnicowania mezengenicznego⁷. Test kiełkowania ujawnił zdolność MPC do inwazji mysiego żelu białkowego ECM. Podsumowując, wyniki te wskazują, że MPC należy uznać za bardziej niedojrzałego przodka, zachowującego potencjał angiogenny. Niemniej jednak początkowy entuzjazm co do mezodermalnego potencjału różnicowania MPC w rzeczywistości słabnie. W rzeczywistości, po ponad 7 latach badań nad MPC, potencjał mezengenny i angiogenny został obszernie opisany^5-9, ale nadal brakuje różnicowania w stosunku do innych komórek pochodzenia mezodermalnego. Dlatego tutaj proponujemy nową i bardziej rygorystyczną definicję tych komórek jako "mezangiogennych komórek progenitorowych", zachowując akronim MPC.

Uważamy również, że większość kontrowersji dotyczących potencjału angiogennego MSC może być związana z niejednorodnym składem ekspansowanych kultur składających się z subpopulacji MPC i MSCs w zmiennym procencie²³.

Wreszcie, MPC mogą również odegrać kluczową rolę we wdrażaniu CBMP mających zastosowanie do rekonstrukcji tkanek, ponieważ komórki te mogą również wspierać neowaskularyzację. W rzeczywistości przyszłe badania nad regeneracją powinny uwzględniać fakt, że wzrost nowo powstałych tkanek powinien być wspierany przez jednoczesną neoangiogenezę. Współistnienie potencjału mezengennego i angiogennego w MPC może znacznie poprawić potencjał regeneracyjny nowych podejść terapeutycznych, które obejmują te interesujące komórki.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD Bioscience (San Jose, CA-USA)	354230	Mysie białka ECM Stężenie podstawowe: 100% (9 - 12 mg / ml) Stężenie końcowe: 100%
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (D-PBS)	Sigma (St. Louis, MO, USA)	D8537
70 μ m	Filtry Miltenyi Biotec (BergischGladbach, Niemcy)	130-095-823
Ficoll-Paque PREMIUM	GE Healthcare (Uppsala, Szwecja)	17-5442-03	pożywka do wirowania w nieciągłym gradieniu gęstości
Zbiorcza ludzka surowica typu AB (PhABS)	LONZA (Walkersville MD-USA)	14-490E	Stężenie końcowe: 10%
Glutamax-I	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	35050-038	Stabilizowana L-glutamina Stężenie zapasów: 100x Stężenie końcowe: 2 mM
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma (St. Louis, MO, USA)	A8412	Stężenie zapasów: 7,5% Stężenie końcowe: 0,5%
Azydek sodu	Sigma (St. Louis, MO, USA)	S8032	Stężenie końcowe: 0,02%
Penicylina / Streptomycyna (paciorkowiec pióra)	Gibco ( Grand Island, NY, USA)	15070-063	Antybiotyki Stężenie magazynowe: 5,000 UI/ml penicyliny, 5,000 i #956; g/ml Streptomycyna Stężenie końcowe: 50 UI/ml penicyliny, 50 μ g/ml Kolba hodowlana Streptomycyny
T-75 do kultur zawiesinowych	Greiner Bio-one  (Frickenhausen, Niemcy)	658 190
Kolba hodowlana T-75	Greiner Bio-one poddana działaniu TC  (Frickenhausen, Niemcy)	658170
TrypLE Select	ThermoFisher (Waltham,  MA, USA)	12563-011	Bezzwierzęcy roztwór odłączający proteazy Stężenie podstawowe: 1x Stężenie końcowe: 1x
Trypsyna/EDTA	ThermoFisher (Waltham,  MA, USA)	15400-054	Bez czerwieni fenolowej Stężenie magazynowe: 0,5% Stężenie końcowe: 0,25%
przeciwciało anty-CD90 APC  (płyta CD90)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Niemcy)	130-095-402	Stężenie końcowe: 1:40
anty-CD45 APC-Vio770 (CD45)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Niemcy)	130-096-609	Stężenie końcowe: 1:40
