Związki zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC) stanowią poważne zagrożenie dla środowiska wodnego. Miejskie oczyszczalnie ścieków w znacznym stopniu przyczyniają się do estrogenowej siły działania wód powierzchniowych. Przedstawiona w artykule metodologia pozwala na ocenę skuteczności i przydatności procesów oczyszczania ścieków w odniesieniu do usuwania EDC.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie zestawu metod chemicznych i ekotoksykologicznych do oceny skuteczności procesów oczyszczania ścieków w celu usunięcia siły działania estrogenów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Związki zaburzające gospodarkę hormonalną stanowią poważne zagrożenie dla środowiska wodnego. Etynyloestradiol (EE2) i estron (E1) zostały niedawno wpisane na listę obserwacyjną zanieczyszczeń środowiska w ramach Europejskiej Ramowej Dyrektywy Wodnej. Miejskie oczyszczalnie ścieków w znacznym stopniu przyczyniają się do estrogenowej siły działania wód powierzchniowych. Dużą część siły estrogenowej ścieków z oczyszczalni ścieków (WWTP) można przypisać odprowadzaniu estrogenów steroidowych, w tym estradiolu (E2), EE2 i E1, z powodu niepełnego usunięcia tych substancji w oczyszczalni. Ocena skuteczności procesów oczyszczania ścieków wymaga ilościowego oznaczenia poszczególnych substancji, najczęściej podejmowanego przy użyciu metod analizy chemicznej. Do najczęściej stosowanych metod należy chromatografia gazowa ze spektrometrią mas (GCMS/MS) lub chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (LCMS/MS) z wykorzystaniem monitorowania reakcji wielokrotnych (MRM). Chociaż jest to bardzo przydatne do celów regulacyjnych, ukierunkowana analiza chemiczna może dostarczyć jedynie danych na temat monitorowanych związków (i określonych metabolitów). Metody ekotoksykologiczne dodatkowo zapewniają, że wszelkie wytworzone produkty uboczne lub nieznane związki estrogenowe są również oceniane poprzez pomiar ich aktywności biologicznej. Dostępnych jest wiele testów biologicznych in vitro, w tym Yeast Estrogen Screen (YES), do pomiaru aktywności estrogenowej próbek ścieków. Analiza chemiczna w połączeniu z testami biologicznymi in vivo i in vitro stanowi użyteczny zestaw narzędzi do oceny skuteczności i przydatności procesów oczyszczania ścieków w odniesieniu do estrogenowych związków zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego. W artykule wykorzystano zestaw testów chemicznych i ekotoksykologicznych do oceny konwencjonalnych, zaawansowanych i powstających procesów oczyszczania ścieków w badaniach laboratoryjnych i terenowych.
Wprowadzenie
Obawy dotyczące negatywnego wpływu związków zaburzających gospodarkę hormonalną na zdrowie reprodukcyjne dzikich zwierząt skłoniły Unię Europejską do umieszczenia dwóch substancji estrogenowych (estradiolu i etynyloestradiolu) na "liście obserwacyjnej" zgodnie z Ramową Dyrektywą Wodną (WFD). EDC obejmuje różne klasy chemiczne, w tym naturalne i syntetyczne estrogeny steroidowe, leki, pestycydy i chemikalia przemysłowe oraz składniki produktów konsumenckich o znanym negatywnym wpływie na dziką przyrodę. Niektóre z tych związków mogą potencjalnie wpływać na zdrowie człowieka1.
Badania wykazały, że ścieki z oczyszczalni ścieków są estrogenne dla ryb2, a w konsekwencji wiele wód, do których odprowadzane są również ścieki estrogenne dla ryb3. Po raz pierwszy wykazano to w krajowych badaniach w Wielkiej Brytanii, które wykazały zwiększone stężenie witellogeniny (żeńskiego specyficznego prekursora białka żółtka4) we krwi dzikich samców ryb i wysokie rozpowszechnienie interpłciowości (rozwój jaj i/lub żeńskich przewodów rozrodczych w jądrach samców ryb) u normalnie gonochorystycznych gatunków ryb5,6.
Konwencjonalne oczyszczanie ścieków to zazwyczaj trzyetapowy proces składający się z wstępnego przesiewu, po którym następuje pierwotne i wtórne oczyszczanie, które usuwa zarówno rozpuszczoną, jak i zawieszoną materię organiczną. Skuteczność usuwania poszczególnych EDC zależy od właściwości fizykochemicznych substancji oraz od skuteczności zastosowanego procesu oczyszczania. Dla wielu osób usunięcie EDC poprzez adsorpcję i degradację biologiczną może być znaczące, ale niepełne. Obróbka trzeciego stopnia, taka jak filtracja piaskowa, może być skuteczna w zwiększaniu usuwania EDC7, podczas gdy zaawansowane oczyszczanie z wykorzystaniem zaawansowanego utleniania (na przykład ozonu) lub węgla aktywnego może być skuteczne w osiągnięciu prawie całkowitego usunięcia7
.Ocena każdej nowej technologii oczyszczania ścieków musi określić skuteczność proponowanego procesu usuwania EDC. Zestaw testów, w tym ukierunkowana analiza chemiczna wraz z badaniami ekotoksykologicznymi, wykorzystującymi testy biologiczne in vivo i in vitro, dostarcza kompleksowych danych do tego celu. Chociaż jest to bardzo przydatne do celów regulacyjnych, ukierunkowana analiza chemiczna może dostarczyć jedynie danych na temat monitorowanych związków (i określonych metabolitów). Testy biologiczne dodatkowo umożliwiają "wykrycie" niepożądanych skutków metabolitów i produktów ubocznych przemiany ścieków wytwarzanych przez oczyszczanie, które w przeciwnym razie nie zostałyby wykryte8,9. W artykule opisano zastosowanie zestawu laboratoryjnych testów chemicznych i ekotoksyczności do oceny skuteczności szeregu zaawansowanych i powstających procesów oczyszczania ścieków w usuwaniu estrogenowej siły ścieków surowych i oczyszczonych oraz wód odbiorczych.
Protokół
Oświadczenie etyczne: Protokoły oceny aktywności zakłócającej działanie układu endokrynnego chemicznych substancji i mieszanin u ryb zostały zatwierdzone przez Zespół ds. Dobrostanu Zwierząt i Etyki Badawczej Brunel University London (AWERB) oraz przez Biuro Główne Wielkiej Brytanii na podstawie ustawy o zwierzętach (Procedury Badawcze) z 1986 roku.
1. Pobieranie, konserwacja i ekstrakcja próbek wody
- Zbieranie i konserwacja próbek
- Przed użyciem oczyść butelki odpowiednim środkiem czyszczącym o działaniu powierzchniowo czynnym. Po oczyszczeniu przepłucz butelki wodą, odcedź i wysusz.
- Zbieraj próbki w szklanych butelkach o pojemności 2 L zawierających środek konserwujący składający się z 0,5 g azotanu(V) miedzi(II) i 6 ml roztworu kwasu solnego o stężeniu 3,6 M. Przechowuj próbki poniżej 10 °CWyizoluj i przeanalizuj tak szybko, jak to możliwe, po zebraniu i zabezpieczeniu.
- Ekstrakcja i oczyszczanie próbek (do analizy estrogenów steroidowych)10
- Ekstrakcja na fazie stałej (SPE)
- Przed ekstrakcją, w celu zmniejszenia zawartości zawiesiny, przefiltruj próbki wody za pomocą 1 µm papierowy filtr o rozmiarze porów
- Po przefiltrowaniu dodaj do próbek szczytowych standard wewnętrzny 100 µl dodanie roztworu wewnętrznego standardu znakowanego deuterem zawierającego 2,4,16,16-d4-estron: 2,4,16,16-d4-17β-estradiol (E2): oraz 2,4,16,16-d4-17α-etylowinilostradiol (EE2) (wszystkie w 40 µg/L do metanolu) do 1000 ml efluentu (lub 100 ml influentu), uzyskując wewnętrzną dawkę 2 ng/L dla próbek efluentu ściekowego i 20 ng/L dla próbek influentu ściekowego.
- Przymocuj jednorazowe wkłady zaworowe, kartusze do ekstrakcji na fazie stałej (SPE) ze styrenu i divinylbenzenu oraz zbiorniki do kartuszy do urządzenia do SPE. Włącz pompę próżniową, aby sprawdzić szczelność urządzenia.
- Do każdej zbiorniczki dodaj pipetą 5 ml octanu etylu w celu kondycjonowania kolumn. Włącz pompę próżniową (ciśnienie poniżej 10 inHg, aby zapewnić przepływ mniejszy niż 10 ml na minutę) i przesącz ciecz. Nie dopuszczaj do wyschnięcia kolumn SPE. Powtórz czynność, przepuszczając kolejno 5 ml metanolu, a następnie 5 ml wody.
- Dopełnij każdy zbiornik kartusza wodą i podłącz 1/8" Rury PTFE łączące zbiorniki wkładu i szklane butelki na próbki. Włącz próżnię przy przepływie mniejszym niż 10 ml na minutę i przepuść całą próbkę przez wkład. Opróżniaj pojemnik na odpady w miarę potrzeby.
- Starannie osusz kartyki SPE pod próżnią (lub przy użyciu powietrza lub azotu), aż do zmiany koloru zawartości kartykinp. od brąznej ciemnej do brąznej jasnej
- Umieść czyste, suche fiolki do zbierania próbek o pojemności 10 ml na statywie i wstaw je do układu ekstrakcyjnego. Sprawdź, czy każdy wkład jest ustawiony nad fiolką. Pobierz pipetą 8 ml dichlorometanu do każdego zbiornika z próbką, włącz pompę próżniową (prędkość przepływu mniejsza niż 10 ml na minutę) i przesącz ciecz do fiolek zbiorczych.
- Usuń fiolki 10 ml z manifoldu SPE i skorzystaj z koncentratora, aby zmniejszyć objętość do 1 ml. Przenieś każdy próbkę do fiolki do dozownika automatycznego i dalej skoncentruj do 100 µl za pomocą urządzenia do odparowania azotem
- Przed ekstrakcją, w celu zmniejszenia zawartości zawiesiny, przefiltruj próbki wody za pomocą 1 µm papierowy filtr o rozmiarze porów
- Oczyszczanie metodą chromatografii żelowej (GPC)
- Wstrzyknąć 95 µl próbki eluatów do HPLC wyposażonego w GPC w warunkach opisanych w Tabela 1. Skoncentrować ekstrakt GPC do 200 µl za pomocą koncentratora i aparatu do odparowania pod strumieniem azotu, a następnie uzupełnić do objętości 2,0 ml heksanem.
- oczyszczanie metodą SPE
- Przymocuj jednorazowe wkłady zaworów, kartusze aminopropylowe i zbiorniki do kartuszy do zestawu do ekstrakcji na kolumnach (SPE). Umieść czyste, suche szklane fiolki zbiorcze o pojemności 10 ml w statywie i umieść je wewnątrz zestawu do ekstrakcji. Pobierz pipetą 2 ml heksanu do każdego zbiornika w celu kondycjonowania kartuszy. Pozwól cieczy przepłynąć przez kartusze.
- Pipetuj ekstrakt próbek GPC do zbiornika i ponownie pozwalaj cieczy przepływać przez kartusz. Zbierz eluat z próbki w fiolce i usuń ją z kolektora. Nie wyrzucaj eluatów.
- Umieść nową, czystą, suchą fiolkę do zbierania o pojemności 10 ml na statywie i wstaw ją do układu ekstrakcyjnego. Aby przemyć kolumnę, dodaj 2 ml octanu etylu w heksanie (30% v/v) do zbiornika i przesącz ciecz przez kolumnę. Powtórz czynność, dodając kolejne 2 ml octanu etylu w heksanie, odrzucając wszystkie przemywki.
- Umieścić ponownie oryginalny fiolkę do zbierania o pojemności 10 ml (krok 1.2.3.2) w statywie wewnątrz układu ekstrakcyjnego. Pobrać pipetą 2 ml octanu etylu w acetonie (50% v/v) i wprowadzić do zbiornika, włączyć pompę próżniową (ciśnienie poniżej 2 inHg, aby zapewnić przepływ o szybkości mniejszej niż 2 ml na minutę) i przesączyć ciecz do fiolki. Powtórzyć proces, używając kolejnych 2 ml octanu etylu.
