Opisano nowy test behawioralny do badania krótkoterminowych reakcji smakowych swobodnie poruszających się trzmieli (Bombus terrestris) na składniki odżywcze i toksyny w roztworze.
Artykuł metodologiczny
Nowatorski test behawioralny do badania reakcji smakowych osobników, swobodnie poruszających się trzmieli (Bombus terrestris)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ogólne zapylacze, takie jak trzmiel płowoogoniasty, Bombus terrestris, napotykają zarówno składniki odżywcze, jak i toksyny w nektarze kwiatowym, który zbierają z kwitnących roślin. Tylko kilka badań opisało reakcje smakowe pszczół na toksyny w pożywieniu, a eksperymenty te wykorzystywały głównie reakcję przedłużenia trąbki na powściągliwych pszczołach miodnych. W tym artykule przedstawiono nowy test behawioralny do pomiaru reakcji żywieniowych swobodnie poruszających się, indywidualnych trzmieli robotnic na składniki odżywcze i toksyny. Test ten mierzy ilość roztworu spożytego przez każdego trzmiela i określa, w jaki sposób degustacje w żywności wpływają na mikrostrukturę zachowań żywieniowych.
Roztwory są prezentowane w mikrokapilarnej probówce dla pojedynczych trzmieli, które wcześniej były głodzone przez 2-4 godziny. Zachowanie jest rejestrowane na cyfrowym wideo. Dokładna struktura zachowań żywieniowych jest analizowana poprzez ciągłą ocenę pozycji trąbki (aparatu gębowego) na podstawie nagrań wideo za pomocą oprogramowania do rejestrowania zdarzeń. Pozycja trąbki jest definiowana przez trzy różne kategorie behawioralne: (1) trąba jest wysunięta i styka się z roztworem, (2) trąba jest rozciągnięta, ale nie styka się z roztworem oraz (3) trąba jest schowana pod głową. Ponadto szacuje się również szybkość odsuwania się trąbki od roztworu.
W obecnym teście objętość zużytego roztworu, liczba napadów karmienia, czas trwania napadów karmienia i szybkość retrakcji trąbki po pierwszym kontakcie są używane do oceny fagostymulacyjnej lub odstraszającej aktywności badanych związków.
Ten nowy test smaku pozwoli badaczom zmierzyć, jak związki znajdujące się w nektarze wpływają na zachowania pszczół związane z żerowaniem, a także będzie przydatny dla biologów zajmujących się zapylaniem, toksykologów i neuroetologów badających system smaku trzmieli.
Wprowadzenie
Interakcje między roślinami a zapylaczami są złożone. Zapylacze odwiedzają kwiaty, aby uzyskać nektar i pyłek jako pożywienie; Z kolei zapylacze ułatwiają rozmnażanie płciowe u roślin. Chociaż ta zależność jest w większości wzajemna, nektar kwiatowy i pyłek czasami zawierają toksyny lub inne związki roślinne1-5, które mogą szkodzić owadom zapylającym. Ekologiczne uzasadnienie obecności takich związków w nektarze i pyłku nie jest jasne we wszystkich sytuacjach. Jednym z nierozstrzygniętych pytań w tej dziedzinie jest to, w jaki sposób zapylacze, takie jak pszczoły, mogą wykrywać i unikać kwiatów z nektarem zawierającym toksyny.
Gatunek trzmiela, Bombus terrestris (Linnaeus, 1758), jest ogólnym zapylaczem, który odwiedza kwiaty wielu gatunków roślin, w tym tych produkujących nektar zawierający toksyny6. Wykazano, że trzmiele unikają spożywania roztworów zawierających wysokie stężenia toksyn w 24-godzinnym teście dwóch wyborów7. Ten test spożycia żywności opisany przez Tiedeken i wsp. 7 ujawniło, że pszczoły mogą wykrywać gorzkie związki w roztworach. Jednak ten test nie był w stanie odróżnić smaku od procesów po spożyciu, takich jak złe samopoczucie, które również mogą wpływać na zachowanie żywieniowe w tym przedziale czasu8-10.
Pszczoły posiadają zmysł smakowy na swoich czułkach, aparatach gębowych i stępie, aby wykrywać związki11-13. Eksperymenty z odruchem rozciągania trąbki (PER) polegają na krępowaniu poszczególnych pszczół w uprzęży, a następnie stymulowaniu czułka czułka pszczoły do wytworzenia odruchu karmienia14-17. Pszczoły mogą być unieruchomione w indywidualnych uprzężach, a następnie stymulowane do wytwarzania odruchu karmienia jako testu ich zdolności do odczuwania związków18,19. Inni zmodyfikowali test PER w celu zbadania wrażliwości czułków lub aparatu gębowego na toksyny9,20. Jednak pszczoły są narażone na stres podczas zaprzęgów. Może to wpływać na to, jak reagują na związki21.
