Techniki ewolucji wytrzymałych drożdży fermentujących pentozy do biokonwersji lignocelulozy do etanolu

Summary

Techniki adaptacyjnej ewolucji i izolacji są opisane i zademonstrowane, aby uzyskać pochodne szczepu Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124, które są w stanie szybko zużywać mieszaninę cukrów heksozowych i pentozowych w enzymatycznych scukrzanych niedetoksykowanych hydrolizatach i gromadzić ponad 40 g/L etanolu.

Abstract

Biomasa lignocelulozowa jest obfitym, odnawialnym surowcem przydatnym do produkcji etanolu klasy paliwowej i innych bioproduktów. Procesy obróbki wstępnej i scukrzania enzymatycznego uwalniają cukry, które mogą być fermentowane przez drożdże. Tradycyjne drożdże przemysłowe nie fermentują ksylozy (stanowiącej do 40% cukrów roślinnych) i nie są w stanie funkcjonować w skoncentrowanych hydrolizatach. Skoncentrowane hydrolizaty są potrzebne do ekonomicznego odzyskiwania etanolu, ale są one obciążone toksycznymi produktami ubocznymi powstającymi podczas obróbki wstępnej. Chociaż metody detoksykacji mogą sprawić, że hydrolizaty będą fermentować, są kosztowne i generują zobowiązania z tytułu utylizacji odpadów. W tym miejscu opisano i zademonstrowano techniki ewolucji adaptacyjnej i izolacji, aby uzyskać pochodne rodzimego szczepu Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124, które są w stanie skutecznie przekształcać hydrolizaty w ekonomicznie odzyskiwalny etanol pomimo niekorzystnych warunków hodowli. Ulepszone osobniki są wzbogacane w ewoluującej populacji przy użyciu wielokrotnych nacisków selekcyjnych zależnych od naturalnej różnorodności genetycznej populacji S. stipitis i mutacji wywołanych ekspozycją na dwa różne hydrolizaty, etanol lub promieniowanie UV. Kultury w końcowej ewolucji są rozcieńczane w celu zebrania dominujących izolatów, podczas gdy populacje pośrednie, zamrożone w glicerolu na różnych etapach ewolucji, są wzbogacane na selektywnych podłożach przy użyciu odpowiednich gradientów naprężeń w celu odzyskania najbardziej obiecujących izolatów poprzez rozcieńczanie. Izolaty są poddawane badaniom przesiewowym na różnych typach hydrolizatów i klasyfikowane przy użyciu nowatorskiej procedury obejmującej bezwymiarowe przemiany wskaźnika względnej wydajności (RPI) szybkości wchłaniania ksylozy i danych dotyczących uzysku etanolu. Korzystając z parametru statystycznego RPI, oblicza się ogólną względną średnią wydajności w celu uszeregowania izolatów na podstawie wielu czynników, w tym warunków hodowli (różniących się składnikami odżywczymi i inhibitorami) oraz cech kinetycznych. Dzięki zastosowaniu tych technik, pochodne szczepu rodzicielskiego miały następujące ulepszone cechy w scukrzanych enzymach hydrolizatach o pH 5-6: zmniejszone początkowe opóźnienie fazy poprzedzającej wzrost, zmniejszone opóźnienie diauxic podczas przejścia glukoza-ksyloza, znacznie zwiększone tempo fermentacji, lepsza tolerancja etanolu i akumulacja do 40 g / l.

Introduction

Szacuje się, że rocznie 1,3 miliarda ton suchej biomasy lignocelulozowej mogłoby wesprzeć produkcję etanolu i pozwolić Stanom Zjednoczonym na zmniejszenie zużycia ropy naftowej o 30%. ¹ Chociaż w wyniku hydrolizy biomasy roślinnej powstają mieszaniny cukrów bogate w glukozę i ksylozę, inhibitory fermentacji są wytwarzane przez chemiczną obróbkę wstępną niezbędną do rozbicia hemicelulozy i wystawienia celulozy na atak enzymatyczny. Uważa się, że kwas octowy, furfural i hydroksymetylofurfural (HMF) są kluczowymi składnikami spośród wielu inhibitorów, które powstają podczas wstępnego leczenia. Aby posunąć naprzód przemysł etanolu lignocelulozowego, potrzebne są badania i procedury umożliwiające ewolucję szczepów drożdży zdolnych do przetrwania i wydajnego funkcjonowania w celu wykorzystania zarówno cukrów heksozowych, jak i pentozowych w obecności takich związków hamujących. Istotną dodatkową słabością tradycyjnych przemysłowych szczepów drożdży, takich jak Saccharomyces cerevisiae, jest brak możliwości efektywnej fermentacji ksylozy dostępnej w hydrolizatach biomasy roślinnej.

Szczep typu Pichia stipitis NRRL Y-7124 (CBS 5773), ostatnio przemianowany na Scheffersomyces stipitis, to rodzime drożdże fermentujące pentozowo, które są dobrze znane z fermentacji ksylozy do etanolu. ^2,3 Ewolucja szczepu NRRL Y-7124 była kontynuowana w tym miejscu, ponieważ udokumentowano, że ma on największy potencjał rodzimych szczepów drożdży do akumulacji ekonomicznie odzyskiwalnego etanolu w ilości przekraczającej 40 g/l z niewielką ilością produktu ubocznego ksylitolu. ^4,5,6 W optymalnym podłożu szczep S. stipitis NRRL Y-7124 wytwarza 70 g/l etanolu w ciągu 40 godzin (1,75 g/l/h) z wydajnością 0,41 ± 0,06 g/g w hodowlach o dużej gęstości komórek (6 g/l komórek). ^7,8 Odnotowano również oporność na inhibitory fermentacji, etanol, furfural i ^HMF,9 a S. stipitis został sklasyfikowany jako jedne z najbardziej obiecujących rodzimych drożdży fermentujących pentozę dostępnych do produkcji etanolu na skalę komercyjną z lignocelulozy. ¹⁰ Naszym celem było zastosowanie różnorodnych, nieodtrutych hydrolizatów lignocelulozowych i nacisków selekcyjnych etanolu, aby wymusić ewolucję w kierunku bardziej wytrzymałej pochodnej szczepu NRRL Y-7124 nadającej się do zastosowań przemysłowych. Kluczowymi z poszukiwanych ulepszeń były szybsze tempo wchłaniania cukru w skoncentrowanych hydrolizatach, zmniejszona diauxy w celu bardziej efektywnego wykorzystania mieszanych cukrów oraz wyższa tolerancja etanolu i inhibitorów. Zastosowanie S. stipitis do nieodtrutych hydrolizatów było kluczowym celem badań mających na celu wyeliminowanie dodatkowych kosztów operacyjnych związanych z procesami detoksykacji hydrolizatów, takimi jak nadmierne wapnowanie.