- Usuń fiolkę z próbką i za pomocą koncentratora zmniejsz objętość ekstraktu do 1 ml. Przenieś próbkę do mniejszej fiolki szklanej i przy użyciu urządzenia do odparowywania pod strumieniem azotu odparuj ekstrakt do początkowego wysuszenia.
- Dodaj 100 µl metanolu i dokładnie wymieszać. Przenieść ekstrakt do fiolki do dozowania automatycznego (z wkładką o pojemności 0,3 ml) i zamknąć fiolkę. Przeanalizować próbki za pomocą LCMS/MS (patrz sekcja 2).
- Ekstrakcja na fazie stałej (SPE)
| Kolumna: | PL gel, 50 A, 300 x 7,5 mm, 5 µm |
| Kolumna ochronna: | PL gel, 50 x 7,5 mm, 5 µm |
| Faza ruchoma: | Dichlorometan |
| Szybkość przepływu: | 1 ml na min |
| Temperatura kolumny: | 25 °C |
| Detektor UV: | 210 nm |
| Objętość dozowania: | 95 µl |
| Tryb dozowania: | Standardowy |
| Szybkość poboru: | 500 ml na min |
| Szybkość wyrzutu: | 500 ml na min |
| Pozycja poboru: | 3 mm |
| Fracja zebrana: | 3 ml frakcji (7–10 min) w fiolkach 10 ml |
Tabela 1. Warunki i parametry oczyszczania ekstraktów z prób wody ściekowej metodą chromatografii żelowej (GPC). Tabela zawiera szczegółowe informacje dotyczące kolumny GPC, fazy ruchomej, temperatury, objętości dozowania oraz długości fali detektora.
- Ekstrakcja próbki (dla testu detekcji estrogenów u drożdży)
- Przefiltruj próbki zgodnie z opisem w sekcji 1.2.1.1. Zamocuj jednorazowe wkłady zaworowe, karty C18 do oczyszczania fazy stałej (SPE) oraz zbiorniki do karty na urządzeniu SPE. Włącz pompę próżniową, aby sprawdzić szczelność układu.
- Pipetą dodaj po 5 ml metanolu do każdego zbiornika w celu kondycjonowania karty C18. Włącz próżnię (do około 5 inHg, aby uzyskać przepływ ok. 5 ml na minutę) i pozwalaj cieczy przepływać, robiąc 1-minutową przerwę w połowie procesu. Nie dopuszczaj do wyschnięcia karty. Powtórz czynność, używając wody o czystości HPLC lub wody dwukrotnie zdestylowanej (ddH2O). Ponownie nie dopuszczaj do wyschnięcia.
- Wykonaj ekstrakcję próbek wodnych zgodnie z opisem w sekcji 1.2.1.4. Kontynuuj działanie próżni przez co najmniej 30 minut, aby dokładnie wysuszyć karty.
- Umieść czyste, suche fiolki zbiorcze o pojemności 10 ml na stojaku w układzie ekstrakcyjnym. Sprawdź, czy każdy wkład znajduje się nad fiolką. Dodaj po 5 ml metanolu do każdego zbiornika. Włącz próżnię (maksymalny przepływ 5 ml/min) i pozwól cieczy przepłynąć przez kartę do fiolki, robiąc 2-minutową przerwę w połowie procesu.
- Przed analizą za pomocą testu YES skoncentruj ekstrakt do początkowego wyschnięcia przy użyciu azotu i rozpuść ponownie w 500–1000 µl etanolu. Zamknij fiolki szczelnie, aby zapobiec parowaniu, i przechowuj w temperaturze 4 °C (w lodówce bez iskrzenia).
2. Analiza chemiczna metodą LCMS/MS
- Dostrajaj warunki pracy systemu LCMS/MS zgodnie z instrukcjami producenta.
- Przeanalizuj roztwory wzorców kalibracyjnych, ekstrakty próbek, próbki ślepe oraz próbki kontrolne jakości analizy (AQC) przy użyciu warunków chromatografii cieczowej i spektrometrii mas, monitorując przejścia jonowe szczegółowo opisane w Tabeli 2. Oznacz stężenie estrogenów steroidowych w ekstrakcie próbki, stosując standardy wewnętrzne10.
| LCMS | |||||
| Chromatografia cieczowa | |||||
| Kolumna: | C18(2), 150 x 4,6 mm, 5 μm. | ||||
| Objętość wstrzykiwania: | 20 µl | ||||
| Przepływ: | 0,5 ml na minutę. | ||||
| Faza ruchoma: | Rozpuszczalnik A: woda zawierająca 0,1% amoniaku. | ||||
| Rozpuszczalnik B: acetonitryl. | |||||
| Program gradientowy: | |||||
| Czas (min) | 0 | 10 | 18 | 24 | 28 |
| Stosunek rozpuszczalników A:B | 90:10:00 | 50:50:00 | 0,479167 | 0,479167 | 90:10:00 |
| Spektrometria mas | |||||
| Źródło: | Elektrosprej (jon ujemny) | ||||
| Gaz i źródło: | CUR: 20 psi, GS1: 70 psi, GS2: 30 psi | ||||
| TEM: 600 °C, gaz CAD 5 i napięcie IonSpray -900 | |||||
| Przejścia MRM: | |||||
| E1: | 269/145 & 269/143 | ||||
| E2: | 271/145 & 271/143 | ||||
| EE2: | 295/145 & 295/143 | ||||
| E1-D4 : | 273/147 | ||||
| E2-D4: | 275/147 | ||||
| EE2-D4: | 299/145 | ||||
Tabela 2. Szczegółowe parametry i warunki analizy estrogenu steroidowego metodą LCMS/MS w ekstraktach ścieków. Tabela zawiera objętość wstrzykiwania próbki i przepływ, warunki fazy ruchomej oraz gradient.
3. Aktywność estrogenowa z zastosowaniem in vitro testu drożdżowego wykrywania estrogenów (YES)8
- Przygotuj i przechowuj minimalne medium oraz składniki medium zgodnie z tabelą 3 (a) do (g).
| (a) Minimalna pożywka (pH 7,1): |
| Przygotuj roztwór Fe2(SO4)3, dodając 40 mg Fe2(SO4)3 do 50 ml wody dwukrotnie destylowanej (ddH2O) |
| Dodaj 1 L ddH2O do 2 L szklanego cylinderu |
| Dodaj do cylindra następujące składniki: |
| 13,61 g KH2PO4 |
| 1,98 g (NH4)2SO4 |
| 4,2 g KOH |
| 0,2 g MgSO4 |
| 1 ml roztworu Fe2(SO4)3 |
| 50 mg L-leucyny |
| 50 mg L-histydyny |
| 50 mg adeniny |
| 20 mg L-arginyny-HCl |
| 20 mg L-metioniny |
| 30 mg L-tyrozyny |
| 30 mg L-izoleucyny |
| 30 mg L-lyzyny-HCl |
| 25 mg L-fenyloalaniny |
| 100 mg L-kwasu glutaminowego |
| 150 mg L-waliny |
| 375 mg L- seryny |
| Umieść cylinder na ogrzewanym mieszadle z magnetycznym mieszadłem i mieszaj, aż wszystko się rozpuści |
| Sprawdź, czy pH wynosi 7,1, i w razie potrzeby skoryguj |
| Używając 50 ml sterylnego strzykawki, rozdziel 45 ml porcje do szklanych butelek z metalowymi pokrywkami z gwintem |
| Sterylizuj minimalną pożywkę w 121 °C przez 10 min w autoklawie |
| Przechowuj w temperaturze pokojowej |
| (b) D-(+)-Glukoza: |
| Przygotuj 20% roztwór wagowy/objętościowy w ddH2O |
| Rozdziel 20 ml porcje do szklanych fiolki z metalowymi pokrywkami z gwintem |
| Sterylizuj roztwór glukozy w 121 °C przez 10 min w autoklawie |
| Przechowuj w temperaturze pokojowej |
| (c) L-Asparaginian: |
| Przygotuj roztwór macierzysty o stężeniu 4 mg/ml w ddH2O |
| Rozdziel 20 ml porcje do szklanych fiolki z metalowymi pokrywkami z gwintem |
| Sterylizuj roztwór L-asparaginianu w 121 °C przez 10 min w autoklawie |
| Przechowuj w temperaturze pokojowej |
| (d) Roztwór witamin: |
| Przygotuj roztwór biotyny, dodając 2 mg biotyny do 100 ml ddH2O |
| Odważ 8 mg tiaminy, 8 mg pirydoxyny, 8 mg kwasu pantotenowego, 40 mg inozytolu. Dodaj wszystkie suche składniki oraz 20 ml roztworu biotyny do 180 ml ddH2O |
| Przygotuj 10 ml sterylnych porcji, filtrując przez jednorazowy filtr o wielkości porów 0,2 µm do sterylnych szklanych butelek w szafce laminarnej |
| Przechowuj w 4 °C |
| (e) L-Treonina: |
| Przygotuj 100 ml roztworu L-treoniny o stężeniu 24 mg/ml w ddH2O |
| Rozdziel 10 ml porcje do szklanych fiolki z metalowymi pokrywkami z gwintem |
| Sterylizuj roztwór L-treoniny w 121 °C przez 10 min w autoklawie |
| Przechowuj w temperaturze pokojowej |
| (f) Siarczan miedzi(II): |
| Przygotuj 25 ml roztworu siarczanu miedzi(II) o stężeniu 20 mM w ddH2O |
| Przygotuj 5 ml sterylnych porcji, filtrując przez filtr o wielkości porów 0,2 µm do sterylnych szklanych butelek w szafce laminarnej |
| Przechowuj w temperaturze pokojowej |
| (g) Chlorofenolowa czerwień-β-D-galaktopiranozyd (CPRG): |
| Przygotuj 25 ml roztworu CPRG o stężeniu 10 mg/ml w ddH2O |
| Przygotuj 5 ml sterylnych porcji, filtrując przez filtr o wielkości porów 0,2 µm do sterylnych szklanych butelek w szafce laminarnej |
| Przechowuj w 4 °C |
Tabela 3. Test szkawnicy drożdżowej na obecność estrogenów; przygotowanie i przechowywanie pożywki minimalnej oraz składników pożywki.
- Przygotowanie i przechowywanie 10-krotnie skoncentrowanej hodowli drożdży
- W dniu 1 przygotuj podłoże wzrostowe (zgodnie z punktem 3.4.1) i wlej je do sterylnej kolby stożkowej. Dodaj 125 µl 10-krotnie skoncentrowanych drożdży z fiolki kriogenicznej przechowywanej w temperaturze -20 °C. Inkubuj zasiane podłoże przez około 24 godz. w temperaturze 28 °C na wstrząsaczu orbitalnym.
- W dniu 2 przygotuj dwie butelki podłoża wzrostowego (~ 50 ml) i wlej je do oddzielnych sterylnych kolb stożkowych. Dodaj po 1 ml 24-godzinnej hodowli drożdży do każdej kolby z podłożem wzrostowym. Inkubuj zasiane podłoże przez około 24 godz. w temperaturze 28 °C na wstrząsaczu orbitalnym.
- W dniu 3 wlej każdą 24-godzinną hodowlę do sterylnej probówki wirowarkowej o pojemności 50 ml. Wirowanie probówek o pojemności 50 ml przez 10 min w temperaturze 4 °C przy 2000 × g. Odstąpić nad osadem, a następnie zawiesić każdy osad ponownie w 5 ml minimalnego podłoża z 15% glicerolem. Przygotuj porcje po 0,5 ml 10-krotnie skoncentrowanej hodowli drożdży do sterylnych fiolki kriogenicznych o pojemności 1,2 ml i przechowuj w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 4 miesiące.
- Przygotowanie i przechowywanie zapasów chemicznych do krzywych wzorcowych
- Wypłucz wszystkie szkło laboratoryjne i łyżeczki dwukrotnie absolutnym etanolem i pozostaw do wyschnięcia przed użyciem, aby usunąć ślady zanieczyszczeń.
- Waga E2 bezpośrednio do szklanej fiolki w szafce do ważenia proszków i dostosuj stężenie objętościowo w absolutnym etanolu. Rozcieńcz do stężenia 2×10-7 M (54,48 µg/L). Zamknij fiolkę i przechowuj w temperaturze 4 °C (w lodówce bez iskrzenia).