Tutaj opisano nowy test do oceny behawioralnej reakcji smakowej swobodnie poruszających się trzmieli na sacharozę i chininę, alkaloid, który wcześniej był opisywany jako odstraszający9 i toksyczny10 dla pszczół miodnych (Apis mellifera) i trzmieli (Bombus terrestris)7,22. Chociaż chininy nie znaleziono w nektarze roślinnym, alkaloid ten jest często stosowany jako bodziec awersyjny w badaniach behawioralnych i fizjologicznych u pszczół7,9,12,13,22. Metoda polega na nagrywaniu na wideo aparatu gębowego trzmieli w dużej rozdzielczości podczas początkowego kontaktu trąbki z roztworami testowymi. W szczególności delikatna struktura reakcji na karmienie jest badana poprzez ciągłą ocenę zachowania w odstępie 2 minut. Objętość spożytego roztworu jest mierzona w okresie karmienia, a więc ilość spożywanego pokarmu może być skorelowana z mikrostrukturą zachowań żywieniowych. Mierzona jest również szybkość retrakcji trąbki, jako wskaźnik aktywnego unikania, a tym samym wykrywania przed spożyciem.
Protokół
1. Odławianie pszczół z kolonii i okres głodówki
Uwaga: Opisane tutaj eksperymenty zostały przeprowadzone na Uniwersytecie w Newcastle (Wielka Brytania) z wykorzystaniem Bombus terrestris audax. Na każdą grupę badawczą wykorzystano kilka (2-3) kolonii zakupionych komercyjnie. Kolonie utrzymywano na blacie w warunkach laboratoryjnych (25 ± 2 °C i 28 ± 2% RH) w stałej ciemności i karmiono ad libitum roztworami cukru oraz pyłkiem zebranym przez pszczoły miodne.
- Odławiać poszczególne robotnice trutni za pomocą plastikowej probówki (długość 7 cm, średnica wewnętrzna 2,8 cm) z perforowanym plastikowym korkiem, otwierając bramkę kolonii na czas wystarczający jedynie do wyjścia jednej pszczoły i jej schwytania.
- Przed rozpoczęciem eksperymentu poddać wszystkie pszczoły indywidualnemu głodzeniu przez 2-4 hr w plastikowych probówkach, przechowując je w temperaturze pokojowej i całkowitej ciemności.
2. Przenoszenie pszczół do probówek przechowujących i faza habituacji
- Po okresie głodzenia przenieś trzmiela bezpośrednio z plastikowej probówki do rurki utrzymującej. Rurka utrzymująca to zmodyfikowana probówka do wirowania o pojemności 15 ml (długość: 119 mm; średnica: 17 mm) z wywierconym otworem o średnicy 4 mm na końcu oraz przymocowanym wewnątrz kawałkiem stalowej siatki (podstawa: 8 mm; wysokość: 30 mm), którą utrwalono poprzez stopienie plastiku rurki za pomocą podgrzanej stalowej igły sekcyjnej.
- Przymocuj rurkę utrzymującą z trzmielem do uchwytu polistyrenowego za pomocą wosku dentystycznego. Po obu stronach rurki utrzymującej zamocuj dwa kawałki tektury. Ma to na celu osłonę pszczoły przed bodźcami wizualnymi, które mogłyby zakłócić przebieg eksperymentu.
- Ustaw cyfrową kamerę mikroskopową 5 cm powyżej końcówki rurki utrzymującej i podłącz kamerę do kompatybilnego laptopa.
- Ustaw rurkę utrzymującą w taki sposób, aby w kadrze wideo znajdowało się co najmniej pierwsze 18 mm końcówki rurki. Przed rozpoczęciem eksperymentu przeprowadź 3-minutowy okres habituacji.
3. Faza przedtestowa: Podanie kropli sacharozy
- Podłącz strzykawkę do adaptera żeńskiego zawierającego kroplę roztworu sacharozy (~3,5 µl, 500 mM sacharozy rozpuszczonej w wodzie dejonizowanej). Podaj sacharozę do wnętrza końcówki rurki mocującej, aby pobudzić wysunięcie trąbki.
- Pozostaw trzmiela do 5 min na spożycie kropli sacharozy. Jeśli kropla nie zostanie spożyta, wycofaj trzmiela z eksperymentu.
