Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowane tworzenie dwuwarstwowej błony lipidowej za pomocą cienkiej warstwy polidimetylosiloksanu

DOI:

10.3791/54258

⸱

10 lipca 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Engineering, Inha University, 2Department of Mechanical Engineering, Inha University, 3Biohybrid Systems Research Center (BSRC), Inha University, 4Convergent Research Center for Metabolism and Immunoregulation (CRCMI), Inha University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Demonstrujemy system tworzenia dwuwarstwowych lipidów, który można przechowywać, przenośny. Dwuwarstwowa błona lipidowa może powstać w ciągu 1 godziny z ponad 80% skutecznością, gdy zamrożony prekursor błony zostanie doprowadzony do temperatury otoczenia. System ten ograniczy pracochłonne procesy i wiedzę specjalistyczną związaną z kanałami jonowymi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sztuczna dwuwarstwa lipidowa, czyli błona lipidowa (BLM), jest potężnym narzędziem do badania kanałów jonowych i interakcji białek, a także do zastosowań biosensorów. Jednak konwencjonalne techniki formowania BLM mają kilka wad i często wymagają specjalistycznej wiedzy i pracochłonnych procesów. W szczególności konwencjonalne BLM cierpią z powodu niskich wskaźników powodzenia formacji i niespójnego czasu tworzenia membrany. Tutaj demonstrujemy składowany i przenośny system tworzenia BLM z kontrolowanym czasem rozrzedzania i zwiększoną szybkością tworzenia BLM poprzez zastąpienie konwencjonalnie stosowanych folii (politetrafluoroetylen, polioksymetylen, polistyren) polidimetylosiloksanem (PDMS). W tym eksperymencie stosuje się polimer o porowatej strukturze, taki jak cienka warstwa PDMS. Ponadto, w przeciwieństwie do konwencjonalnie stosowanych rozpuszczalników o niskiej lepkości, zastosowanie skwalenu umożliwiło kontrolowany czas rozrzedzania poprzez powolną absorpcję rozpuszczalnika przez PDMS, co wydłużyło żywotność membrany. Ponadto, dzięki zastosowaniu mieszaniny skwalenu i heksadekanu, podwyższono temperaturę zamarzania roztworu lipidowego (~16 °C), ponadto wyprodukowano prekursory błonowe, które można przechowywać w nieskończoność i łatwo transportować. Te prekursory błonowe skróciły czas tworzenia BLM < 1 godzinę i osiągnęły szybkość tworzenia BLM na poziomie ~80%. Co więcej, eksperymenty z kanałami jonowymi z gramicydyną A wykazały wykonalność systemu membranowego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sztuczna dwuwarstwowa błona lipidowa, lub błona lipidowa (BLM), jest ważnym narzędziem do wyjaśnienia mechanizmów działania błon komórkowych i kanałów jonowych, a także do zrozumienia interakcji między kanałami jonowymi a jonami/cząsteczkami. 1-7 Chociaż metoda patch-clamp jest często uważana za złoty standard w badaniach błon komórkowych, jest pracochłonna i wymaga wysoko wykwalifikowanych operatorów do pomiarów kanałów jonowych. 8 Podczas gdy sztucznie odtworzone dwuwarstwowe błony lipidowe pojawiły się jako alternatywne narzędzia do badań kanałów jonowych,9,10 są one również związane z pracochłonnymi procesami i specyficzną wiedzą specjalistyczną. Ponadto membrany są podatne na zakłócenia mechaniczne. W związku z tym wprowadzone do tej pory technologie dwuwarstwowe lipidów mają ograniczone zastosowania praktyczne. 11

W celu zwiększenia wytrzymałości i trwałości dwuwarstwowych błon lipidowych, Costello i wsp.12, a Ide i Yanagida13 opracowały wolnostojącą dwuwarstwę lipidową wspartą hydrożelami. Pomimo zwiększonej trwałości (< 24 godzin), wytrzymałość dwuwarstwowa nie uległa poprawie. Jeon i wsp.W ramach projektu 14 opracowano hydrożelową membranę kapsułkowaną (HEM) z intymnym kontaktem hydrożelowo-lipidowym, co skutkuje wydłużeniem żywotności (do kilku dni). Aby jeszcze bardziej wydłużyć żywotność HEM, Malmstadt i Jeon i in. stworzyli membranę otoczoną hydrożelem z wiązaniem hydrożelowo-lipidowym poprzez koniugację kowalencyjną in-situ (cgHEM). 15 W obu systemach żywotność membrany znacznie się wydłużyła (> 10 dni). Jednak systemy tworzenia błon nie były wystarczająco wytrzymałe i nie mogły być przechowywane ani dostarczane tam, gdzie było to wymagane, aby uwolnić wiedzę specjalistyczną do wykorzystania dwuwarstw lipidowych.