- Przeprowadzenie testu
- W dniu 0 przygotuj podłoże wzrostowe. Do butelki z 45 ml minimalnego podłoża dodaj 5 ml roztworu glukozy, 1,25 ml roztworu L-asparaginianu, 0,5 ml roztworu witamin, 0,4 ml roztworu L-treoniny oraz 125 µl roztworu siarczanu miedzi(II). Wlej podłoże wzrostowe do sterylnej kolby stożkowej.
- Dodaj 125 µl 10-krotnie skoncentrowanego zapasu (odmrożonego z przechowywania w -20 °C) do kolby i inkubuj zasiane podłoże przez około 24 godz. w temperaturze 28 °C na wstrząsaczu orbitalnym.
- W dniu 1 oznakuj sterylną 96-dołkową „płytę do rozcieńczeń” i wykonaj rozcieńczenia szeregowe (objętości po 100 µl w etanolu) krzywej wzorcowej E2 oraz substancji testowych/ekstraktów ścieków (np. EE2).
- Oznakuj sterylną 96-dołkową mikropłytkę o płaskim optycznie dnie („płyta testowa”). Na każdej płycie umieść kontrole (z dodatkiem i bez rozpuszczalnika) oraz krzywą wzorcową E2, dodatkowo rzędy substancji testowych/ekstraktów ścieków.
- Pipetą dodaj po 10 µl każdego stężenia (E2, substancja lub ekstrakt) do odpowiedniego dołka płyty testowej. Pipetą dodaj po 10 µl etanolu do każdego dołka „kontroli rozpuszczalnika” na płycie testowej. Zostaw płytę testową bez pokrywki, aby roztwór odparował do sucha.
- Przygotuj butelkę podłoża wzrostowego (~ 50 ml) i dodaj 0,5 ml roztworu chlorofenolo czerwony-β-D-galaktopiranozydu (CPRG) na butelkę. Oceń gęstość komórek drożdży w 24-godzinnej hodowli, mierząc mętność hodowli przy długości fali 620 nm w czytniku płytek. Zaszczep podłoże testowe 4×107 komórek drożdży z 24-godzinnej hodowli.
- Wlej zaszczepione podłoże testowe do sterylnej rynienki. Używając pipety wielokanałowej dodaj po 200 µl zaszczepionego podłoża testowego do każdego dołka 96-dołkowej płyty testowej.
- Zamknij 96-dołkową płytę testową pokrywką i uszczelnij krawędzie taśmą. Silnie wstrząsaj płytą(testami) przez 2 min na wstrząsaczu do płytek i inkubuj w temperaturze 32 °C w szafce grzewczej z naturalną wentylacją.
- W dniu 2 silnie wstrząsaj płytą(testami) przez 2 min na wstrząsaczu do płytek. Wróć do inkubatora w temperaturze 32 °C.
- W dniu 4 silnie wstrząsaj płytą(testami) przez 2 min na wstrząsaczu do płytek. Pozostaw płytę(testy) w spoczynku na około 1 godz., a następnie odczytaj płyty testowe przy długości fali 540 nm (optymalna absorpcja CPRG ~575 nm) i 620 nm (do pomiaru mętności) za pomocą czytnika płytek. Płyty można pozostawić w temperaturze pokojowej i odczytać później, jeśli to konieczne.
- W dniu 0 przygotuj podłoże wzrostowe. Do butelki z 45 ml minimalnego podłoża dodaj 5 ml roztworu glukozy, 1,25 ml roztworu L-asparaginianu, 0,5 ml roztworu witamin, 0,4 ml roztworu L-treoniny oraz 125 µl roztworu siarczanu miedzi(II). Wlej podłoże wzrostowe do sterylnej kolby stożkowej.
- Obliczenia aktywności estrogenowej
- Skoryguj wyniki testu pod względem mętności, stosując następujące równanie: Wartość skorygowana = absorbancja próbki lub wzorca (E2) przy 540 nm – [absorbancja próbki lub wzorca (E2) przy 620 nm – absorbancja kontroli przy 620 nm]. Wykreśl krzywą wzorcową E2 z odpowiednimi kontrolami (w celu sprawdzenia zanieczyszczenia)8.
- Użyj skorygowanej wartości próbki (ekstraktu lub substancji) do obliczenia „równoważników estradiolu”. Wykorzystaj wartości z wykreślonej krzywej wzorcowej E2 oraz równanie regresji (trójparametrowe wielomianowe lub liniowe, w zależności od dopasowania), aby interpolować wartości absorbancji próbki/ekstraktu na wartości równoważne E2. Użyj współczynnika stężenia (czyli objętość wody wyekstrahowanej i objętość etanolu, w którym ponownie zawieszono ekstrakt) do obliczenia aktywności estrogenowej w próbce przed ekstrakcją.
4. Ocena aktywności estrogennej w warunkach laboratoryjnych z wykorzystaniem indukcji witelogeniny w organizmie u samców miętusia tłustogłowego
- Użyj samców miętusia fathead (Pimephales promelas) >4 miesiące, które wykazują cechy płciowe wtórne (to znaczy, rozwój brodawek godowych i gruczołu tłuszczowego położonego grzbietowo) wskazujące na męskie wyznaczenie płciowe.
- Aby zapobiec aktywności rozrodczej, oddziel dojrzałe samce trzy tygodnie (± 3 dni) przed rozpoczęciem testu. Przygotuj co najmniej dwa szklane akwaria o pojemności 45 L, z maksymalnym obciążeniem 3 g/L. Aby zapewnić wystarczającą liczbę zdrowych ryb na potrzeby testu, użyj co najmniej 100 samców.
- Utrzymuj ryby samce w identycznych warunkach środowiskowych, jakie będą występować podczas testu (czyli, temperatura wody 25 ± 1 °C i cykl świetlny 16:8 godz. światło:ciemność). Utrzymuj natężenie przepływu wody rozcieńczającej do każdego zbiornika, aby zapewnić wymianę 95% objętości co najmniej co 6–8 godzin, czyli 330 ml/min dla zbiornika o pojemności 45 L.
- Aparatura testowa i projekt eksperymentu
- Używaj dużych szklanych zbiorników, aby pomieścić obciążenie do 3 g ryb na litr wody. Dla 8 dorosłych samców (nominalnie po 4,5 g każdy) użyj zbiornika o pojemności 10–20 L.
- Użyj dwóch zbiorników powielonych dla każdego zabiegu i osłon każdy zbiornik przed wszelkimi niepotrzebnymi bodźcami wzrokowymi (czyli użyj ekranów z laminowanych kartek między zbiornikami). Oznacz każdy zbiornik numerem badania, stężeniem ekspozycji oraz numerem identyfikacyjnym naczynia.
- Dla badań odpływów ścieków
- Po przybyciu natychmiast przenieść ścieki do zbiornika magazynowego w temperaturze 10 ± 1 °CRozpocznij dawkowanie ścieków w ciągu dwóch godzin od ich otrzymania.
- Doprowadź odpływ przez pompę perystaltyczną z 10 °C zbiornik magazynowy do zbiornika aklimatyzacyjnego. Podgrzej efluent w zbiorniku aklimatyzacyjnym do 18 ± 2 °C. Pompować podgrzane ścieki z naczynia aklimatyzacyjnego do naczyń dawkujących/mieszących, a następnie do zbiorników testowych (zawierających ryby). Podgrzać zbiorniki do temperatury 25 ± 1 °C.
- Dla badań związanych z dawkowaniem substancji chemicznych
- Waż substancje testowe w szafce do ważenia proszków. Przygotuj stężone zapasy chemiczne w ddH₂O.2O preferencyjnie bez użycia rozpuszczalników.
Uwaga: Jeśli do rozpuszczenia badanych związków konieczne są rozpuszczalniki, należy stosować kontrole zawierające rozpuszczalniki dodatkowo do kontroli z wodą rozcieńczającą. - Doprowadź wodę rozcieńczającą z zbiornika głównego o regulowanej temperaturze do zbiornika dawkującego/mieszącego za pomocą zasilania grawitacyjnego lub pompy oraz urządzenia (urządzeń) do regulacji przepływu. Do zbiorników dawkujących/mieszających dodawaj stężony roztwór (roztwory) chemiczny za pomocą perystaltycznego systemu pompowego. Reguluj szybkość pompy (roztworu stężonego) oraz przepływ wody (wody rozcieńczającej) w celu uzyskania pożądanej stężenia w trakcie ekspozycji.
Uwaga: Użyj rurki silikonowej do doprowadzania wody/substancji testowej do każdego naczynia testowego z naczynia dawkującego/mieszałki. Użyj takiej prędkości przepływu, która zapewni wymianę 75% objętości naczynia w ciągu co najmniej 24 godzin. czyli 20 ml/min dla zbiornika 20 L. Utrzymuj przepływ na poziomie ± 10% określonej wartości nominalnej.
- Waż substancje testowe w szafce do ważenia proszków. Przygotuj stężone zapasy chemiczne w ddH₂O.2O preferencyjnie bez użycia rozpuszczalników.
- Utrzymuj temperaturę wody w zbiorniku ekspozycyjnym na poziomie 25 ± 1 °C, stężenie tlenu rozpuszczonego powyżej 70% wartości nasycenia powietrzem (5,8 mg L-1 w 25 °C) oraz ± 0,5 jednostki pH (początkowe pH w zakresie od 6,5 do 8,5) przez cały okres badania. Ustawić warunki oświetlenia na cykl świetlny 16 godz. światła : 8 godz. ciemności, z 20-minutowymi okresami przejściowymi świtów i zmierzchów.
- Karmić ryby dwa razy dziennie świeżo rozmrożonymi dorosłymi krylami solnymi (Artemia) przy 2,5 (± 0,1 g na zbiornik na jedno karmienie. Ponadto karmić ryby raz dziennie niewielką ilością (dwoma szczyptami palcami) pokarmu w płatkach dla ryb tropikalnych. Zachować minimalnie 3 godziny między poszczególnymi karmieniami.
- Codziennie prowadź rejestr karmienia, aby monitorować reakcję/reakcję pokarmową (dobrą, umiarkowaną lub słabą w porównaniu z kontrolą). Odsysaj wodę z zbiorników co najmniej dwa razy w tygodniu (najlepiej codziennie), aby usunąć niezjedzone pokarmy i kał. Co najmniej raz w tygodniu czyść ścianki i dna naczyń testowych.
- Pobieraj cotygodniowe próbki wody z każdego zbiornika w celu potwierdzenia aktywności estrogennej (za pomocą testu drożdżowego) oraz składu chemicznego (za pomocą chemii analitycznej). Szczegóły dotyczące pobierania próbek wody, ekstrakcji i analizy zawarte są w sekcjach 1–3.
Uwaga: Dla każdego eksperymentu należy wykorzystać kontrolę wody rozcieńczającej (kontrola ujemna), kontrolę dodatnią (E2 lub EE2) oraz co najmniej trzy rozcieńczenia odcieku (100, 50 i 25%) lub substancji testowej w celu monitorowania odpowiedzi dawkowo-efektowej. W przypadku testowania nowych technologii, należy użyć związku/odcieku z lub bez obróbkinp., EE2 bez leczenia, EE2 z TAML/pereksiem wodoru (H2O2) leczenie12; Rycina 1).
- Używaj dużych szklanych zbiorników, aby pomieścić obciążenie do 3 g ryb na litr wody. Dla 8 dorosłych samców (nominalnie po 4,5 g każdy) użyj zbiornika o pojemności 10–20 L.
