Mikroskopia koherentnego rozpraszania Ramanowskiego (CARS) oparta na naturalnej wibracji wiązań molekułowych pozwala na chemicznie selektywne obrazowanie żywych komórek bez znaczników. W pracy przedstawiono implementację komplementarnej techniki mikroskopowej na standardowym wielofotonowym laserowym mikroskopie skaningowym opartym na laserze femtosekundowym Ti:sapphire i laserze OPO.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Implementacja koherentnego systemu rozpraszania Ramana (CARS) na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym Ti:Sapphire i OPO
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Laserowe mikroskopy skaningowe łączące femtosekundowy laser Ti:szafirowy i optyczny oscylator parametryczny (OPO) do powielania linii laserowej stały się dostępne dla biologów. Systemy te przeznaczone są przede wszystkim do wielokanałowej dwufotonowej mikroskopii fluorescencyjnej. Jednak bez żadnych modyfikacji, komplementarna nieliniowa mikroskopia optyczna, taka jak generacja drugiej harmonicznej (SHG) lub generacja trzeciej harmonicznej (THG), może być również wykonywana za pomocą tej konfiguracji, umożliwiając bezznacznikowe obrazowanie cząsteczek strukturalnych lub wodnych granic faz międzylipidowych. Techniki te dobrze nadają się do obserwacji in vivo, ale mają ograniczoną specyficzność chemiczną. Chemicznie selektywne obrazowanie można uzyskać na podstawie nieodłącznych sygnałów wibracyjnych opartych na rozpraszaniu Ramana. Konfokalna mikroskopia ramanowska zapewnia rozdzielczość przestrzenną 3D, ale wymaga dużej średniej mocy i długiego czasu akwizycji. Aby przezwyciężyć te trudności, ostatnie postępy w technologii laserowej umożliwiły opracowanie nieliniowej optycznej mikroskopii wibracyjnej, w szczególności koherentnego rozpraszania Ramanowskiego Stokesa (CARS). Mikroskopia CARS stała się zatem potężnym narzędziem do obrazowania biologicznego i żywych komórek, poprzez chemiczne mapowanie lipidów (za pomocą wibracji rozciągających C-H), wody (za pomocą wibracji rozciągających O-H), białek lub DNA. W niniejszej pracy opisano implementację techniki CARS na standardowym wielofotonowym laserowym mikroskopie skaningowym sprzężonym z OPO. Opiera się na synchronizacji w czasie dwóch linii laserowych poprzez regulację długości jednej ze ścieżek wiązki laserowej. Przedstawiamy krok po kroku implementację tej techniki na istniejącym systemie wielofotonowym. Pomocne jest podstawowe zaplecze w optyce eksperymentalnej, a prezentowany system nie wymaga drogiego wyposażenia dodatkowego. Ilustrujemy również obrazowanie CARS uzyskane na osłonkach mielinowych nerwu kulszowego gryzonia i pokazujemy, że obrazowanie to może być wykonywane jednocześnie z innymi nieliniowymi obrazami optycznymi, takimi jak standardowa technika fluorescencji dwufotonowej i generacja drugiej harmonicznej.