Do ewolucji sił zastosowano dwa obiecujące hydrolizaty przemysłowe: enzymatyczny hydrolizat słodziany amoniaku wstępnie przetworzony (AFEX CSH) oraz rozcieńczony hydrolizat trawy rózgowej (PSGHL) poddany wstępnej obróbce kwasem. ^11,12 Technologia obróbki wstępnej AFEX jest opracowywana w celu zminimalizowania produkcji inhibitorów fermentacji, podczas gdy obróbka wstępna rozcieńczonym kwasem stanowi obecnie najtańszą technologię najczęściej praktykowaną w celu wystawienia biomasy celulozowej do scukrzania enzymatycznego. PSGHL można oddzielić od celulozy pozostałej po obróbce wstępnej i jest charakterystycznie bogaty w ksylozę z hydrolizowanej hemicelulozy, ale ma niską zawartość glukozy. Składy AFEX, CSH i PSGHL różnią się od siebie kluczowymi aspektami, które zostały wykorzystane do zarządzania procesem ewolucji. AFEX CSH ma niższą zawartość aldehydów furanowych i inhibitorów kwasu octowego, ale wyższą zawartość aminokwasów i źródeł azotu amoniakalnego w porównaniu z PSGHL (Tabela 1). PSGHL stanowi dodatkowe wyzwanie polegające na tym, że ksyloza jest dominującym dostępnym cukrem. W związku z tym PSGHL jest odpowiedni do specyficznego wzbogacania w celu poprawy wykorzystania ksylozy w hydrolizatach, co jest słabością uniemożliwiającą komercyjne wykorzystanie dostępnych drożdży. Nawet wśród rodzimych drożdży fermentujących pentozę poleganie na nieoptymalnym cukrze ksylozie w celu wspomagania wzrostu i naprawy komórek staje się jeszcze trudniejsze w hydrolizatach z różnych powodów: niedoborów składników odżywczych, inhibitorów powodujących rozległe uszkodzenia integralności strukturalnej komórek oraz zakłóceń metabolizmu spowodowanych brakiem równowagi redoks. ⁹ Suplementacja azotem, zwłaszcza w postaci aminokwasów, może stanowić znaczny koszt operacyjny fermentacji. Wpływ suplementacji azotem na badania przesiewowe i klasyfikację izolatów badano za pomocą hydrolizatów proso rózgowatych.

Ulepszone osobniki zostały wzbogacone w ewoluującej populacji, korzystając z wielokrotnych nacisków selekcyjnych zależnych od naturalnej różnorodności genetycznej populacji S. stipitis i mutacji wywołanych ekspozycją na dwa różne hydrolizaty, etanol lub promieniowanie UV. Naciski selekcyjne zastosowano równolegle i szeregowo, aby zbadać postęp ewolucji S. stipitis w kierunku pożądanych pochodnych zdolnych do efektywnego wzrostu i fermentacji w hydrolizatach (ryc. 1). Powtarzające się hodowle populacji funkcjonalnych w coraz trudniejszych hydrolizatach przeprowadzono na mikropłytkach wykorzystujących serię rozcieńczeń 12% glukanu AFEX CSH lub PGSHL przygotowanych przy 20% obciążeniu ciałami stałymi. Zastosowanie wzrostu ksylozy w hodowli ciągłej pod wpływem etanolu jeszcze bardziej poprawiło populacje przystosowane do AFEX CSH poprzez wzbogacenie o fenotypy wykazujące mniejszą podatność na represję etanolu przy wykorzystaniu ksylozy. Ta ostatnia cecha została niedawno wykazana jako problematyczna dla wykorzystania pentozy przez szczep NRRL Y-7124 po fermentacji glukozy. ⁸ Następnie zbadano wzbogacanie PSGHL w celu poszerzenia funkcjonalności hydrolizatu.

Przypuszczalne ulepszone pochodne S. stipitis NRRL Y-7124 zostały wyizolowane z każdej fazy procesu ewolucji, stosując ukierunkowane wzbogacanie w warunkach stresu i rozcieńczanie posiewu w celu wybrania kolonii z najbardziej rozpowszechnionych populacji. Bezwymiarowe względne wskaźniki wydajności (RPI) wykorzystano do uszeregowania szczepów na podstawie ogólnej wydajności, przy czym zachowanie kinetyczne oceniano na różnych typach hydrolizatów i zastosowanych suplementach odżywczych. Chociaż sukcesy różnych procedur adaptacyjnych mających na celu poprawę funkcjonalności S. stipitis w hydrolizatach lignocelulozowych zostały już wcześniej udokumentowane, szczepy wykazujące ekonomiczną produkcję etanolu na niedetoksykowanych hydrolizatach nie zostały wcześniej zgłoszone. ^13-17 Korzystając z procedur ewolucji, które zostaną zobrazowane bardziej szczegółowo tutaj, Slininger i wsp.¹⁸ opracowano szczepy, które są znacznie ulepszone w stosunku do szczepu macierzystego NRRL Y-7124 i są w stanie wytwarzać >40 g/l etanolu w AFEX CSH i enzymatyczny scukrzony hydrolizat proso rózgowatych rózg rózgowatych (SGH) odpowiednio uzupełniony źródłami azotu. Te nowe szczepy są w przyszłości interesujące dla rozwijającego się przemysłu lignocelulozy do etanolu oraz jako przedmiot dodatkowych badań genomicznych opartych na wcześniej zsekwencjonowanych szczepach NRRL Y-11545. ¹⁹ Badanie genomiczne najważniejszych szczepów wytworzonych w różnych fazach ewolucji, przedstawione na rysunku 1, wyjaśniłoby historię zmian genetycznych, które wystąpiły podczas rozwoju, jako wstęp do dalszych badań nad ulepszaniem szczepów.