Rycina 1. Schemat przedstawiający projekt eksperymentalny in vivo testu bioaktywności witelogeniny u miętusa głowacika w celu określenia usuwania ekotoksyczności 17α-etynowoestradiolu za pomocą oczyszczania wody przy użyciu TAML/peroksydu. Układ eksperymentalny składa się z ośmiu szklanych akwariów o pojemności 11 L, do których dopływa woda w sposób ciągły. Oddzielne roztwory zapasowe substancji chemicznych oraz woda (przefiltrowana, pozbawiona chloru) są dostarczane do komór mieszających. Nominalne stężenia (bez reakcji) w zbiornikach mieszających wynoszą 2 ng/L EE2, 80 nM TAML oraz 0,16 µg/L H2O2. Roztwory zapasowe substancji chemicznych (EE2, H2O2 i TAML) przygotowuje się i dawkuje oddzielnie, tak aby reakcje rozpoczynały się w komorach mieszających. Ryby (po 8 samców miętusa głowacika na zbiornik) są narażane na mieszaniny po czasie kontaktu reakcji wynoszącym około 45 minut. Próbki wody pobiera się tygodniowo z zbiorników ekspozycyjnych. Próbki osocza pobiera się od miętusów głowacików w celu oznaczenia estrogennego biomarkera – witelogeniny (VTG) – u grupy podstawowej na początku badania oraz u wszystkich pozostałych ryb po 21 dniach ekspozycji. Badane warianty to: „-C” – kontrola ujemna (tylko woda rozcieńczająca), „+” – kontrola dodatnia EE2, „+H” – EE2 plus H2O2, „+T” – EE2 plus H2O2 plus TAML. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Mills et al. 201512. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Procedura testowa
- Okres aklimatyzacji
- Zmierz masę mokrą (g) każdego płciowo dojrzałego samca ryby i przydziel przypadkowo do każdego zbiornika (po 8 samców na zbiornik).
- Zachowaj nieprzydzielone ryby z tej samej partii i utrzymuj je w tych samych warunkach testowych. Użyj tych ryb do zastąpienia osobników, u których w 7-dniowym okresie aklimatyzacji pojawią się oznaki uszkodzeń fizycznych lub osłabienia. Upewnij się, że na końcu okresu aklimatyzacji każdy zbiornik z eksperymentem zawiera 8 samców dobrze przyzwyczajonych do warunków testowych.
- Pobierz próbki osocza „początkowego stanu” dodatkowych 8 samców z tej samej partii ryb. Postępuj zgodnie z metodą pobierania krwi opisaną w punkcie 4.4 oraz metodą analizy witellogeniny (VTG) w punkcie 4.5.
- Po okresie aklimatyzacji podawaj ścieki lub roztwory chemiczne do zbiorników eksponowanych przez 21 dni, zgodnie z opisem w punktach 4.2.2 lub 4.2.3. Monitoruj codziennie śmiertelność, zachowanie i wygląd fizyczny ryb w każdym zbiorniku replikowanym przed pierwszym karmieniem w ciągu dnia. Rejestruj wszelkie niepokojące zachowania lub zdarzenia.
Uwaga: Upewnij się, że warunki środowiskowe i dawki pokarmu zapewniają dobre samopoczucie ryb (punkty 4.2.4 i 4.2.5).
- Okres aklimatyzacji
- Pobieranie próbek ryb po 21-dniowym okresie ekspozycji
- 12 godzin przed pobraniem próbek przestań dokarmiać ryby.
- Oznacz probówki mikrocentryfugowe do pobierania próbek krwi, dodaj około 5 µl aprotyniny (inhibitor proteaz) i umieść je na lodzie.
- Przygotuj roztwór MS222 o stężeniu 500 mg/L, rozpuszczając 500 mg MS222 w 1 L wody pozbawionej chloru (wcześniej przyzwyczajonej do temperatury 25 ± 1 °C). Zneutralizuj MS222 do pH 7,4 ± 0,4 za pomocą 1 M NaOH.
- Przenieś każdą rybę z zbiornika do buforowanego roztworu MS222. Utrzymuj w roztworze aż do całkowitego ustania ruchów skrzelowych (zwykle 5 ± 1 min).
- Podczas terminalnej narkozy zmierz i zanotuj długość ciała do rozgałęzienia ogona (mm). Użyj jednorazowego skalpela, aby amputować ogon, i heparynowaną kapilarę hematokrytową, aby zebrać krew z tętnicy ogonowej (Rycina 2). Ostrożnie przenieś krew do odpowiednio oznaczonej probówki mikrocentryfugowej i trzymaj na lodzie.
- Natychmiast po pobraniu krwi uśmierć rybę. Potwierdź śmierć trwałym ustaniem krążenia i/lub zniszczeniem mózgu. Zmierz i zanotuj całkowitą masę ryby (z dokładnością do 0,01 g) oraz przeprowadź sekcję narządów zgodnie z potrzebami.
- Wykonaj odwirowanie krwi (7 000 × g przez 5 min przy 4 °C) w ciągu 2 godzin od pobrania. Przenieś supernatant osocza za pomocą pipety do nowych oznakowanych probówek mikrocentryfugowych o pojemności 0,4 ml i trzymaj na lodzie. Zamroź probówki zawierające osocze na suchym lodzie w ciągu 30 minut po odwirowaniu i przechowuj w temperaturze -80 °C przed analizą stężenia VTG w osoczu.
Rycina 2. Zdjęcia przedstawiające samca piestrznika (Pimephales promelas), pobieranie osocza i lokalizacja jądra Na końcu 21-dniowego wstrzymania wszystkie ryby należy uśpić, aby pobrać próbki krwi. Po wprowadzeniu w stan znieczulenia śmiertelnego należy zmierzyć długość ryb (długość rozwartą, mm), a następnie niezwłocznie pobrać krew z tętnicy ogonowej. Foto-A: przerywana czerwona linia wskazuje miejsce amputacji ogona (do amputacji ogona należy użyć jednorazowego skalpela). Foto-B pokazuje heparynowaną probówkę hematokrytową używaną do pobierania krwi. Każdą rybę należy natychmiast uśmiercić po pobraniu próbki krwi; w tym przypadku cała głowa została odcięta od ciała (Foto-C). Po uśmierceniu ryby można otworzyć jamę ciała, aby ujawnić narządy wewnętrzne. Foto-C pokazuje położenie jądra (gruczołu płciowego) w stosunku do pęcherza pławnego (SB) u ryb z rodziny karpiowatych. np. płoć grubogłowa, płotka, karaś itp. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
- Wymierz stężenia VTG w osoczu za pomocą homologicznego zestawu do enzymatycznego testu immunosorbentnego (ELISA) opracowanego specjalnie dla miętusia grubogłowego.
- Przygotuj wzory i bufory VTG zgodnie z instrukcją producenta. Rozcieńcz próbki osocza w stosunkach 1:50, 1:5 000 oraz 1:500 000 i oznacz je w duplikatach, aby uzyskać wyniki mieszczące się w zakresie krzywej wzorcowej VTG, zgodnie z instrukcją producenta. Oblicz stężenia witelogeniny zgodnie z wytycznymi producenta.
5. Ocena terenowa nowoczesnych i innowacyjnych technologii oczyszczania ścieków w celu ograniczenia aktywności estrogennej przy użyciu in vivo indukcji witelogeniny oraz interseksu u leszcza (Rutilus rutilus)
- Przechwycenie dzikich leszczy żyjących w dół rzeki od ujść oczyszczalni ścieków
Note: Użyj leszcza (Rutilus rutilus) lub innego pospolitego gatunku słodkowodnego lub słonawowodnego, który jest gonochoryczny i znany z wrażliwości na estrogenową dysfunkcję endokrynną.- Łowienie ryb metodą elektrołowu, siecią, pułapkami lub innymi uznawanymi metodami rybackimi w zależności od sytuacji13. Przetranportuj ryby w natlenionych zbiornikach do laboratorium w celu pobrania próbek.
- Przygotuj probówki mikrowirówek zgodnie z opisem w punkcie 4.4.2. Przygotuj buforowany MS222 zgodnie z opisem w punkcie 4.4.3. Znieczul ryby zgodnie z opisem w punkcie 4.4.4.
- Pomiary długości i masy ryb podczas znieczulenia końcowego.
- Pobierz krew z tętnicy ogonowej za pomocą jednorazowej strzykawki heparynizowanej. Natychmiast po pobraniu próbki krwi uśmierć każdą rybę. Ostrożnie przenieś krew do odpowiednio oznakowanych probówek mikrowirówek i przechowuj na lodzie. Przygotuj osocze zgodnie z opisem w kroku 4.4.7 i zmierz stężenie VTG metodą ELISA (4.5).
- Używając pęsety usuń 2–3 łuski z każdej ryby i umieść je w osobno oznakowanych małych kopertach papierowych. Przechowuj koperty w temperaturze pokojowej, w suchych warunkach, w celu późniejszego określenia wieku ryb i analizy wzrostu.
- Otwórz jamę ciała skalpelem, aby ujawnić narządy wewnętrzne. Usuń przewód pokarmowy, aby ujawnić pęcherz pławny z jądrem po każdej stronie (Rycina 2). Ostrożnie usuń parzyste jądra za pomocą cienkiej pęsety i umieść je w fiolce szklanej. Zakryj jądra ciekłym Bouina w stosunku 1:10 tkanka:środek utrwalający.
- Utrzymuj tkanki w ciekłym Bouina przez 6–24 godziny, w zależności od wielkości tkanki (środek utrwalający przenika z prędkością 1 mm na godzinę). Po utrwaleniu wylej ciekły Bouina i zastąp go 70% przemysłowym metylowanym spirytusem (IMS). Przechowuj utrwalone tkanki w temperaturze pokojowej, aż do przetworzenia tkanek do analizy histopatologicznej (rozdział 5.3).
- Ocena estrogenowej aktywności w warunkach terenowych z wykorzystaniem indukcji witelogeniny in vivo oraz wystąpienia interseksu u leszcza
- Projekt i przygotowanie eksperymentu
Note: Zadbaj o wcześniejsze przygotowanie zbiorników i instalacji pilotażowej przed rozpoczęciem prac in vivo. Uruchom przepływ wody w zbiornikach 3–4 tygodnie przed wprowadzeniem ryb do systemu. Regularnie monitoruj natężenie przepływu wody, jakość i warunki wody (pH, temperatura, rozpuszczony tlen, itd.), aby upewnić się, że parametry są stabilne.- Zbuduj duże zbiorniki (np. 300–1000 L) na instalacji pilotażowej, które mogą otrzymywać „kontrolną” wodę kranową pozbawioną chloru, standardowe oczyszczone ścieki oraz ścieki poddane zaawansowanemu oczyszczaniu, równolegle. Podłącz do zbiorników pompę powietrza/napowietrzacze. Ustaw natężenie przepływu wody tak, aby zapewnić co najmniej 6 wymian objętości zbiornika na dobę.
Note: Upewnij się, że zbiorniki są dobrze izolowane i zacienione, aby zapobiec nadmiernym dziennej zmianom temperatury. Zaprojektuj zbiorniki tak, aby umożliwić obserwację ryb pod kątem zmian w zachowaniu (brak poboru pokarmu, itd.), objawów chorób i śmiertelności.
- Zbuduj duże zbiorniki (np. 300–1000 L) na instalacji pilotażowej, które mogą otrzymywać „kontrolną” wodę kranową pozbawioną chloru, standardowe oczyszczone ścieki oraz ścieki poddane zaawansowanemu oczyszczaniu, równolegle. Podłącz do zbiorników pompę powietrza/napowietrzacze. Ustaw natężenie przepływu wody tak, aby zapewnić co najmniej 6 wymian objętości zbiornika na dobę.
- Rozpocznij ekspozycję, unosząc worki z leszczami (z hodowli ryb) w odpowiednich zbiornikach przez 1 godzinę. Stopniowo dodawaj wodę z zbiorników do worków, aż temperatura i warunki wody w workach będą odpowiadały warunkom w zbiornikach. Puść ryby do zbiorników.
- Karm dorosłe leszcze codziennie peletowanym pokarmem dla ryb (rozmiar 0,5–0,8). Karm młode leszcze codziennie małymi peletami (rozmiar peletów 100–300) pokarmem nieestrogenicznym 14 ad libitum, dostosowując ilość na podstawie ilości niezjedzonego pokarmu. Prowadź codzienną dokumentację karmienia, odnotowując reakcję/zachowanie podczas karmienia (dobre, przeciętne lub słabe, w porównaniu z kontrolą).
- Pobieraj cotygodniowe próbki wody z każdego zbiornika, aby potwierdzić estrogenową aktywność i skład chemiczny. Szczegóły dotyczące metod pobierania i analizy próbek wody zawarte są w punktach 1–3.
- Projekt i przygotowanie eksperymentu
- Badanie histopatologiczne jąder ryb15
- Ostrożnie usuń z pojemnika pęsetą jądra, które zostały zdekapitowane i utrwalone (opisane w krokach 5.1.6 i 5.1.7), i umieść je na desce do krojenia.
