Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ludzki model hodowli komórek trofoblastu pierwotnego w celu zbadania ochronnego działania melatoniny przed zakłóceniami wywołanymi niedotlenieniem/reoksygenacją

15.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54228

⸱

30 lipca 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1INRS-Institut Armand-Frappier

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt przedstawia unikalny model in vitro immunooczyszczanych ludzkich komórek cytopifoblastu kosmkowego hodowanych w warunkach hipoksji/reoksygenacji. Model ten jest odpowiedni do badania ochronnego wpływu obiecujących metod leczenia, takich jak melatonina, na powikłania ciąży związane ze zwiększonym stresem oksydacyjnym i zmienioną funkcją łożyska.

Streszczenie

Ten protokół opisuje, w jaki sposób kosmkowe komórki cytotrofoblastu są izolowane z łożysk w terminie przez kolejne trawienia enzymatyczne, po których następuje wirowanie gęstości, izolacja gradientu pożywki i oczyszczanie immunomagnetyczne. Jak zaobserwowano in vivo, jednojądrzaste komórki cytotrofoblastu kosmków w hodowli pierwotnej różnicują się w wielojądrowe komórki syncytiotrofoblastu po 72 godzinach. W porównaniu z normoksją (8%O2), kosmkowe komórki cytotrofoblastu, które ulegają hipoksji/reoksygenacji (0,5% / 8%O2), ulegają zwiększonemu stresowi oksydacyjnemu i wewnętrznej apoptozie, podobnej do obserwowanej in vivo w powikłaniach ciąży, takich jak stan przedrzucawkowy, przedwczesny poród i wewnątrzmaciczne ograniczenie wzrostu. W tym kontekście, pierwotne trofoblasty kosmkowe hodowane w warunkach niedotlenienia/reoksygenacji stanowią unikalny system eksperymentalny pozwalający lepiej zrozumieć mechanizmy i szlaki sygnałowe, które są zmienione w ludzkim łożysku i ułatwić poszukiwanie skutecznych leków chroniących przed niektórymi zaburzeniami ciąży. Trofoblasty kosmkowe człowieka wytwarzają melatoninę i wyrażają jej enzymy i receptory syntetyzujące. Melatonina została zasugerowana jako leczenie stanu przedrzucawkowego i wewnątrzmacicznego ograniczenia wzrostu ze względu na jej ochronne działanie przeciwutleniające. W pierwotnym modelu komórek cytotrofoblastu kosmków opisanym w tym artykule, melatonina nie ma wpływu na komórki trofoblastu w stanie normoksycznym, ale przywraca równowagę redoks komórek syncytiotrofoblastu zakłóconych przez niedotlenienie/reoksygenację. Tak więc ludzkie komórki trofoblastu kosmków w hodowli pierwotnej są doskonałym podejściem do badania mechanizmów stojących za ochronnym działaniem melatoniny na funkcję łożyska podczas niedotlenienia/reoksygenacji.

Wprowadzenie

Przez cały okres ciąży u ludzi, komórki cytofoblast łożyska, które są jednojądrowymi komórkami macierzystymi, szybko się namnażają i różnicują w kosmkowe lub pozakosmkowe komórki cytotrofobostowe. Pozakosmkowe cytotrofoblasty atakują i przebudowują spiralne tętnice ściany macicy. Z drugiej strony cytotrofoblasty kosmkowe nadal proliferują, różnicują się i łączą się, tworząc wielojądrowy syncytiotrofoblast (syncytium)1. Utrzymanie homeostazy trofoblastu kosmków jest niezbędne dla dobrego samopoczucia płodu i zdrowej ciąży. W rzeczywistości trofoblasty kosmkowe umożliwiają matczyno-płodową wymianę tlenu i składników odżywczych oraz wytwarzają hormony niezbędne do zajścia w ciążę. Co więcej, synciotrofoblast jest jedynym typem komórki, który ma bezpośredni kontakt z krążeniem krwi matki i zapewnia niezbędną barierę fizyczną i immunologiczną. Dlatego syncytiotrofoblast musi przejść apoptozę i wymianę w celu utrzymania homeostazy i uniknięcia patologii łożyska2-5.

Technika opracowana przez Klimana i wsp.6 W 1986 r. wyizolowanie pierwotnych cytotrofoblastów kosmków z ludzkich łożysk spowodowało rewolucję w badaniach nad łożyskiem, umożliwiając badanie mechanizmów molekularnych zaangażowanych w różnicowanie trofoblastów kosmków. Ta klasyczna technika, oparta na sekwencyjnym trawieniu enzymatycznym z trypsyną i DNazą, a następnie izolacji w pożywkach wirujących o gęstości (koloidalne cząstki krzemionki pokryte poliwinylopirolidonem lub Percollem) jest obecnie uznawana za złoty standard izolacji komórek cytotrofoblastu kosmków. Technikę tę można zoptymalizować poprzez immunooczyszczanie magnetyczne, procedurę, która oddziela cytotrofoblasty kosmkowe od komórek nietrofoblastycznych w oparciu o różnicową ekspresję określonych antygenów na powierzchni tych komórek. Wybraliśmy ludzki antygen leukocytarny ABC (HLA-ABC) ze względu na brak jego ekspresji na błonie komórek trofoblastycznych7,8.