Rozwój dwuwarstwowej platformy lipidowej koncentrował się przede wszystkim na zwiększeniu wytrzymałości i długowieczności BLM. Chociaż żywotność BLM została ostatnio znacznie zwiększona, ich zastosowania były ograniczone ze względu na brak możliwości transportu i przechowywania. Aby przezwyciężyć te problemy, Jeon i in. stworzyli system membranowy, który można przechowywać, i wprowadzili prekursor membranowy (MP). 16 Aby skonstruować MP, przygotowali mieszaninę n-dekanu i heksadekanu zawierającą 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-fosfatydylocholiny) w celu kontrolowania temperatury zamarzania roztworu lipidowego w taki sposób, aby zamarzał on w temperaturze ~14 °C (poniżej temperatury pokojowej, powyżej typowej temperatury lodówki). W tym eksperymencie MP rozprowadzono na małym otworze na folii z politetrafluoroetylenu (PTFE), a następnie zamrożono w lodówce w temperaturze 4 °C. Kiedy MP został doprowadzony do temperatury pokojowej, MP rozmroził się i automatycznie utworzyła się dwuwarstwa lipidowa, eliminując wiedzę specjalistyczną zwykle związaną z tworzeniem błony. Jednak wskaźnik sukcesu BLM wykonanego z MP wynosił zaledwie ~27%, a czas tworzenia membrany był niespójny (od 30 minut do 24 godzin), co ograniczało jego praktyczne zastosowania.

W tym badaniu, zamiast konwencjonalnych hydrofobowych cienkich warstw (PTFE, polioksymetylen, polistyren) użyto cienkiej warstwy polidimetylosiloksanu (PDMS), aby (a) kontrolować czas produkcji i (b) zwiększyć wskaźnik sukcesu tworzenia BLM, jak wcześniej zgłaszali Ryu i inni.17 W tym przypadku tworzenie błony było ułatwione przez ekstrakcję rozpuszczalników ze względu na porowaty charakter PDMS, a czas potrzebny do utworzenia membrany był z powodzeniem kontrolowany w tym badaniu. W tym systemie, gdy roztwór lipidowy został wchłonięty przez cienką warstwę PDMS, osiągnięto stały czas tworzenia błony. Co więcej, żywotność membrany została wydłużona ze względu na powolną absorpcję rozpuszczalników do cienkiej warstwy PDMS, w wyniku dodania skwalenu do roztworu lipidowego. Przeprowadziliśmy pomiary optyczne i elektryczne, aby sprawdzić, czy membrany uformowane tą techniką nadają się do badań kanałów jonowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie roztworu

  1. Przygotowanie roztworu buforowego:
    1. Aby sformułować roztwór buforowy, rozpuść 1 M KCl (chlorek potasu), 10 mM Tris-HCl (chlorowodorek tris) i 1 mM EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) w wodzie destylowanej i dostosuj pH do 8,0.
    2. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,20 μm. Aby wysterylizować, należy sterylizować roztwór w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut.
  2. Przygotowanie roztworu lipidowego do wstępnego malowania:
    1. Aby przygotować roztwór lipidowy do wstępnego malowania, należy rozpuścić 3% lipid DPhPC (1,2-difitanoilo-sn-glicero-3-fosfatydylocholiny) (w:v) w mieszaninie 2:8 n-dekanu i heksadekanu (v:v). Mieszać przez noc za pomocą rotatora.
  3. Przygotowanie roztworu lipidowego do tworzenia błony:
    1. Aby sformułować roztwór lipidowy do tworzenia błony, rozpuść 0,1% lipid DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-fosfatydylocholina) (w:v) w mieszaninie skwalenu 2:8 i heksadekanu (v:v). Mieszaj przez noc za pomocą rotatora.

