Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Implementacja koherentnego systemu rozpraszania Ramana (CARS) na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym Ti:Sapphire i OPO

10.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54262

⸱

17 lipca 2016

 ,  ,  ,  , 
1INSERM U1051, Institut des Neurosciences de Montpellier (INM), Université de Montpellier, 2Université de Nîmes, 3CNRS, IES, UMR 5214, 4Aix-Marseille Université, CNRS, École Centrale Marseille, Institut Fresnel, UMR 7249, 5Montpellier RIO Imaging (MRI)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Mikroskopia koherentnego rozpraszania Ramanowskiego (CARS) oparta na naturalnej wibracji wiązań molekułowych pozwala na chemicznie selektywne obrazowanie żywych komórek bez znaczników. W pracy przedstawiono implementację komplementarnej techniki mikroskopowej na standardowym wielofotonowym laserowym mikroskopie skaningowym opartym na laserze femtosekundowym Ti:sapphire i laserze OPO.

Streszczenie

Laserowe mikroskopy skaningowe łączące femtosekundowy laser Ti:szafirowy i optyczny oscylator parametryczny (OPO) do powielania linii laserowej stały się dostępne dla biologów. Systemy te przeznaczone są przede wszystkim do wielokanałowej dwufotonowej mikroskopii fluorescencyjnej. Jednak bez żadnych modyfikacji, komplementarna nieliniowa mikroskopia optyczna, taka jak generacja drugiej harmonicznej (SHG) lub generacja trzeciej harmonicznej (THG), może być również wykonywana za pomocą tej konfiguracji, umożliwiając bezznacznikowe obrazowanie cząsteczek strukturalnych lub wodnych granic faz międzylipidowych. Techniki te dobrze nadają się do obserwacji in vivo, ale mają ograniczoną specyficzność chemiczną. Chemicznie selektywne obrazowanie można uzyskać na podstawie nieodłącznych sygnałów wibracyjnych opartych na rozpraszaniu Ramana. Konfokalna mikroskopia ramanowska zapewnia rozdzielczość przestrzenną 3D, ale wymaga dużej średniej mocy i długiego czasu akwizycji. Aby przezwyciężyć te trudności, ostatnie postępy w technologii laserowej umożliwiły opracowanie nieliniowej optycznej mikroskopii wibracyjnej, w szczególności koherentnego rozpraszania Ramanowskiego Stokesa (CARS). Mikroskopia CARS stała się zatem potężnym narzędziem do obrazowania biologicznego i żywych komórek, poprzez chemiczne mapowanie lipidów (za pomocą wibracji rozciągających C-H), wody (za pomocą wibracji rozciągających O-H), białek lub DNA. W niniejszej pracy opisano implementację techniki CARS na standardowym wielofotonowym laserowym mikroskopie skaningowym sprzężonym z OPO. Opiera się na synchronizacji w czasie dwóch linii laserowych poprzez regulację długości jednej ze ścieżek wiązki laserowej. Przedstawiamy krok po kroku implementację tej techniki na istniejącym systemie wielofotonowym. Pomocne jest podstawowe zaplecze w optyce eksperymentalnej, a prezentowany system nie wymaga drogiego wyposażenia dodatkowego. Ilustrujemy również obrazowanie CARS uzyskane na osłonkach mielinowych nerwu kulszowego gryzonia i pokazujemy, że obrazowanie to może być wykonywane jednocześnie z innymi nieliniowymi obrazami optycznymi, takimi jak standardowa technika fluorescencji dwufotonowej i generacja drugiej harmonicznej.

Wprowadzenie

Mikroskopia optyczna stała się główną techniką nieniszczącej wizualizacji dynamicznych procesów w żywych systemach biologicznych z rozdzielczością subkomórkową. Mikroskopia fluorescencyjna jest obecnie najpopularniejszym kontrastem obrazowym stosowanym w żywych komórkach ze względu na wysoką swoistość i czułość1. Pojawiła się szeroka paleta sond fluorescencyjnych (barwniki egzogenne, białka kodowane genetycznie, nanocząstki półprzewodnikowe). Rozwinęły się różne techniki fluorescencyjne oparte na oświetleniu próbek (takie jak mikroskopia konfokalna lub dwufotonowa) w celu wykonania obrazowania 3D i zmniejszenia głównej wady tej techniki, jaką jest fotowybielanie2. Inne ograniczenia obejmują wymóg znakowania fluoroforami, ponieważ większość gatunków molekularnych nie jest wewnętrznie fluorescencyjna, a zatem te fluorofory muszą być sztucznie wprowadzone do obrazowanej próbki. Ta sztuczna manipulacja może być uciążliwa, zwłaszcza w przypadku małych cząsteczek lub indukować potencjalną fototoksyczność. Powody te sprawiają, że mikroskopia fluorescencyjna nie nadaje się do obserwacji in vivo. Stąd stosowanie technik obrazowania optycznego o wysokiej czułości i specyficznych kontrastach molekularnych bez użycia cząsteczek fluorescencyjnych jest wysoce pożądane w naukach biomedycznych.