Wprowadzenie
Mikroskopia optyczna stała się główną techniką nieniszczącej wizualizacji dynamicznych procesów w żywych systemach biologicznych z rozdzielczością subkomórkową. Mikroskopia fluorescencyjna jest obecnie najpopularniejszym kontrastem obrazowym stosowanym w żywych komórkach ze względu na wysoką swoistość i czułość1. Pojawiła się szeroka paleta sond fluorescencyjnych (barwniki egzogenne, białka kodowane genetycznie, nanocząstki półprzewodnikowe). Rozwinęły się różne techniki fluorescencyjne oparte na oświetleniu próbek (takie jak mikroskopia konfokalna lub dwufotonowa) w celu wykonania obrazowania 3D i zmniejszenia głównej wady tej techniki, jaką jest fotowybie....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Rysunek 1. Schematyczny widok ogólnego układu. Obejmuje on lasery Ti:szafir (680 – 1 080 nm) oraz OPO (1 050 – 1 300 nm), linię opóźniającą z 4 lustrami (M1 do M4), szybki oscyloskop, fotodiodę oraz dwie stałe przysłony irysowe I1 i I2. Lustra M2 i M3 są zamocowane na liniowym stole translacyjnym, co ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Częstotliwość serii impulsów standardowego lasera tytanowo-szafirowego (Ti:sapphire) wynosi zazwyczaj około 80 MHz. OPO posiada tę samą częstotliwość, ponieważ jest pompowany przez laser Ti:sapphire. W związku z tym wymagany jest szybki oscyloskop o przepustowości co najmniej 200 MHz. Wymagana jest również szybka fotodioda w zakresie 600 do 1 100 nm. Maksymalne przesunięcie czasowe występuje, gdy sygnały Ti:sapphire i OPO są przesunięte o 1/(2×80×106) = 6,2 nanosekundy. Odpowia.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Najtrudniejszą częścią pracy jest czasowa synchronizacja wiązek laserowych. Wymaga to szybkiej fotodiody połączonej z szybkim oscyloskopem, ale na początku można wykonać tylko przybliżone nakładanie się w czasie. Następnie wymagana jest dalsza regulacja o kilka cm. Wreszcie, mikrometr porusza się w liniowym stopniu translacji, co pozwala na ostateczną precyzyjną regulację długości linii opóźniającej w celu wyzwolenia sygnału CARS. Sygnał ten jest utrzymywany w wąskim zakresie około 20 mikrometrów, co obserwuje się poprze.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować Dr. Philippe'owi Combette'owi (IES, UM, Montpellier, Francja) za wypożyczenie szybkiego oscyloskopu i podziękować za wsparcie finansowe ze strony Montpellier RIO Imaging (MRI). HR dziękuje, że ANR przyznaje France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) i France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) sieci infrastrukturalne na rozwój spójnego obrazowania ramanowskiego. Prace te były głównie wspierane przez grant Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (FP7-IDEAS-ERC 311610) oraz grant INSERM - AVENIR dla NT.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Oscyloskop | Tektronix | TDS 520D | 500 MHz |
| Fotodetektor | Thorlabs | DET08C/M, T4290 | 5 GHz InGaAs, 800 - 1,700 nm |
| Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II | Koherentny | ||
| optyczny oscylator parametryczny OPO Kompaktowa rodzina | APE Berlin | ||
| Axio Examiner mikroskop LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Peryskop z napędem Newport | |||
| Obiektyw W Plan-apochromat 20X/1.0 | Carl Zeiss | ||
| Sumator wiązki | Carl Zeiss | ||
| Modulator akustyczno-optyczny | Carl Zeiss Tłumik mocy OPO Carl Zeiss | ||
| Lampa fotopowielacza | Zeiss | ||
| ZEN | Zeiss | ||
| filtry | Carl Zeiss | LSM BiG 1935-176 | 400 - 480 nm; 500 - 550 Nm; 465 - 610 nm |
| Lustro dichroiczne | Carl Zeiss | Długość fali odcięcia 760 nm | |
| Srebrne lustra | Newport | 10D20ER.2 | λ/10, 480 - 20 000 nm, Ilość 4 |
| Jednoosiowy stolik translacyjny z mikrometrem wzorcowym | Thorlabs | PT1/M | Ilość 1 |
| Aluminiowa listwa | stykowa Thorlabs | MB1015/M | Ilość 1 |
| Uchwyt lustrzany | Thorlabs | KMSS/M | Ilość 4 |
| Uchwyt lusterka do Ø Optyka 1" | ilość Thorlabs | MH25 | 4 |
| Przysłony irysowe | ilość Thorlabs | ID8/M | 3 |
| Skrzynka ochronna | Thorlabs | TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S | Ilość 1 |
| Słupki optyczne | Thorlabs | TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M | Ilość 8 (długości w zależności od konfiguracji) |
| Filtr pasmowo-przepustowy 661 - 690 nm | Jednozakresowy filtr pasmowo-przepustowy Semrock 676/29 nm BrightLine® | Ilość 1 | |
| Koraliki fluorescencyjne | ThermoFisher | TetraSpeck&handel; Zestaw rozmiarów mikrosfer fluorescencyjnych | |
| P5L07 | |||
| Fluoromielina i handel; Czerwona fluorescencyjna plama mielinowa | ThermoFisher | F34652 |
Bibliografia
- Valeur, B., Berberan-Santos, M. N. Molecular Fluorescence: Principles and Applications. , 2nd Edition, Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Moreaux, L., Sandre, O., Mertz, J.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