2. Tworzenie cienkiej warstwy PDMS

  1. Wymieszaj PDMS i utwardzacz w proporcji 9:1 (w/w) w kubku do mieszania, aby utworzyć prepolimer PDMS. Dodać 5 g prepolimeru PDMS do szalki Petriego, aby utworzyć cienką warstwę PDMS (grubość 200 - 250 μm). Rozprowadzić prepolimer PDMS za pomocą powlekarki wirowej z prędkością 800 obr./min przez 10 sekund, aby utworzyć cienką warstwę.
  2. Umieścić szalkę Petriego w eksykatorze próżniowym pod ciśnieniem 100 mTorr na 2 godziny w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Aby spolimeryzować cienką warstwę prepolimeru, piecz w piekarniku przez 5 godzin w temperaturze 70 °C.
  3. Aby uzyskać kwadratową cienką folię PDMS, pokrój spolimeryzowaną cienką folię PDMS na kwadraty o wymiarach 2 x 2 cm2. Użyj mikrodziurkacza o średnicy 500 μm, aby zrobić otwór w środku cienkiej warstwy PDMS. Wstępnie pomaluj otwory 3% roztworem lipidowym DPhPC zmieszanym z n-dekanem i heksadekanem w proporcji 2:8.

3. Produkcja i montaż komór

  1. Aby wyprodukować komorę BLM, zaprojektuj dwa symetryczne bloki komory za pomocą oprogramowania do rysowania 3D o wymiarach zewnętrznych 4 cm x 1,5 cm x 1 cm i wymiarach studni wewnętrznej 1,5 cm x 1,3 cm x 0,8 cm17.
  2. Wykonaj komorę za pomocą bloku PTFE za pomocą maszyny CNC i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.

4. Zgromadzenie Izby

  1. Aby zmontować komorę, umieść wstępnie pomalowaną cienką warstwę PDMS między dwoma blokami PTFE tak, aby otwór na cienkiej folii PDMS był wyrównany z otworem w komorze.
  2. Uszczelnij zewnętrzne krawędzie komory za pomocą szkła nakrywkowego ze smarem (ułatwiającym obserwację optyczną). Unieruchomić zmontowaną komorę za pomocą nakrętek i.
    UWAGA: Upewnij się, że komora jest dobrze uszczelniona, aby nie było wycieku płynu.

5. Tworzenie prekursora membranowego z przyspieszonym tworzeniem samoorganizacji (MPES)

  1. Za pomocą pipety nanieść 0,5 μl 0,1% lipidu DPhPC zmieszanego z n-dekan:heksadekanem w proporcji 2:8 na otwór cienkiej warstwy PDMS połączonej z komorą.
  2. Przed użyciem należy przechowywać komorę w zamrażarce lub lodówce w temperaturze poniżej 10 °C.

6. Tworzenie i weryfikacja membrany

  1. Aby utworzyć BLM z MPES, wyjmij komorę z lodówki i zawiesij 2 ml roztworu buforowego z każdej strony komory. Odstawić komorę na < 10 minut, aż zamrożony prekursor błonowy rozmrozi się.
  2. Umieść komorę na mikromanipulatorze, aby precyzyjnie kontrolować wysokość w stosunku do źródła światła i mikroskopu. Oświetl jedną stronę komory jako źródło światła za pomocą halogenowego oświetlacza światłowodowego, aby rozjaśnić aperturę cienkiej warstwy PDMS do optycznej obserwacji procesu powstawania BLM.
  3. Po drugiej stronie umieść mikroskop cyfrowy pionowo w stosunku do źródła światła, aby obserwować powstawanie BLM (powiększ 200X).
  4. Aby potwierdzić powstawanie BLM, obserwuj środek apertury, w którym kolor staje się jaśniejszy niż pierścień.

7. Zapis elektryczny

  1. Do pomiaru elektrycznego przygotuj elektrody Ag/Cl za pomocą srebrnego drutu o grubości 208 μm i wybielaj w podchlorynie sodu przez > 1 minutę. Umieść elektrody Ag/Cl z każdej strony komory na tyle głęboko, aby można je było zanurzyć w roztworze buforowym.
  2. Podłącz elektrody do mikroelektrody amplifier. Korzystając z oprogramowania do elektrofizjologii, zastosuj trójkątny kształt fali ±10 mV w poprzek membrany, aby uzyskać falę prostokątną. Ustaw napięcie zasilania, klikając strzałki wskazane na V_clamp (mV).
  3. Zapisz właściwości elektryczne membrany, klikając przycisk nagrywania (ikona czerwonej kropki). Kontynuuj nagrywanie, aż zostanie zaobserwowana jednolita fala prostokątna. Wyjdź z nagrywania, klikając ikonę czarnego kwadratu.

8. Włączenie kanału jonowego

UWAGA: Włączenie gramikadyny A (gA) następuje spontanicznie po utworzeniu BLM, ponieważ gA jest dodawana bezpośrednio do roztworu lipidowego.