- Rozpocznij nagrywanie wideo po okresie habituacji. W niniejszym badaniu aktywność trąbki była rejestrowana przy 26,7 klatkach/sek-1 z 25-krotnym powiększeniem.
4. Faza testowa: Prezentacja rozwiązania testowego
- Napełnić rurkę mikrokapilarną o pojemności 100 µl roztworem testowym. Połączyć ją z odcinkiem rurki silikonowej (długość 6 cm, średnica wewnętrzna 1 mm) i przymocować do mikromanipulatora.
- Połączyć rurkę za pomocą adaptera męskiego z drugą rurką silikonową (długość 6 cm, średnica wewnętrzna 4 mm), która pełni funkcję gruszki pipety.
- Ustawić rurkę mikrokapilarną w odległości 5-10 mm od końcówki rurki trzymającej. Delikatnie ścisnąć rurkę, aby utrzymać roztwór odżywczy na końcówce rurki mikrokapilarnej.
- Po spożyciu przez trzmiela kropli sacharozy niezwłocznie usunąć strzykawkę zawierającą 500 mM roztwór sacharozy.
- Rozpocząć 2-minutową fazę testową w momencie, gdy trąba trzmiela zetknie się z roztworem wewnątrz rurki mikrokapilarnej.
- Aby kontrolować ewentualne parowanie, napełnić dwie dodatkowe rurki mikrokapilarne sacharozą lub wodą i manipulować nimi dokładnie tak samo, jak podczas fazy testowej.
- Przed i po każdej próbie zeskanować poziomy cieczy wewnątrz rurki mikrokapilarnej za pomocą skanera przy rozdzielczości 600 dpi, aby zmierzyć ilość spożytego pokarmu (Rysunek 4A).
5. Analizy obrazu
- Wyznacz objętość zużytego roztworu za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów ImageJ (wersja 1.48).
- Wgraj plik obrazu i powiększ go (ok. 400%). Aby ustawić skalę odniesienia, wybierz narzędzie linii prostej i narysuj linię między dwoma końcami rurki mikrokapilarnej. Wybierz „Analyze”, a następnie „Set Scale”. W polu „Known distance” wprowadź całkowitą długość rurki, a w polu „Unit of length” odpowiednią jednostkę.
- Ponownie wybierz narzędzie linii prostej i narysuj linię między dwoma poziomami cieczy. Wybierz „Analyze”, a następnie „Measure”. W oknie wyników długość cieczy jest podana w kolumnie „Length”.
- Oblicz objętość zużytego roztworu, korzystając z wzoru:
gdzie
to długość rurki mikrokapilarnej, a 
oraz 
to odpowiednio zmierzone długości cieczy wewnątrz rurki mikrokapilarnej przed i po fazie testowej.
6. Analizy wideo
- Oceń zachowania żerowania podczas 2 min fazy testowej każdego nagrania wideo, korzystając z oprogramowania do rejestracji zdarzeń (patrz Tabela materiałów).
- Najpierw zdefiniuj zachowania żerowania (tj. elementy) w menu klas behawioralnych oprogramowania do rejestracji. Zachowania żerowania są następujące: (1) proboscis out/contact: proboscis jest wysunięty i pozostaje w kontakcie z roztworem wewnątrz rurki mikrokapilarnej (2) proboscis out/no contact: proboscis jest wysunięty, ale nie pozostaje w kontakcie z roztworem wewnątrz rurki mikrokapilarnej, (3) proboscis stowed: proboscis nie jest wysunięty, lecz schowany pod głową oraz (4) out of sight: trutień znajduje się poza kadrem wideo.
- Ustaw każde zachowanie jako „stan” (state) i „wzajemnie wykluczający się” (mutually exclusive) w menu właściwości, a następnie wykonaj ciągłe zapisy dla interwału 2 min. Odtwarzaj filmy w trybie spowolnionym (2 razy wolniej) dla większej precyzji.
- Zmierz prędkość cofania proboscis z roztworu testowego po pierwszym kontakcie pomiędzy dwiema kolejnymi klatkami (rozdzielonymi w prezentowanych tutaj nagraniach wideo o 37.5 msec), korzystając z oprogramowania do śledzenia ruchu w wideo (patrz Tabela materiałów).
- Prześlij plik wideo i przejdź do klatki, w której proboscis po raz pierwszy styka się z roztworem.
- Aby ustawić skalę referencyjną, wybierz narzędzie linii i narysuj linię odpowiadającą szerokości rurki mikrokapilarnej w klatce wideo. Kliknij prawym przyciskiem myszy na linii i wybierz „Calibrate measure”. Wprowadź szerokość rurki kapilarnej oraz odpowiednią jednostkę.