Pojawiło się kilka nieliniowych technik obrazowania optycznego bez etykietowania i barwienia, w tym generacja drugiej harmonicznej (SHG)3,4 i generacja trzeciej harmonicznej (THG)5. Mikroskopia SHG została wykorzystana do obrazowania układów strukturalnych na poziomie supramolekularnym, takich jak mikrotubule lub kolagen6. THG jest generowany z niejednorodności optycznych, takich jak granica faz między środowiskiem wodnym a lipidami7. Wykazano również, że THG obrazuje mielinę8,9. Obie techniki mogą być stosowane na dwufotonowym mikroskopie fluorescencyjnym i wymagają tylko jednej wiązki laserowej. Wymagają one jednak dużej intensywności lasera (zwykle 50 mW przy 860 nm dla SHG10, 25 - 50 mW przy 1 180 nm dla THG9), co jest szkodliwe dla żywych próbek i nie zapewnia specyficzności chemicznej, która jest wymagana do jednoznacznego obrazowania określonych struktur biologicznych.

Chemicznie selektywne obrazowanie można uzyskać z naturalnych sygnałów drgań molekularnych opartych na rozpraszaniu Ramana. Kiedy wiązka światła uderza w materię, fotony mogą być absorbowane i rozpraszane przez atomy lub cząsteczki. Większość rozproszonych fotonów będzie miała taką samą energię, tj. częstotliwość, jak fotony padające. Ten proces nazywa się rozpraszaniem Rayleigha. Jednak niewielka liczba fotonów zostanie rozproszona z częstotliwością optyczną inną niż częstotliwość padających fotonów, tj. w nieelastycznym procesie rozpraszania zwanym rozpraszaniem Ramana. Różnica w energii wynika ze wzbudzenia modów wibracyjnych w zależności od struktury molekularnej i środowiska. Dlatego spontaniczne rozpraszanie Ramana zapewnia chemicznie selektywne obrazowanie, ponieważ różne cząsteczki mają określone częstotliwości drgań. Jest jednak ograniczony ze względu na wyjątkowo słaby sygnał. Konfokalna mikroskopia Ramana została opracowana i zapewnia rozdzielczość przestrzenną 3D, ale wymaga wysokiej średniej mocy i długiego czasu akwizycji11. Aby przezwyciężyć te trudności, ostatnie postępy w technologii laserowej umożliwiły rozwój nieliniowej optycznej mikroskopii wibracyjnej, w szczególności koherentnego rozpraszania Ramana przeciwko Stokesowi (CARS)11,12,13.

CARS to nieliniowy proces optyczny trzeciego rzędu. Trzy wiązki laserowe, składające się z wiązki pompy o częstotliwości ωP, wiązki Stokesa o częstotliwości ωS i wiązki sondy (najczęściej będącej pompą) są skupiane w próbce i generują wiązkę anty-Stokesa o częstotliwości ωAS= (2ωP - ωS)14. Sygnał anty-Stokesa może być znacznie wzmocniony, gdy różnica częstotliwości między pompą a wiązkami Stokesa jest dostrojona do drgań molekularnych Ramana ΩR=(ωP - ωS). Sygnał CARS opiera się na oddziaływaniu wielu fotonów. Generuje zatem spójny sygnał o rzędy wielkości silniejszy niż spontaniczne rozpraszanie Ramana.

Mikroskopia CARS została po raz pierwszy eksperymentalnie zademonstrowana przez Duncana i wsp.15. Zumbusch i wsp. udoskonalili następnie technikę, stosując dwie skupione wiązki lasera femtosekundowego w bliskiej podczerwieni z soczewką obiektywową o dużej aperturze numerycznej, co pozwoliło na warunek dopasowania fazowego CARS i uniknięcie dwufotonowego tła nierezonansowego16. Mikroskopia CARS stała się zatem potężnym narzędziem do obrazowania żywych komórek i tkanek, poprzez chemiczne wykrywanie cząsteczek, takich jak lipidy (za pomocą wibracji rozciągających C-H)17,18, woda (za pomocą wibracji rozciągających O-H), białka, DNA w żywych komórkach19,20, ale także deuterowane związki chemiczne do zastosowań farmaceutycznych21 i kosmetycznych22.

Główne ograniczenie mikroskopii nieliniowej wynika ze złożoności i kosztu źródeł optycznych. System CARS wymaga dwóch laserów o regulowanej długości fali o krótkim czasie trwania impulsów oraz z czasowo i przestrzennie zsynchronizowanymi ciągami impulsów. Wczesne mikroskopy CARS opierały się na dwóch zsynchronizowanych pikosekundowych laserach Ti:sapphire20. Obrazowanie CARS uzyskano również za pomocą pojedynczego femtosekundowego lasera Ti:szafirowego generującego źródło światła superkontinuum23. Ostatnio źródła laserowe składające się z pojedynczego femtosekundowego lasera Ti:szafirowego pompującego przestrajalne optyczne oscylatory parametryczne (OPO) zostały wykorzystane w mikroskopii CARS. Taka konfiguracja umożliwia samoistnie zsynchronizowane czasowo wiązki z różnicą częstotliwości między pompą a wiązką Stokesa, obejmujące pełne spektrum drgań molekularnych24. Ponadto laserowe mikroskopy skaningowe oparte na laserze fs "pod klucz" i OPO, używane głównie do fluorescencji dwufotonowej (TPF), są obecnie dostępne dla osób niebędących fizykami. Potencjał takich zestawów można znacznie zwiększyć bez konieczności dodatkowych inwestycji poprzez włączenie innych nieliniowych metod obrazowania optycznego, ponieważ każda metoda obrazowania nieliniowego (NLO) jest wrażliwa na określone struktury lub cząsteczki. Multimodalne obrazowanie NLO wykorzystuje zatem potencjał mikroskopii NLO dla złożonych próbek biologicznych25. Sprzężenie tych technik pozwoliło na zbadanie wielu zagadnień biologicznych, w szczególności dotyczących metabolizmu lipidów, rozwoju skóry lub raka26, rozwoju mięśni szkieletowych27, zmian miażdżycowych28. Co więcej, implementacja skanowania wiązką laserową za pomocą CARS daje możliwość obrazowania o wysokiej szybkości, tj. atrakcyjnego narzędzia do badania procesów dynamicznych in vivo.