- Użyj noża mikrotomu, aby przekroić każde jądro na 3 części (przednią, środkową i tylną), a z każdej części wyciąć przekrój poprzeczny o grubości 3–5 mm. Ostrożnie umieść wszystkie sześć kawałków w oznakowanym plastikowym kasetce do biopsji i umieść kasetkę w procesorze tkanek, stosując czasy wymienione w Tabela 4.
- Wlej tkanki w parafinę i nacinaj na mikrotomie obrotowym (3–5 μm). Przenieś przekroje na oznakowane szklane szkiełka z powłoką adhezyjną i umieść szkiełka na ogrzewanym stole (ustawionym na 45 °C) do wysuszenia przez 24 godziny.
- Obarwaj szkiełka ręcznie lub za pomocą automatycznego barwnika, stosując czasy podane w Tabela 5. Umieść kroplę środka montażowego na zabarwionej tkance i nałóż szkiełko nakrywkowe, aby chronić tkankę.
- Najpierw obejrzyj każde szkiełko przy małej wielkości (20X, czyli obiektyw 2X z 10X powiększeniem okularów), aby określić płeć i liczbę punktów przyczepienia do jamy ciała15. Zanotuj wszelkie nieprawidłowości dla każdej ryby.
- Przy większym powiększeniu (100X lub 400X) przeanalizuj tkankę, aby ocenić stadia gametogenezy, nieprawidłowości oraz obecność oocytów w tkance jąder. Zapisz stopień nasilenia interseksu, korzystając z następującego systemu oceny od 0 (normalna tkanka samca) do 7 (100% tkanka jajnikowa)6 (patrz Tabela 6).
| Numer kroku | Zabieg | Cel | Czas (godz.) |
| 1 | 70% IMS | Dehydratacja | 3 |
| 2 | 90% IMS | Dehydratacja | 2,5 |
| 3 | 95% IMS | Dehydratacja | 1,5 |
| 4 | 100% IMS | Dehydratacja | 1,5 |
| 5 | 100% IMS | Dehydratacja | 1,5 |
| 6 | 100% IMS | Dehydratacja | 1,5 |
| 7 | 100% IMS | Dehydratacja | 1,5 |
| 8 | Środek klarujący do histologii | Klarowanie | 1,5 |
| 9 | Środek klarujący do histologii | Klarowanie | 1,5 |
| 10 | Środek klarujący do histologii | Klarowanie | 1,5 |
| 11 | WAX | Impregnacja parafiną | 1,25 |
| 12 | WAX | Impregnacja parafiną | 1,25 |
| RAZEM 20 godz. |
Tabela 4. Reżim obróbki tkanek metodą impregnacji parafiną w celu histopatologii. Tkanki powinny być przetwarzane w automatycznym procesorze do tkanek. Tkanki należy zanurzyć w roztworach podanych poniżej na określony czas.
| Barwnik nr | Barwnik | Cel | Czas (min) |
| 1 | Środek do odtłuszczania histologicznego | Rozpuszcza parafinę | 15 |
| 2 | 100% IMS | Hydratacja | 2 |
| 3 | 90% IMS | Hydratacja | 2 |
| 4 | 70% IMS | Hydratacja | 2 |
| 5 | WODA Z KRAHNA (PRZEPŁYWNA) | Płukanie | 2 |
| 6 | HEMATOKSYLINA | Barwi jądra komórkowe na niebiesko | 10 |
| 7 | WODA Z KRAHNA (PRZEPŁYWNA) | Usunięcie nadmiaru | 10 |
| 8 | Kwasny IMS | Dechlorynacja | 20 sek |
| 9 | WODA Z KRAHNA (PRZEPŁYWNA) | Płukanie | 20 sek |
| 10 | LiCO3 | Sól | 20 sek |
| 11 | WODA Z KRAHNA (PRZEPŁYWNA) | Płukanie | 20 sek |
| 12 | 1% EOZYNA (WODNA) | Barwi cytoplazmę na różowo | 20 sek |
| 13 | WODA Z KRAHNA (PRZEPŁYWNA) | Usunięcie nadmiaru | 5 |
| 14 | 70% IMS | Dehydratacja | 2 |
| 15 | 90% IMS | Dehydratacja | 2 |
| 16 | 100% IMS | Dehydratacja | 5 |
| 17 | Środek do odtłuszczania histologicznego | Usunięcie IMS, środek wiążący | 5 |
Tabela 5. Roztwory i czasy immersji dla barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) & E) barwienie tkanek gonad ryb. Szkiełka powinny być umieszczane w każdej kąpieli przez wyznaczony czas, w odpowiedniej kolejności. & Barwienie tkanek E jest wymagane w celu określenia wpływu estrogenowych ścieków przemysłowych na rozwój lub organizację jąder u ryb.
| Wynik | Opis sekcji |
| 0 | Prawidłowe jądro męskie |
| 1 | Wieloogniskowy jajomączek z 1–5 oocytami (zazwyczaj pojedynczo) rozproszonymi wśród tkanki jąder |
| 2 | Wieloogniskowy jajomuchy, 6–20 komórek jajowych często w małych skupieniach rozsianych wśród tkanki jąder |
| 3 | Wieloogniskowy jajnik-jądro, 21–50 oocytów ułożonych w skupieniach |
| 4 | >50 i <100 oocytów. Przekrój jest zazwyczaj wielofazowy i ma wygląd mozaiki tkanki jądra i jajnika. |
| 5 | >100 oocytów, zazwyczaj wielogniazdowych, ale mogą być również pojedyncze, z wyraźnie rozpoznawalnymi strefami tkanki jajnikowej i tkanki jąder oddzielonymi od siebie. |
| 6 | >50 procent tkanki gonadalnej na przekroju stanowi jajnik, który wyraźnie oddzielony jest od tkanki jądra przez komórki nabłonkowe i tkanki fagocytarne. |
| 7 | 100 procent tkanki gonadalnej na przekroju to tkanka jajnikowa. |
Tabela 6. System punktacji oceny nasilenia stanu interseksualnego u leszcza. Przygotowane histologicznie preparaty tkanki gonadalnej należy badać pod mikroskopem świetlnym w powiększeniach 20X, 100X i 400X w celu oceny obecności nieprawidłowości oraz obecności oocytów w tkance jąder. Tabela została zmodyfikowana na podstawie Joblinga et al. 20066.
Wyniki
Próby zrozumienia wpływu ulepszeń procesów oczyszczania ścieków lub określenia najbardziej odpowiedniej technologii modernizacji urządzeń w ramach trzeciego stopnia oczyszczania w istniejących oczyszczalniach ścieków (WWTP) w odniesieniu do skuteczności usuwania aktywności zaburzającej gospodarkę hormonalną w odprowadzanych ściekach, wymagają nie tylko pomiaru kluczowych komponentów chemicznych wpływających do zakładu, ale także analizy produktów rozkładu, które również mogą wykazywać aktywność zaburzającą gospodarkę hormonalną. W ściekach bytowych najbardziej estrogennymi substancjami są hormony steroidowe: estron (E1), 17β-estradiol (E2) oraz 17α-etynyloestradiol (EE2)5,8. Estrogeny steroidowe są wydalane z organizmu głównie w postaci mieszaniny nieaktywnych koniugatów16,17. Koniugaty te ulegają w znacznym stopniu dekonjugacji w systemie kanalizacyjnym pod wpływem aktywności bakteryjnej, a dalsza degradacja zachodzi w oczyszczalni ścieków. Dekoniugowane steroidy są usuwane ze strumienia ścieków poprzez adsorpcję do osadu lub ulegają biodegradacji podczas oczyszczania wtórnego, co prowadzi najpierw do powstania produktów transformacji, a w konsekwencji może dojść do całkowitej mineralizacji pierwotnego aktywnego komponentu. Analiza chemiczna wszystkich poszczególnych związków w strumieniu ścieków byłaby trudna, czasochłonna i kosztowna, a ponadto nie objęłaby nieznanych komponentów aktywnych obecnych w próbce. Ponadto suma wkładu estrogennego każdego komponentu dostarczyłaby jedynie informacji o skumulowanej sile estrogennej analizowanych związków w próbce. Stanowi to ryzyko w sytuacjach, gdy procesy transformacji generują nieznane substancje estrogenne lub gdy dopływ ma pochodzenie przemysłowe. Połączenie analizy chemicznej z ekotoksykologicznymi testami biologicznymi in vivo i in vitro stanowi rozwiązanie problemu obecności nieznanych komponentów estrogennych w mieszaninach, takich jak oczyszczone ścieki. Testy in vitro, takie jak Yeast Estrogen Screen (YES), były szeroko stosowane do określania aktywności estrogennej ścieków i pomagania w identyfikacji aktywnych komponentów w oczyszczonych próbkach8,18,19. Niemniej jednak różnice między badaniami in vivo a in vitro mogą być znaczące11, a kompleksowa ocena nowych procesów pod kątem usuwania potencjału zaburzania gospodarki hormonalnej wymaga zastosowania zestawu testów chemicznych i ekotoksykologicznych.
Określenie, czy poszczególne oczyszczalnie lub procesy usuwają związki aktywne ze strumienia ścieków, można przeprowadzić za pomocą analizy chemicznej, której poprzedza ekstrakcja próbek, zagęszczanie oraz oczyszczanie ekstraktu przed analizą, najczęściej realizowaną przy użyciu metod LCMS(/MS) lub GCMS(/MS). Dane uzyskane z analizy chemicznej mogą być wykorzystane do oceny zgodności z poszczególnymi przewidywanymi stężeniami braku efektu (PNEC)20 lub normami jakości środowiska (EQS)21 dla konkretnych związków, dlatego metody te są kluczowe dla danych dotyczących zgodności regulacyjnej. Ponadto celowane lub niecelowane metody analizy chemicznej pozwalają na identyfikację i oznaczanie ilościowe poszczególnych związków lub izomerów w przeciwieństwie do metod biologicznych, które dają odpowiedź całkowitą. Metody analizy chemicznej umożliwiają zatem ocenę konkretnych związków w celu sprostania wyzwaniom związanym z oczyszczaniem ścieków w odniesieniu do poszczególnych oczyszczalni. Badania wykazały, że konwencjonalne oczyszczanie ścieków (np. oczyszczalnie z osadem czynnym) może być wysoce skuteczne w usuwaniu naturalnych hormonów steroidowych, choć usuwanie syntetycznego hormonu EE2 wykazuje zazwyczaj mniejszą efektywność. Badania terenowe z zastosowaniem zaawansowanych metod oczyszczania, wykorzystujących techniki takie jak ozonowanie, granulowany węgiel aktywny (GAC) i membrany, wykazały – choć przy wysokich kosztach – że mogą one służyć jako rozwiązanie końcowe (end-of-pipe) w celu usunięcia EE2 poniżej przewidywanych poziomów efektu oraz poniżej granic wykrywalności. Rysunek 3 przedstawia usuwanie EE2 przy użyciu GAC w komunalnej oczyszczalni ścieków w skali pilotowej. Badania przeprowadzone w skali pilotowej w komunalnych oczyszczalniach ścieków z zastosowaniem końcowego oczyszczania GAC wykazują również redukcję potencjału estrogennego po zastosowaniu GAC, zmierzoną za pomocą testu Yeast Estrogen Screen (YES), co przedstawiono na Rysunku 4.