Protocol

1. Przygotuj materiały wyjściowe i sprzęt do testów

1. Przygotować hydrolizaty z użyciem 18 do 20% początkowej suchej masy biomasy w reakcji obróbki wstępnej do wykorzystania w procedurach ewolucji, izolacji i klasyfikacji. Patrz Slininger i wsp. 2015¹⁸ dla szczegółowych metod otrzymywania AFEX CSH, PSGHL i SGH z dodatkami azotu N1 lub N2 stosowanymi w ewolucji, izolacji lub rankingu. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się ze składem każdego rodzaju hydrolizatu.
   UWAGA: Fortyfikacje azotowe SGH oznaczono jako SGH-N1 lub SGH-N2 zdefiniowane w następujący sposób: SGH-N1 = SGH wzbogacone do stosunku molowego węgla do azotu (C:N) 42:1 ze źródłami azotu, w tym mocznikiem, aminokwasami bezwitaminowymi z kazeiny, D,L-tryptofanem, L-cysteiną i witaminami z określonych źródeł (tak, że ~15% azotu molowego N to pierwszorzędowy azot aminowy (PAN), a ~85% N pochodzi z mocznika); SGH-N2 = SGH wzbogacony do 37:1 C:N mocznikiem i mąką sojową jako najtańszym komercyjnym źródłem aminokwasów i witamin, dostarczającym ~12% N z PAN i 88% w postaci mocznika.
2. Zdobądź liofilizowaną kulturę szczepu rodzicielskiego, Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 (CBS 5773) z ARS Culture Collection (National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, Illinois) i przygotuj podstawowe kultury glicerolu zgodnie z zaleceniami. Utrzymywać kultury wyjściowe drożdży rodzicielskich i ich pochodnych w 10% glicerolu w temperaturze -80 °C.
   1. Zawiesić zapasy glicerolu na płytkach agarowych dekstrozy peptonowej (YM) słodu drożdżowego (YM) (3 g/l ekstraktu drożdżowego, 3 g/l ekstraktu słodowego, 5 g/l peptonu, 10 g/l dekstrozy, 20 g/l agaru) i inkubować 48-72 godziny w temperaturze 25 °^C.8 Opracowane płytki można przechowywać do tygodnia w temperaturze 4 °C przed użyciem jako płynny inokular do hodowli wstępnej.
3. Przygotowanie optymalnego zdefiniowanego podłoża (ODM), syntetycznego podłoża zgodnego z procedurami formulacji przemysłowej²⁰, które zostało wcześniej opracowane w celu optymalnej konwersji ksylozy do etanolu przez szczep macierzysty Scheffersomyces (Pichia) stipitis NRRL Y-7124. ⁷ Stosować zdefiniowaną pożywkę we wszystkich prekulturach i kulturach do testów biologicznych wydajności fermentacji, a także do ciągłej ewolucji kultur z prowokacją etanolem, karmionych ksylozą. Skład ODM jest wymieniony w celach informacyjnych w tabeli 2.
4. Jak opisano ^{wcześniej,18} należy przeanalizować biomasę komórkową za pomocą spektrofotometru z odczytem kuwety lub mikropłytki, w zależności od przypadku, w celu zmierzenia absorbancji kultury przy długości fali 620 nm (A₆₂₀). Oznaczać ilościowo cukry, etanol, furfural, hydroksymetylofurfural (HMF) i kwas octowy w próbkach hodowlanych przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) lub zrobotyzowanego oznaczania enzymatycznego glukozy i ksylozy w celu zwiększenia przepustowości.

2. Wzbogacanie wytrzymałych instrumentów pochodnych podczas transferu szeregowego na AFEX CSH

1. Zaszczepić prekulturę szczepu NRRL Y-7124. Przenieś komórki z agaru YM do 75 ml ODM + 150 g / L ksylozy, aby utrzymać zdolność do wzrostu w stresie osmotycznym. Inkubować kultury wstępne w kolbach o pojemności 125 ml zamkniętych silikonowymi zatyczkami z gąbki przez 24 godziny w temperaturze 25 °C z wytrząsaniem (150 obr./min, orbita 1").
2. Rozmrozić zamrożone podwielokrotności 6-12% glukanu AFEX CSH w zimnej wodzie do użycia. W razie potrzeby dostosuj pH do 5 i przefiltruj sterylizację przed przygotowaniem serii rozcieńczeń w 96-dołkowych mikropłytkach.
3. Napełnić mikropłytki 50 μl na studzienkę i 8 dołkami na rozcieńczenie hydrolizatu, a następnie zaszczepić kilkoma mikrolitrami kultury wstępnej na studzienkę, aby umożliwić początkową absorbancję (620 nm) A₆₂₀ ≥0,1. Inkubować płytki statycznie przez 24-48 godzin w temperaturze 25 °C w plastikowym pudełku z mokrym ręcznikiem papierowym w celu uzyskania wilgotności.
4. Stosując najbardziej skoncentrowane rozcieńczenie hydrolizatu, które widocznie urosło do A₆₂₀ >1, przenieść 1-5 μl do każdej studzienki nowej serii rozcieńczeń hydrolizatu, aby uzyskać początkową A₆₂₀ ≥0,1.
5. Monitorować kulturę wzrostu A₆₂₀ w mikropłytkach za pomocą spektrofotometru. Seria rozcieńczeń bez inokulacji służy jako kontrola i ślepa próba. Pokrywy płyt pozostają założone podczas monitorowania, aby zapobiec zanieczyszczeniu, a odczyty są odpowiednio dostosowywane.
6. Regularnie przygotowywać zapasy glicerolu w kulturach adaptacyjnych w celu późniejszej izolacji ulepszonych szczepów lub do wykorzystania w reinokulacji ciągłej serii rozcieńczania hydrolizatu. Aby przygotować zapasy, należy połączyć cztery studzienki (200 μl) o największym skolonizowanym stężeniu hydrolizatu. Wymieszać 1:1 z 20% sterylnym glicerolem w kriowialach, aby zamrozić komórki w 10% glicerolu w temperaturze -80 °C.
7. Powtarzaj kroki 2.3-2.6, aż wzrost 12% glukanu AFEX CSH będzie stale widoczny po 24 godzinach.

3. Wyizoluj pochodne tolerancyjne dla pojedynczych komórek po wzbogaceniu na AFEX CSH

1. Smugi wybranych zapasów glicerolu z kultur adaptacyjnych do agaru YM i użyj smug do zaszczepienia 50 μl 3% lub 6% glukanu AFEX CSH (pH 5) w każdej z trzech studzienek mikropłytki (początkowe A₆₂₀ ~ 0,1). Inkubować mikropłytki przez 24 godziny, jak w kroku 2.3. Basen replikuje skolonizowane studnie o najwyższej sile hydrolizatu o silnym wzroście, a płytka rozcieńczająca do YM lub 6% glukanu AFEX CSH agar. Przygotuj ten ostatni jako mieszaninę 1:1 sterylizowanego filtrem 12% glukanu AFEX CSH z ciepłym autoklawizowanym roztworem agaru o stężeniu 30 g/l.
2. Pobrać 5 pojedynczych kolonii z płytki o najwyższym stopniu rozcieńczenia, wykazujących wzrost po 24-48 godzinnej inkubacji w temperaturze 25 °C, aby zamrozić je jako kultury podstawowe glicerolu. Umieść każdą kolonię na talerzu YM. Inkubować 24 godziny. Za pomocą sterylnej pętli przenieś rozwiniętą smugę komórek do małej objętości 10% glicerolu, wymieszaj w celu zawieszenia komórek i rozprowadź do 2-3 kriowialiów w celu zamrożenia w temperaturze -80 °C.