  1. Aby zaobserwować aktywność kanału gA, należy przyłożyć 100 mV w poprzek membrany z częstotliwością próbkowania 5 kHz, aby zmierzyć potencjał utrzymywania membrany. Ustaw napięcie zasilania, klikając strzałki wskazane na V_clamp (mV).
  2. Zapisz właściwości elektryczne włączenia gA, klikając przycisk nagrywania (ikona czerwonej kropki). Kontynuuj nagrywanie, aż zostaną zaobserwowane bieżące skoki. Wyjdź z nagrywania, klikając ikonę czarnego kwadratu.
  3. Po zebraniu danych elektrycznych przefiltruj dane za pomocą dolnoprzepustowego filtra Bessela przy 100 Hz za pomocą oprogramowania do elektrofizjologii.
  4. Obserwuj skoki prądu w przefiltrowanych danych o potencjale utrzymywania (każdy skok prądu, ~0,15 nS, reprezentuje dimeryzację kanału jonowego gA), aby zweryfikować włączenie gA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optymalizacja składu rozwiązania MPES
Przetestowano różne kompozycje lipidów i rozpuszczalników, aby skutecznie odtworzyć dwuwarstwowe błony lipidowe z MPES. System MP z mieszaniną n-dekanu i heksadekanu zawierającą 3% DPhPC14 wykazywał niski wskaźnik powodzenia tworzenia błony (~27%). Ponadto, ponieważ folia PDMS w sposób ciągły ekstrahowała roztwór lipidowy, konieczne było zoptymalizowanie składu rozpuszczalnika w celu utrzymania nienaruszonej dw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasza technika tworzenia BLM stanowi potężne narzędzie do badań błon komórkowych i kanałów jonowych, w przeciwieństwie do konwencjonalnych technik, które mają ograniczony potencjał do zastosowań przemysłowych. Opracowaliśmy prekursor membranowy przy użyciu cienkiej warstwy PDMS i opracowaliśmy zamrożony prekursor membranowy z przyspieszoną samoorganizacją.