Łożysko to narząd, który ulega dramatycznym zmianom poziomu tlenu podczas ciąży. W pierwszym trymestrze ciąży współczynnik natlenienia jest fizjologicznie bardzo niski (2%O2), ale wzrasta do łagodnego poziomu natlenienia (8%O2) w drugim i trzecim trymestrze. Tuuli i wsp.9 opisano, że rozmnażanie in vitro środowiska trofoblastu wewnątrz kosmków łożyskowych jest wyzwaniem, a zmiany w poziomach natlenienia mogą nawet prowadzić do zmian fenotypowych. W związku z tym sugeruje się przyjęcie 8% tlenu jako normoksji, aby naśladować ciśnienie tlenu występujące w kosmkach łożyskowych w trzecim trymestrze ciąży8,9. Chen i wsp.10 szeroko zbadano kilka zmiennych związanych z napięciem tlenu w hodowli komórek trofoblastu i wykazano znaczenie oznaczania poziomu tlenu w środowisku okołokomórkowym. Poziom tlenu w kosmkach ma tendencję do zwiększania się z powodu waskulogenezy. Przepływ krwi w kosmkach łożyskowych stale rośnie, a poziom nadtlenku wodoru (obfitej w reaktywną formę tlenu) jest ważnym sygnałem, który kontroluje waskulogenezę11,12. W powikłaniach ciąży brak unaczynienia powoduje niedotlenienie, a co ważniejsze, przerywane zmiany natlenienia (zwane hipoksją/reoksygenacją). Stany te prowadzą do nieprawidłowego wzrostu stresu oksydacyjnego, który zagraża żywotności łożyska i płodu13,14. Zmiany, jakie komórki trofoblastu ulegają in vivo podczas epizodów niedotlenienia/reoksygenacji, można naśladować in vitro w następujący sposób: kosmkowe cytotroblasty są utrzymywane w warunkach normoksyjnych (8%O2), aż zróżnicują się w syncytiotrofoblast. Następnie poddaje się je warunkom hipoksyjnym (0,5%O2) przez 4 godziny, po których następuje dodatkowe 18 godzin normoksji (reoksygenacji). Stosując to podejście hipoksji/reoksygenacji, trofoblasty wykazują rozregulowany status redoks i zwiększony poziom wewnętrznej apoptozy8, co zaobserwowano w przypadku niektórych powikłań ciąży. W związku z tym jest to przydatny model in vitro do oceny nowych podejść zapobiegawczych i terapeutycznych do zwalczania powikłań ciąży związanych z niedotlenieniem/reoksygenacją łożyska.

Komórki łożyska produkują melatoninę, która pełni kilka ważnych funkcji, takich jak zdolność do eliminowania stresu oksydacyjnego i dysfunkcji łożyska15. W tym miejscu przedstawiamy podejście eksperymentalne i modele komórkowe stosowane do wykazania ochronnego działania melatoniny w komórkach trofoblastu łożyska na poziomie molekularnym, komórkowym i funkcjonalnym8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Łożyska zostały pobrane natychmiast po spontanicznych porodach pochwowych z niepowikłanych ciąż w szpitalu CHUM-St-Luc, Montreal, QC, Kanada, za świadomą zgodą pacjentki i za zgodą komisji etycznych (CHUM-St-Luc Hospital i INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, QC, Kanada).