Rysunek 3. Przykładowe dane terenowe pokazujące usuwanie etynyloestradiolu po zaawansowanym oczyszczaniu trzecim stopniu. (A) Próbki są pobierane z oczyszczalni ścieków (WWTP) po konwencjonalnym oczyszczaniu (oczyszczalnia z osadem czynnym) zgodnie z procedurami opisanymi dla konserwacji próbek. (B) Próbki są ekstrahowane za pomocą ekstrakcji do fazy stałej, a następnie oczyszczane w celu usunięcia substancji zakłócających przy użyciu SPE w fazie normalnej oraz chromatografii żelowej. (C) Oczyszczony, zagęszczony ekstrakt zostaje odparowany do małej objętości i analizowany za pomocą LCMS/MS z jonizacją elektrospray w trybie ujemnym w trybie MRM. Wyniki są obliczane z zastosowaniem standaryzacji wewnętrznej przy użyciu izotopowo znakowanych standardów wewnętrznych. W przedstawionym przykładzie EE2 występuje w końcowym ścieku z ASP w stężeniu powyżej przewidywanego poziomu braku efektu (PNEC) wynoszącego 0,1 ng/L i jest usuwany za pomocą GAC oraz ozonu (O3) do poziomu stężenia bezpiecznego dla środowiska. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 4. Zdjęcie płytki testowej Yeast Estrogen Screen (YES) (A) wykazującej zmianę koloru z żółtego na czerwony, co wiąże się z aktywnością estrogenową próbek. Wykresy sporządzone na podstawie płytki testowej YES przedstawiające skorygowaną absorbancję (540 nm) wzorca estradiolu (B) oraz próbek ścieków oczyszczonych w procesie osadu czynnego (ASP) i za pomocą granulowanego węgla aktywnego (GAC) (C). Każda próbka została przebadana w dublecie. Ścieki ASP i GAC zostały poddane ekstrakcji i zagęszczeniu przy użyciu metod SPE opisanych w sekcji 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Ozonowanie jest również skuteczną metodą usuwania estrogenów steroidowych i aktywności estrogennej z oczyszczonych w sposób konwencjonalny ścieków w oczyszczalniach. Ozon jest w stanie utlenić szeroki zakres zanieczyszczeń organicznych oraz rozpuszczonej materii organicznej w próbkach ścieków, zapewniając jednocześnie właściwości dezynfekcyjne. Skuteczność ozonowania zależy od charakterystyki wody, takiej jak pH, ilość materii organicznej oraz zastosowana dawka ozonu. Estrogeny, które są słabo usuwane w procesach konwencjonalnego oczyszczania, mogą zostać usunięte ze ścieków przy dawkach od 0,8 do 2 mg O3/mg DOC. Ozon jest selektywnym utleniaczem, który reaguje z centrami bogatymi w elektrony (nienasycone wiązania węgiel-węgiel, związki aromatyczne, w tym alkohole aromatyczne), co sprawia, że ozon znajduje zastosowanie w rozkładzie wielu EDC. Jednakże eliminacja poszczególnych związków nie musi prowadzić do całkowitej mineralizacji związku wyjściowego. Substancje organiczne po ozonowaniu mogą ulec przekształceniu, generując produkty pośrednie lub produkty uboczne utleniania, które obejmują szereg polarnych związków o niskiej masie cząsteczkowej, takich jak aldehydy, ketony, kwasy karboksylowe, kwasy ketonowe i związki bromowane. Przykładami są bromiany, formaldehyd, acetaldehyd i kwasy karboksylowe. Za pomocą testów biologicznych in vivo i in vitro wykazano, że choć ozon utlenia niektóre substancje chemiczne tylko częściowo, powstałe główne produkty transformacji wykazują niższą potencję estrogenną, a zatem zastosowanie ozonu w odpowiedniej dawce prowadzi do wysokiego stopnia usunięcia aktywności estrogennej.
Jedną z głównych korzyści z dodatkowego oczyszczania ścieków jest ograniczenie feminizacji samców ryb w odbiornikach wód; jest to niekorzystny efekt, który może prowadzić do obniżenia płodności3. Badania in vivo z wykorzystaniem ryb (np. płoci lub głowicy) narażonych na działanie ścieków wykazują obecność żeńskich komórek zarodkowych lub oocytów w jądrach samców (np. jak pokazano na Ryc. 5). Interseksualizm lub obecność VTG u samców nie występuje lub jest znacząco ograniczona u ryb po zaawansowanym oczyszczaniu, takim jak GAC7 lub ozonowanie22. Badania te wykazują, że produkty transformacji powstające podczas ozonowania nie mają działania estrogennego, jednak nie odnosi się to do toksyczności wytworzonego effluentu. Kwestia ta została omówiona w innych badaniach, na przykład w pracy Magdeburg et al.23, która wykazuje, że produkty uboczne utleniania ozonem są toksyczne dla pstrąga tęczowego, ale toksyczność tę można usunąć poprzez następującą po ozonowaniu filtrację piaskową.
Rysunek 5. Fotomikrografie prawidłowych gonad samca (A) oraz gonad interseksualnych (B, C) u dorosłych płoci (Rutilus rutilus) eksponowanych na ścieki w ocenie terenowej. Fotomikrograf A przedstawia przekrój histologiczny prawidłowego jądra samca. Fotomikrografy B i C przedstawiają przekroje histologiczne samca ryby o cechach interseksualnych po sześciomiesięcznej ekspozycji na odcieki z oczyszczalni ścieków z osadem czynnym. Strzałki wskazują oocyty obecne w tkance jądra. Pasek skali na każdym fotomikrografie odpowiada 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Wysoki koszt oczyszczania końcowego (end-of-pipe) z wykorzystaniem ozonu, węgla aktywnego GAC lub technologii membranowych wymusza opracowanie alternatywnych, tańszych i zrównoważonych metod usuwania substancji zaburzających gospodarkę hormonalną (EDC). Co więcej, metody adsorpcji i separacji jedynie przenoszą EDC z jednej fazy do drugiej, zamiast eliminować je poprzez degradację. Opracowano aktywatory TAML, które katalizują utlenianie organicznych mikrozanieczyszczeń w ściekach za pomocą nadtlenku wodoru12,24-26. Aktywatory TAML z H2O2 skutecznie degradują EE2 oraz inne estrogeny steroidowe w czystej wodzie laboratoryjnej, a także w odciekach z miejskich oczyszczalni ścieków i w próbkach moczu wzbogaconych o analizowane związki12. Badania laboratoryjne wykazują, że proces TAML/H2O2 zapewnia wysoki stopień usuwania estrogenów steroidowych, w tym EE2, znacząco redukuje aktywność estrogenną mierzoną in vitro za pomocą bioanalizy YES oraz istotnie ogranicza feminizację ryb in vivo mierzoną za pomocą bioanalizy VTG (Rycina 1 oraz Rycina 6).
Rycina 6. Średnie stężenie EE2 i aktywność estrogenna w wodzie w zbiornikach traktowanych i nietraktowanych (A) oraz witellogenina w osoczu samców ryb w stanie bazowym i po ekspozycji (B). A) Stężenie EE2 (ng/L, ciemnoniebieskie słupki) zmierzono za pomocą LCMS/MS, a aktywność estrogenną (ekwiwalent EE2 ng/L, ciemnozielone słupki) za pomocą testu in vitro Yeast Estrogen Screen (YES). B) Stężenie witellogeniny w osoczu (ng/ml, jasnoniebieskie słupki) u samców golowaców zostało zmierzone za pomocą ilościowego testu immunoenzymatycznego (ELISA). Wyniki analizy chemicznej EE2 raportowane jako < 0,03 ng/L EE2 (t.j. poniżej granicy wykrywalności (LOD)) traktowano jako połowę LOD (t.j. 0,015 ng/L EE2) do obliczeń średnich, błędu standardowego i analizy statystycznej. Wartości EE2 i aktywności estrogennej stanowią średnie stężenia zmierzone w próbkach pobranych w ciągu 21-dniowej ekspozycji. Poziom VTG w osoczu zmierzono przed ekspozycją (stan bazowy) oraz po 21 dniach ekspozycji. Schemat traktowania obejmował: kontrolę negatywną (sama woda do rozcieńczania), EE2+H2O2+TAML, EE2+H2O2 oraz sam EE2. Słupki błędu na wykresie A reprezentują błąd standardowy średniej, a słupki błędu na wykresie B reprezentują odchylenie standardowe. Litery nad słupkami na wykresie B oznaczają podobieństwo statystyczne. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Mills et al.12 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Oczyszczalnie ścieków są główną drogą zanieczyszczenia wód powierzchniowych EDC. Ocena skuteczności usuwania aktywności hormonalnej konwencjonalnych, zaawansowanych lub nowo pojawiających się procesów leczenia wymaga zastosowania różnych testów chemicznych i biologicznych. Analiza chemiczna z wykorzystaniem analizy nieukierunkowanej i ukierunkowanej dostarcza danych jakościowych lub ilościowych na temat skuteczności usuwania poszczególnych składników, a tym samym umożliwia dokonanie oceny w odniesieniu do środowiskowych norm jakości lub przewidywanych stężeń niepowodujących zmian w analizowanych związkach lub mieszaninach związków.
Powstawanie produktów przemian w wyniku niepełnej mineralizacji substancji po oczyszczeniu oraz obecności nieznanych składników biologicznie czynnych w ściekach ogranicza przydatność samych badań chemicznych. Połączenie testów biologicznych in vivo i in vitro w połączeniu z badaniami przesiewowymi chemii analitycznej stanowi użyteczny zestaw narzędzi do określenia skuteczności usuwania EDC za pomocą nowych procesów oczyszczania ścieków. Testy te, w połączeniu z tradycyjnymi parametrami jakości wody oraz innymi toksykologicznymi i mikrobiologicznymi punktami końcowymi, pozwalają na krytyczną ocenę obecnych i powstających technologii oczyszczania ścieków.
Ważne jest, aby pamiętać, że badania przesiewowe estrogenów na bazie drożdży (np. TAK) nie są jedynymi testami in vitro w celu określenia siły estrogenowej chemikaliów i ścieków. Opracowano również szereg stabilnie transfekowanych testów opartych na komórkach ssaków, na przykład ER-CALUX27 i hERα-HeLa-990328 odpowiednio z ludzkimi komórkami raka piersi lub komórkami guza szyjki macicy. Test YES porównano z podobnymi testami opartymi na komórkach ssaków i stwierdzono, że ma porównywalnie wysoki poziom odtwarzalności, prawdziwie dodatnie i prawdziwie ujemne wskaźniki identyfikacji estrogenowej29, chociaż czasami uważa się, że jest nieco mniej czuły27. Jedną z zalet testów reporterowych opartych na drożdżach jest to, że w laboratoriach bez znaczącego doświadczenia z hodowlą komórek ssaków TAK można łatwiej przyjąć, ponieważ wymaga to mniej rygorystycznych środków kontroli biologicznej i sterylnych technik (w razie potrzeby TAK można wykonać na stole laboratoryjnym). Testy oparte na komórkach ludzkich wymagają również inkubatorów i luminometrów CO2 w porównaniu ze standardowymi inkubatorami i czytnikami mikropłytek stosowanymi w YES. Dwa testy reporterowe estrogenów na bazie drożdży (TAK, Saccharomyces cerevisiae i A-YES, Arxula adeninivorans) są obecnie poddawane międzylaboratoryjnym testom w celu walidacji ISO 19040 "Jakość wody - Oznaczanie potencjału estrogenowego wody i ścieków", podkreślając zainteresowanie przemysłu tymi technikami.
Istnieje szereg ograniczeń opisanych metod, do których zalicza się potencjalne zanieczyszczenie próbek podczas pobierania próbek, przechowywania i analizy próbek substancjami estrogenowymi pochodzącymi ze środowiska terenowego lub laboratoryjnego lub zanieczyszczeniem ludzi (np . plastyfikatorami, środkami powierzchniowo czynnymi, produktami higieny osobistej). Ten rodzaj zanieczyszczenia w teście YES (lub innych testach reporterowych opartych na komórkach) podniesie tło i wpłynie na zastosowanie testu. Próbki wody lub rozpuszczalniki przechowywane w plastikowych butelkach mogą łatwo powodować fałszywe alarmy. Wyniki fałszywie ujemne są również niepokojące, ponieważ zarówno test LCMS/MS, jak i test TAK wymagają SPE skoncentrowania estrogenów do wykrywalnych poziomów. Matryca, wybór sorbentu SPE i rozpuszczalnika elucyjnego może mieć wpływ na wydajność ekstrakcji i rodzaje eluowanych związków. Użycie wkładów C18 SPE do ekstrakcji w warunkach opisanych w tym protokole może generować ujemne odchylenie, ponieważ wysoce polarne i zasadowe związki byłyby słabo zatrzymywane przez sorbent. Ponadto protokół ten wymaga odtworzenia eluentu ELUENT YES z metanolu do etanolu poprzez odparowanie do sucha w azocie, co powoduje utratę lotnych związków. W rezultacie, protokół może dostarczyć niedoszacowanej aktywności estrogenowej badanych próbek. Ograniczenia te są szczególnie ważne przy rozważaniu testu YES, ponieważ nieznane lub nieoczekiwane związki mogą zostać pominięte, ponieważ nie zostały wyekstrahowane lub zostały utracone w wyniku parowania. Ponadto technika LCMS/MS wykorzystuje znakowane wzorce wewnętrzne w celu skorygowania odzysku; Podejście to nie może być stosowane w teście YES.
