Method Article

Łatwa metoda profilowania polisomów roślin

DOI:

10.3791/54231

⸱

August 28th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Laboratoire de Génétique et Biophysique des Plantes, Aix-Marseille Université, 2UMR 7265 Biologie Végétale & Microbiologie Environnementales, CNRS, 3BIAM, CEA, 4Department of Biology, Biocenter, University of Copenhagen, 5Laboratoire de Chimie Bactérienne, 6CNRS, LCB UMR 7283, Aix Marseille Université

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje prostą metodę ekstrakcji i frakcjonowania transkryptów z tkanek roślinnych na podstawie liczby związanych rybosomów. Pozwala na globalne oszacowanie aktywności translacyjnej i określenie statusu translacyjnego określonych mRNA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Translacja mRNA na białko jest podstawowym i wysoce regulowanym procesem biologicznym. Profilowanie polisomów jest uważane za złoty standard w analizie regulacji translacyjnej. Opisana tutaj metoda to łatwy i ekonomiczny sposób frakcjonowania polisomów z różnych tkanek roślinnych. Gradient sacharozy jest wytwarzany bez potrzeby stosowania kreatora gradientu poprzez sekwencyjne zamrażanie każdej warstwy. Ekstrakty cytozolowe są następnie przygotowywane w buforze zawierającym cykloheksymid i chloramfenikol w celu unieruchomienia rybosomów cytozolowych i chloroplastycznych do mRNA i są ładowane na gradient sacharozy. Po odwirowaniu sześć frakcji jest zbieranych bezpośrednio od dołu do góry gradientu, bez przebijania probówki do ultrawirówki. Podczas zbierania absorbancja przy 260 nm jest odczytywana w sposób ciągły w celu wygenerowania profilu polisomowego, który daje obraz globalnej aktywności translacyjnej. Frakcje są następnie łączone w celu przygotowania trzech różnych populacji mRNA: polisomów, mRNA związanych z kilkoma rybosomami; monosomy, mRNA związane z jednym rybosomem; i mRNA, które nie są związane z rybosomami. Następnie ekstrahuje się mRNA. Protokół ten został zatwierdzony dla różnych roślin i tkanek, w tym siewek Arabidopsis thaliana i roślin dorosłych, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum i liści Oryza sativa.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synteza białek jest niezbędnym i kosztownym energetycznie procesem we wszystkich komórkach 1. Przede wszystkim komórki muszą inwestować energię w produkcję maszynerii translacyjnej, rybosomów. Na przykład aktywnie dzieląca się komórka drożdży wytwarza nawet 2000 rybosomów na minutę. Taka produkcja wymaga do 60% całkowitej aktywności transkrypcyjnej i do 90% całkowitej aktywności splicingowej komórki 2. Ponadto energia jest potrzebna do syntezy aminokwasów, aminoacylo-tRNA i wiązań peptydowych. W roślinach dodanie jednego aminokwasu do łańcucha peptydowego kosztuje od 4,5 do 5,9 cząsteczki ATP 3. Dlatego nie jest zaskakujące, że translacja mRNA na białko jest głównym miejscem regulacji, szczególnie jeśli chodzi o radzenie sobie ze zmieniającymi się warunkami środowiskowymi.

Etap inicjacji translacji, czyli powiązanie mRNA z rybosomem, jest głównym celem regulacji translacji4. W wyniku regulacji translacji, jak również innych potranskrypcyjnych etapów regulacyjnych, tylko 40% zmian w stężeniu białka można wyjaśnić obfitością mRNA 5,6. Tak więc badanie całkowitego mRNA daje stosunkowo słabe informacje na temat obfitości białek. Z drugiej strony, powiązanie mRNA z rybosomami daje lepszy wgląd w obfitość białek, dając dostęp do tych mRNA, które biorą udział w translacji. Aktywnie ulegające translacji mRNA są związane z kilkoma rybosomami w strukturach zwanych polisomami. I odwrotnie, słabo translowane mRNA będą związane tylko z jednym rybosomem (monosomem). W związku z tym status translacyjny mRNA można ocenić, monitorując jego związek z rybosomami7.