- Wybierz „Image”, a następnie „Coordinate system origin”. W nowym oknie kliknij na czubek proboscis i wybierz „Apply”.
- Wybierz narzędzie ręcznego przesuwania, kliknij prawym przyciskiem myszy na czubku proboscis w klatce wideo i wybierz „Track Path”. Przejdź do następnej klatki i ponownie dopasuj punkt śledzenia do czubka proboscis.
- Kliknij prawym przyciskiem myszy na punkcie śledzenia i wybierz „Configuration”. Wybierz „Complete Path” oraz „Speed” w sekcji pomiarów. Wybierz „Apply”. Prędkość zostanie wówczas wyświetlona.
Wyniki
Nową metodę stosuje się do badania reakcji żywieniowych na 1 M roztwór sacharozy, 1 M roztwór sacharozy z dodatkiem 1 mM chininy oraz wodę dejonizowaną. Natychmiastowe reakcje żywieniowe na każdy z tych trzech warunków określono poprzez pomiar czasu trwania kontaktów trąbki z roztworem testowym, częstotliwości epizodów jedzenia oraz szybkości cofania trąbki po pierwszym kontakcie podczas 2-minutowej fazy testowej. Objętość spożytego roztworu mierzy się również po zakończeniu fazy testowej. W niniejszym badaniu przyjęto kryterium epizodu żywieniowego wynoszące 5 sekund (Rycina 1, patrz plik dodatkowy), oparte na wcześniejszych badaniach Francisa i in.25, którzy użyli progu 5 sekund do scharakteryzowania zachowania cofania trąbki u Drosophila w odpowiedzi na związki odstręczające25. Zgodnie z tym podejściem, epizod żywieniowy zdefiniowano jako kontakt rozciągniętej trąbki z roztworem, który nie jest przerwany brakiem kontaktu trwającym 5 sekund lub dłużej.
W porównaniu do roztworu sacharozy i wody dejonizowanej, dodanie chininy do roztworu sacharozy wyraźnie odstręcza przed żerowaniem u trzmieli, ponieważ szybko się oddalają, gdy wykryją substancję odbiorczą jako nieprzyjemną (Wideo Rycina 1).
W tym eksperymencie zabiegi wywarły istotny wpływ na łączny czas trwania kontaktów z trąbką w fazie testowej (ANOVA na przekształconych logarytmicznie danych, F2,31 = 41, p <0,001). Łączny czas trwania kontaktu z roztworem sacharozy zawierającej chininę był istotnie skrócony w porównaniu do samej sacharozy (p <0,001), ale nie różnił się istotnie od samej wody zdejonizowanej (p = 0,219) (rysunek 2). Podobnie, zabiegi wywarły istotny wpływ na łączny czas trwania epizodów odżywiania się (ANOVA na przekształconych logarytmicznie danych, F2,31 = 27,95, p <0,001, rysunek 3A). Łączny czas trwania epizodów odżywiania się roztworem sacharozy zawierającej chininę był istotnie skrócony w porównaniu do samej sacharozy (p <0,001), ale nie różnił się istotnie od samej wody zdejonizowanej (p = 0,41). Zabiegi wywarły również istotny wpływ na częstotliwość epizodów odżywiania się (uogólniony model liniowy Poissona z funkcją łączącą logarytmiczną, zmiana dewiacji w porównaniu do rozkładu c2: p <0,050), przy czym liczba epizodów z roztworem sacharozy zawierającym chininę była istotnie większa w porównaniu do samej sacharozy (p <0,01), ale jedynie brzegowo istotnie różniła się od zabiegu z wodą zdejonizowaną (p = 0,055, z powodu jednej pszczoły brzęczki, która wykazała siedem epizodów odżywiania się wodą, rysunek 3B). Podobnie, szybkość cofnięcia trąbki istotnie różniła się między zabiegami (ANOVA na przekształconych logarytmicznie danych, F2,31 = 5,12, p <0,050). Pszczoły brzęczki cofają trąbkę od roztworu testowego istotnie szybciej po pierwszym kontakcie z roztworem sacharozy zawierającej chininę niż z samą sacharozą lub wodą zdejonizowaną (p <0,050, rysunek 3C). Wyniki te sugerują, że chinina wywołuje aktywne zachowanie unikania u pszczół brzęczek. Zabiegi wywarły również istotny wpływ na całkowitą objętość spożytego roztworu (ANOVA na przekształconych logarytmicznie danych, F2,32 = 62,5, p <0,001), przy czym spożycie roztworu sacharozy zawierającej chininę było zmniejszone w porównaniu do samej sacharozy (p <0,001), ale nie różniło się istotnie od wody zdejonizowanej (p = 0,457) (rysunek 4B). Objętość roztworu odparowana z kapilary w czasie testu była pomijalna. W warunkach laboratoryjnych (25 ±2°C i 28 ±2% RH), odparowanie wynosiło od 0,033 do 0,883 µl, ze średnią wartością 0,276 µl dla wody zdejonizowanej i 0,171 µl dla 1 M sacharozy.