1. Izolacja i oczyszczanie kosmków komórek cytotrofoblastu

  1. Rozwiązania i media
    1. Przygotować pożywkę transportową, uzupełniając zmodyfikowany Eagle's Medium High-Glucose (DMEM-HG) firmy Dulbecco antybiotykiem 1% obj./obj. (10 000 jednostek/ml penicyliny G, 100 mg/ml siarczanu streptomycyny) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotować podstawowe pożywki hodowlane, uzupełniając DMEM-HG 10% obj./obj. płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 25 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), antybiotyku 1% obj./obj. (10 000 jednostek/ml penicyliny G, 100 mg/ml siarczanu streptomycyny) i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem podgrzać podłoże do temperatury 37 °C.
    3. Przygotować 4 l roztworu soli fizjologicznej (0,9% wag./obj. chlorku sodu).
    4. Przygotuj zmodyfikowany zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS), dodając 25 mM HEPES do 1x HBSS (pH 7,4).
    5. Przygotować świeże, cztery butelki roztworu wytrawiającego ze zmodyfikowanym HBSS (przygotowanym w ppkt 1.1.4), siarczanem magnezu (MgSO4), chlorkiem wapnia (CaCl2), trypsyną, dezoksyrybonukleazą IV (DNazą IV) i antybiotykiem 1% obj./obj. (10 000 jednostek/ml penicyliny G, 100 mg/ml siarczanu streptomycyny), jak pokazano w Tabeli 1.
    6. Przygotuj gradient pożywki wirowej o gęstości
      1. Przygotować roztwór pożywki do wirowania gęstości, uzupełniając pożywkę wirówkową o gęstości 10% obj./obj. HBSS 10x.
      2. Przygotować 14 probówek z roztworem pożywki do odwirowania o dużej gęstości i zmodyfikowanym HBSS, jak opisano w tabeli 2.
      3. Energicznie wymieszać każdy roztwór gęstości (etap 1.1.6.2) przed dodaniem jego zawartości do gradientu. Delikatnie dodać roztwory o gęstości do szklanej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml z pompą perystaltyczną (1 ml/min), zaczynając od najwyższego stężenia (70%). Unikaj kropelek, spuszczając roztwory ze ścianki rury, aby utrzymać właściwą separację każdej warstwy gradientu.
        1. W przypadku braku pompy perystaltycznej warstwy należy nakładać bardzo delikatnie za pomocą pipet Pasteura.
    7. Przygotować końcowy bufor do biegania, uzupełniając bufor bieżący (patrz Tabela materiałów) antybiotykiem/antybiotykiem przeciwgrzybiczym o stężeniu 2% obj. / obj. (10 000 jednostek/ml penicyliny G, 100 mg/ml siarczanu streptomycyny). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Izolacja cytotrofoblastu kosmków
    Uwaga: Używaj sterylnego sprzętu chirurgicznego, szkła, pipet, kolb itp.
    1. W dniu izolacji cytotrofoblastu kosmków, w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, ogrzać roztwory wytrawiające (z kroku 1.1.5) i 70 ml FBS. Uwaga: Użyć 50 ml FBS do przerwania trawienia i pozostałych 20 ml do etapu zamrażania (1.2.22), które po rozmrożeniu można umieścić na lodzie.
    2. Po porodzie należy jak najszybciej (w czasie krótszym niż 1 godzina) dostarczyć łożysko do laboratorium w lodowatym podłożu transportowym (z kroku 1.1.1).
    3. Wyrzuć pożywkę transportową i krew łożyskową do płynnego kosza na śmieci. Zważ łożysko i zanurz w zimnym roztworze soli fizjologicznej.
    4. Zmierz i przeanalizuj następujące cechy: długość pępowiny; lokalizacja pępowiny; długość, szerokość, kształt łożyska (owalny, dyskoidalny); kolor błony; patologie struktury liścienia. Uwaga: Dane są prezentowane w sekcji wyników.
    5. Przeciąć pępowinę wzdłuż jej wprowadzenia przez łożysko (tj. u jej podstawy z dodatkowym okręgiem o promieniu 1 cm wokół pępowiny). Zanurzyć w 300 ml histologicznego roztworu utrwalającego tkanki (formalina 10%) w celu późniejszej analizy histologicznej.
    6. Pokrój całe łożysko w kostkę o wymiarach 5 x 5 x 5 cm. Dokładnie umyj (4 razy x ~ 1 min) w roztworze soli fizjologicznej (0,9%), aby usunąć krwinki, aż roztwór soli fizjologicznej będzie klarowny. Wylej płyn do płukania.
    7. W szkiełku zegarkowym usuń błony łożyskowe i zmiel tkanki, aby usunąć naczynia krwionośne i zwapnienia. Mocno chwyć naczynia krwionośne kleszczami i usuń tkanki za pomocą tylnej części nożyczek Metzenbaum.
      1. Umieść rozdrobnione łożysko w lejku Büchnera. Przepłukać około 100 ml buforu soli fizjologicznej. Kontynuuj mielenie, aż uzyskasz 30 - 35 g zmielonej tkanki (użyj plastikowej łódki do ważenia i wagi). W razie potrzeby zmielić pozostałą część łożyska, aby uzyskać do trzech dodatkowych preparatów o wadze 30 - 35 g. W tym czasie umieść zmieloną tkankę w łodzi wagowej na lodzie.
        Uwaga: Ten krok zajmie około 45 minut do 1 godziny.
    8. Dodać 30 - 35 g mielonej tkanki łożyskowej do kolby trypsynizującej. Przenieść 150 ml przygotowanego roztworu wytrawiającego 1 (tabela 1) do kolby trypsynizującej i dobrze wymieszać.
    9. Umieścić kolbę trypsynizującą w wytrząsającej łaźni wodnej na 30 minut z prędkością nie większą niż 50 cykli/min i ręcznie mieszać kolbę trypsynizującą co 5 minut w celu uzyskania jednorodnego roztwarzania.
    10. Pod koniec pierwszego trawienia wyjąć kolbę trypsynizującą z łaźni wodnej i przechylić ją (45°) na 1 minutę w celu osadzenia tkanki łożyska. Za pomocą sterylnej pipety o pojemności 10 ml usunąć i wyrzucić około 80 ml supernatantu. Unikaj zasysania tkanki.
    11. Przenieść 100 ml roztworu wytrawiającego 2 (tabela 1) do kolby trypsynizującej; dobrze wymieszać i powtórzyć krok 1.2.9.
    12. Pod koniec drugiego wytrawiania wyjąć kolbę trypsynizującą z łaźni wodnej i przechylić ją pod kątem 45° na 1 minutę. Za pomocą sterylnej pipety o pojemności 10 ml usunąć 80 ml supernatantu i delikatnie przenieść do probówki wirówkowej z sitkiem do komórek (oczko 100 μm). Przefiltrowany sklarowany sklarowany sklarowany sklarat nad osadem należy przenieść do zlewki zawierającej 2 ml FBS za każdym razem, gdy probówka wirówkowa jest pełna.
    13. Przeprowadzić trzecie wytrawianie zgodnie z opisem dla drugiego wytrawiania (1.2.11 i 1.2.12) przy użyciu 75 ml roztworu do wytrawiania 3. Równolegle wykonaj kroki od 1.2.15 do 1.2.16.1 dla trawienia 2.