Ten protokół opisuje izolację polisomów z sześciodniowych siewek Arabidopsis thaliana, późniejszą izolację RNA i analizę wyników. Polisomy i monosomy są oddzielone gradientem gęstości sacharozy. Gradienty są zebrane w sześć frakcji. Niektóre frakcje są łączone w celu uzyskania trzech dobrze oddzielonych frakcji: polisomów, monosomów i frakcji lekkiej (zwanej dalej supernatantem), która zawiera wolne podjednostki rybosomalne 60S i 40S oraz mRNA, które nie są związane z rybosomami. Globalną aktywność translacyjną można oszacować, generując stosunek polisomów do monosomów, który jest określany przez całkowanie obszaru pod krzywą oraz przez porównanie profili polisomów. mRNA i białka są następnie ekstrahowane z różnych frakcji i wykorzystywane do analizy za pomocą RT-PCR, qRT-PCR, Northern blot, mikromacierzy, western blot lub proteomiki. Protokół ten został zatwierdzony dla innych roślin i tkanek.

Sprzęt wymagany do wykonania tego protokołu jest powszechnie spotykany w większości laboratoriów: Nie ma potrzeby korzystania z kreatora gradientów. Zamrożenie każdej warstwy przed dodaniem kolejnej zapobiega jakiemukolwiek mieszaniu się lub zakłóceniu warstw. Do zbierania gradientu nie używa się przekłuwacza do probówek, co można osiągnąć poprzez zanurzenie szklanej rurki kapilarnej w gradiencie. Dzięki temu kosztowne probówki do ultrawirówek pozostają nieuszkodzone i mogą być wielokrotnie używane. Podsumowując, sprawia to, że obecny protokół jest łatwą i tanią metodą profilowania polisomów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie od 20 do 50% (w/v) gradientów sacharozy

Uwaga: Gradienty składają się z 4 warstw sacharozy (50%, 35% i 2 warstwy po 20%) w probówce ultrawirówki o pojemności 13,2 ml. Z naszego doświadczenia wynika, że rozlanie 20% sacharozy w dwóch oddzielnych warstwach znacznie poprawia jakość preparatów polisomowych.

  1. Przygotować roztwory podstawowe. Upewnij się, że wszystkie roztwory są wolne od RNAzy i DNAzy.
    1. Przygotuj 10X roztwór soli: 400 mM Tris-HCl pH 8,4, 200 mM KCl i 100 mM MgCl2.
    2. Przygotuj 2 M roztwór sacharozy: Na 200 ml rozpuść 137 g sacharozy w 1X roztworze soli.
  2. Rozcieńczyć roztwór sacharozy w roztworze soli, jak opisano w tabeli 1, w celu przygotowania gradientów. Podane objętości dotyczą sześciu gradientów.
Końcowe stężenie sacharozySacharoza 2M (ml)Roztwór soli 1X (ml)Objętość końcowa (ml)
50%8,83.212
35%Pytanie 12,9Rozdział 12.125
20%7,4Rozdział 17,625
20%5,8Rozdział 14,220

Tabela 1. Rozcieńczenia roztworu sacharozy w celu przygotowania sześciu gradientów.

  1. Wylać warstwy zgodnie z tabelą 2.
Warstwa sacharozy50%35%20%20%
Objętość (ml)1,85Klasa 3,65Klasa 3,65Godzina 1,35

Tabela 2. Objętość roztworu sacharozy na warstwę.