Celem tej pracy jest pokazanie każdego kroku do wdrożenia techniki CARS na standardowym wielofotonowym laserowym mikroskopie skaningowym. Mikroskop oparty jest na laserze fsec Ti:sapphire oraz OPO (pompowanym laserem Ti:sapphire) obsługiwanym przez oprogramowanie dla biologów. Integracja została zrealizowana poprzez dostosowanie długości jednej ze ścieżek wiązki laserowej w celu zsynchronizowania w czasie obu wiązek. Opisujemy krok po kroku implementację tej techniki, która wymaga jedynie podstawowego przygotowania w zakresie optyki eksperymentalnej. Ilustrujemy również obrazowanie CARS uzyskane na osłonkach mielinowych nerwu kulszowego gryzoni i pokazujemy, że obrazowanie to można wykonywać jednocześnie z innymi nieliniowymi obrazami optycznymi, takimi jak standardowa technika fluorescencji dwufotonowej i generacja drugiej harmonicznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Schemat spektroskopii ultraszybkiego lasera z laserem Ti:Szafir, wiązką OPO, lustrami dichroicznymi, PMT, absorpcją.
Rysunek 1. Schematyczny widok ogólnego układu. Obejmuje on lasery Ti:szafir (680 – 1 080 nm) oraz OPO (1 050 – 1 300 nm), linię opóźniającą z 4 lustrami (M1 do M4), szybki oscyloskop, fotodiodę oraz dwie stałe przysłony irysowe I1 i I2. Lustra M2 i M3 są zamocowane na liniowym stole translacyjnym, co umożliwia zmianę długości linii opóźniającej z rozdzielczością mikrometryczną. Filtr pasmowy 660 – 685 nm został umieszczony przed fotopowielaczem (PMT) wykorzystywanym do obrazowania CARS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

1. Uruchamianie systemu laserowego

  1. Upewnij się, że długość fali lasera Ti:szafir jest ustawiona na 800 nm lub zdefiniuj tę wartość w kontrolerze zasilania lasera Ti:szafir. Przekręć klucz z pozycji Standby na On, aby włączyć laser Ti:szafir.
  2. Włącz laser OPO z tyłu kontrolera OPO i otwórz migawkę lasera Ti:szafir w kontrolerze zasilania lasera Ti:szafir.
  3. Włącz komputer tabletowy, aby rozpompować OPO. Kliknij ikony OPO Connected oraz Remote Connected na tablecie. Odczekaj 30 - 40 min na rozgrzanie układu.
  4. Włącz komputer mikroskopu i aktywuj przełączniki „Microscope Components”. Uruchom oprogramowanie, dwukrotnie klikając ikonę na pulpicie.
  5. W karcie Acquisition oprogramowania otwórz Laser tool w Setup Manager, aby sterować oboma laserami z poziomu programu. Wybierz On dla lasera Ti:szafir oraz On dla lasera OPO. Sprawdź wartość optycznej mocy lasera (typowe wartości to 3 700 mW przy 800 nm i 700 mW przy 1 000 nm).
  6. Aby skonfigurować tor wiązki i lasery, otwórz Light Path tool w grupie narzędzi Setup Manager tool i zaznacz pole the first Photomultiplier tube (PMT).
  7. Aby sprawdzić plamkę lasera Ti:szafir na wyjściu obiektywu, otwórz Channels tool w grupie Acquisition Parameter tool. Ustaw moc lasera Ti:szafir na niską wartość (około 1%), zredukuj wzmocnienie (gain) do 0 (na tym etapie obraz nie jest potrzebny) i kliknij przycisk Continuous, aby rozpocząć procedurę skanowania i skierować wiązkę lasera przez obiektyw mikroskopu. Sprawdź obecność czerwonej plamki poprzez bezpośrednią obserwację, umieszczając kartę do wizualizacji lasera IR na wyjściu obiektywu powietrznego mikroskopu (10X).
  8. Aby sprawdzić plamkę lasera OPO, zatrzymaj skanowanie lasera Ti:szafir, klikając przycisk Stop. W oknie Channels window ustaw niską wartość OPO power i kliknij przycisk Continuous.