    14. Przeprowadzić czwarte wytrawianie dokładnie tak samo, jak trzecie wytrawianie, używając roztworu wytrawiającego 4 (75 ml), ale zebrać maksymalną ilość supernatantu. Wykonaj kroki od 1.2.15 do 1.2.16.1 równolegle dla trawienia 3 i na końcu dla trawienia 4.
    15. Porcjować supernatant (z procesów trawienia 2, 3 i 4) na 13,5 ml części, z których każda składa się na jedną probówkę wirówkową o pojemności 15 ml. Za pomocą szklanej pipety Pasteura o długości 22,8 cm bardzo delikatnie i powoli umieść 1,5 ml FBS na dnie każdej probówki, aby utworzyć osobną warstwę. Nie mieszać FBS i supernatantu. Wirować probówki bez hamulca przez 20 minut przy 1 250 x g w temperaturze pokojowej.
      Uwaga: Po odwirowaniu w probówce widoczne są 4 warstwy, jak pokazano na rysunku 1. Oddzielenie komórek trypsyny i trofoblastu pozwala uniknąć nadmiernego trawienia komórkowego.
    16. Za pomocą pompy próżniowej odessać i wyrzucić warstwy supernatantu (roztwór do wytrawiania) i FBS, w tym białawy film między dwiema warstwami. Zawiesić osad (trofoblasty i warstwy krwinek czerwonych) w 1 ml pożywki do hodowli komórek ciepłych (etap 1.1.2; bez FBS i bez HEPES).
      1. Zbierz zawieszone komórki ze wszystkich probówek i połącz je w 1 probówkę. Pozostaw probówkę w temperaturze pokojowej do końca wszystkich roztwarzeń. Uwaga: Po wszystkich trawieniach zwykle uzyskuje się 3 probówki zawieszonych komórek (po jednej na trawienie).
    17. Uzupełnić objętość do 15 ml ciepłym podłożem do hodowli komórkowych. Wirować przy 1 250 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant za pomocą pompy próżniowej. Unikać zasysania granulki.
    18. Delikatnie zawiesić osad otrzymany z 3 probówek z 1 ml pożywki do hodowli ciepłokomórkowych. Zbierz ich zawartość w 1 tubie. Aby uzyskać 8 ml, uzupełnij objętość ciepłym podłożem do hodowli komórkowych.
    19. Bardzo delikatnie nałożyć zawiesinę komórek na gradient separacji za pomocą pipety Pasteura. Wirować bez hamulca przez 30 minut przy 507 x g w temperaturze pokojowej.
    20. Po odwirowaniu zidentyfikuj różne warstwy komórek w gradiencie za pomocą podświetlenia. Zlokalizuj warstwy zawierające trofoblast i komórki zanieczyszczające między 40 a 50% gęstości pożywki wirowej. Za pomocą pompy próżniowej usuń górne warstwy (> 50%).
    21. Zebrać komórki znajdujące się w warstwach zainteresowania za pomocą pipety Pasteura i przenieść je do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Uzupełnić objętość do 50 ml pożywką do hodowli komórkowych. Wirować przez 10 minut w temperaturze 1 250 x g w temperaturze pokojowej.
    22. W sterylnych warunkach wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad z 20 ml FBS i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Na lodzie dodać 2,22 ml sterylnego dimetylosulfotlenku (DMSO) i delikatnie wymieszać, odwracając. Podwielokrotność 1,5 ml zawiesiny komórkowej przelać do fiolek kriogenicznych, zamrozić przez noc w temperaturze -80 °C i przenieść do zbiornika z ciekłym azotem.
  3. Oczyszczanie trofoblastu
    1. Zamontuj płuczące i robocze oraz nową kolumnę filtracyjną na magnetycznym przyrządzie do oczyszczania zgodnie z instrukcjami producenta. Wykonaj "program czyszczenia", aby wyczyścić porty ujemne 1, dodatnie 1 i dodatnie 2, a następnie wprowadź probówki o pojemności 50 ml pod każdy port zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Szybko rozmrozić komórki, które zostały zamrożone w kroku 1.2.22 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Przenieść komórki do probówki o pojemności 50 ml i delikatnie zawiesić komórki za pomocą 20 ml zimnego roztworu buforowego. Odwirowywać probówkę przez 5 minut w temperaturze 450 x g i temperaturze 4 °C.
    3. Odrzucić supernatant. Powtórz etap mycia z buforem do pracy na zimno. Policz komórki za pomocą hemocytometru, aby określić żywotność. Powtórzyć wirowanie (przez 5 minut, 450 x g w temperaturze 4 °C). Ostrożnie usunąć supernatant. Dodać 1 ml zimnego buforu zawierającego 1% obj./obj. mysich przeciwciał anty-HLA-ABC. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut, delikatnie mieszając co 5 minut.
    4. Dodać 6 ml buforu do pracy na zimno. Wirować przez 5 minut w temperaturze 450 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i powtórzyć ten krok. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml zimnego buforu zawierającego 10% obj./obj. wtórnych kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami przeciw myszy. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 15 minut, delikatnie mieszając co 5 minut.
    5. Dodać 6 ml buforu do pracy na zimno. Wirować przez 5 minut w temperaturze 450 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 5 ml buforu do pracy na zimno.
    6. Oddzielić komórki trofoblastu za pomocą magnetycznego przyrządu do oczyszczania. Zebrać komórki w porcie ujemnym i dodać 20 ml buforu pracującego na zimno.
      Uwaga: Komórki trofoblastu nie zawierają kompleksu HLA-ABC, a zatem są oddzielone od innych typów komórek i skierowane w stronę ujemnego portu 1.
    7. Wirować przez 5 minut w temperaturze 450 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić komórki w 20 ml ciepłej pożywki pierwotnej. Policz komórki za pomocą hemocytometru, aby określić żywotność.
    8. Płytki komórek o następującej gęstości: 0,15 x 106 komórek/dołek na płytkach 96-dołkowych, 1,6 x 106 komórek/basenik na płytkach 24-dołkowych i 4,5 x 106 komórek/basenik na płytkach 6-dołkowych. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    9. Potwierdzić czystość komórek trofoblastu za pomocą cytometrii przepływowej16,17 i/lub immunocytochemii18.
      Uwaga: Czystość komórek oczyszczonych immunologicznie określono przy użyciu sprzężonych z FITC przeciwciał monoklonalnych przeciwko cytokeratynie-7 i wimentynie17-19. Protokół ten jest szczegółowo opisany w Lanoix et al., 20087.
    10. Po upływie co najmniej 4 godzin należy dwukrotnie przepłukać komórki ciepłą pożywką hodowlaną w celu usunięcia nieprzyłączonych komórek, a następnie przenieść płytki do komory normoksji, która składa się z 8%O2 (patrz rysunek 2 i sekcja 2).