  1. Po nalaniu każdej warstwy trzymaj probówki w zamrażarce o temperaturze -40 °C lub -80 °C do całkowitego zamrożenia przed dodaniem kolejnej warstwy sacharozy. Zamrozanie osiąga się zwykle po 2 godzinach w temperaturze -40 °C, ale zaleca się odczekanie około 6 godzin przed wylaniem kolejnej warstwy. Ostatnie 20% warstwy można zamrozić lub dodać na świeżo w dniu eksperymentu.
    Uwaga: Zamrożenie każdej warstwy przed dodaniem następnej zapobiega jakiemukolwiek mieszaniu się lub zakłóceniu warstw. Nachylenia można przechowywać w zamrażarce o temperaturze -40 °C lub -80 °C przez co najmniej sześć miesięcy.
  2. Jeśli jeszcze tego nie zrobiono, dodaj ostatnie 20% warstwy do gradientów w dniu eksperymentu. Następnie pozwól gradientom rozmrozić się w chłodnym pomieszczeniu lub lodówce.

2. Przygotowanie ekstraktów cytozolowych

Uwaga: Zalecamy użycie dwóch gradientów na próbkę biologiczną. 300 mg to optymalna ilość materiału roślinnego do przygotowania dwóch gradientów podczas pracy z 6-dniowymi sadzonkami Arabidopsis thaliana. Podczas pracy z tkankami mniej aktywnymi translacyjnie ilość materiału roślinnego można zwiększyć do 600 mg.

  1. Zbierz sześciodniowe sadzonki wyhodowane na 1/2 pożywki Murashige i Skoog8 uzupełnionej 1% sacharozą lub równoważną pożywką przez szybkie zamrożenie w ciekłym azocie
  2. Zmiel materiał roślinny we wstępnie schłodzonym moździerzu i tłuczku z ciekłym azotem.
  3. Odważyć 300 mg sproszkowanego materiału w wstępnie schłodzonym naczyniu wagowym. Wykonaj ten krok szybko, aby uniknąć rozmrożenia próbki.
    Uwaga: Zamrożone próbki należy przechowywać nie dłużej niż tydzień w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
  4. Dodać 2,4 ml wstępnie schłodzonego buforu polisomu (roztwór soli 4X, 5,26 mM EGTA, 0,5% (v/v) poli(etylenoksy)etanol oktylofenoksy, rozgałęziony, 50 μ g.ml-1 cykloheksymidu, 50 μ g.ml1 chloramfenikol) i homogenizować mieszając z końcówką pipety. Przenieść do dwóch probówek o pojemności 1,5 ml. Pracuj szybko, aby zapobiec nagrzewaniu się próbek.
  5. Wirować przy 16 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w mikrowirówce w celu osadzania zanieczyszczeń.
    Uwaga: Aby zapobiec degradacji RNA, zawsze utrzymuj próbki w temperaturze 4°C, używaj roztworów wolnych od RNaz/DNaz i pracuj w warunkach wolnych od RNaz/DNaz. Heparyna może być dodawana do buforu polisomowego do końcowego stężenia 300 μ g.ml-1, w celu zwiększenia ochrony RNA. Ponieważ jednak heparyna może zakłócać dalszą analizę, będzie musiała zostać usunięta na etapie wytrącania RNA poprzez wykonanie wytrącania chlorkiem litu zamiast wytrącania etanolu (por. uwaga 4.7).

3. Profilowanie polisomów

  1. Ostrożnie odpipetować supernatant, nie naruszając osadu. Jeśli fragmenty roślin zostały odpipetowane, powtórzyć krok 2.5. Załadować supernatant na wierzch gradientu, delikatnie pipetując na ściankę boczną probówki w stałym strumieniu. Użyj jednego gradientu na każdą probówkę o pojemności 1,5 ml.
  2. Przenieść do wstępnie schłodzonych wiader i odwirować przy 175 000 x g przez 2 godziny 45 minut w temperaturze 4 °C, w ultrawirówce (np. 32 000 obr./min w przypadku stosowania wirnika SW41).
  3. Skonfiguruj system zbierania gradientów zgodnie z opisem na rysunku 1. Kuweta UV ma długość ścieżki 1 mm.