2. Ustawienia mikroskopu

  1. Ręcznie umieść lustro dichroiczne z długością fali odcięcia 760 nm w suwaku portu bocznego w przestrzeni nieskończonej powyżej obrotowego uchwytu obiektywów, aby skierować światło o długości fali do 760 nm z próbki do PMT w trybie detekcji niedeskanowanej (NDD).
  2. W celu odtworzenia wyników przedstawionych w niniejszej pracy, zainstaluj filtr pasmowy o wąskim pasmie 660–685 nm w kostce reflektora NDD przed detektorem PMT1, aby rejestrować wyłącznie sygnał CARS przy 670 nm.
  3. W kostce refleksyjnej NDD, przed detektorem PMT3, należy umieścić filtr wąskopasmowy w zakresie od 500 do 550 nm w celu obserwacji fluorescencji mieliny. W kostce refleksyjnej przed detektorem PMT4 należy umieścić filtr wąskopasmowy w zakresie od 565 do 610 nm w celu obserwacji SHG.
  4. Aby wybrać w oprogramowaniu rejestrację sygnału na detektorze z ad hoc otworzyć filtr pasmowo-przepustowy Narzędzie do analizy drogi światła w Menu Managera konfiguracji w Karta akwizycjiAktywuj wybrany PMT (zaznacz pole wyboru) i wybierz kolor dla tego kanału. W niniejszej pracy dla CARS wybrano kolor zielony, dla fluorescencji czerwony, a dla SHG purpurowy.

3. Synchronizacja czasowa

Uwaga: Oba promienie laserowe pochodzą z tego samego lasera tytano-szafirowego (Ti:sapphire), jednak wiązka OPO jest opóźniona w momencie generowania, przez co oba promienie nie są zsynchronizowane czasowo w chwili dotarcia do mikroskopu. Celem jest tutaj opóźnienie jednego z dwóch promieni, aby ponownie zsynchronizować je w czasie przed dotarciem do mikroskopu.

  1. Za pomocą kabli BNC połącz kanał wejściowy CH1 oscyloskopu z elektrycznym wyjściem BNC lasera (Sync. Out). Połącz kanał wejściowy CH2 oscyloskopu z fotodiodą i wybierz kanał CH1 jako kanał wyzwalania, naciskając przycisk TRIGGER MENU, następnie przycisk menu głównego Source, a potem przycisk menu bocznego odpowiadający wybranemu kanałowi CH1.
  2. Umieść i zamocuj za pomocą słupków montażowych fotodiodę w płaszczyźnie ogniskowej obiektywu mikroskopu powietrznego (10X) lub na drodze wiązki mikroskopu po zdjęciu obiektywu. Uwaga: W razie potrzeby usuń kondensor wraz z jego uchwytem.
  3. W narzędziu Channels (grupa Acquisition Parameter tool) zdefiniuj długość fali lasera Ti:szafir na 830 nm przy niskiej mocy (tj. poniżej 1% pełnej mocy). W narzędziu Acquisition Mode tool ogranicz obszar skanowania do jednego punktu, aby oświetlić fotodiodę najcieńszą wiązką. Włącz skanowanie laserem, klikając przycisk Continuous.
  4. Naciśnij AUTOSET na przednim panelu oscyloskopu i ręcznie przesuń fotodiodę, aby uzyskać serie impulsów na ekranie. Naciśnij przycisk RUN/STOP, aby zamrozić obraz.
    1. Aby zapisać kopię obrazu z oscyloskopu, włóż dyskietkę 3,5 cala do stacji dyskietek lub podłącz port GPIB na tylnym panelu do komputera. Następnie naciśnij SHIFT HARDCOPY MENU, naciśnij FORMAT (główne), aby wybrać format obrazu TIFF i określ kanał wyjściowy w menu Port. Naciśnij przycisk HARDCOPY, aby zarejestrować obraz serii impulsów lasera Ti:szafir na oscyloskopie.
  5. Wyłącz skanowanie lasera Ti:szafir, klikając przycisk Stop. Klikając narzędzie Channels tool, zdefiniuj sygnał OPO na 1,107 nm przy niskiej mocy. Włącz skanowanie lasera OPO i zarejestruj serie impulsów lasera OPO na oscyloskopie. Wyłącz skanowanie lasera OPO.
  6. Porównaj przesunięcie czasowe między sygnałami lasera Ti:szafir i OPO.
    UWAGA: Przesunięcie czasowe tshift wyznacza długość linii opóźniającej LDelayLine, którą należy zaimplementować zgodnie z równaniem: LdelayLine = c × tshift, gdzie c to prędkość światła.
  7. Wybierz jedną z linii laserowych.
    UWAGA: W niniejszej pracy wybrano linię lasera Ti:szafir, ponieważ w pobliżu tej linii laserowej dostępna była wolna przestrzeń. Dodatkowo wybór ten pozwala na ponowne ustawienie linii laserowej przy użyciu widzialnego światła laserowego.
  8. Otwórz linię laserową, usuwając rury ochronne w miejscu, w którym zostanie zaimplementowana linia opóźniająca.
    Uwaga! Należy nosić odpowiednie okulary ochronne i zdjąć z nadgarstków bransoletki łańcuchowe lub zegarek.
  9. Wybierz długość fali z zakresu widzialnego, aby móc łatwo obserwować wiązkę laserową (na przykład 700 nm przy niskiej mocy w narzędziu Channels tool oprogramowania). Włącz skanowanie laserem.
  10. Umieść i ustaw za pomocą słupków montażowych dwie przysłony irysowe wzdłuż otwartej linii laserowej. Ustaw jedną przysłonę na wyjściu linii opóźniającej, a drugą na wejściu peryskopu.
    UWAGA: Peryskop steruje za pomocą dwóch lusterek zmotoryzowanych, sterowanych programowo, kątem wpadania wiązki laserowej do głowicy skanującej mikroskopu skanującego.
  11. Zmniejsz otwór przysłony irysowej i dostosuj położenie przysłony do drogi wiązki laserowej. Zamocuj je na stole optycznym. Dostosuj pionową pozycję trzeciej mobilnej przysłony irysowej, aby sprawdzać wysokość wiązki laserowej podczas sukcesywnego ustawiania czterech luster linii opóźniającej.
    UWAGA: Przysłony irysowe te będą służyć jako kontrola procedury ponownego ustawiania, wskazując ścieżkę do podążania.
  12. Umieść lustro M1 zamontowane na kompaktowym kinematycznym uchwycie lustra na wejściu linii opóźniającej (jak pokazano na Ryc. 1) i dostosuj jego pozycję oraz orientację, aby zachować wysokość wiązki przy użyciu mobilnej przysłony irysowej. Umieść lustra M2 i M3 (również zamontowane na kompaktowych kinematycznych uchwytach luster) pod kątem 90° na stole translacyjnym, który zostanie umieszczony w połowie drogi. Ustaw je tak, aby odpowiadały wcześniej obliczonej długości linii opóźniającej.
  13. Dostosuj orientację luster M2 i M3 za pomocą mobilnej przysłony irysowej. Ustaw lustro M4 (również zamocowane na kompaktowym uchwycie) na wyjściu linii opóźniającej (tuż przed przysłoną I1, jak pokazano na Ryc. 1) i ostrożnie dostosuj jego pozycję i kąt, aby dopasować drogę wiązki laserowej przez dwie stałe przysłony irysowe.
  14. Umieść kartę do obserwacji lasera na wyjściu obiektywu mikroskopu i sprawdź profil wiązki laserowej, klikając Continuous, aby włączyć skanowanie laserem. Powinien pojawić się jednolity jasny dysk. W razie potrzeby lekko skoryguj orientację lustra M4.
  15. Ponownie umieść szybką fotodiodę pod wiązką laserową w płaszczyźnie ogniskowania próbki mikroskopu. Obserwuj przesunięcie czasowe między wiązką lasera Ti:szafir a wiązką OPO na oscyloskopie.
    Uwaga: W razie potrzeby zmień długość linii opóźniającej, przesuwając cały układ M2 i M3 zamontowany na stole translacyjnym (bez zmiany strojenia stołu translacyjnego), aby zsynchronizować oba impulsy. Może być wymagane przesunięcie o kilka centymetrów.