4. Oceń wydajność pochodnych tolerancyjnych AFEX CSH w porównaniu z macierzystymi

1. Testuj izolaty w prostych 6% kulturach wsadowych Glucan AFEX CSH.
   1. Przenieś komórki z 48-godzinnych płytek z glicerolem do buforu fosforanu potasu o pH 7 (0,4 mM), aby przygotować zawiesiny komórek z A₆₂₀ = 10. Użyj 1 μl każdej zawiesiny do zaszczepienia każdej z czterech studzienek po 50 μl 3% hydrolizatu glukanu do początkowego A₆₂₀ = 0,2. Inkubować mikropłytki przez 24 godziny, jak w kroku 2.3. Przygotuj 3% glukan AFEX CSH o pH 5, rozcieńczając 12% glukan AFEX CSH 1:3 sterylną wodą.
   2. Przenieść dwie 24-godzinne studzienki mikropłytki w celu zaszczepienia 25 ml kultur wstępnych o pH 5 12% glukanu AFEX CSH użytego w 50% pełnej mocy. Inkubować kultury wstępne w kolbach o pojemności 50 ml z zamknięciami z gąbki silikonowej przez 24 godziny w temperaturze 25 °C, ~150 obr./min (orbita 1"). Przygotuj 12% glukan AFEX CSH o połowie mocy, rozcieńczając hydrolizat 1:1 sterylną wodą.
   3. Użyj prekultur hydrolizatu o połowie mocy, aby zaszczepić podobne 25 ml kultur wzrostu do początkowego A₆₂₀ = 0,1. Inkubować kultury wzrostowe jak powyżej (4.1.2) i pobierać próbki codziennie (0,2 ml). Monitorowanie akumulacji biomasy (A₆₂₀) oraz stężeń cukrów i produktów fermentacji (HPLC).
2. Alternatywnie, należy ponownie rozbić (tj. zebrać i ponownie wykorzystać) populacje 6% drożdży hodowanych w AFEX CSH w celu przetestowania w 8% hydrolizatowych kulturach hydrolizowanych glukanu, jak opisano wcześniej. ^{Rozdział 18}
3. Alternatywnie, dalsze badania populacji ponownie rozdrobnionych 6% kultur glukanu AFEX CSH poprzez karmienie 12% hydrolizatem glukanu, jak opisano wcześniej. ^{Rozdział 18}
4. Zbadać opóźnienie diuksowe izolatów w kulturach okresowych ODM z mieszankami cukrów.
   1. Zaszczepić prekultury 75 ml ODM ze 150 g/l ksylozy w kolbach o pojemności 125 ml z zamknięciami z gąbki silikonowej przez transfer pętli ze smug glicerolu YM. Inkubować przez 24 godziny, jak w kroku 2.1.
   2. Użyć prekultur do zaszczepienia podobnych 75 ml kultur testowych ODM zawierającym 75 g/l glukozy i 75 g/l ksylozy o pH 6,5. Wstrząsnąć kolbami w temperaturze 25 °C, 150 obr./min. Próbka codziennie.
   3. Alternatywnie, należy zbadać wpływ kwasu octowego 0-15 g/l na diauxy podczas fermentacji glukozy i ksylozy, stosując podobny protokół, z wyjątkiem tego, że początkowe pH ustala się na poziomie 6,0 ± 0,2 w badanych kulturach w celu utrzymania pH 6-7 podczas spożywania kwasu octowego, jak opisano wcześniej. ^{Rozdział 18}

5. Zastosuj ciągłą hodowlę, aby wybrać do wykorzystania ksylozy z etanolem

1. Przygotować ODM jako pożywkę paszową do hodowli ciągłej z 60-100 g/L ksylozy, 20-50 g/L etanolu o pH 6,3 ± 0,2. Wybierz kombinacje ksylozy i etanolu, aby symulować częściową fermentację ksylozy o stężeniu 150 g/l, zakładając potencjalną wydajność ~0,5 g etanolu/g ksylozy, i aby dostosować się do możliwości wystąpienia 50-70 g/l etanolu. ⁸
2. Aby przygotować inokulum do hodowli ciągłej, przenieść reprezentatywną kolonię AFEX tolerującą CSH (analogiczną do kolonii 5 w przykładzie, rysunek 1) za pomocą pętli z 48-godzinnej płytki YM do 75 ml ODM bez etanolu (w tym przypadku ksylozy 100 g/l) w kolbach o pojemności 125 ml. Inkubować w temperaturze 25 °C, 150 obr./min (orbita 1") przez 24 godziny. Wybierz stężenie ksylozy ODM przed hodowlą, aby odpowiadało stężeniu początkowej objętości utrzymywania hodowli ciągłej.
3. Zaszczepić ciągłą objętość hodowli ODM o pH 6,3 ± 0,2 zawierającej 100 g / L ksylozy + 20 g / L etanolu ~ 5-10 ml koncentratu prekulturowego izolatu AFEX tolerancyjnego CSH (analogicznie do Kolonii 5, Rysunek 1), aby uzyskać 100 ml przy początkowym A₆₂₀ ~ 0,5. Utrzymać objętość hodowli (V_R) w temperaturze 25 °C w kolbie wirowej z płaszczem o pojemności 100 ml, mieszanej z prędkością 200 obr./min i wyposażonej w sterylizowalną elektrodę pH, regulator pH i łaźnię wodną o kontrolowanej temperaturze.
4. Początkowo, ponieważ wzrost komórek będzie powolny z powodu ekspozycji na etanol, należy ustawić pożywkę zasilającą do dozowania za pomocą pompy uruchamianej pH. Ustaw pompę tak, aby podawała pH -6,3 ODM ze 100 g/l ksylozy i 50 g/l etanolu, gdy fermentacja hodowli obniży pH do 5,4, zatrzymując w ten sposób dalszy spadek pH. Utrzymać objętość na poziomie 100 ml za pomocą pompy ściekowej stale przesuwającej powierzchnię hodowli. W konsekwencji stężenie etanolu wzrasta wraz z ciągłym metabolizmem i karmieniem.
5. Mierz ścieki i pobieraj próbki (1-2 ml) z hodowli ciągłych co 48-72 godziny w celu analizy stężenia żywotnych komórek, produktów i substratów, jak opisano wcześniej. ¹⁸ Aby określić stężenie żywotnych komórek, należy wykonać seryjne rozcieńczenia próbek w buforze w stosunku 1:10 (patrz 4.1.1) i rozprowadzić rozcieńczenia na płytce do agaru YM (patrz 1.2.1). Na podstawie wskaźników zbierania ścieków (Q) oblicz współczynnik rozcieńczenia (D) (Q/V_R), a w przykładzie S. stipitis wahał się on od 0 do 0,01 godz.^-1.
6. Regularnie oszczędzaj zapasy glicerolu, izolując z płytek żywotności buforowane roztwory próbek, tworzące 30-100 kolonii, reprezentujących najbardziej rozpowszechnionych w tym czasie silnych kolonistów pod względem wzbogacania. Zalej płytki ~5 ml 10% glicerolu, aby umożliwić przygotowanie duplikatów kriowialiów. W celu konserwacji lub wytchnienia należy zatrzymać ciągłą hodowlę i w razie potrzeby wznowić ją przy użyciu większości aktualnych (odpornych) zapasów glicerolu.
7. Aby wznowić działanie, należy przesunąć zapasy glicerolu z najbardziej odpornych populacji do agaru YM i przenieść komórki 24-48 godzin w pętli do wstępnej hodowli ODM bez etanolu w celu inkubacji, jak powyżej. Zaszczepić 100 ml objętości trzymającej ODM do początkowej A₆₂₀ 0,5 za pomocą koncentratu wstępnie wyhodowanych drożdży i pozwolić kulturze rosnąć partiami do fazy stacjonarnej przed ponownym uruchomieniem przepływu pożywki.
8. Jeśli kultury mogą rosnąć stabilnie w temperaturze >0,01 godz^.-1 na ksylozie w obecności etanolu >25 g/l, należy rozpocząć ciągłe podawanie hodowli (ODM + 60 g/l ksyloza + etanol w zakresie od 30 do 50 g/l) przy niskiej zawartości rozcieńczenia ~0,01 ^h-1 do objętości 100 ml (początkowo ODM + 60 g/l ksylozy + 20 g/l etanolu). Z biegiem czasu zwiększ zawartość etanolu w paszy do 50 g/l. Uchwyć zaawansowane populacje w zapasach glicerolu.
   UWAGA: Utrzymanie niskiego stopnia rozcieńczenia pozwala na wytworzenie wystarczająco wysokiego stężenia komórek, aby zmniejszyć dostępność tlenu i wspomóc fermentację.
9. Opcjonalnie należy co miesiąc naświetlać promieniowaniem ultrafioletowym (UV) populacje glicerolu używane do ponownego zaszczepiania ciągłych kultur.
   1. Zawiesić kolonie z smug wyjściowych glicerolu w 10 ml ODM (jak w kulturach wstępnych) z 60 g/l ksylozy i zebrać wszystkie zapasy w jednej sterylnej kolbie. Zastosuj zawiesinę komórek w grupie ~5 x 10⁸ żywych komórek/ml, aby po prostu pokryć dno 4-5 płytek Petriego 6 ml / płytkę. Aby uzyskać pokrycie 6 ml standardowej jednorazowej płytki Petriego, należy dozować 15 ml w celu pokonania napięcia powierzchniowego, a następnie usunąć 9 ml.
   2. Wystaw każdą otwartą płytkę hodowli na działanie promieniowania UV ze źródła światła w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Dostosuj czas lub odległość ekspozycji na promieniowanie UV, aby uzyskać żądany współczynnik zabijania >90%. Tutaj naświetlaj przez 45 minut w odległości około 56 cm od źródła.
   3. Rozcieńczyć zawiesiny komórek płytki przed i po napromienianiu. Oszacuj współczynnik zabijania na podstawie jednostek tworzących kolonie. W przypadku przykładu S. stipitis wskaźnik zabijania wynosił ~97%.
   4. Przenieść kultury wystawione na działanie promieni UV (24-30 ml) do kolby o pojemności 50 ml pokrytej folią i inkubować w temperaturze 25 °C i 150 obr./min przez 24 godziny, aby umożliwić niewielkiemu procentowi żywotnych komórek ponowne zasiedlenie do ~1 x 10⁸ żywotnych komórek S. stipitis/ml. Zapobiegając reaktywacji zdjęć, foliowa osłona zachowuje mutacje podczas inkubacji kultur.
   5. Użyj ponownie zasiedlonej mutagennej kultury, aby zaszczepić ciągłe kultury do ~1 x 10⁷ żywotnych komórek/ml. Uruchom ponownie wzbogaconą etanolem pożywkę ODM + 60 g/L ksylozy, aby kontynuować proces selekcji.