figure-protocol-1
Rysunek 1. System zbierania gradientów. Kuweta UV jest połączona rurką z polichlorku winylu ze szklaną rurką kapilarną, która schodzi na dno gradientu. Nachylenie przechodzi przez system dzięki pompie perystaltycznej. OD260 jest odczytywany w sposób ciągły i zbierane są frakcje o objętości 2 ml. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Ustaw kolektor frakcji na RT i ustaw karuzelę na prędkość, która pozwoli na zebranie frakcji o pojemności 2 ml. Używaj wstępnie schłodzonych probówek zbiorczych.
  2. Zbierz frakcje od dołu do góry za pomocą szklanej rurki kapilarnej połączonej rurką z polichlorku winylu z systemem zbierania gradientowego. Użyj plastikowej folii parafinowej, aby zabezpieczyć połączenie między rurką z polichlorku winylu a szklaną rurką kapilarną.
  3. Odczytać absorbancję przy 260 nm od dołu do góry gradientu. Po zebraniu całego gradientu umieść probówki zbiorcze na lodzie przed ekstrakcją RNA.

4. Ekstrakcja RNA

  1. Frakcje zebrane z dwóch gradientów należy zebrać w 50 ml zakorkowanych probówkach wirówkowych w następujący sposób:
    Polisomy: frakcje od 1 do 3 (12 ml)
    Monosomy: frakcja 4 (4 ml)
    Supernatant: frakcje 5 i 6 (8 ml)
  2. Do każdej frakcji dodać 1 vol. 8M chlorowodorek guanidyny, 50 μg nośnika akrylowego i 1,5 obj. izopropanolu.
    Uwaga: Nośnik akrylowy to liniowy akrylamid, stosowany jako współprecypitent w celu poprawy odzysku kwasów nukleinowych podczas wytrącania alkoholu.
  3. Wymieszać przez odwrócenie probówek i wytrącić O/N w temperaturze -20 °C.
  4. Wirować przy 175 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, w ultrawirówce (32 000 obr./min w wirniku SW32). Jeżeli etap wytrącania jest wykonywany w probówce, która nie jest kompatybilna z ultrawirowaniem, należy przenieść do odpowiedniej probówki.
  5. Odrzucić supernatant i rozpuścić osad w 200 μl buforze TE wolnym od RNAz (10 mM Tris-HCl pH 7,5 - 1 mM EDTA). Przenieść do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml.
  6. Ekstrahować RNA przez dodanie 1 obj. fenolu nasyconego wodą (pH 6,6) i 1 obj. chloroformu: alkoholu izoamylowego (24:1). Mieszaj energicznie. Wirować przy 15 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść fazę wodną do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
    Uwaga: Kwaśny fenol (pH 4,5) może być stosowany w celu zminimalizowania zanieczyszczenia DNA.
  7. Wytrącić RNA, dodając 1/10 obj. 3 M octan sodu i 3 obj. 100% etanolu. Pozostawić do wytrącania w temperaturze -80 °C przez 20 minut lub O/N w temperaturze -20 °C. Wirować w temperaturze 15 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    Uwaga: W przypadku stosowania heparyny w buforze polisomowym (por. uwaga 2.5) należy przeprowadzić wytrącanie chlorku litu (LiCl) zamiast wytrącania etanolu, aby prawidłowo usunąć wszelkie ślady heparyny, które mogłyby zakłócać dalszą analizę9. Po ekstrakcji dodać LiCl do końcowego stężenia 2,5 M. Pozostawić na wytrącanie przez 30 minut w temperaturze -20 °C lub O/N w temperaturze 4 °C. Wirować przy 15 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Umyj granulat 500 μl 75% etanolu. Wysuszyć granulat na powietrzu i rozpuścić w 30 μl buforu TE. Ocenić jakość RNA za pomocą elektroforezy na 1,2% żelu agarozowym wolnym od RNAzy (100 V, 15 min) lub metodami elektroforezy kapilarnej.