2. Indukcja in vitro normoksji i niedotlenienia/reoksygenacji

  1. Działanie w komorze inkubatora (patrz rysunek 2A w celu konfiguracji).
    1. W okapie z przepływem laminarnym umieścić szalkę Petriego zawierającą sterylną wodę na dnie komory inkubatora, aby uniknąć wysuszenia, a następnie umieścić wcześniej przygotowane płytki lub kolby do hodowli komórkowych (etap 1.3.10) na górnych półkach komory.
    2. Na zewnątrz okapu przymocuj komorę (otwór wlotowy) do węża gazowego (Rysunek 2A: 5a, b i c), aby dotrzeć do rurki z gazem (8% O2 lub 0.5% O2) (Rysunek 2A: 7). Otwórz zarówno otwory wlotowe, jak i wylotowe komory. W tym momencie reduktor gazu (Rysunek 2A: 4) powinien pozostać zamknięty.
    3. Ostrożnie otwórz zawór regulatora gazu (Rysunek 2A: 4). Płukanie przez 4 minuty z przepływem powietrza 25 l/min w celu całkowitej wymiany powietrza wewnątrz komory.
    4. Po przepłukaniu komory należy zamknąć reduktor gazu, a następnie porty wlotowe i wylotowe komory.
    5. Odłączyć wąż wylotowy przepływomierza (Rysunek 2A: 5c) od króćca wlotowego komory i umieścić komorę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C.
    6. Wymienić powietrze znajdujące się obecnie na płytkach, kolbach i rozpuszczone w pożywce, napełniając komorę gazem po upływie 1 godziny od wykonania czynności 2.1.3.
    7. Powtórzyć kroki 2.1.1-2.1.6 dla pozostałych składów gazowych (np. 2%O2 dla hodowli trofoblastu w pierwszym trymestrzeciąży9).
  2. Potwierdź procentową zawartość tlenu (Rysunek 2B-C)
    1. Aby potwierdzić stężenie tlenu w pożywce do hodowli komórkowej (bez komórek) wewnątrz komory, należy użyć elektrody tlenowej podłączonej do adaptera tlenowego. Podłącz elektrodę tlenową do woltomierza.
    2. Należy utworzyć krzywą kalibracyjną w tym samym roztworze (tj. pożywce do hodowli komórkowych), wystawiając roztwór na działanie gazów o znanej zawartości tlenu (np. 0% i 21% tlenu). Po ustabilizowaniu odczytów dla każdego stężenia, wprowadzić elektrodę do medium w komorze.
      Uwaga: Wszystkie pomiary należy wykonywać na tej samej głębokości, aby uniknąć odchyleń w stężeniu tlenu10.
  3. Indukcja normoksji i hipoksja/reoksygenacja w trofoblastach.
    1. Po dodaniu pierwotnych komórek trofoblastu do odpowiednich kolb do hodowli komórkowych, płytek lub szalek Petriego, w razie potrzeby należy wykonać zabiegi.
    2. Równolegle, wewnątrz komory, wystawiaj komórki na działanie żądanej mieszaniny gazów, aby co 24 godziny odtwarzać określony stan (ryc. 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Izolacja i immunopuryfikacja komórek cytotrofoblastu kosmkowego z prawidłowej łożyska w terminie, uzyskanej podczas porodu drogą pochwową, pozwoliły na uzyskanie 1 x 108 żywe komórki. Łożysko ważyło 350 g, miało średnicę 19 cm i wysokość 4 cm, kształt dyskowaty oraz przezroczyste błony. Nie stwierdzono malformacji kotyledonów. Pępowina była rozmieszczona paracentralnie i miała długość 56 cm. Czystość oceniono metodą cytometrii przepływowej przy użyciu markerów vimentyny i cytok...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