4. Przestrzenne nakładanie się wiązek

Uwaga: Aby uzyskać sygnał CARS, wymagane jest przestrzenne nakładanie się dwóch wiązek laserowych. Można zastosować naprzemienne oświetlanie obu wiązek tych samych koralików, zabarwionych w całej objętości dwoma różnymi barwnikami fluorescencyjnymi, aby wskazać przesunięcie przestrzenne. Następnie precyzyjne regulacje pozycji luster mogą zminimalizować to przesunięcie.

  1. Należy użyć gotowych preparatów z fluorescencyjnymi mikrosferami lub osadzić mikrosfery w zawiesinie na czystych szkiełkach przedmiotowych zgodnie z poniższym opisem:
    1. Przed pobraniem próbek wymieszać roztwór kulek (za pomocą mieszadła wortexowego lub poprzez sonikację), aby upewnić się, że kuleczki są równomiernie zawieszone.
    2. Zastosuj 5 μl zawiesiny kulek na powierzchnię szkiełka i rozprowadzić za pomocą końcówki pipety. Odczekać do wyschnięcia kropli, a następnie nanieść 5 μl mediumu montażowego, takiego jak glicerol, woda lub olej immersyjny, na wysuszoną próbkę kuleczek. Przykryć próbkę szkiełkiem nakrywką, a następnie uszczelnić szkiełko szybkoschnącym klejem lub stopioną parafiną.
  2. Umieść szkiełko przedmiotowe z unieruchomionymi fluorescencyjnymi kuleczkami polistyrenowymi pod obiektywem wodnym 20X. Dodaj kilka kropli wody, aby zanurzyć obiektyw.
  3. Aby ustawić ostrość na kuleczki, otwórz Zlokalizuj zakładka w oprogramowaniu, która umożliwia przełączenie z trybu skanowania laserowego na bezpośrednią obserwację próbki za pomocą oka, poprzez naciśnięcie Online przycisk. Otwórz Narzędzie okulistyczne aby wybrać ad hoc filtr i włączyć lampę halogenową, klikając w ikony.
  4. Ręcznie wyjmij lustro dichroiczne z suwaka portu bocznego w przestrzeni nieskończonej, a następnie za pomocą napędu ostrzenia mikroskopu ustaw ostrość w płaszczyźnie próbki, obserwując kulki przez okulary. Ponownie zamontuj lustro dichroiczne.
  5. W Zlokalizuj zakładkęnastępnie przełącz urządzenie w tryb skanowania laserowego, naciskając przycisk Offline przycisk. Przejdź do Karta akwizycji Aby zdefiniować parametry skanowania: ustaw rozmiar ramki na 512 pikseli, prędkość skanowania na 9, uśrednianie na 1, głębokość bitową na 8 bitów oraz zwiększ obszar skanowania do maksymalnej wartości.
  6. W ramach Narzędzie kanałów z Karta akwizycjidodaj ścieżkę (Ścieżka 1), jeśli nie została jeszcze utworzona. Wybierz długość fali 830 nm oraz niską moc dla wiązki lasera tytanowo-szafirowego. Kleszcz kolor na zielony w polu Track 1 w oknie Channels oraz w polu PMT3 lub PMT4 w oknie Light Path.
  7. W obrębie Narzędzie kanałów z Karta akwizycjidodaj drugi ślad (Ślad 2). Wybierz długość fali 1107 nm oraz niską moc wiązki lasera OPO. W polu Ślad 2 zaznacz kolor czerwony z Okno kanałów a w polu PMT3 z okno drogi optycznej.
  8. Ustaw wzmocnienie obu ścieżek na 600. Następnie kolejno wykonaj skanowanie próbki oboma wiązkami, klikając w Ciągły.
  9. Obserwuj obraz w obszarze ekranu w widoku 2D. W Opcja wyświetlania widoku blok sterujący, dostosowanie intensywności wyświetlania.
    Uwaga: W razie potrzeby należy lekko przesunąć pokrętło ostrości, aby odnaleźć płaszczyznę ogniskowania kulek. Dostosuj obszar przycięcia i powiększ obraz pojedynczej kulki lub grupy sąsiadujących kulek.