5. Analiza danych

  1. Eksport surowych danych do oprogramowania graficznego i do analizy danych.
    Uwaga: Jak pokazano na rysunkach 2A i B, surowe profile dostarczają informacji jakościowych: liczby widocznych pików polisomów, wysokości piku monosomu oraz obecności ramienia odpowiadającego wolnym podjednostkom rybosomów.
  2. Scal profile, aby umożliwić porównanie profili między próbkami. Użyj narzędzia czytnika ekranu, aby określić wartość X piku monosomu dla każdej próbki i wyrównać piki monosomu, usuwając dodatkowe punkty danych na początku krzywych. Zidentyfikuj najniższy punkt krzywej i określ jego wartość Y (za pomocą narzędzia czytnika ekranu). Ustaw najniższą wartość punktu Y na 0 za pomocą funkcji "ustaw wartość kolumn".
  3. Określ stosunek polisomów do monosomów, całkując obszar pod krzywą z surowych profili (rysunek 3C). Użyj narzędzia wyboru danych, aby zdefiniować granicę obszaru, który ma zostać zintegrowany. Następnie użyj funkcji całkowania (Analiza-Matematyka).
  4. Znormalizuj krzywe do piku monosomu, dzieląc wszystkie punkty danych krzywej przez wartość Y szczytu piku monosomu (wyznaczoną za pomocą czytnika ekranu). Wybierz kolumnę, a następnie w obszarze Analiza-Matematyka wybierz pozycję Normalizuj i wybierz metody "podzielone przez określoną wartość". Ten krok umożliwia porównanie względnego poziomu polisomów (rysunek 3D).