Do istotnych ograniczeń badań ścieków in vivo należą wysokie koszty i czas potrzebny na ocenę w porównaniu z metodami in vitro . Obecnie stosowanie testów na zarodkach ryb w celu wykrycia aktywności estrogenowej jest ograniczone. Odniesiono jednak pewne sukcesy w produkcji reagujących na estrogeny transgenicznych świecących zarodków ryb30, które mogą mieć przyszłe zastosowania. Strzebla grubogłowa (stosowana w tym protokole) jest powszechnym gatunkiem laboratoryjnym, a indukcja VTG u samców ryb jest dobrze udokumentowanym biomarkerem ekspozycji na estrogeny i wymierną miarą estrogenności ścieków22 lub innych związków lub mieszanin estrogenowych31. Wytyczne OECD dotyczące badań substancji chemicznych zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego zostały zwalidowane przy użyciu dorosłej strzebli grubogłowych, japońskiej medaki i danio pręgowanego32,33, przy czym VTG jest czułym biomarkerem ekspozycji na estrogen u wszystkich trzech gatunków. Jednak indukcja VTG nie koreluje bezpośrednio z upośledzeniem rozrodczości, a tym samym z ekologicznymi konsekwencjami narażenia na ścieki, jak widać u poważnie interpłciowych płoci3. Z drugiej strony płocie nie są klasycznym "gatunkiem laboratoryjnym" do badań ekotoksykologicznych ze względu na duże rozmiary, długi czas pokolenia (2-3 lata do osiągnięcia dojrzałości płciowej), styl rozrodu; Tarło grupowe (lęg) odbywa się raz w roku, a trudność w odróżnieniu samców od samic (poza okresem tarła). Jednak ten normalnie gonochorystyczny gatunek został bardzo dobrze przebadany w Wielkiej Brytanii, ze względu na odkrycie, że za estrogenowymi ściekami samce ryb wykazywały zaburzenia endokrynologiczne (np. obecność specyficznej dla samicy witellogeniny we krwi) i histopatologii (ovotestes - rozwijające się jaja w jądrach i/lub żeńskich przewodach rozrodczych)5,6. W związku z tym, jako przyszłe zastosowanie tych protokołów, karaluch (lub podobne gatunki) może być użytecznym dzikim gatunkiem wskaźnikowym, aby pokazać, czy w rzekach otrzymujących zaawansowane oczyszczanie ścieków obserwuje się rzeczywistą poprawę jakości ścieków (i zmniejszoną estrogenność). Mogą być również stosowane w systemach typu end-of-pipe do monitorowania technologicznie ulepszonych ścieków z instalacji pilotażowych7. Rozważając, które gatunki wykorzystać w ocenach ścieków in vivo , istnieje kompromis między stosunkowo szybkimi i kontrolowanymi testami z wykorzystaniem gatunków laboratoryjnych a dłuższymi badaniami terenowymi, ale bardziej istotnymi dla środowiska, z wykorzystaniem gatunków rodzimych. Takie oceny in vivo są jednak kosztowne i powinny być traktowane jedynie jako ostateczny zestaw badań po ocenach z wykorzystaniem analizy chemicznej i testów in vitro .
Krytyczne kroki w ramach opisanych protokołów obejmują przygotowanie i obchodzenie się z próbkami i wyrobami szklanymi (tj. butelki i sprzęt do pobierania próbek powinny być wstępnie poddane działaniu odpowiedniego środka do czyszczenia powierzchni czynnej) w celu uniknięcia zanieczyszczenia próbek zanieczyszczeniami środowiskowymi, w tym ograniczenie kontaktu próbek z tworzywami sztucznymi i innymi materiałami, które mogą powodować wyniki fałszywie dodatnie. Jest to równie ważne przy projektowaniu i budowie akwariów i systemów ekspozycji ryb. Idealnie byłoby, gdyby akwaria (zasoby mieszkalne i podczas ekspozycji) były zbudowane z materiałów o niskiej adsorpcji32 przy minimalnym ryzyku zanieczyszczenia. Stal nierdzewna może być stosowana do zbiorników na ścieki lub wodę. Natomiast zbiorniki o szklanej konstrukcji są preferowane do akwariów (ponieważ zapewnia to również łatwą obserwację ryb). Należy unikać stosowania rur lub przewodów z tworzywa sztucznego niskiej jakości32, PVC34 i ABS można stosować, jeśli są "odpowiednio przyprawione", tj. pozostawione do wypłukania wszelkich zanieczyszczeń z bieżącej wody rozcieńczającej przez co najmniej 12 godzin przed użyciem. Rurki silikonowe klasy medycznej są z powodzeniem stosowane w naszym zakładzie do dostarczania pomp perystaltycznych chemikaliów i ścieków / wody rozcieńczającej do zbiorników. Oprócz uwzględnienia zanieczyszczenia estrogenowego w budowie i prowadzeniu systemu wodnego, ważne jest również, aby pomyśleć o diecie ryb; Stwierdzono, że wiele odpowiednich pokarmów dla ryb jest estrogennych dla ryb. Dlatego ważne jest, aby testować wszelkie pokarmy pod kątem aktywności (np. w badaniu przesiewowym estrogenów drożdży, patrz Beresford i wsp.14) przed zastosowaniem ich w tego typu badaniach.
Rozwiązywanie problemów z opisanymi protokołami analizy chemicznej lub testów YES jest uproszczone, jeśli próbki zapewniające jakość, w tym wiele ślepych prób podróżnych, laboratoryjnych i rozpuszczalnikowych, są analizowane wraz z kontrolami dodatnimi i próbkami rzeczywistymi w celu wyeliminowania wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych. W testach in vivo należy również zawsze stosować kontrolę dodatnią (np. EE2) i ujemną (tylko woda rozcieńczona) w celu potwierdzenia czułości oczekiwanego biomarkera biologicznego lub punktu końcowego (tj. VTG lub histopatologii) i umożliwienia wykrycia wszelkich nieoczekiwanych zanieczyszczeń (np. z zestawu doświadczalnego, diety lub wód rozcieńczających). Wszelkie modyfikacje w protokole powinny zostać zatwierdzone przed przeprowadzeniem jakiegokolwiek badania.
Przewiduje się, że w związku ze ściślejszymi regulacjami dotyczącymi związków estrogenowych przedostających się do środowiska przez ścieki z oczyszczalni ścieków, konieczne będzie opracowanie bardziej skutecznych technologii oczyszczania ścieków. Zestaw testów opisanych w tym manuskrypcie uzupełnia ekotoksykologiczne i chemiczne testy oceniające zwykle stosowane do zrzutów ścieków z oczyszczalni ścieków. W związku z tym przyszłe zastosowanie tego typu holistycznego zestawu testów powinno umożliwić twórcom technologii oczyszczania ścieków i operatorom zakładów wdrażanie najbardziej bezpiecznych ekologicznie projektów, biorąc pod uwagę najlepsze metody usuwania zarówno określonych regulowanych estrogenowych substancji chemicznych, jak i ogólnej aktywności biologicznej.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Projekty przedstawione w tym artykule zostały sfinansowane przez Severn Trent Water i Brunel University London. Autorzy pragną podziękować Alanowi Henshawowi i Johnowi Churchleyowi za udzielenie pomocy terenowej i laboratoryjnej. T.J.C. dziękuje Heinz Endowments za wsparcie. M.R.M. dziękuje Instytutowi Steinbrennera za stypendium doktoranckie Steinbrennera oraz Carnegie Mellon University za stypendium prezydenckie.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Myjka płytkowa Wellwash Versa | Thermo Scientific | 5165010 | |
| Czytnik płytek | Urządzenia molekularne | SpectraMax 340PC | |
| Inkubator | Memmert | INB 400 | 37 ° Inkubacja C wymagana do oznaczania karpi |
| Fisherbrand whirlimixer | Fisher Scientific | 13214789 | |
| Kostkarka do lodu | Scotsman | AF80 | |
| 12-kanałowa cyfrowa pipeta wielokanałowa F1 | Thermo Scientific Zestawy | 4661070 | |
| ELISA | Biosense Laboratories | V01018401-096 (Strzebla grubogłowy) V01003402-096 (Karp) | |
| Probówki do mikrofug, 0,5 ml | Alpha labs | LW2372 | |
| Probówki do mikrofuge, 1,5 ml | Alpha labs | LW2375 | |
| Kwas siarkowy, 95-98% | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Histology | |||
| Procesor tkanek | Leica Biosystems | TP1020 | |
| Dozownik wosku | Thermo Scientific Raymond Lamb | E66HC | |
| Metalowa forma do zatapiania | Leica Biosystems | Różne | |
| Płyta grzejna | Thermo Scientific Shandon | 3120063 | |
| Zimna płyta (EG1150 C) | Leica Biosystems | 14038838037 | |
| Podgrzewane kleszcze (EG F) | Leica Biosystems | 14038835824 | |
| Mikrotom | Leica Biosystems | RM2235 | |
| Sekcja parafinowa Flotacja kąpiel | Elektrotermiczna | MH8517 | |
| Stół do suszenia szkiełek | Elektrotermiczny | MH6616 | |
| Automatyczny barwnik Stainmate | Thermo Scientific Shandon | E103/S10L | |
| Kasety, Histosette II, biopsja | Simport | M493 | |
| Wosk parafinowy | Thermo Scientific Raymond Lamb | W1 | |
| Histo-Clear II | National Diagnostics | HS-202 | |
| IMS (mieszanka etanolowa), IDA99 | Tennants | ID440 | |
| Polisynowe szkiełka adhezyjne | Thermo Scientific Gerhard Menzel | J2800AMNZ | |
| Szkiełka nakrywkowe, 22x50 mm | VWR | 631-0137 | |
| Histomount | National Diagnostics | HS-103 | |
| Haematoxylin Harris GURR | VWR | 351945S | |
| Eosin, 1%, wodny | Pyramid Inovation | S20007-E | |
| Pudełka na prowadnice Fisherbrand | Fisher Scientific | 11701486 | |
| , MB35 | Thermo Scientific Shandon | 3050835 | |
| Bouin' s rozwiązanie | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Komora sitowa drożdżowa | |||
| przepływowa | Labcaire Systems Ltd | SC12R | |
| Inkubator chłodzony | LMS Inkubator chłodzony | 303 | |
| Inkubator | Memmert | INB 400 | |
| Shaker | Grant | PSU-10i | |
| Fisherbrand whirlimixer | Fisher Scientific | 13214789 | |
| Wytrząsarka płytkowa | Heidolph Titramax 100 | 544-11200-00 | |
| 12-kanałowa cyfrowa pipeta wielokanałowa F1 | Thermo Scientific Finnpipette | 4661070 | |
| 12-kanałowa pipeta, elektroniczna | Sartorius | 735441 | |
| 96-dołkowe | mikropłytki płaskodenneMP Biomedicals Thermo Scientific Nunc Sarstedt | 76-232-05 260860 82.1581.001 | Odkryliśmy, że wszystkie te płytki wielodołkowe wytwarzają wodę o niskiej zawartości tła |
| HPLC | Rathburn | RH1020 | |
| Absolutny etanol | Hayman Kimia | F200238 | |
| Bezwodny fosforan potasu jednozasadowy | bezwodny Sigma-Aldrich | P-5655 | |
| Siarczan amonu | Sigma-Aldrich | A-2939 | |
| Wodorotlenek potasu, granulki | Sigma-Aldrich | P-1767 | |
| Siarczan magnezu, bezwodny | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| Siarczan żelaza(III) | Sigma-Aldrich | 307718 | |
| L-Leucyna | Sigma-Aldrich | L-8912 | |
| L-histydyna | Sigma-Aldrich | H-6034 | |
| Adenina | Sigma-Aldrich | A-2786 | |
| L-Argenina, chlorowodorek | Sigma-Aldrich | A-6969 | |
| L-Metionina | Sigma-Aldrich | M-5308 | |
| L-Tyrozyna | Sigma-Aldrich | T-8566 | |
| L-Izoleucyna | Sigma-Aldrich | I-7403 | |
| L-Lizyna, chlorowodorek | Sigma-Aldrich | L-8662 | |