  10. Użyj sterownika peryskopu, aby nałożyć wiązki na siebie w płaszczyźnie x-y. W oprogramowaniu otwórz Zachowaj tabulatorKliknij w Opcje systemu oraz wyświetl Zmotoryzowane narzędzie peryskopowe okno. Należy użyć regulacji grubej i precyzyjnej luster peryskopowych wiązki lasera Ti:szafir, aby zsynchronizować przestrzennie oba obrazy.
  11. Do manipulacji peryskopem należy użyć pierwszych drążków regulacyjnych dla ruchów pionowych, a drugich dla poziomych przesunięć wiązki laserowej. Przesuń wiązkę za pomocą lustra wejściowego, aż obraz stanie się lekko widoczny, a następnie skoryguj natężenie lasera za pomocą lustra wyjściowego peryskopu, klikając „input” i „output”.
  12. Aby zapewnić pionowe nakładanie się wiązek, w Zachowanie zakładki, otwórz Narzędzie kolimacyjne i dostosuj wartość odległości ogniskowej wiązki lasera Ti:szafir.
  13. Powoli zmieniaj położenie pionowe obiektywu, aby sprawdzić różnicę w ostrości obu obrazów. Alternatywnie, wykonaj stos obrazów (z-stack) próbki, otwierając narzędzie Z-Stack w zakładce Acquisition i wybierając odpowiednie parametry (zakres, liczbę przekrojów). Kliknij przycisk Ortho w obszarze ekranu obrazu, aby zobaczyć wiązki w przekroju osiowym. Zmaksymalizuj nakładanie się obrazów w osi z, powtarzając powyższą procedurę kilkakrotnie.

5. Końcowe regulacje i obserwacja sygnału koherentnego anty-Stokesowskiego rozpraszania Ramanowskiego (CARS) z kropel oliwy z oliwek

  1. Nanieś kroplę oliwy z oliwek na szkiełko przedmiotowe i przykryj ją szkiełkiem nakrywkowym. Dodaj kilka kropel wody, aby zanurzyć obiektyw imersyjny 20X. Ustaw ostrość na krawędzi szkiełka nakrywkowego, korzystając z okularów (zgodnie z opisem w punkcie 4.2).
  2. W narzędziu Channels tool w karcie Acquisition tab, wybierz dla Ścieżki 1 długość fali 830 nm dla wiązki lasera Ti:szafirem oraz 1 107 nm dla OPO. Zaznacz oba lasery w Ścieżce 1, aby uzyskać jednoczesny skan obu laserów. Na początek ustaw niskie wartości mocy.
  3. W oknie Light Path window wybierz PMT1. Włącz skanowanie laserowe, klikając przycisk Continuous. Delikatnie przesuń płaszczyznę ostrości, aby skierować światło lasera do cienkiej warstwy oleju.
  4. W razie potrzeby zwiększ moc optyczną obu laserów. Dostosuj intensywność wyświetlania w bloku sterowania Display View Option. Powoli przesuwaj stół translacyjny linii opóźniającej, aż sygnał zostanie znacząco wzmocniony.
  5. Po zakończeniu precyzyjnej kalibracji sprawdź, czy jest to rzeczywiście sygnał CARS: delikatnie przesuń stół translacyjny; intensywność sygnału powinna zmaleć. I/lub wyłącz jedną z wiązek laserowych, albo laser Ti:szafirem, albo OPO. Ponownie powinien nastąpić silny spadek intensywności w porównaniu do sygnału CARS.
  6. Aby uzyskać maksymalny sygnał CARS, wybierz w oprogramowaniu opcję wyświetlania wartości średniej intensywności całego obrazu (w widoku Histo w karcie screen area). Dostosuj długość fali (o kilka nm), a następnie pozycje x,y,z wiązki ogniskującej, aby zmaksymalizować wartość średniej intensywności.

6. Osłonięcie drogi optycznej linii opóźniającej

  1. Ponieważ końcowy system jest przeznaczony dla osób niebędących fizykami, należy osłonić drogę przejścia światła linii opóźniającej za pomocą rurek lub obudowy, aby zapobiec bezpośredniemu dostępowi do szkodliwej, niewidocznej wiązki laserowej o wysokiej mocy szczytowej. Należy zapewnić dostęp do pokrętła stopnia translacyjnego.