figure-protocol-2
Rysunek 2. Reprezentatywne profile polisomowe. Siewki Arabidopsis thaliana typu dzikiego (wt, ekotyp Col-0) i zmutowane były hodowane przez sześć dni na 1/2 podłoża Murashige i Skoog w długich fotoperiodach dnia (16 godzin światła, 8 godzin ciemności). A: surowe profile polisomowe z sadzonek wt. B: surowe profile polisomowe z sadzonek mutantów. C: Oznaczanie procentu polisosomów i monosomów przez całkowanie obszaru pod krzywą D: Profile polisomów znormalizowane do piku monosomu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W literaturze profile polisomów są często pokazywane od frakcji lekkiej do frakcji ciężkiej ze względu na sposób zbierania gradientów, tj. od góry do dołu. Ponieważ w opisanym tutaj protokole gradienty są zbierane od dołu do góry, profile, które pokazujemy, zaczynają się od frakcji ciężkiej (polisomy) i przechodzą do frakcji lekkiej (wolne podjednostki rybosomów i RNA) (ryc. 2A). Następnie zbieramy każdy gradient w sześciu frakcjach o pojemności 2 ml, ale mniejsze frakcje...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony przez nas protokół jest łatwą i tanią metodą generowania profili polisomowych i izolowania mRNA związanych z polisosomami, pojedynczymi rybosomami lub wolnymi od rybosomów. W literaturze opisano szeroki zakres różnych metod frakcjonowania polisomów. Opisana przez nas metoda została zoptymalizowana tak, aby zachować tylko niezbędne związki i została dostosowana do materiału roślinnego. W szczególności zmniejszyliśmy ilość detergentu11 i dodaliśmy chloramfenikol do buforu, aby związać rybosomy chlo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Francuską Narodową Agencję Badawczą (ANR-14-CE02-0010). Dziękujemy dr Benjaminowi Fieldowi i dr Elodie Lanet za krytyczną lekturę manuskryptu. Dziękujemy Panu Michelowi Terese za pomoc w edycji wideo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Probówka do ultrawirówek, cienkościenna, poliallomer - 13,2 mlBeckman Coulter331372
Probówka do ultrawirówek, cienkościenna, polialomerowa - 38,5 mlBeckman Coulter326823
Szklana rurka kapilarnaDrummond Scientific1-000-1000
Ultrawirówka Beckman Coulterserii Optima
SW41 Rotor ultrawirówkiBeckman Coulter331362
SW32Beckman Coulter369650
Pompa perystaltycznaDowolna
rurka z polichlorku winylu Tygon R3607 Fisher Scientific070534-22Rurka z polichlorku winylu, 2,29 mm 
Kolektor frakcji Model 2110Bio-Rad731-8120
Kuweta UVHellma170.700-QSKwarcowa kuweta przepływowa
Spektrofotometr UVVarianCary50Odczyt co 0,0125 sekundy
Wszystkie chemikaliaTylkodo użytku Biologia molekularna Klasa
Murashige i Skoog Mieszanina soli bazalnej (MS)Sigma-AldrichM5524
Woda wolna od rnazyDowolne
szalki PetriegoFisher Scientific10083251 
Oktylofenoksyetanol poli(etylenoksy)etanol, rozgałęziony (Nonidet P40)EuromedexUN3500
Liniowy akryloamid (nośnik akrylowy)ThermoFischer scientificAM9520Nośnik wytrącania RNA
OriginPro 8Oprogramowanie analityczneOriginLab
Wirnik ultrawirówkowy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nelson, C. J., Millar, A. H. Protein turnover in plant biology. Nat Plants. 1 (3), 15017(2015).
  2. Warner, J. R. The economics of ribosome biosynthesis in yeast. Trends Biochem Sci. 24 (11), 437-440 (1999).
  3. Amthor, J. S. The McCree-de Wit-Penning de Vries-Thornley Respiration Paradigms: 30 Years Later. Ann Bot. 86 (1), 1-20 (2000).
  4. Preiss, T., W Hentze, M. Starting the protein synthesis machine: eukaryotic translation initiation. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 25 (12), 1201-1211 (2003).
  5. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2013).
  6. Baerenfaller, K., et al. Genome-scale proteomics reveals Arabidopsis thaliana gene models and proteome dynamics. Science. 320 (5878), 938-941 (2008).
  7. Zanetti, E., Chang, I., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification of Polyribosomal Complexes of Arabidopsis for Global Analysis of Gene Expression. Plant physiol. 138 (2), 624-635 (2005).
  8. Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol plant. 15 (3), 473-497 (1962).
  9. del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), 414-421 (2007).
  10. Arabidopsis protocols. Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. , Methods in molecular biology; 323. Clifton, N.J. (2006).
  11. Piques, M., et al. Ribosome and transcript copy numbers, polysome occupancy and enzyme dynamics in Arabidopsis. Mol syst biol. 5 (314), 314(2009).
  12. Morita, M., Alain, T., Topisirovic, I., Sonenberg, N. Polysome Profiling Analysis. bio-protocol. 3 (14), 3-8 (2013).
  13. Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress. PloS One. 8 (8), (2013).
  14. Sormani, R., et al. Sublethal cadmium intoxication in Arabidopsis thaliana impacts translation at multiple levels. Cell Physiol. 52 (2), 436-447 (2011).
  15. Lanet, E., et al. Biochemical evidence for translational repression by Arabidopsis microRNAs. Plant cell. 21 (6), 1762-1768 (2009).
  16. Jabnoune, M., Secco, D., Lecampion, C., Robaglia, C., Shu, Q., Poirier, Y. A Rice cis-Natural Antisense RNA Acts as a Translational Enhancer for Its Cognate mRNA and Contributes to Phosphate Homeostasis and Plant Fitness. Plant cell. 25 (10), 4166-4182 (2013).
  17. Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470 (10), Elsevier Inc. (2010).
  18. Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. PNAS. 111 (1), 203-212 (2013).
  19. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Polysome ProfilingPlant TissuesSucrose GradientRNA ExtractionUltracentrifugationCytosolic ExtractFraction CollectionOD MeasurementArabidopsis ThalianaNicotiana Benthamiana

Related Articles