U ssaków rozwój płodu jest bezpośrednio zależny od odpowiedniej funkcji łożyska. Rozwojowe pochodzenie zaburzeń zdrowotnych opiera się na hipotezie, że przyczyna chorób objawiających się w późniejszym życiu może być prześledzona we wczesnym rozwoju i że łożysko odgrywa mechanistyczną rolę w programowaniu płodu30-32. Łożysko jest kluczowym mediatorem wzrostu i rozwoju płodu: reguluje transport składników odżywczych, chroni przed szkodliwym narażeniem i pełni ważne funkcje hormonalne. Opracowanie przez Klimana <...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Wspierane przez granty z Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (nr 262011-2009) do CV i March of Dimes Social and Behavioral Sciences Research grant (#12-FY12-179) dla CV i JTS; przez stypendia dla LSF od Ministère de l'éducation, de l'Enseignement supérieurs et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Québec (FRQ)-Nature et technologies (NT) oraz Fondation Universitaire Armand-Frappier INRS, do HC z Réseau Québécois en Reproduction-NSERC-CREATE, do AAHT z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (CIHR) i FRQ-Santé oraz do JBP z NSERC; stypendium dla EMAS od Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientìfico e Tecnològico (CNPq) oraz Programme de bourses d'excellence pour étudiants étrangers MEESR-FRQNT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zakrzywione nożyczki MetzenbaumShandon9212sprzęt chirurgiczny (izolacja komórek) (2 sztuki)
Kleszcze do odłamków Fine 41/2 inFisherbrand13-812-42sprzęt chirurgiczny (izolacja komórek) (2 sztuki)
Nożyczki 4,5 Str RozwarstwienieFisherbrand08-940sprzęt chirurgiczny (izolacja komórek) (2 sztuki)
Gąbka z gazy 10 cm x 10 cmCardinal Health
Naczynie do pieczenia ze szkła podłużnegoPyrex1105397Szkło (2,8 l)
Lejek BuchnerCoorstek Inc10-356ESzkło szklane (średnica 114 mm)
Szkło zegarkowe pyrex9985100EMDSzkło
Roztwór formaliny, neutralny buforowany, 10%Sigma-AldrichHT501128-4Lhistologicznego roztworu utrwalającego tkanki
Kolby trypsynizująceWheaton355395(1 szt)
Jednorazowe probówki hodowlaneKimble73750-13100Wyroby szklane
szkła borokrzemianowego Pipet Pasteura (22,8 cm)FisherbrandK63B1367820CNaczynia szklane
250 ml Zlewki szklaneFisherbrandKFS14005250Szkło
Butelki na media szklane z nakrętkąFisherbrandKFS14395250Szkło (8 sztuk)
Tubka Corex50 ml Corning8422-A(1 szt.)
15 ml probówka wirówkowa z polistyrenuCorning430791
50 ml probówka wirówkowa z polistyrenuCorning430829
10 ml pipeta serologicznaCorning11415038
sitko do komórek 100 μ m NylonCorning431752
Chłonna wkładkaScienceware1199918
500  ml Butelki Górny filtrCorningPore: 0,22  &mikro; m / pożywka i preparat HBSS
2 ml Fiolki kriogenicznePojemnikCorning 430488
, Nalgene Mr. FrostySigma-AldrichC1562-1EA
Pompa perystaltycznaPharmacia Fine ChemicalsModel P3 Kąpiel
wodna z wytrząsaniemFisherModel 127
Pompa próżniowaABM4EKFS6CX-4
Chlorek soduFisherbrandEC231-598-3Roztwór soli 0,9%
Hank' s Buforowany roztwór soli (Hbss)Sigma-AldrichH2387Ilość: 9,25 (jedna fiolka) na 1 l roztworu wytrawiającego
Kwas hydroksypiperazynoetanosulfonowy (Hepes)Life Technologies15630-08025 ml (1 M) na 1 l roztworu wytrawiającego
Trypsyna typu ISigma-AldrichT80039,888 U
Deoksyrybonukleaza typu IVRoche10-104-159-001402,000 U
Chlorek wapniaSigma-AldrichC4901100 mM
Siarczan magnezuBaker2500-01800 mM
Dulbecco' s Zmodyfikowany Eagle Medium High Glucose (Dmem)Life Technologies10564-045
Penicylina/Streptomycyna SiarczanHyklonSV30010
Płodowa surowica bydlęcaCorning35-010-CV
PercollSigma-AldrichP1644Gradient pożywki wirującej o gęstości. Objętość: 36 ml
IsopropanolAcros42383-001050 ml
sulfotlenku dimetyluSigma-Aldrich472301
Automacs Miltenyi BiotecModel 003
Automacs  Kolumny Miltenyi Biotec130-021-101
Bufor do biegania Automacs Miltenyi Biotec130-091-221http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1
Roztwór do płukania Automacs Miltenyi Biotec130-091-222http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx
Anty-ludzki oczyszczony klon Hla Abc W6/32Affymetrix eBioscience14-9983-82przeciw myszom
Mikrogranulki IggMiltenyi Biotec130048401
Płytka wielodołkowa -  6 dołków z PokrywkaCorning3335Powierzchnia wiązania komórek
Płytka wielodołkowa -  24 Studnia z pokrywkąCorning3337Powierzchnia wiązania komórek
Płytka wielodołkowa -  96 Studnia z pokrywkąCorning3300Powierzchnia wiązania komórek
Modułowa komora inkubatora Billups-RothenbergMIC-101Zestaw dwóch jest niezbędny do jednoczesnego generowania warunków normoksji i hipoksji/reoksygenacji
Pojedynczy przepływomierzBillups-RothenbergSFM3001
50 mm Filtr liniowyWhatman6721-5010PTFE, pory: 1,0 i mikro; m
Gas RegulatorPro StarPRS301233Zestaw dwóch jest niezbędny do jednoczesnego generowania warunków normoksji i hipoksji/reoksygenacji
Wąż gazowy Klasa Vi Przezroczysty 5/16 Parker100-050701023 sztuki z ~ 0,5 m
17 mm Regulowany zacisk węża gazowegoOpaska zaciskowa OwijkiTHCSS-16
Butla gazowa Normoxia PraxairNI CDOXR1U-KRozmiar K (3rd trymestr skład: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2)
Butla z gazem Normoxia PraxairNI CDOXR1U-KRozmiar K (3rd trymestr skład: 5% CO2, 0,5% O2, Bal. N2)
Mikroelektroda tlenowa Mi-730Mikroelektrody INC84477
Adapter tlenowyMikroelektrody INC3572
Odczynnik do wykrywania ROS: CM-H2DCFDA Zestaw InvitrogenC-400
β-hCG ELISA DRG międzynarodoweEIA-4115
Oczyszczone przeciwciało anty-wimentynoweeBioscience14-9897Gospodarz: mysie
przeciwciało anty-cytokeratyny 7 (FITC) Abcamab119697Gospodarz: mysz
Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H& L przeciwciałoLife TechnologiesA-11029
361020733 Naczynia szklane ze do zamrażania Separator magnetyczny przeciwciało