7. Strojenie długości fali dla CARS

  1. Użyj równania Równanie mieszania częstotliwości optycznych, ΩR=1/λP-1/λS, obejmujące długości fal Ti:szafiru i OPO. aby dostroić długości fal lasera do pożądanej wibracji Ramanowskiej. Aby odtworzyć wyniki przedstawione w niniejszej pracy w celu obrazowania sygnału CARS z wiązań C-H o wibracji rozciągającej 3015 cm⁻¹-1, wybierz λlaser tytano-szafirowy = 830 nm i λOPO = 1,095 nm.
    UWAGA: Charakterystyczne częstotliwości drgań ramanowskich obserwowane w próbkach biologicznych, takich jak woda, dla wiązania C-H można znaleźć w opracowaniu Evansa i wsp.13 lub w Ellis i wsp.29.
  2. Użyj równania Wzór na długość fali CARS do obliczeń λ; metoda spektroskopii optycznej; równanie naukowe. aby określić długość fali emisji sygnału CARS. W przypadku obrazowania wiązań C-H metodą CARS należy wybrać filtr wąskopasmowy o długości fali 670 nm, ponieważ λCARS = 670 nm z długościami fal laserowych przedstawionymi w punkcie 7.1.
    UWAGA: Dostępna jest aplikacja mobilna do obliczania λCARS (spektroskopia CARS) z λP oraz λS wartości (patrz odnośnik 30).

8. Obserwacja sygnału CARS i barwionej mieliny w przekrojach nerwu kulszowego

Uwaga: Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z regulacjami instytucjonalnymi.

  1. Przygotować przekroje osiowe i podłużne nerwu kulszowego na szkiełku przedmiotowym zgodnie z metodą opisaną przez Ozçelik et al.31.
  2. Przygotować roztwór barwiący fluoromieliną czerwoną, rozcieńczając roztwór stokowy 300-krotnie w PBS. Przykryć przekroje nerwów roztworem barwiącym na 20 min w RT. Usunąć roztwór i przemyć 3 razy przez 10 min w PBS.
  3. Ustawić przekroje pod obiektywem imersyjnym wodnym 20X. Nałożyć szkiełko nakrywkowe. Dodać kilka kropel PBS, aby zanurzyć obiektyw, i wyregulować ostrość obiektywu, aby uzyskać wyraźny obraz przekrojów przez okulary (zgodnie z wcześniejszym opisem w sekcji 4.2).
  4. W Track 1 wybrać lasery Ti:szafir oraz OPO i zdefiniować ich długości fal odpowiednio na 830 nm oraz 1,095 nm. W oknie Light Path window wybrać PMT1 oraz kolor zielony.
  5. W Track 2 wybrać tylko laser OPO (długość fali 1,095 nm). W oknie Light Path window wybrać PMT4 oraz kolor czerwony.
  6. Dla obu laserów wybrać niską moc i na początek ustawić wzmocnienie na 600. Włączyć skanowanie laserowe i dostosować następujące parametry w celu poprawy kontrastu sygnałów CARS i fluorescencji: wartości mocy, pokrętło stolika translacyjnego (bardzo delikatnie), długości fal (o kilka nm) oraz intensywność wyświetlania.
  7. Aby zarejestrować końcowe obrazy w wysokiej rozdzielczości, wybrać w narzędziu Acquisition Mode tool następujące parametry: rozmiar ramki 1,024 pikseli, prędkość skanowania 7, uśrednianie 4. Kliknąć przycisk Snap, aby zarejestrować pojedynczy obraz. Zapisać obraz w formacie własnościowym, aby zachować obraz oraz pełne parametry akwizycji.