przeciwciało anty-CD73 PE (CD73)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Niemcy)	130-095-182	Stężenie końcowe: 1:40
przeciwciało anty-CD31 PE Vio-770 (CD31)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Niemcy)	130-105-260	Stężenie końcowe: 1:40
Mysie przeciwciało IgG1 APC	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Niemcy)	130-098-846	Stężenie końcowe: 1:40
Mysie przeciwciało IgG2a APC Vio770	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Niemcy)	130-096-637	Stężenie końcowe: 1:40
Mysie przeciwciało IgG1 PE	MiltenyiBiotec ( BergischGladbach, Niemcy)	130-098-845	Stężenie końcowe: 1:40
Mysie przeciwciało IgG1 PE Vio-770	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Niemcy)	130-098-563	Stężenie końcowe: 1:40
Niski poziom glukozy Zmodyfikowany Eagle Medium firmy Dulbecco  (DMEM)	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	13-1331-82	Minimalna pożywka niezbędna bez czerwieni fenolowej Stężenie podstawowe: 1,000 mg/L
glukozy Surowica bydlęca  (FBS)	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	10500	Stężenie magazynowe: 0,2 mg / ml Stężenie końcowe: 2 i mu; g / ml
Odczynnik przeciwblaknięcia Prolong Gold z 4',6-diamidino-2-fenyloindolem	Invitrogen (Waltham, MA,  USA)	P-36931	Wodne medium montażowe + DAPI Stężenie końcowe: 1x
Paraformaldehyd	Sigma (St. Louis, MO, USA)	P6148	Utrwalacz Stężenie końcowe: 4%
Szkiełka dwukomorowe LAB-TEK	Sigma (St. Louis, MO, USA)	C6682
Przeciwciało anty-Nestin [klon 10C2]	Abcam (Cambridge, Wielka Brytania)	ab2035	Stężenie podstawowe: 1 mg / ml Stężenie końcowe: 7 μ g/ml
Alexa Fluor 555 Phalloidin	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	A34055	Stężenie zapasów: 200 UI / ml Stężenie końcowe: 5 UI / ml
Triton X-100	Euroclone (Mediolan, Włochy) EMR237500		Stężenie końcowe: 0,05%
MesenPRO RS Medium  (Medium MSC-RS)	ThermoFisher (Waltham,  MA, USA)	12746-012
Alexa Fluor 488 zestaw przeciw myszom SFX	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	A31619	Wtórne przeciwciało przeciw mysim kozom + wzmacniacz sygnału Stężenie podstawowe: 2 mg / ml Stężenie końcowe: 2 i mu; g/ml
Pipeta Pasteura	Kartell Labware  (Noviglio (MI), WŁOCHY )	329
StemMACS AdipoDiff  Media	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Niemcy)	130-091-679
StemMACS OsteoDiff  Media	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Niemcy)	130-091-678
Test mineralizacji kości Osteoimage	LONZA (Walkersville, MD-USA)	PA-1503	Fluorescencyjny roztwór barwiący specyficzny dla hydroksyapatytu
50 ml Rurka stożkowa z polistyrenu	Greiner bio-one (Kremsmü nster Austria)	227261
Nile Red	ThermoFisher (Waltham,  MA USA)	N1142	Fluorescencyjny roztwór barwiący do lipidów Stężenie podstawowe: 100 mM Stężenie końcowe: 200 nm
Gliceryna	Sigma (St. Louis, MO, USA)	G2289	Stężenie końcowe: 50%
Polistirene szalki	Petriego Sigma (St. Louis, MO, USA)	P5606
Płytki 24-dołkowe z powłoką TC	Greiner Bio-one GmbH (Frickenhausen, Niemcy)	662160
Pożywka do wzrostu śródbłonka, EGM-2 BulletKit  (NWZA-2)	LONZA (Walkersville, MD-USA)	CC-3162	Bogate w VEGF podłoże do wzrostu komórek śródbłonka
Leica Qwin Image Analisys Software	Leica (Wetzlar, Niemcy)		Oprogramowanie do analizy obrazu