Bibliografia

  1. Vaillancourt, C., Lanoix, D., Le Bellego, F., Daoud, G., Lafond, J. Involvement of MAPK signalling in human villous trophoblast differentiation. Mini Rev Med Chem. 9 (8), 962-973 (2009).
  2. Gauster, M., Moser, G., Orendi, K., Huppertz, B. Factors involved in regulating trophoblast fusion: potential role in the development of preeclampsia. Placenta. 30, Suppl A 49-54 (2009).
  3. Huppertz, B., Kadyrov, M., Kingdom, J. C. Apoptosis and its role in the trophoblast. Am J Obstet Gynecol. 195 (1), 29-39 (2006).
  4. Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: the smart killer: the human trophoblast as a model. Mol Cell Endocrinol. 348 (1), 1-11 (2012).
  5. Huppertz, B., Frank, H. G., Reister, F., Kingdom, J., Korr, H., Kaufmann, P. Apoptosis cascade progresses during turnover of human trophoblast: analysis of villous cytotrophoblast and syncytial fragments in vitro. Lab Invest. 79 (12), 1687-1702 (1999).
  6. Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F., 3rd, Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
  7. Lanoix, D., Beghdadi, H., Lafond, J., Vaillancourt, C. Human placental trophoblasts synthesize melatonin and express its receptors. J Pineal Res. 45 (1), 50-60 (2008).
  8. Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: The watchdog of villous trophoblast homeostasis against hypoxia/reoxygenation-induced oxidative stress and apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 381 (1-2), 35-45 (2013).
  9. Tuuli, M. G., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Review: Oxygen and trophoblast biology--a source of controversy. Placenta. 32, Supple 2 109-118 (2011).
  10. Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Pericellular oxygen concentration of cultured primary human trophoblasts. Placenta. 34 (2), 106-109 (2013).
  11. Roberts, J. M., Hubel, C. A. Is oxidative stress the link in the two-stage model of pre-eclampsia. Lancet. 354 (9181), 788-789 (1999).
  12. Burton, G. J., Jauniaux, E. Oxidative stress. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 287-299 (2011).
  13. Ji, L., Brkic, J., Liu, M., Fu, G., Peng, C., Wang, Y. L. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Mol Aspects Med. 34 (5), 981-1023 (2013).
  14. Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental stress and pre-eclampsia: a revised view. Placenta. 30, Suppl A 38-42 (2009).
  15. Sagrillo-Fagundes, L., Soliman, A., Vaillancourt, C. Maternal and placental melatonin: actions and implication for successful pregnancies. Minerva Ginecol. 66 (3), 251-266 (2014).
  16. Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21 (7), 733-741 (2000).
  17. Potgens, A. J., Gaus, G., Frank, H. G., Kaufmann, P. Characterization of trophoblast cell isolations by a modified flow cytometry assay. Placenta. 22 (2-3), 251-255 (2001).
  18. Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol Med. 121, 203-217 (2006).
  19. Maldonado-Estrada, J., Menu, E., Roques, P., Barre-Sinoussi, F., Chaouat, G. Evaluation of Cytokeratin 7 as an accurate intracellular marker with which to assess the purity of human placental villous trophoblast cells by flow cytometry. J Immunol Methods. 286 (1-2), 21-34 (2004).
  20. Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol Biol. 550, 73-87 (2009).
  21. Mounier, C., Barbeau, B., Vaillancourt, C., Lafond, J. Endocrinology and cell signaling in human villous trophoblast. Methods Mol Biol. 550, 89-102 (2009).
  22. Chen, B., et al. Pomegranate juice and punicalagin attenuate oxidative stress and apoptosis in human placenta and in human placental trophoblasts. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (9), 1142-1152 (2012).
  23. Reti, N. G., et al. Effect of high oxygen on placental function in short-term explant cultures. Cell Tissue Res. 328 (3), 607-616 (2007).
  24. Pidoux, G., et al. Biochemical characterization and modulation of LH/CG-receptor during human trophoblast differentiation. J Cell Physiol. 212 (1), 26-35 (2007).
  25. Pidoux, G., et al. ZO-1 is involved in trophoblastic cell differentiation in human placenta. Am J Physiol Cell Physiol. 298 (6), 1517-1526 (2010).
  26. Williams, J. L., Fyfe, G. K., Sibley, C. P., Baker, P. N., Greenwood, S. L. K+ channel inhibition modulates the biochemical and morphological differentiation of human placental cytotrophoblast cells in vitro. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (4), 1204-1213 (2008).
  27. Schild, R. L., Schaiff, W. T., Carlson, M. G., Cronbach, E. J., Nelson, D. M., Sadovsky, Y. The activity of PPAR gamma in primary human trophoblasts is enhanced by oxidized lipids. J Clin Endocrinol Metab. 87 (3), 1105-1110 (2002).
  28. Menendez-Pelaez, A., Reiter, R. J. Distribution of melatonin in mammalian tissues: the relative importance of nuclear versus cytosolic localization. J Pineal Res. 15 (2), 59-69 (1993).
  29. Perrone, S., Stazzoni, G., Tataranno, M. L., Buonocore, G. New pharmacologic and therapeutic approaches for hypoxic-ischemic encephalopathy in the newborn. J Matern Fetal Neonatal Med. 25, Suppl 1 83-88 (2012).
  30. Nelissen, E. C., van Montfoort, A. P., Dumoulin, J. C., Evers, J. L. Epigenetics and the placenta. Hum Reprod Update. 17 (3), 397-417 (2011).
  31. Barker, D. J. Intrauterine programming of adult disease. Mol Med Today. 1 (9), 418-423 (1995).