6. Oceń populacje zapasów glicerolu i zidentyfikuj te, które mają lepszą fermentację ksylozy w obecności etanolu

1. Smuga wybranych kultur wyjściowych glicerolu do agaru YM jako pierwszy krok w badaniu przesiewowym w celu uzyskania najlepszego wzrostu i fermentacji ksylozy w obecności etanolu.
2. Przenieść każdą wyewoluowaną populację do badań przesiewowych ze smug agaru do 75 ml kultur wstępnych w ODM ze 150 g/l glukozy i inkubować w kolbach 125 ml przez 96 godzin przed użyciem jako inokula do kultur testowych. Duże populacje uprawiane glukozą będą wymagały indukcji enzymów do wykorzystania ksylozy.
   1. Aby przetestować indukcję, zebrać każdą kulturę, zawiesić komórki na 30 ml, początkowo A₆₂₀ z 40 w ODM +60 g / L ksyloza + 30-45 g / L etanolu i inkubować w temperaturze 25 °C, 150 obr./min (orbita 1") w kolbach o pojemności 50 ml z zamknięciami z gąbki silikonowej. Pobierać próbki dwa razy dziennie w celu monitorowania wychwytu ksylozy za pomocą analizy HPLC.
3. Alternatywnie, jak opisano w Slininger i wsp.^,18 w celu oceny wzrostu ksylozy w obecności etanolu, przygotować prekultury każdej wyewoluowanej populacji przez przeniesienie pętli do 75 ml ODM z 150 g / l ksylozy w kolbach 125 ml i inkubować 96 godzin w temperaturze 25 °C, 150 obr./min (orbita 1"). Zaszczepić badane kultury do niskiego początkowego poziomu A₆₂₀ wynoszącego 0,1 w 25 ml ODM + 60 g/L ksylozy + 30-45 g/l etanolu w kolbach 125 ml. Inkubować kolby w temperaturze 25 °C, 300 obr./min, orbitę 1" i próbkę.

7. Wyizoluj kolonie jednokomórkowe, które wykorzystują ksylozę w PSGHL, gdy obecny jest etanol

1. Na podstawie wyników kroku 6 wybierz populacje glicerolu wykazujące lepszą zdolność do wzrostu i fermentacji ksylozy w obecności etanolu. Użyj ich do smugowania talerzy. Płytki smugowe służą do przygotowania gęstych, buforowanych zawiesin komórkowych A₆₂₀ = 5. Następnie zawiesiny komórkowe stosuje się do inokulacji prekultur w płytkach studzienkowych o głębokości 96 do A₆₂₀ = 0,5. Zaszczepić 1 ml kultur wstępnych na PSGHL zmieszanym 1:1 z ODM + 50 g/L ksylozy (bez etanolu). Inkubować prekultury w 96-dołkowych, głębokich płytkach z wentylowanymi pokrywami o niskim parowaniu przez 48 godzin w temperaturze 25 °C, 400 obr./min, orbita 1". Oddziel różne populacje zapasów glicerolu za pomocą pustych studzienek.
2. Korzystając z każdej kultury wstępnej, zaszczep szesnaście replikowanych kultur o pojemności 1 ml do początkowego A₆₂₀ ~ 0,5 w 1:1 PSGHL:ODM + 50 g / L ksylozy z 20, 30 lub 40 g / L etanolem, aby wzbogacić tolerancyjnych kolonistów. Inkubuj kultury wzbogacające podobnie jak kultury wstępne.
3. Dla każdego innego zasobu glicerolu należy zebrać studzienki hodowlane o najwyższym stężeniu etanolu, co pozwala na wzrost i użycie ksylozy. Umieść każdą linię komórkową na agarze YM, aby uzyskać przeważające pojedyncze kolonie do zachowania w glicerolu. Wybierz dziesięć kolonii na linię komórkową i przenieś każdą z nich na płytkę z agarem YM w celu przygotowania bulionu glicerynowego.

8. Dalsze wzbogacanie wytrzymałych szczepów wyewoluowanych podczas transferu seryjnego na PSGHL, tak jak w przypadku AFEX CSH

1. Przygotuj pre-kultury NRRL Y-7124 (rodzic), wyewoluowany izolat AFEX tolerujący CSH i populację ewoluującą w kulturze ciągłej ze zwiększoną zdolnością do stosowania ksylozy w obecności etanolu. Zaszczepić 75 ml ODM + 150 g/L ksylozy za pomocą pętli ze smug wyjściowych glicerolu, jak opisano powyżej (krok 2.1) w procesie adaptacji hydrolizatu AFEX CSH.
2. Rozcieńczyć PSGHL wodą, aby uzyskać szereg rosnących stężeń. Przygotować 96-dołkową mikropłytkę dla każdej z trzech linii komórkowych, używając każdego rozcieńczenia PSGHL do napełnienia 8 dołków 50 μl. Użyć kultury wstępnej do zaszczepienia każdej mikrokultury o wielkości 50 μl z serii rozcieńczeń do inicjalizacji A₆₂₀ ~ 0,1-0,5.
   1. Kontynuuj ewolucję drożdży w zwiększaniu mocy PSGHL, stosując tę samą procedurę, co adaptacja hydrolizatu AFEX CSH opisana powyżej (etap 2), aż kultury będą w stanie rosnąć w hydrolizacie o pełnej mocy przy stabilnym średnim stosunku 14-d wynoszącym_{ΔA 620} na Δtime, ponieważ transfery seryjne są kontynuowane przez dodatkowe cztery miesiące.

9. Izoluj kolonie jednokomórkowe za pomocą gradientów PSGHL z lub bez wyzwania etanolem

1. Otrzymać izolaty jednokomórkowe bezpośrednio z końcowych płytek adaptacyjnych PSGHL o pełnej mocy przez rozcieńczenie do agaru YM. Wybierz dziesięć dużych kolonii dla każdej z trzech linii komórkowych i przyłóż smugę do płytek YM, aby przygotować zapasy glicerolu, jak opisano wcześniej (krok 3.2).
2. Opcjonalnie zbadaj wcześniejsze punkty czasowe w procesie ewolucji, izolując z przechowywanych zapasów glicerolu trzy linie komórkowe.
   1. Zaszczepić prekulturę dla każdej linii komórkowej za pomocą pętli ze smug glicerolu i inkubować przez 24 godziny na 30 ml ODM + 50 g/L ksylozy (kolby 50 ml, 25 °C, 150 obr./min).
   2. Wyzwanie dla komórek od prekultur do wzrostu w hydrolizacie poprzez inokulację 50 μl 50% PSGHL w studzienkach mikropłytkowych do początkowego A₆₂₀ ~ 0,2 i inkubację statyczną 48 godzin.
   3. Rozprowadź 0,1 ml każdej wzbogaconej kultury na płytkach agarowych gradientu PSGHL o sile od 0 do 50% (dostarczając ~ 300-400 żywych komórek na płytkę) i wybierz 10 pojedynczych kolonii na linię komórkową z najwyższego możliwego obszaru stężenia hydrolizatu gradientu. ²¹ Seria zebranych kolonii do YM w celu przygotowania bulionu glicerolowego, jak w kroku 3.2.
   4. Jako alternatywę dla kroku 9.2.3, zamiast zaszczepiać gradientowe płytki agarowe, należy zaszczepić studzienki z 96-dołkowymi mikropłytkami do początkowego A₆₂₀ ~ 0,2, gdzie studzienki są zaprojektowane tak, aby zawierały zakres stężeń hydrolizatu od 50 do 100% mocy i etanolu od 10 do 40 g/L. W takim przypadku należy wywołać mikropłytki 72-96 godzin i w inny sposób, jak w kroku 2.3. Wyizolować dziesięć pojedynczych kolonii ze studni najostrzejszych kombinacji hydrolizatu i etanolu, wykazujących wzrost poprzez rozcieńczanie, i przygotować zapasy glicerolu, jak w kroku 3.2.

10. W głównym badaniu przesiewowym wyeliminuj gorsze izolaty, porównując i oceniając wydajność PSGHL w dwóch warunkach odżywczych

1. Zastosuj wysokoprzepustowe badanie przesiewowe płytki głębinowej o wydajności PSGHL do przesiewania pięciu zestawów trzydziestu izolatów wraz z macierzystym izolatem NRRL Y-7124 i izolatem tolerancyjnym AFEX CSH (analogicznie do Colony 5 z przykładu ewolucji na rysunku 1) jako kontrole, aby wybrać sześć najwyższych szczepów (20%) z każdego zestawu, aby przejść do wtórnego poziomu przesiewowego (krok 12).
2. Przesiewanie należy przeprowadzić w głębokich płytkach dołkowych wypełnionych po 1 ml na studzienkę i pokrytych pokrywkami ze stali nierdzewnej z czarnymi silikonowymi uszczelkami o niskiej odparności. Clamp wszystkie płytki do płyty inkubatora/wytrząsarki i pracuj w temperaturze 25 °C i 400 obr./min (orbita wytrząsarki 1"). Zaprojektuj wszystkie wzory napełniania płyt studni głębinowych, aby umożliwić oddzielenie różnych izolatów przez otwarte studzienki.
3. Aby rozpocząć uprawę, należy pobrać kulkę komórek ze smug glicerolu przygotowanych z 30 izolatów uzyskanych jak powyżej (w krokach 3, 7 i 9), aby zduplikować dołki ksylozy ODM + 50 g / L i inkubować przez 48 godzin.
4. Jako pożywkę prowokacyjną do wstępnej hodowli izolatów należy przygotować 50% PSGHL, mieszając PSGHL 1:1 z ODM + 10 g/L glukozy + 50 g/L ksylozy. W celu przesiewania 30 izolatów i dwóch szczepów kontrolnych napełnia się 2 płytki z 2 dołkami na każdy z 16 izolatów, pozostawiając puste studzienki między różnymi izolatami.
5. W przypadku kultur prowokacyjnych przenieś objętość 50 μl kultur wstępnych ODM (A₆₂₀ ~ 10) do każdej z dwóch studzienek 50% kultur prowokacyjnych PSGHL dla każdego z izolatów i kontroli, aby uzyskać początkowy A₆₂₀ ~ 0,5 i inkubować 72 godziny.
6. Do badań przesiewowych należy użyć dwóch pożywek testowych o różnej zasobności odżywczej: 60% składników odżywczych PSGHL + ODM i 75% składników odżywczych PSGHL + ODM + YM. Dodaj składniki odżywcze ODM (z wyłączeniem cukrów) w połowie mocy, jak standardowo w przypadku stosowania ODM z 50 g/l cukru (krok 1.3). Zgodnie z przeznaczeniem, dodać składniki odżywcze YM (z wyłączeniem cukrów) w połowie standardowej mocy 3 g/l ekstraktu drożdżowego, 3 g/l ekstraktu słodowego, 5 g/l peptonu.
7. Zaszczepić kultury testowe, przenosząc 50 μl 72-godzinnych 50% prowokacyjnych kultur wstępnych PSGHL w celu zaszczepienia 1,000 μl do początkowego A₆₂₀ ~ 0,5 w pięciu głębokich dołkach dla każdego z dwóch pożywek testowych.
8. Codziennie pobieraj próbki z każdego izolatu. Odpipetować zawartość studzienki do probówki do mikrofuge i odwirować (5 533 x g, 15 min) w celu uzyskania supernatu do wysokoprzepustowych analiz etanolu, glukozy i ksylozy. Zmierz biomasę jako A₆₂₀ w 96-dołkowych mikropłytkach (200 μl/dołek) za pomocą spektrofotometru.
9. W każdym zestawie 30 badanych izolatów (5 zestawów dla szczepów wyewoluowanych przez S. stipitis NRRL Y-7124) należy obliczyć względne wskaźniki wydajności (RPI) zgodnie z opisem w kroku 11 poniżej i użyć do uszeregowania każdego szczepu na podstawie wydajności etanolu (maksymalny etanol zgromadzony na początkowy dostarczony cukier) i szybkości wchłaniania ksylozy (stężenie ksylozy zużytej na początkowe 96 godzin) na obu pożywkach testowych.

11. Ranga izoluje na głównym ekranie PSGHL za pomocą względnego wskaźnika wydajności (RPI)

1. Po pierwotnym badaniu przesiewowym oblicz bezwymiarowe względne wskaźniki wydajności (RPI), aby uszeregować 30 izolatów w każdym z pięciu różnych eksperymentów, aby przebadać izolaty na PSGHL z dwoma różnymi preparatami składników odżywczych na eksperyment, tj. 60% PSGHL i 75% PSGHL.
2. Obliczyć parametr statystyczny F do wykorzystania w klasyfikacji skuteczności izolatu w grupie izolatów badanych w danym doświadczeniu: F = (_{X-X śr.})/s. W tym przypadku X jest parametrem wydajności, takim jak wydajność (Y) lub szybkość (R), obserwowanym dla każdego pojedynczego izolatu, podczas gdy_średnia X i s są odpowiednio średnią i odchyleniem standardowym X obserwowanym dla wszystkich izolatów w danym eksperymencie. Dla rozkładów normalnych -2 < F < 2.
3. Dla każdego izolatu w eksperymencie oblicz względną wydajność na podstawie szybkości, RPI_R = (2 + F_R) × 100/4 i podobnie oblicz względną wydajność na podstawie wydajności, RPI_Y = (2 + F_Y) × 100/4. Wartość RPI waha się od ~0 do 100 percentyla (od najniższego do najwyższego). Następnie oblicz średnie RPI dla każdego izolatu w danym eksperymencie hydrolizatu w następujący sposób:_średnia RPI = (RPI_Y +RPI_R)/2, gdzie udział plonu i stawki jest w tym zastosowaniu równy wag.
   Należy pamiętać, że ogólnie rzecz biorąc, parametry wydajności i stawki mogą być ważone, jeśli zostaną uznane za nierówne pod względem ważności.
4. Oblicz_ogólny RPI dla n typów badanych hydrolizatów: RPI_ogółem = Σ_i=1,n[(RPI_Y +RPI_R)/2]_i/n. Rozważ każdy izolat w eksperymentalnym zestawie 30 izolatów i 2 kontrolnych. Podczas pierwotnego rankingu ~150 izolatów pojedynczej kolonii przystosowanych do PSGHL bogatego w ksylozę,_ogólny RPI jest obliczany dla wskaźników i plonów w dwóch preparatach PSGHL zastosowanych na ekranie, tj. 60% PSGHL i 75% PSGHL, gdzie n = 2.
5. Na podstawie_ogólnego wskaźnika RPI w każdym eksperymencie wybierz najwyższy odsetek izolatów, który ma zostać przekazany do dodatkowego ekranu. W tym przykładzie wybrano 20% najlepszych szczepów do przejścia (tj. 30 ze 150 przetestowanych).

12. Na dodatkowym sicie porównaj najlepsze wyniki na pierwotnym sicie na wielu kompletnych hydrolizatach (>100 g/l cukrów mieszanych), aby odkryć najlepiej działające wytrzymałe szczepy

1. Porównaj najlepsze wyniki PSGHL na 6% glukanie AFEX CSH i SGH wzbogaconym o dwa poziomy azotu, SGH-N1 i SGH-N2 (skład jak w tabeli 1) w celu uzyskania ostatecznego rankingu. Przebadaj 30 izolatów, które były najlepsze w pierwotnym badaniu przesiewowym płytki głębokiej PSGHL (kroki 10 i 11) oraz dwie kontrole (szczep macierzysty NRRL Y-7124 i izolat tolerancyjny AFEX CSH (analogicznie do Colony 5, przykład z rysunku 1).
2. Rozpocznij hodowlę od pobrania kulki komórek ze smug glicerolu, aby zduplikować głębokie studzienki o zawartości 1 ml ODM + 50 g/L ksylozy, jak poprzednio, i inkubować przez 48 godzin w systemie płytek głębokich (krok 10.2). Następnie przenieś 50 μl prekultur ODM do 50% kultur prowokacyjnych SGH i inkubuj w systemie płytek głębinowych przez 72 godziny, aby uzyskać A₆₂₀ przy ~10). Przygotuj 50% SGH mieszając SGH w stosunku 1:1 z bezcukrowym ODM + 50 g/L ksylozy (pH 5,6).
3. Dla każdego z izolatów zaszczepić 16 ml podwielokrotności SGH-N1 lub SGH-N2 osadem komórkowym (15 min, 2,711 x g) z trzech dołków kultury prowokacyjnej, aby otrzymać początkową kulturę testową A₆₂₀ ~ 2,0. Inkubować kultury testowe w temperaturze 25 °C, 180 obr./min (orbita 1") w kolbach o pojemności 25 ml z zamknięciem z gąbki silikonowej. Codziennie pobieraj próbki kolb i analizuj je na sicie PSGHL.
4. Podobnie, sito izoluje jak w krokach 12.2 i 12.3, ale tym razem zastępuje się SGH-N1 i SGH-N2 6% glukanem AFEX CSH o pH 5,2 do użycia w przygotowaniu pożywki do hodowli prowokacyjnej i pożywki do badań kulturowych. W przypadku kultur prowokacyjnych o sile 50% należy użyć 6% AFEX CSH rozcieńczonego wodą w stosunku 1:1, ponieważ jest to wystarczająca ilość azotu bez poprawek.
5. Powtórz kroki 12.1-12.4, aby zduplikować wyniki.

13. Uszeregowaj wydajność izolatów na ekranie wtórnym, używając _ogólnego RPI, aby ocenić użycie wielu kompletnych hydrolizatów

1. Oblicz względne wskaźniki wydajności (RPI), aby uszeregować każdy z 20% najlepszych izolatów (~ 30 ze 150) z pierwotnego ekranu, które zostały przetestowane w wtórnym badaniu przesiewowym na preparatach hydrolizatu scukrzanego enzymami o różnym bogactwie odżywczym.
2. Oceń każdy izolat badany w wtórnym badaniu przesiewowym na podstawie szybkości wychwytu ksylozy i wydajności etanolu przeprowadzonych na trzech scukrzonych enzymatycznie wstępnie poddanych działaniu preparatów hydrolizatów przebieganych w dwóch powtórzeniach, w tym AFEX CSH (i = 1 i 2), SGH-N1 (i = 3 i 4) i SGH-N2 (i = 5 i 6).
3. Oblicz_ogólny RPI dla każdego izolatu i zastosuj ten parametr klasyfikacji, aby dalej przechylić listę lepszych izolatów: RPI_ogółem = Σ_i=1,n[(RPI_Y +RPI_R)/2]_i/n, gdzie n = 6,
   UWAGA: Wykazać kinetykę lepszych izolatów w hydrolizatach SGH-N2 w kulturach kolbowych, postępując zgodnie z procedurami opisanymi w Slininger i wsp.^{Rozdział 18}

Results

S. stipitis został wyewoluowany przy użyciu kombinacji trzech kultur selekcyjnych, które obejmowały AFEX CSH, PSGHL i ciągłą hodowlę ksylozy karmioną etanolem. Rysunek 1 przedstawia schemat ideowy eksperymentów ewolucyjnych przeprowadzonych wraz z izolatami, które okazały się najskuteczniejsze ogólnie lub najskuteczniejsze na jednym z badanych hydrolizatów. Tabela 3 przedstawia liczbę przystąpień do NRRL tych lepszych izolatów i podsumowuje stresy adaptacyjne zastosowane w proce...

Discussion

O powodzeniu procesu ewolucji zadecydowało kilka etapów. Po pierwsze, kluczowe jest wybranie odpowiednich nacisków selekcyjnych, aby kierować ewolucją populacji w kierunku pożądanych fenotypów, które są potrzebne do udanego zastosowania. Do rozwoju S. stipitis wybrano następujące selektywne naprężenia i zastosowano je w odpowiednim czasie, aby ukierunkować wzbogacenie w pożądane fenotypy: zwiększenie mocy 12% glukanu AFEX CSH (który wymusza wzrost i fermentację różnych cukrów w obecności kwasu octowego i niskieg...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellic Ctec, zawiera ksylanazę (endo-1,4-)	Novozymes	Brak numeru produktu	www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Cellic Htec, zawiera celulazę i ksylalanazę	Novozymes	Brak numeru produktu	www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Prażona mąka Nutrisoy	Archer Daniels Midland Co. (ADM)	63160	ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL  1800-37-5843
Pluronic F-68 (środek powierzchniowo czynny)	Sigma-Aldrich	P1300	Sigma-Aldrich
Difco Test witaminowy Casaminokwasy	Becton Dickinson and Company	228830	wielu dostawców: np. , Fisher Scientific, VWR, Daigger
D,L-tryptofan	Wielu dostawców Sigma-Aldrich	T3300	: np. , Fisher Scientific, VWR, Daigger
L-cysteina	Sigma-Aldrich	C7352	wielu dostawców: e.g., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich
Bacto	Agar Becton Dickinson and Company	214010	wielu dostawców: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Malt Extract	Becton Dickinson and Company	218630	wielu dostawców: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Ekstrakt z drożdży Bacto	Becton Dickinson and Company	212750	wielu dostawców: np. , Fisher Scientific, VWR, Daigger
Pepton Type IV z soi	Fluka	P0521-500g	wielu dostawców: np. , Fisher Scientific, VWR, Daigger
Adenine, >99% proszek	Sigma-Aldrich	A8626	CAS 73-24-5. Przydałyby się inne marki. Wielu dostawców: np. , Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Cytosine, >99%	Sigma-Aldrich	C3506	CAS 71-30-7. Przydałyby się inne marki. Wielu dostawców: np. , Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Guanina, SigmaUltra	Sigma-Aldrich	G6779	CAS 73-40-5. Przydałyby się inne marki. Wielu dostawców: np. , Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Thymine, 99%	Sigma-Aldrich	T0376	CAS 65-71-4. Przydałyby się inne marki. Wielu dostawców: np. , Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Uracil, 99%	Sigma-Aldrich	U0750	CAS 66-22-8. Przydałyby się inne marki. Wielu dostawców: np. , Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Dekstroza (D-glukoza), Bezwodny, Certyfikowany ACS	Fisher Chemical	D16-500	CAS 50-99-7. Przydałyby się inne marki. Wielu dostawców: np. , Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
D-Xylose, test >99%	Sigma-Aldrich	X1500	CAS 58-86-6. Przydałyby się inne marki. Wielu dostawców: np. , Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
96-well, płaskie płyty	Becton Dickinson Falcon	351172	wielu dostawców: np. , Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Wypall L40 Wiper	Kimberly-Clark		ręcznik w pudełkach na mikropłytki do wchłaniania wody do nawilżania; wielu dostawców np. , Thermo-Fisher, uline,
kolba pyreksowa Daigger Corning, 125 ml, wąski otwór (korek #5)	Corning Life Science Glass	4980-125	wielu dostawców: np. , Thermo-Fisher, VWR,
wytrząsarka/inkubator Daigger Innova 42R, obrót o 2,5 cm (1")	New Brunswick Scientific (1-800-631-5417)	M1335-0016	wielu dostawców: np. , Eppendorf, Thermo-Fisher. Można użyć innych wytrząsarek/inkubatorów o skoku 2,5 cm (1").
Duetz Zacisk pokrywy do 4 płytek głębinowych MTP	Applikon Biotechnology	Z365001700	applikon-biotechnology.com (USA), 1-650-578-1396
Pokrowiec warstwowy Duetz System na 96 płytek głębinowych	Applikon Biotechnology	Z365001296	applikon-biotechnology.com (USA), 1-650-578-1396
Uszczelka silikonowa Duetz System (0,8 mm niski parownik) do pokrywy płytki głębinowej	96 Applikon Biotechnology	V0W1040027	applikon-biotechnology.com (Stany Zjednoczone), 1-650-578-1396
Niebieska warstwa z mikrofibry do pokrowca kanapkowego systemu Duetz	Applikon Biotechnology	V0W1040001	applikon-biotechnology.com (USA), 1-650-578-1396
96 dołków, 2 ml kwadratowe płytki dolne w kształcie piramidy, naturalny popypropylen	Applikon Biotechnology	ZC3DXP0240	applikon-biotechnology.com (USA), 1-650-578-1396
Zamknięcia z gąbki silikonowej Bellco 32 mm, opakowanie 25 sztuk do kolb 125 ml	Bellco	1924-00032	Thomas Scientific, ich numer katalogowy to 1203K27
Bellco Spinner Flask, 1968-Szklana kopuła, typ kołnierza uszczelnianego, objętość robocza 100 ml. Ten projekt nie był już produkowany.	Bellco	1968-00100 (oryginał Kat. Nie.)	Naczynia z płaszczem mają dolne porty wlotowe i wylotowe do kontroli temperatury z obiegową łaźnią wodną. Zbiorniki mają średnicę zewnętrzną 75 mm i wysokość 200 mm. Istnieją cztery boczne porty w ~45° kątowniki i jeden górny port. Otwory na porty odpowiedni rozmiar dla korków neoprenowych w rozmiarze 0 (średnice wewnętrzne 21-22 mm na portach).
Suszarka na podczerwień Mathis Labomat	MathisAg	Typ-NBR BFA12 215307	Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157
Dwukanałowy analizator biochemiczny	YSI Life Sciences	2900D-UP	www.ysi.com, zrobotyzowany system do szybkiego oznaczania cukrów w formacie 96-dołkowej mikropłytki
Spektrofotometr MicroPlate PowerWave XS	Bio-Tek Instruments, Inc	MQX200R	www.biotek.com