W przeciwieństwie do konwencjonalnych metod tworzenia błon z foliami hydrofobowymi, w których tworzenie błony następuje tylko poprzez inter...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Program Centrum Badawczego Pionierów (NRF-2012-0009575) oraz granty Narodowej Fundacji Badawczej (NRF-2012R1A1B4002413, NRF-2014R1A1A2059341) z Narodowej Fundacji Badawczej Korei. Prace te były również częściowo wspierane przez Inha University Research Grant.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorek potasuSigma-AldrichP9333Do roztworu buforowego
Chlorowodorek trisuSigma-Aldrich1185-53-1Do roztworu buforowego
Kwas etylenodiaminotetraoctowySigma-Aldrich60-00-4Do roztworu buforowego
n-dekanSigma-Aldrich44074-UDo roztworu
lipidowegoHexadecaneSigma-Aldrich544-76-3Do roztworu lipidów
SkwalenSigma-AldrichS3626Do roztworu lipidów
Gramicidin ASigma-Aldrich11029-61-1Białko błonowe
1,2-difitanoyl-sn-glicero-3-fosfocholinaAvanti Polar Lipids, Inc.850356Do tworzenia membrae
Sylgard 184a i 184b zestaw elastromerowyDow Corning AsiaDo produkcji cienkiej warstwy PDMS
0,2 i mu; m filtrSatorius stedim16534----------KDo filtrowania roztworu buforowego
RotatorFinePCRAGDo jednorodnego rozpuszczania lipidów
AutoklawBiofreeBF-60ACDo sterylizacji roztworu buforowego
Powlekarka wirowaShinu MstSP-60PDo rozprowadzania prepolimeru PDMS
Eksykator próżniowyWelch2042-22Do usuwania pęcherzyków powietrza w prepolimerze PDMS
500 μ m  dziurkaczHarris Uni-Core0.5Aby utworzyć aperturę na cienkowarstwowej
maszynie CNCSME tradingSME 2518Aby wyprodukować komorę do formowania membrany
Halogenowy oświetlacz światłowodowyMoticMLC-150CDo oświetlania apertury cienkiej warstwy PDMS do obserwacji optycznej
Mikroskop cyfrowyCyfrowy niebieskiQX-5Aby optycznie obserwować dwuwarstwową błonę lipidową Formacja
ElektrodaA-MDo elektrycznej obserwacji tworzenia się membrany
Wzmacniacz mikroelektrod (wzmacniacz Axopatch)Axon InstrumentsWzmacniacz Axopatch 200BDo pomiaru pojemności membrany (opisany w manuskrypcie jako wzmacniacz mikroelektrod)
PDMS Systemy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanke, W., Schulue, W. Planar lipid bilayers: methods and applications. , Academic Press. (2012).
  2. Mirzabekov, T. A., Silberstein, A. Y., Kagan, B. L. Use of planar lipid bilayer membranes for rapid screening of membrane active compounds. Methods Enzymol. 294, 661-674 (1999).
  3. Bayley, H., Cremer, P. S. Stochastic sensors inspired by biology. Nature. 413 (6852), 226-230 (2001).
  4. Fang, Y., Lahiri, J., Picard, L. G protein-coupled receptor microarrays for drug discovery. Drug. Discov. Today. 8 (16), 755-761 (2003).
  5. Majd, S., et al. Applications of biological pores in nanomedicine, sensing, and nanoelectronics. Curr. Opin. Biotechnol. 21 (4), 439-476 (2010).
  6. Kim, Y. R., et al. Synthetic Biomimetic Membranes and Their Sensor Applications. Sensors (Basel). 12 (7), 9530-9550 (2012).
  7. Ryu, H., et al. Investigation of Ion Channel Activities of Gramicidin A in the Presence of Ionic Liquids Using Model Cell Membranes. Sci Rep. 5, (2015).
  8. Wood, C., Williams, C., Waldron, G. J. Patch clamping by numbers. Drug. Discov. Today. 9 (10), 434-441 (2004).
  9. Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194, 979-980 (1962).
  10. Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 3561-3566 (1972).
  11. Baaken, G., Sondermann, M., Schlemmer, C., Ruhe, J., Behrends, J. C. Planar microelectrode-cavity array for high-resolution and parallel electrical recording of membrane ionic currents. Lab Chip. 8 (6), 938-944 (2008).
  12. Costello, R., Peterson, I., Heptinstall, J., Byrne, N., Miller, L. A robust gel-bilayer channel biosensor. Adv. Mater. Opt. Electron. 8 (2), 47-52 (1998).
  13. Ide, T., Yanagida, T. An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 265 (2), 595-599 (1999).
  14. Jeon, T. J., Malmstadt, N., Schmidt, J. J. Hydrogel-encapsulated lipid membranes. J Am Chem Soc. 128 (1), 42-43 (2006).
  15. Malmstadt, N., Jeon, T. J., Schmidt, J. J. Long-Lived Planar Lipid Bilayer Membranes Anchored to an In Situ Polymerized Hydrogel. Adv. Mater. 20 (1), 84-89 (2008).
  16. Jeon, T. J., Poulos, J. L., Schmidt, J. J. Long-term storable and shippable lipid bilayer membrane platform. Lab. Chip. 8 (10), 1742-1744 (2008).
  17. Ryu, H., et al. Automated Lipid Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Film for Ion Channel Measurements. Anal. Chem. 86 (18), 8910-8915 (2014).
  18. Yaws, C. Chemical Properties Handbooks: Physical, Thermodynamic, Environmental, Transport, Safety, and Health Related Properties for Organic and Inorganic Chemicals. , MC GRAW HILL HANDBOOKS. (1999).
  19. Windholz, M., Budavari, S., Stroumtsos, L. Y., Fertig, M. N. The Merck index. An encyclopedia of chemicals and drugs. , Merck & Co. (1976).
  20. Miller, C. Ion Channel Reconstitution. , Springer Science & Business Media. (1986).
  21. Miller, C. Open-state substructure of single chloride channels from Torpedo electroplax. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 299 (1097), 401-411 (1982).
  22. Benz, R., Frohlich, O., Lauger, P., Montal, M. Electrical capacity of black lipid films and of lipid bilayers made from monolayers. Biochim. Biophys. Acta. 394 (3), 323-334 (1975).
  23. Priel, A., Gil, Z., Moy, V. T., Magleby, K. L., Silberberg, S. D. Ionic requirements for membrane-glass adhesion and giga seal formation in patch-clamp recording. Biophys. J. 92 (11), 3893-3900 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tworzenie dwuwarstwy lipidowejczarna membrana lipidowazautomatyzowany monta membranymieszanina skwalenu i heksadekanuinkorporacja gramicydyny Apomiar elektrofizjologicznyprzygotowanie filmu PDMSprzygotowanie roztworu buforowegoprotok monta u komory

Powiązane artykuły