| L-Fenyloalanina | Sigma-Aldrich | P-5482 | |
| Kwas L-Glutaminowy | Sigma-Aldrich | G-8415 | |
| L-Walina | Sigma-Aldrich | V-0513 | |
| L-Seryna | Sigma-Aldrich | S-4311 | |
| Tiamina, chlorowodorek | Sigma-Aldrich | T-1270 | |
| Pirydoksyna | Sigma-Aldrich | P-5669 | |
| Kwas D-Pantotenowy, sól hemiwapniowa | Sigma-Aldrich | P-5155 | |
| Inozytol | Sigma-Aldrich | I-5125 | |
| D-Biotyna | Sigma-Aldrich | B-4639 | |
| D-(+)-Glukoza bezwodna; mieszane anomery | Sigma-Aldrich | G-7021 | |
| Kwas L-asparaginowy | Sigma-Aldrich | A-4534 | |
| L-treonina | Sigma-Aldrich | T-8441 | |
| Siarczan miedzi(II), bezwodny | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
| Chlorofenol-β-D galaktopyranozyd (CPRG) | Sigma-Aldrich | 10884308001 | |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G-2025 | |
| 17 β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E-8875 | |
| Steroids | |||
| Aceton | Rathburn | ||
| Acetonitryl | Rathburn | ||
| Roztwór amoniaku | Rathburn | ||
| Octan etylu | Rathburn | ||
| Azotan miedzi(II) | Sigma-Aldrich | ||
| Aceton | Rathburn | ||
| Dichlorometan | Rathburn | ||
| 2,4,16,16-d4-17β-estradiol | CDN Izotopy | ||
| 2,4,16,16-d4-estron | CDN Izotopy | ||
| 2,4,16,16-d4-17α-etynylo-estradiol | CDN Izotopy | ||
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | ||
| Estron | Sigma-Aldrich | ||
| 17α-etynylo-estradiol | Sigma-Aldrich | ||
| Heksan | Rathburn | ||
| Kwas solny | Sigma-Aldrich | ||
| Metanol | Sigma-Aldrich | ||
| Wodorowęglan sodu | Sigma-Aldrich | ||
| Wodorotlenek sodu | Sigma-Aldrich | ||
| Styren diwinylo-benzen wkład (Isolute ENV+) wkład do ekstrakcji do fazy stałej (200 mg/6 ml) | Biotage | ||
| Isolute aminopropylowy wkład ekstrakcyjny do fazy stałej (500 mg/6 ml) | Biotage | ||
| Badanie ryb | |||
| pomarańczowo-biały silikonowy przewód kolektora 0,63 otwór PK 6 | Łączniki proste Watson Marlow | 982.0063.000 | |
| do otworu 0,5/0,8 PK 20 | Watson Marlow | 999.2008.000 | |
| rurka silikonowa 0,8 otwór 15 m | Watson Marlow | 913.A008.016 | |
| Wielokanałowa pompa persytaltyczna serii 200 | Watson Marlow | 205CA | |
| Rurka silikonowa x 15 m (zbiorniki dozujące) | Rurka silikonowa VWR | SFM1-3250 | |
| x 15 m (duża do dopływu/odpływu) | VWR | SFM1-5450 | |
| 2,5 l szklany winchester pk 4 | Fisher Scienctific | BTF-505-050B | |
| magnetyczne 51 x 8 mm pk 10 | Fisher Scienctific | FB55595 | |
| 3-aminobenzoesan etylu metanosulfonian (MS222) | Sigma Aldrich | E10521-10G | |
| 17&alfa;-etynyloestradiol | Sigma Aldrich | E4876-100MG | |
| Etanol absolutny | Hayman Kimia | F200238 | |
| SPE | |||
| 1/8 cala Rurki PTFE "słomki" oznaczone kolorem PK 4 | Sigma Aldrich | 57276 | |
| jednorazowe wkładki do rozdzielacza | Sigma Aldrich | 57059 | |
| rurki filtracyjne bez fryt 6 ml pk 30 | Sigma Aldrich | 57242 | |
| adaptery rezerwowe PK 12 | Sigma Aldrich | 57020-U | |
| obciążnik ze stali nierdzewnej do rozdzielacza pk 4 | Sigma Aldrich | 57278 | |
| męski wtyk Luer do rozdzielacza pk 12 | Kolektor próżniowy Sigma Aldrich | 504351 | |
| SPE | Sigma Aldrich | 57265 | |
| do rozdzielacza odciągowego (supelco) PK 12 | Waters | WAT054806 | |
| Sep-Pak Plus C18 cartridge box 50 | Wody | WAT020515 | |
| Metanol klasy HPLC 2,5 l | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| Fiolki szklane 7 ml z pokrywkami (58 x 17 mm) PK 399 | Fisher Scientific | TUL-520-031K | |
| Pompa | próżniowa Hayman Kimia | F200238 | |
| , e.g., pompa próżniowa serii VP | Camlab | 1136915 |
Bibliografia
- Bergman, Å, Heindel, J., Jobling, S., Kidd, K., Zoeller, R. T. State-of-the-science of endocrine disrupting chemicals. Toxicol. Lett. 211, (2012).
- Rodgers-Gray, T. P., et al. Exposure of juvenile roach (Rutilus rutilus) to treated sewage effluent induces dose-dependent and persistent disruption in gonadal duct development. Environ. Sci. Technol. 35 (3), 462-470 (2001).
- Jobling, S., et al. Altered sexual maturation and gamete production in wild roach (Rutilus rutilus) living in rivers that receive treated sewage effluents. Biol. reprod. 66 (2), 272-281 (2002).
- Tyler, C. R., Der Eerden, B. V. an, Jobling, S., Panter, G., Sumpter, J. P. Measurement of vitellogenin, a biomarker for exposure to oestrogenic chemicals, in a wide variety of cyprinid fish. J. Comp. Physiol. B, Biochem. Syst. Environ. Physiol. 166 (7), 418-426 (1996).
- Jobling, S., Nolan, M., Tyler, C. R., Brighty, G., Sumpter, J. P. Widespread sexual disruption in wild fish. Environ. Sci. Technol. 32 (17), 2498-2506 (1998).
- Jobling, S., et al. Predicted exposures to steroid estrogens in U.K. rivers correlate with widespread sexual disruption in wild fish populations. Environ. Health Perspect. 114, Suppl 1. 32-39 (2006).
- Baynes, A., et al. Additional treatment of wastewater reduces endocrine disruption in wild fish - a comparative study of tertiary and advanced treatments. Environ. Sci. Technol. 46 (10), 5565-5573 (2012).
- Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environ. Toxicol. Chem. 15 (3), 241-248 (1996).
- Grover, D. P., Balaam, J., Pacitto, S., Readman, J. W., White, S., Zhou, J. L. Endocrine disrupting activities in sewage effluent and river water determined by chemical analysis and in vitro assay in the context of granular activated carbon upgrade. Chemosphere. 84 (10), 1512-1520 (2011).
- The determination of steroid oestrogens in waters using chromatography and mass spectrometry (2008) Methods for the Examination of Waters and Associated Materials. (2008), Environment Agency. Bristol, UK. (2008).
- Van den Belt, K., Berckmans, P., Vangenechten, C., Verheyen, R., Witters, H. Comparative study on the in vitro/in vivo estrogenic potencies of 17beta-estradiol, estrone, 17alpha-ethynylestradiol and of 17beta-estradiol, estrone, 17alpha-ethynylestradiol and nonylphenol. Aquat. toxicol. 66 (2), 183-195 (2004).
- Mills, M. R., et al. Removal of ecotoxicity of 17α-ethinylestradiol using TAML/peroxide water treatment. Sci. Rep. 5, 10511(2015).
- EN 14962:2006 Water quality - Guidance on the scope and selection of fish sampling methods. , British Standards Institute. London, UK. (2006).
- Beresford, N., Brian, J. V., Runnalls, T. J., Sumpter, J. P., Jobling, S. Estrogenic activity of tropical fish food can alter baseline vitellogenin concentrations in male fathead minnow (Pimephales promelas). Environ. Toxicol. Chem. 30 (5), 1139-1145 (2011).
- Nolan, M., Jobling, S., Brighty, G., Sumpter, J. P., Tyler, C. R. A histological description of intersexuality in the roach. J. Fish Biol. 58 (1), 160-176 (2001).
- Dascenzo, G., et al. Fate of natural estrogen conjugates in municipal sewage transport and treatment facilities. Sci. Total Environ. 302 (1-3), 199-209 (2003).
- Gomes, R. L., Birkett, J. W., Scrimshaw, M. D., Lester, J. N. Simultaneous determination of natural and synthetic steroid estrogens and their conjugates in aqueous matrices by liquid chromatography/mass spectrometry. Int. J. Environ. Anal. Chem. 85 (1), 1-14 (2005).
- Metcalfe, C. D., et al. Estrogenic potency of chemicals detected in sewage treatment plant effluents as determined by in vivo assays with Japanese medaka (Oryzias latipes). Environ. Toxicol. Chem. 20 (2), 297-308 (2001).
- Stalter, D., Magdeburg, A., Wagner, M., Oehlmann, J. Ozonation and activated carbon treatment of sewage effluents: Removal of endocrine activity and cytotoxicity. Water Res. 45 (3), 1015-1024 (2011).
- Caldwell, D. J., Mastrocco, F., Anderson, P. D., Länge, R., Sumpter, J. P. Predicted-no-effect concentrations for the steroid estrogens estrone, 17β-estradiol, estriol, and 17α-ethinylestradiol. Environ. Toxicol. Chem. 31 (6), 1396-1406 (2012).
- Gardner, M., Comber, S., Scrimshaw, M. D., Cartmell, E., Lester, J., Ellor, B. The significance of hazardous chemicals in wastewater treatment works effluents. Sci. Total Environ. 437, 363-372 (2012).
- Filby, A. L., Shears, J. A., Drage, B. E., Churchley, J. H., Tyler, C. R. Effects of advanced treatments of wastewater effluents on estrogenic and reproductive health impacts in fish. Environ. Sci. Technol. 44 (11), 4348-4354 (2010).
- Magdeburg, A., Stalter, D., Oehlmann, J. Whole effluent toxicity assessment at a wastewater treatment plant upgraded with a full-scale post-ozonation using aquatic key species. Chemosphere. 88 (8), 1008-1014 (2012).
- Collins, T. J. TAML oxidant activators: a new approach to the activation of hydrogen peroxide for environmentally significant problems. Acc. Chem. Res. 35 (9), 782-790 (2002).
- Collins, T. J. Designing Ligands for Oxidizing Complexes. Acc. Chem. Res. 27 (9), 279-285 (1994).
- Truong, L., Denardo, M. A., Kundu, S., Collins, T. J., Tanguay, R. L. Zebrafish Assays as Developmental Toxicity Indicators in The Design of TAML Oxidation Catalysts. Green Chem. 15 (9), 2339-2343 (2013).
- Murk, A. J., et al. Detection of estrogenic potency in wastewater and surface water with three in vitro bioassays. Environ. Toxicol. Chem. 21 (1), 16-23 (2002).
- Test No 455: The Stably Transfected Human Estrogen Receptor-alpha Transcriptional Activation Assay for Detection of Estrogenic Agonist-Activity of Chemicals. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2009).
- Kolle, S. N., et al. In house validation of recombinant yeast estrogen and androgen receptor agonist and antagonist screening assays. Toxicol in Vitro. 24 (7), 2030-2040 (2010).
- Lee, O., Tyler, C. R., Kudoh, T. Development of a transient expression assay for detecting environmental oestrogens in zebrafish and medaka embryos. BMC Biotechnology. 12, 32(2012).
- Brian, J. V., et al. Accurate prediction of the response of freshwater fish to a mixture of estrogenic chemicals. Environ Health Perspect. 113 (6), 721-728 (2005).
- Test No 229: Fish Short Term Reproduction Assay. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing. Paris. (2009).
- Test No 230: 21-day Fish Assay: A Short-Term Screening for Oestrogenic and Androgenic Activity and Aromatase Inhibition. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing. Paris. (2009).
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie