Artykuł metodologiczny

Posiew czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów Zróżnicowane ludzkie makrofagi pochodzące z monocytów

30.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54244

⸱

30 czerwca 2016

 , 
1Experimental Atherosclerosis Section, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono protokół dla hodowli komórkowej makrofagów makrofagów stymulujących tworzenie kolonii (M-CSF) zróżnicowanych ludzkich makrocytów pochodzących z monocytów. Protokół wykorzystuje krioprezerwację monocytów w połączeniu z ich masowym różnicowaniem do makrofagów. Następnie zebrane makrofagi można następnie wysiać w studzienkach hodowlanych o wymaganej gęstości komórek do przeprowadzenia eksperymentów.

Streszczenie

Przedstawiono protokół dla hodowli komórkowej makrofagów makrofagów stymulujących tworzenie kolonii (M-CSF) zróżnicowanych ludzkich makrocytów pochodzących z monocytów. W celu rozpoczęcia eksperymentów, świeże lub mrożone monocyty hoduje się w kolbach przez 1 tydzień z M-CSF w celu wywołania ich różnicowania w makrofagi. Następnie makrofagi można zebrać i wysiać w studzienkach hodowlanych o wymaganej gęstości komórek do przeprowadzenia eksperymentów. Użycie określonej liczby makrofagów, a nie określonej liczby monocytów do inicjacji kultur makrofagów do eksperymentów, daje kultury makrofagów, w których pożądana gęstość komórek może być osiągana bardziej konsekwentnie. Zastosowanie kriokonserwowanych monocytów zmniejsza zależność od dostępności dawców i pozwala uzyskać bardziej jednorodne kultury makrofagów.

Wprowadzenie

Badanie hodowanych makrofagów jest użytecznym modelem do zrozumienia funkcji tych komórek w stanach zapalnych, takich jak to ma miejsce w blaszkach miażdżycowych. Gdy badania koncentrują się na chorobach ludzi obejmujących makrofagi, przydatne jest badanie pierwotnych makrofagów ludzkich, a nie makrofagów innych niż ludzie, aby uniknąć różnic gatunkowych. Ponadto skutków transformacji komórek można uniknąć, stosując pierwotne makrofagi, a nie linie komórkowe makrofagów. W tym celu makrofagi zróżnicowane z monocytów wyizolowanych z ludzkiej krwi służą jako sposób na uzyskanie pierwotnych makrofagów ludzkich.

Makrofagi tkankowe mogą być albo rezydowane w tkankach, albo mogą pochodzić z monocytów, które migrują do tkanki i różnicują się w makrofagi 1. Zdefiniowano dwa typy ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów, które różnią się nie tylko morfologią, ale także ekspresją genów i funkcją komórki 2. Te dwa typy uzyskuje się z monocytów, które są zróżnicowane w makrofagi w obecności M-CSF + płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i monocytów, które są różnicowane w makrofagi w obecności czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów (GM-CSF) + FBS 2-6. Z naszego doświadczenia (obserwacja niepublikowana) wynika, że stosowanie surowicy ludzkiej zamiast FBS generuje typ GM-CSF niezależnie od tego, czy w pożywce różnicującej znajduje się M-CSF czy GM-CSF. Makrofagi typu M-CSF są zwykle bardziej wydłużone niż makrofagi typu GM-CSF, które swoją morfologią przypominają jajka sadzone. Badacze powinni uznać, że ludzkie makrofagi pochodzące z monocytów M-CSF i GM-CSF to nie to samo, co tak zwane makrofagi M1 i M2 pochodzące ze szpiku kostnego myszy 6.

Podczas badań z wykorzystaniem ludzkich makrofagów M-CSF pochodzących z monocytów, doświadczyliśmy trudności związanych z dostępnością monocytów do inicjowania eksperymentów i zmiennością uzyskanej gęstości komórek makrofagów podczas różnicowania monocytów w makrofagi. Aby przezwyciężyć te problemy, opracowaliśmy następujący protokół, w którym monocyty są zamrażane do czasu, gdy będą potrzebne do użycia, a monocyty są różnicowane luzem w makrofagi, które można następnie usunąć z kolb hodowlanych i posiać w pożądanej gęstości komórek, aby uzyskać bardziej jednolite kultury z eksperymentu na eksperyment

.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Leukafereza została przeprowadzona zgodnie z protokołem badawczym na ludziach, zatwierdzonym przez instytucjonalną komisję rewizyjną National Institutes of Health.

1. Izolacja i kriokonserwacja monocytów

  1. Otrzymać komórki jednojądrzaste metodą leukaferezy dawców ludzkich i wzbogacić monocyty przez ciągłą elutriację komórek jednojądrzastych przez wirowanie przeciwprądowe, jak opisano w piśmiennictwie 7,8. Otrzymać około 100 x 106 elutriowanych komórek (około 80 - 90% monocytów) w buforze elutrycyjnym określonym przez producenta. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
  2. Odwirować monocyty w probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Usunąć supernatant i delikatnie ponownie zawiesić komórki w FBS, a następnie dimetylosulfotlenek, aby osiągnąć końcowe stężenie 90% FBS/10% dimetylosulfotlenku i 50 x 106 komórek/ml.
  4. Dodać każdy ml zawiesiny komórkowej do indywidualnego kriowialu.
  5. Umieścić kriowiale w pojemniku do zamrażania komórek i przenieść do zamrażarki o temperaturze -80 °C na 24 godziny przed przeniesieniem do kriowialnego zbiornika z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.

2. Różnicowanie monocytów na makrofagi

  1. Rozmrozić kriowial komórek, szybko przenosząc go do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, a następnie natychmiast usuwając, gdy zawiesina komórek rozmrozi się o około 70%.
  2. Natychmiast po całkowitym rozmrożeniu w temperaturze pokojowej przenieś 1 ml zawartości kriowialnej do 50 ml podgrzałego podłoża Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 o temperaturze 37 °C z 2 mM L-glutaminy, 50 ng / ml M-CSF, 25 ng / ml interleukiny-10 (IL-10) i 10% FBS (kompletna pożywka).
  3. Przenieść 25 ml zawiesiny monocytów do każdej z dwóch plastikowych kolb do hodowli komórkowycho długości 75 cm2.
  4. Inkubować kultury w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 / 95% powietrzem przez 48 godzin.
  5. Wypłucz kultury 3 razy 10 ml pożywki RPMI 1640 (podgrzanej do 37 °C), delikatnie usuwając pożywkę, aby uniknąć przemieszczenia luźno przyczepionych komórek.
  6. Po wypłukaniu dodaj świeżą, kompletną pożywkę, zmieniając pożywkę co 2 dni, aż monocyty zróżnicują się i namnażą na tyle, aby się zlały. Wymaga to około tygodnia kultury.

3. Zbieranie makrofagów w celu rozpoczęcia eksperymentów

  1. Przepłukać zróżnicowane makrofagi w kolbie 3 razy 10 ml wstępnie podgrzanego roztworu soli fizjologicznej Dulbecco buforowanego fosforanem o temperaturze 37 °C bez Ca2+ i Mg2+ przed dodaniem 10 ml wstępnie podgrzanego roztworu 0,25% kwasu trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) o temperaturze 37 °C.
  2. Umieścić kolbę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 10 - 15 minut, w tym czasie około 90% makrofagów powinno się zaokrąglić i oderwać. Sprawdzić to za pomocą badania mikroskopowego kolby.
  3. Dodać 10 ml pożywki RMPI 1640 zawierającej 10% FBS, aby zatrzymać trypsynizację.
  4. Przenieść zawiesinę komórek makrofagów z kolby do probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml, odwirować 300 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
  5. Delikatnie zawiesić makrofagi w 1 ml kompletnej pożywki.
  6. Zmieszać 10 μl zawiesiny komórek makrofagów z 10 μl roztworu błękitu trypanowego i określić liczbę komórek makrofagów oraz żywotność (zwykle > 95%) za pomocą hemocytometru.
  7. Na podstawie liczby komórek (zwykle około 15 - 18 x 105 makrofagów) dodaj dodatkowe kompletne podłoże, aby osiągnąć pożądaną gęstość komórek wysiewu. Uwaga: 1 x 105 makrofagów w 1,5 ml pożywki na dołek 12-dołkowej płytki wytworzy prawie zlewającą się kulturę.
  8. Po wysiewie inkubować makrofagi przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 / 95% powietrzem, aby umożliwić przyczepienie komórek. Następnie rozpocznij pożądane eksperymenty.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Żywotność świeżych lub kriozach somehow zachowanych monocytów wynosiła ponad 95%, co określono za pomocą barwienia błękitem trypanowym. 9. Rycina 1 i Rysunek 2 porównaj odpowiednio przy mniejszym i większym powiększeniu postępy świeżych i kriokonserwowanych (t. j., zamrożonych) różnicowanie monocytów w makrofagi. Należy zauważyć, że w porównaniu z monocytami kriozachowanymi, monocyty świeże wykazują subpopulację różnic...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Generowanie zdefiniowanych typów makrofagów może wyjaśnić niektóre ze sprzecznych wyników uzyskanych przez badaczy podczas badania biologii makrofagów. Wykorzystanie różnych warunków hodowli i czynników różnicujących do wytworzenia pierwotnych ludzkich makrofagów może prowadzić do bardzo różnych typów makrofagów, co może nie zostać docenione przez badacza. Na przykład makrofagi są czasami generowane z ludzkich monocytów bez surowicy, samej surowicy ludzkiej, surowicy ludzkiej uzupełnionej M-CSF, FBS samym lub FBS zawiera...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Departament Medycyny Transfuzjologicznej, Centrum Kliniczne, National Institutes of Health, dostarczył elutryzowane monocyty. Praca ta była wspierana przez Intramural Research Program, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cellbind 12-dołkowa płytka hodowlanaCorning3336
CELLSTAR, kolba T-75, pożywka do hodowli tkankowejGreiner Bio-One North America658157
RPMI 1640Cellgro Mediatech15-040-CMpodgrzana do 37 stopni Celsjusza; C
L-GlutaminaCellgro Mediatech25-005-CI
Surowica bydlęcapłodu Gibco16000-036
M-CSFPeproTech300-25
GM-CSFPeproTech300-03
IL-10 PeproTech200-10
DMSOSigmaD2650
Kriowalny Thermo Scientific 
DPBS bez Ca2+ i Mg2+ Corning cellgro21-031-CV
0,25% Trypsyna-EDTA Gibco25200-056
50 ml polipropylenowa rurka stożkowaFalcon352070
TrypanBlue Lonza17-942E
NeubaueraPaul Marienfeld GmbH & Co. KG610031http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html
zamrażanie komórek CoolCell LX pojemnikBioCisionBCS-405inne pojemniki do zamrażania również powinny  być odpowiednie do tego etapu
System Magazynowania Ciekłego Azotu, CryoPlus 1Thermo Scientific 7400Każdy zbiornik ciekłego azotu powinien być odpowiedni
375418 Hemocytometr światła jasnego z ulepszeniem

Bibliografia

  1. Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages. Front. Immunol. 5, 683(2014).
  2. Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
  3. Akagawa, K. S. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Int. J. Hematol. 76, 27-34 (2002).
  4. Akagawa, K. S., et al. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Respirology. 11 Suppl, S32-S36 (2006).
  5. Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J. Immunol. 178, 5245-5252 (2007).
  6. Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. J. Immunol. 188, 5752-5765 (2012).
  7. Strasser, E. F., Eckstein, R. Optimization of leukocyte collection and monocyte isolation for dendritic cell culture. Transfus. Med. Rev. 24, 130-139 (2010).
  8. Kim, S., et al. Monocyte enrichment from leukapheresis products by using the Elutra cell separator. Transfusion (Paris). 47, 2290-2296 (2007).
  9. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
  10. Anzinger, J. J., et al. Native low-density lipoprotein uptake by macrophage colony-stimulating factor-differentiated human macrophages is mediated by macropinocytosis and micropinocytosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, 2022-2031 (2010).
  11. Zhao, B., et al. Constitutive receptor-independent low density lipoprotein uptake and cholesterol accumulation by macrophages differentiated from human monocytes with macrophage-colony-stimulating factor (M-CSF). J. Biol. Chem. 281, 15757-15762 (2006).
  12. Freeman, S. R., et al. ABCG1-mediated generation of extracellular cholesterol microdomains. J. Lipid Res. 55, 115-127 (2014).
  13. Kruth, H. S. Receptor-independent fluid-phase pinocytosis mechanisms for induction of foam cell formation with native low-density lipoprotein particles. Curr. Opin. Lipidol. 22, 386-393 (2011).
  14. Jin, X., et al. ABCA1 contributes to macrophage deposition of extracellular cholesterol. J. Lipid Res. 56, 1720-1726 (2015).
  15. Ong, D. S., et al. Extracellular cholesterol-rich microdomains generated by human macrophages and their potential function in reverse cholesterol transport. J. Lipid Res. 51, 2303-2313 (2010).
  16. Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10. Blood. 89, 315-321 (1997).
  17. Hashimoto, S. I., Komuro, I., Yamada, M., Akagawa, K. S. IL-10 inhibits granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent human monocyte survival at the early stage of the culture and inhibits the generation of macrophages. J. Immunol. 167, 3619-3625 (2001).
  18. Lund, P. K., Joo, G. B., Westvik, A. B., Ovstebo, R., Kierulf, P. Isolation of monocytes from whole blood by density gradient centrifugation and counter-current elutriation followed by cryopreservation: six years' experience. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 60, 357-365 (2000).
  19. Weiner, R. S., Normann, S. J. Functional integrity of cryopreserved human monocytes. J. Natl. Cancer Inst. 66, 255-260 (1981).
  20. Hansen, J. B., et al. Retention of phagocytic functions in cryopreserved human monocytes. J. Leukoc. Biol. 57, 235-241 (1995).
  21. Seager Danciger, J., et al. Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation. J. Immunol. Methods. 288, 123-134 (2004).
  22. Jin, X., Xu, Q., Champion, K., Kruth, H. S. Endotoxin contamination of apolipoprotein A-I: effect on macrophage proliferation--a cautionary tale. Atherosclerosis. 240, 121-124 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

R nicowanie indukowane M CSFkriotrza e monocytyprotok hodowli kom rkowejfrakcja naczyniowo stromalnacytometria przep ywowaliczenie kom r w komorze licznikowejprocedura trypsynizacjipo ywka RPMI 1640g sto zasiewu kom rek

Powiązane artykuły