W tym testcie nie można zapobiec kontaktom między czułkami a roztworem badawczym. Niemniej jednak odsetek trutni wykorzystujących czułki do próbowania roztworu pokarmowego w trakcie fazy testowej (sacharoza: 46,1%, sacharoza z chininą: 60,0% oraz woda zdejonizowana: 33,3%) nie różni się istotnie pomiędzy poszczególnymi zabiegami (binomialny model uogólniony GLM, zmiana dewiacji w porównaniu do c2 rozkład p = 0.450). Nie stwierdzono wpływu zabiegów na czas między pierwszym kontaktem czułkowym a roztworem testowym a pierwszym kontaktem trąbki (mediana: 2,67 s dla sacharozy; 1,10 s dla sacharozy z chininą; 0,80 s dla wody dejonizowanej, ANOVA na danych przekształconych logarytmicznie, F2,13 = 0.620, p = 0,550). Ponadto odsetek trzmieli wysuwających trąbkę w celu skosztowania roztworu testowego pozostaje stały w różnych zabiegach (sacharoza: 66,7%; sacharoza z chininą: 50,0%; woda dejonizowana: 52,2%; binomialny uogólniony model liniowy, zmiana dewiacji w porównaniu do c2 rozkład: p = 0,840). Łącznie te wyniki sugerują, że anteny odgrywają niewielką rolę w wykrywaniu toksyn w tym teście.
W oddzielnym eksperymencie sprawdzano, czy konieczne jest testowanie pszczół przez okres dłuższy niż 2 min. Ilość spożywanego pokarmu testowano za pomocą roztworów 1 M sacharozy lub 1 mM chininy w 1 M sacharozie w dwóch warunkach: 2-minutowy okres testowy i 10-minutowy okres testowy. W obu zabiegach całkowite spożycie pokarmu nie różniło się istotnie w zależności od czasu trwania testu, a także nie wystąpiły istotne interakcje między okresem testowym a zabiegiem (N = 6–13, ANOVA na danych przekształconych logarytmicznie; wpływ zabiegów: F1,31 = 54,8, p <0,001; wpływ okresu testowego: F1,31 = 0, p = 0,979; wpływ interakcji: F = 0,1, p = 0,457). Podsumowując, 2-minutowy okres testowy jest wystarczający do oceny wpływu roztworu na całkowitą ilość pokarmu spożywanego przez trzmiele oraz do wykrywania efektów odstręczających substancji toksycznych lub odpornościowych w tym teście. Zatem poprzez pomiar spożycia pokarmu i analizę zachowania podczas jedzenia możliwe jest skorelowanie całkowitego spożycia pokarmu z dokładną strukturą procesu jedzenia podczas testu.
Ryc. 1: Okresy opóźnień między kontaktami trąbki w pierwszych 2 minutach testu żywienia. Wykresy gęstości okresów czasowych oddzielających poszczególne kontakty trąbki z roztworem sacharozy 1 M, roztworem sacharozy 1 M + chinina 1 mM oraz wodą. Przedstawione dane pochodzą odpowiednio od 13, 10 i 11 pszczół. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Czas trwania kontaktów rurki odżywczym w pierwszych 2 minutach testu żywieniowego. Wykresy gęstości czasu trwania kontaktów rurki odżywczym u trzmieli odżywiających się 1 M sacharozą, 1 M sacharozą + 1 mM chininy lub wodą. Liczebność próby jak na rycinie 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3: Aktywność rurki odżywczego u trzmieli odżywiających się 1 M sacharozą, 1 M sacharozą + 1 mM chininą lub wodą. (A) Łączny czas trwania epizodów odżywiania się w trakcie fazy testowej, (B) częstotliwość epizodów odżywiania się oraz (C) szybkość cofania rurki odżywczego po pierwszym kontakcie. Oznaczenia literowe wskazują istotne różnice: różne litery oznaczają P <0,05. Wykresy pudełkowe przedstawiają medianę (czarne belki), najniższe i najwyższe punkty danych wciąż mieszczące się w zakresie 1,5 międzykwartylowym (wąsy) oraz punkty odstające (kółka). Liczebność próbki jak na rycinie 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 4: Chinina hamuje żywienie się u trzmieli. (A) Otrzymane skanowanie mikrokaptki pokazujące poziom roztworu sacharozy 1 M lub sacharozy 1 M w połączeniu z chininą 1 mM (oznaczony czarną linią) odpowiednio przed i po fazie testowej. (B) Spożycie sacharozy 1 M, sacharozy 1 M z dodatkiem chininy 1 mM lub samej wody dejonizowanej przez trzmiele po fazie testowej. Oznaczenia literowe wskazują istotne różnice: różne litery oznaczają P <0,001. Wykresy pudełkowe przedstawiają medianę (czarne belki), najniższe i najwyższe punkty danych jeszcze mieszczące się w zakresie 1,5 IQR (wąsy) oraz wartości odstające (kółka). Liczebność próby jak na rycinie 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rysunek wideo 1: Nagrania wideo aktywności trąbki w kierunku (A) 1 M sacharozy, (B) 1 M sacharozy z dodatkiem 1 mM chininy oraz (C) wody dejonizowanej w fazie testowej.