  32. Barker, J. R., Thomas, C. F., Behan, M. Serotonergic projections from the caudal raphe nuclei to the hypoglossal nucleus in male and female rats. Respir Physiol Neurobiol. 165 (2-3), 175-184 (2009).
  33. Yui, J., et al. Functional, long-term cultures of human term trophoblasts purified by column-elimination of CD9 expressing cells. Placenta. 15 (3), 231-246 (1994).
  34. Kilani, R. T., Chang, L. J., Garcia-Lloret, M. I., Hemmings, D., Winkler-Lowen, B., Guilbert, L. J. Placental trophoblasts resist infection by multiple human immunodeficiency virus (HIV) type 1 variants even with cytomegalovirus coinfection but support HIV replication after provirus transfection. J Virol. 71 (9), 6359-6372 (1997).
  35. Knofler, M., Stenzel, M., Husslein, P. Shedding of tumour necrosis factor receptors from purified villous term trophoblasts and cytotrophoblastic BeWo cells. Hum Reprod. 13 (8), 2308-2316 (1998).
  36. Douglas, G. C., King, B. F. Isolation of pure villous cytotrophoblast from term human placenta using immunomagnetic microspheres. J Immunol Methods. 119 (2), 259-268 (1989).
  37. Li, L., Schust, D. J. Isolation, purification and in vitro differentiation of cytotrophoblast cells from human term placenta. Reprod Biol Endocrinol. 13, 71(2015).
  38. Stenqvist, A. C., et al. An efficient optimized method for isolation of villous trophoblast cells from human early pregnancy placenta suitable for functional and molecular studies. Am J Reprod Immunol. 60 (1), 33-42 (2008).
  39. Potgens, A. J., Kataoka, H., Ferstl, S., Frank, H. G., Kaufmann, P. A positive immunoselection method to isolate villous cytotrophoblast cells from first trimester and term placenta to high purity. Placenta. 24 (4), 412-423 (2003).
  40. Lanoix, D., Vaillancourt, C. Cell culture media formulation and supplementation affect villous trophoblast HCG release. Placenta. 31 (6), 558-559 (2010).
  41. Vaillancourt, C., Lafond, J. Human embryogenesis: overview. Methods Mol Biol. 550, 3-7 (2009).
  42. Armant, D. R., et al. Human trophoblast survival at low oxygen concentrations requires metalloproteinase-mediated shedding of heparin-binding EGF-like growth factor. Development. 133 (4), 751-759 (2006).
  43. McCaig, D., Lyall, F. Hypoxia upregulates GCM1 in human placenta explants. Hypertens Pregnancy. 28 (4), 457-472 (2009).
  44. Burton, G. J., et al. Optimising sample collection for placental research. Placenta. 35 (1), 9-22 (2014).
  45. Lanoix, D., et al. Quantitative PCR pitfalls: the case of the human placenta. Mol Biotechnol. 52 (3), 234-243 (2012).
  46. Bilban, M., et al. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31 (11), 989-996 (2010).
  47. Novakovic, B., et al. Wide-ranging DNA methylation differences of primary trophoblast cell populations and derived cell lines: implications and opportunities for understanding trophoblast function. Mol Hum Reprod. 17 (6), 344-353 (2011).
  48. Burleigh, D. W., et al. Microarray analysis of BeWo and JEG3 trophoblast cell lines: identification of differentially expressed transcripts. Placenta. 28 (5-6), 383-389 (2007).
  49. Hung, T. H., Skepper, J. N., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J. Hypoxia-reoxygenation: a potent inducer of apoptotic changes in the human placenta and possible etiological factor in preeclampsia. Circ Res. 90 (12), 1274-1281 (2002).
  50. Heazell, A. E., Moll, S. J., Jones, C. J., Baker, P. N., Crocker, I. P. Formation of syncytial knots is increased by hyperoxia, hypoxia and reactive oxygen species. Placenta. 28, Suppl A 33-40 (2007).
  51. Heazell, A. E., Lacey, H. A., Jones, C. J., Huppertz, B., Baker, P. N., Crocker, I. P. Effects of oxygen on cell turnover and expression of regulators of apoptosis in human placental trophoblast. Placenta. 29 (2), 175-186 (2008).
  52. Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Hypoxia induces autophagy in primary human trophoblasts. Endocrinology. 153 (10), 4946-4954 (2012).
  53. Lanoix, D., Guerin, P., Vaillancourt, C. Placental melatonin production and melatonin receptor expression are altered in preeclampsia: new insights into the role of this hormone in pregnancy. J Pineal Res. 53 (4), 417-425 (2012).
  54. Galano, A., Tan, D. X., Reiter, R. J. Melatonin as a natural ally against oxidative stress: a physicochemical examination. J Pineal Res. 51 (1), 1-16 (2011).
  55. Alers, N. O., Jenkin, G., Miller, S. L., Wallace, E. M. Antenatal melatonin as an antioxidant in human pregnancies complicated by fetal growth restriction--a phase I pilot clinical trial: study protocol. BMJ Open. 3 (12), 004141(2013).
  56. Hobson, S. R., Lim, R., Gardiner, E. E., Alers, N. O., Wallace, E. M. Phase I pilot clinical trial of antenatal maternally administered melatonin to decrease the level of oxidative stress in human pregnancies affected by pre-eclampsia (PAMPR): study protocol. BMJ Open. 3 (9), 003788(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja kosmkowych cytotrofoblast wpierwotna hodowla trofoblast wmodel hipoksji i reoksygenacjiochronne dzia anie melatoninyoczyszczanie immunomagnetycznewirowanie gradientoweanaliza cytometrycznar nicowanie syncytiotrofoblast wocena stresu oksydacyjnegosekrecja beta hCG
Ludzki model hodowli komórek trofoblastu pierwotnego w celu zbadania ochronnego działania melatoniny przed zakłóceniami wywołanymi niedotlenieniem/reoksygenacją
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.