Dyskusja
Dzięki temu nowatorskiemu testowi behawioralnemu wykazano, że chinina zniechęca do żerowania trzmiela płowoogoniastego. Skrócony czas kontaktu z trąbką i częstotliwość karmienia wodą lub roztworem sacharozy z chininą jest tutaj interpretowany jako odmowa rozpoczęcia dalszego karmienia roztworami nieodżywczymi lub potencjalnie toksycznymi. Po dodaniu chininy do 1 M roztworu sacharozy trzmiele nie tylko zmniejszają objętość spożywanego roztworu, ale także szybciej chowają trąbkę, skracając w ten sposób czas kontaktu między aparatem gębowym a roztworem zawierającym toksynę. Łącznie wyniki te sugerują, że chinina jest odbierana przez komórki receptorów smakowych na aparatach gębowych trzmiela, co zostało już wcześniej zidentyfikowane u pszczoły miodnej9. Chinina jest toksyną dla owadów, która wywołuje złe samopoczucie u pszczoły miodnej10 i powalenie u komara malarii (Anopheles gambiae)23. Test ten może doprowadzić do identyfikacji niektórych odstraszających i potencjalnie toksycznych związków, które są odbierane przez komórki receptorów smaku na aparatach gębowych trzmieli.
Bardzo ważne jest, aby rurka mikrokapilarna była wypełniona wystarczającą objętością roztworu testowego, aby wystarczyła na całą fazę badania. Zaleca się napełnienie co najmniej trzech czwartych rurki mikrokapilarnej (np. 70-80 μl). Należy jednak zachować ostrożność, aby nie wypełnić całkowicie rurki mikrokapilarnej, aby zmniejszyć ryzyko rozlania podczas procesu skanowania i mocowania rurki mikrokapilarnej do aparatury doświadczalnej. Należy również zachować ostrożność podczas podawania trzmielowi kropli sacharozy o stężeniu 500 mM, aby eksperymentator nie dopuścił do wycieku kropli do probówki.
Otwór o średnicy 4 mm na końcu rurki przytrzymującej jest wystarczająco duży, aby dorosły trzmiel robotnica mógł w naturalny sposób wysunąć swoją trąbkę w kierunku roztworu testowego. Możliwe jest jednak, że trzmiele mogą posmakować roztworu za pomocą czułków przed wysunięciem trąbki. Może to wpływać na prawdopodobieństwo rozszerzenia trąbki, ponieważ PER można wywołać u trzmieli poprzez stymulację ich czułków roztworem cukru15. W rzeczywistości czułki błonkoskrzydłych, takie jak osa pasożytnicza (Trissolcus brochymenae)24 lub pszczoła miodna13, są wyposażone w zmysły smakowe, co pozwala im odczuwać smak cukrów i toksyn, takich jak chinina. W związku z tym początkowe kontakty czułków z roztworami zawierającymi wysoce odstraszające związki, takie jak chinina, mogą również zmniejszyć motywację trzmiela do wydłużenia trąbki, a tym samym wpłynąć na wskaźnik sukcesu eksperymentu. Chociaż nie można kontrolować kontaktu antenowego z roztworem testowym, w niniejszym badaniu nie stwierdzono żadnego znaczącego wpływu kontaktu antenowego na wydłużenie trąbki w kierunku roztworu testowego. W tym teście natychmiastowe ustawienie rurki mikrokapilarnej po fazie przed badaniem, gdy czułki trzmieli nadal znajdują się w probówce, może zmniejszyć możliwość skosztowania roztworu testowego przez trzmiele za pomocą czułków.
Główne ograniczenie tego testu pojawia się podczas śledzenia wycofania się trąby z roztworu testowego po pierwszym kontakcie z trąbką za pomocą oprogramowania wideo do śledzenia ruchu. Materiał wideo pokazuje tylko ruch 2D trąbki, więc dane wyjściowe pomiaru prędkości mogą być niedoszacowane lub zawyżone. Jednak po pewnych modyfikacjach ten aspekt testu można poprawić.
Test ten można wykorzystać do obserwacji naturalnych reakcji żywieniowych na roztwory zawierające różne związki, w tym naturalnie występujące metabolity wtórne roślin. Obserwacja natychmiastowych reakcji na karmienie za pomocą tego testu dostarcza szczegółowych informacji o tym, w jaki sposób trzmiele wykrywają te związki. Jest to korzystne w porównaniu z istniejącymi metodami "go-no go", takimi jak PER18,19 i w porównaniu z testamidwuwyboru7 , ponieważ metoda ta wytwarza kilka miar reakcji behawioralnej, w tym spożycie pokarmu podczas dyskretnego karmienia.
Pomiar kilku parametrów jednocześnie pozwala na lepszą ocenę smakowitości związku. Na przykład w naszym teście trzmiele unikają spożywania wody lub roztworu sacharozy z chininą. Retrakcja trąbki może być spowodowana zmianą odpowiedzi komórek receptora cukru12,13. Nasz test pokazuje, że trzmiele chowają trąbkę szybciej po kontakcie z roztworem sacharozy i chininy niż samą wodą; Może to sugerować, że chinina wpływa na odrębny zestaw neuronów, a także hamuje neurony wyczuwające cukier9,12,13,25.
Nasz test pozwala na analizę czasowego wzorca reakcji behawioralnych podczas karmienia. Podobny protokół, w którym mierzy się czas konsumpcji i liczbę napadów, został już wdrożony w celu oceny reakcji żywieniowej Drosophila na cukry odżywcze i nieodżywcze26. Przewidujemy, że pszczoły będą wykazywać bardziej wiarygodną reakcję na stymulanty żywieniowe w naszym teście niż w innych metodach, takich jak PER, ponieważ pszczoły mogą swobodnie poruszać się w probówce21. Technika ta pozwoli na wyczerpującą analizę progów smakowych składników odżywczych i toksyn, aby wyjaśnić mechanizmy żerowania trzmieli i potencjalnie innych gatunków pszczół.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana z grantu Leverhulme Trust (RPG-2012-708) oraz grantu BBSRC (BB/M00709X/1) dla GAW.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Rodziny trzmieli | Koppert Biological Systems | NATUPOL Ul | |
| Cyfrowa kamera mikroskopowa | Dino-lite Europe | AM4815ZT | Dino-Lite Edge |
| 100 μ l rurka mikrokapilarna | Blaubrand IntraEND | 709144 | |
| 15 ml | Fisher Scientific 11849650 | ||
| 1 ml jednorazowa plastikowa strzykawka typu luer | Slip BD | 300013 | |
| Laptop Dell Latitude 3550 | Dell | Sprawdź kompatybilność z oprogramowaniem wideo | |
| Canon CanoScan LiDE 120 | Canon | Sprawdź kompatybilność z komputerem/laptopem | |
| Observer w wersji 5.0.25 | Wersja oprogramowania Noldus | ||
| Kinovea 0.8.15 | Kinovea | ||
| Rurki silikonowe | 6 cm długość, 1 mm wewnątrz i Oslash; & 6 cm długość, 4 mm wewnątrz i Oslash; | ||
| Męski luer x1/16" standardowy adapter z kolczastego węża | Cole-Parmer | TW-45518-22 | |
| Żeński luer x 1/16" standardowy adapter z kolczastego węża z kolczastego | Cole-Palmer | TW-45508-12 | |
| Siatka stalowa | 0,5 mm rozmiar oczek | ||
| Sacharoza (klasa II) | Sigma-Aldrich | S5391 | |
| Chlorowodorek chininy dwuwodny | Sigma-Aldrich | Q1125 | |
| ImageJ wersja oprogramowania 1.48 | ImageJ |
Bibliografia
- Adler, L. S. The ecological significance of toxic nectar. Oikos. 91, 409-420 (2000).
- Hagler, J. R., Buchmann, S. L. Honey bee (Hymenoptera, Apidae) foraging responses to phenolic-rich nectars. J Kansas Entomol Soc. 66, 223-230 (1993).
- Irwin, R. E., Cook, D., Richardson, L. L., Manson, J. S., Gardner, D. R. Secondary compounds in floral rewards of toxic rangeland plants: Impacts on pollinators. J Agr Food Chem. 62, 7335-7344 (2014).
- Praz, C. J., Mueller, A., Dorn, S. Specialized bees fail to develop on non-host pollen: Do plants chemically protect their pollen. Ecology. 89, 795-804 (2008).
- Baker, H. G., Baker, I. Studies of nectar-constitution and pollinator-plant coevolution. Coevolution of animals and plants. Gilbert, L. E., Raven, P. H. , University of Texas Press. 100-140 (1975).
- Stout, J. C., Parnell, J. A. N., Arroyo, J., Crowe, T. P. Pollination ecology and seed production of Rhododendron ponticum in native and exotic habitats. Biodivers Conserv. 15, 755-777 (2006).
- Tiedeken, E. J., Stout, J. C., Stevenson, P. C., Wright, G. A. Bumblebees are not deterred by ecologically relevant concentrations of nectar toxins. J Exp Biol. 217, 1620-1625 (2014).
- Ayestaran, A., Giurfa, M., de Brito Sanchez, M. G. Toxic but drank: Gustatory aversive compounds induce post-ingestional malaise in harnessed honeybees. Plos One. 5, (2010).
- Wright, G. A., et al. Parallel reinforcement pathways for conditioned food aversions in the honeybee. Curr Biol. 20, 2234-2240 (2010).
- Hurst, V., Stevenson, P. C., Wright, G. A. Toxins induce 'malaise' behaviour in the honeybee (Apis mellifera). J Comp Physiol A. 200, 881-890 (2014).
- Whitehead, A. T., Larsen, J. R. Electrophysiological responses of galeal contact chemoreceptors of Apis mellifera to selected sugars and electrolytes. J Insect Physiol. 22, 1609-1616 (1976).
- de Brito Sanchez, M. G., et al. The tarsal taste of honey bees: behavioral and electrophysiological analyses. Front Behav Neurosci. 8, 25(2014).
- de Brito Sanchez, M. G., Giurfa, M., Mota, T. R. D., Gauthier, M. Electrophysiological and behavioural characterization of gustatory responses to antennal 'bitter' taste in honeybees. European Journal of Neuroscience. 22, 3161-3170 (2005).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera). J Comp Psychol. 97, 107-119 (1983).
- Laloi, D., et al. Olfactory conditioning of the proboscis extension in bumble bees. Entomol Exp Appl. 90, 123-129 (1999).
- Smith, B. H., Burden, C. M. A proboscis extension response protocol for investigating behavioral plasticity in insects: Application to basic, biomedical, and agricultural Research. J Vis Exp. , (2014).
- Felsenberg, J., Gehring, K. B., Antemann, V., Eisenhardt, D. Behavioural Pharmacology in classical conditioning of the proboscis extension response in honeybees (Apis mellifera). J Vis Exp. , (2011).
- Pankiw, T., Page, R. E. Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.). Journal of comparative physiology. A, Neuroethology, sensory, neural, and behavioral physiology. 189, 675-684 (2003).
- Scheiner, R., Page, R. E., Erber, J. Sucrose responsiveness and behavioral plasticity in honey bees (Apis mellifera). Apidologie. 35, 133-142 (2004).
- Kessler, S. C., et al. Bees prefer foods containing neonicotinoid pesticides. Nature. 521, 74-76 (2015).
- Mommaerts, V., Wackers, F., Smagghe, G. Assessment of gustatory responses to different sugars in harnessed and free-moving bumblebee workers (Bombus terrestris). Chem Senses. 38, 399-407 (2013).
- Chittka, L., Dyer, A. G., Bock, F., Dornhaus, A. Psychophysics: Bees trade off foraging speed for accuracy. Nature. 424, 388(2003).
- Kessler, S., González, J., Vlimant, M., Glauser, G., Guerin, P. M. Quinine and artesunate inhibit feeding in the African malaria mosquito Anopheles gambiae: the role of gustatory organs within the mouthparts. Physiol Entomol. 39, 172-182 (2014).
- Iacovone, A., Salerno, G., French, A. S., Conti, E., Marion-Poll, F. Antennal gustatory perception and behavioural responses in Trissolcus brochymenae females. J Insect Physiol. 78, 15-25 (2015).
- French, A. S., et al. Dual mechanism for bitter avoidance in Drosophila. J. Neurosci. 35, 3990-4004 (2015).
- LeDue, E., Chen, Y. -C., Jung, A. Y., Dahanukar, A., Gordon, M. D. Pharyngeal sense organs drive robust sugar consumption in Drosophila. Nat. Commun. 6, 6667(2015).
Przedruki i uprawnienia