9. Obserwacja sygnałów CARS i SHG z przekrojów nerwu kulszowego

  1. Przygotować nerw kulszowy zgodnie z opisem w pracy Ozçelik et al.31.
  2. Postępować zgodnie z procedurą wyjaśnioną w części 8, aby uzyskać obraz przez okulary i wybrać parametry sygnału CARS (Ścieżka 1).
  3. W Ścieżce 2 wybrać wyłącznie laser OPO (długość fali 1095 nm). W oknie Light Path wybrać PMT3 oraz kolor magenta.
  4. Postępować zgodnie z procedurą wyjaśnioną w części 8, aby uruchomić skanowanie laserem i zapisać obrazy o wysokiej rozdzielczości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Częstotliwość serii impulsów standardowego lasera tytanowo-szafirowego (Ti:sapphire) wynosi zazwyczaj około 80 MHz. OPO posiada tę samą częstotliwość, ponieważ jest pompowany przez laser Ti:sapphire. W związku z tym wymagany jest szybki oscyloskop o przepustowości co najmniej 200 MHz. Wymagana jest również szybka fotodioda w zakresie 600 do 1 100 nm. Maksymalne przesunięcie czasowe występuje, gdy sygnały Ti:sapphire i OPO są przesunięte o 1/(2×80×106) = 6,2 nanosekundy. Odpowia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Najtrudniejszą częścią pracy jest czasowa synchronizacja wiązek laserowych. Wymaga to szybkiej fotodiody połączonej z szybkim oscyloskopem, ale na początku można wykonać tylko przybliżone nakładanie się w czasie. Następnie wymagana jest dalsza regulacja o kilka cm. Wreszcie, mikrometr porusza się w liniowym stopniu translacji, co pozwala na ostateczną precyzyjną regulację długości linii opóźniającej w celu wyzwolenia sygnału CARS. Sygnał ten jest utrzymywany w wąskim zakresie około 20 mikrometrów, co obserwuje się poprze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować Dr. Philippe'owi Combette'owi (IES, UM, Montpellier, Francja) za wypożyczenie szybkiego oscyloskopu i podziękować za wsparcie finansowe ze strony Montpellier RIO Imaging (MRI). HR dziękuje, że ANR przyznaje France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) i France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) sieci infrastrukturalne na rozwój spójnego obrazowania ramanowskiego. Prace te były głównie wspierane przez grant Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (FP7-IDEAS-ERC 311610) oraz grant INSERM - AVENIR dla NT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
OscyloskopTektronixTDS 520D500 MHz 
FotodetektorThorlabsDET08C/M, T42905 GHz InGaAs, 800 - 1,700 nm
Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family IIKoherentny
optyczny oscylator parametryczny OPO Kompaktowa rodzinaAPE Berlin
Axio Examiner mikroskop LSM 7 MPCarl Zeiss
Peryskop z napędem Newport
Obiektyw W Plan-apochromat 20X/1.0Carl Zeiss
Sumator wiązkiCarl Zeiss
Modulator akustyczno-optycznyCarl Zeiss Tłumik mocy OPO Carl Zeiss
Lampa fotopowielaczaZeiss
ZENZeiss
filtryCarl ZeissLSM BiG 1935-176400 - 480 nm; 500 - 550  Nm; 465 - 610  nm
Lustro dichroiczneCarl ZeissDługość fali odcięcia 760  nm
Srebrne lustraNewport10D20ER.2 λ/10, 480 - 20 000  nm, Ilość 4
Jednoosiowy stolik translacyjny z mikrometrem wzorcowymThorlabsPT1/MIlość 1
Aluminiowa listwastykowa ThorlabsMB1015/M Ilość 1
Uchwyt lustrzanyThorlabsKMSS/M Ilość 4
Uchwyt lusterka do Ø Optyka 1" ilość ThorlabsMH254
Przysłony irysowe ilość ThorlabsID8/M3
Skrzynka ochronnaThorlabsTB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1SIlość 1
Słupki optyczneThorlabsTR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/MIlość 8 (długości w zależności od konfiguracji)
Filtr pasmowo-przepustowy 661 - 690 nmJednozakresowy filtr pasmowo-przepustowy Semrock 676/29 nm BrightLine®Ilość 1
Koraliki fluorescencyjneThermoFisherTetraSpeck&handel; Zestaw rozmiarów mikrosfer fluorescencyjnych
P5L07 
Fluoromielina i handel; Czerwona fluorescencyjna plama mielinowa ThermoFisherF34652
Carl Oprogramowanie Carl Zeiss Carl Bandpass Karta do oglądania lasera Thorlabs IR Laserowe szkło bezpieczne Newport LV-F22.

Bibliografia

  1. Valeur, B., Berberan-Santos, M. N. Molecular Fluorescence: Principles and Applications. , 2nd Edition, Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).
  2. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  3. Moreaux, L., Sandre, O., Mertz, J. Membrane imaging by second-harmonic generation microscopy. JOSA B. 17 (10), 1685-1694 (2000).
  4. Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (17), 11014-11019 (2002).
  5. Yelin, D., Silberberg, Y. Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology. Opt. Express. 5 (8), 169-175 (1999).
  6. Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution Second-Harmonic Generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 81 (1), 493-508 (2002).
  7. Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
  8. Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100 (5), 1362-1371 (2011).
  9. Lim, H., Sharoukhov, D., Kassim, L., Zhang, Y., Salzer, J. L., Melendez-Vasquez, C. V. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (50), 18025-18030 (2014).
  10. Strupler, M., Pena, A. M., Hernest, M., Tharaux, P. L., Martin, J. L., Beaurepaire, E., Schanne-Klein, M. C. Second harmonic imaging and scoring of collagen in fibrotic tissues. Opt. Express. 15 (7), 4054-4065 (2007).
  11. Cheng, J. X., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Instrumentation, theory, and applications. J. Phys. Chem. B. 108 (3), 827-840 (2004).
  12. Volkmer, A. Vibrational imaging and microspectroscopies based on coherent anti-Stokes scattering microscopy. J. Phys. D: Appl. Phys. 38, R59-R81 (2005).
  13. Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annu. Rev. Anal. Chem. 1, 883-909 (2008).
  14. Mukamel, S. Principles of nonlinear optical spectroscopy. , Oxford University Press. New York. (1995).
  15. Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope. Opt. Lett. 7 (8), 350-352 (1982).
  16. Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Phys. Rev. Lett. 82 (20), 4142-4145 (1999).
  17. Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 585-590 (2011).
  18. Wang, P., Liu, B., Zhang, D., Belew, M. Y., Tissenbaum, H. A., Cheng, J. X. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53 (44), 11787-11792 (2014).
  19. Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).
  20. Cheng, J. X., Jia, Y. K., Zheng, G., Xie, X. S. Laser-scanning coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and applications to cell biology. Biophys J. 83 (1), 502-509 (2002).
  21. Chiu, W. S., Belsey, N. A. N., Garrett, L., Moger, J., Delgado-Charro, M. B., Guy, R. H. Molecular diffusion in the human nail measured by stimulated Raman scattering microscopy. Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 7725-7730 (2015).
  22. Chen, X., Grégoire, S., Formanek, F., Galey, J. -B., Rigneault, H. Quantitative 3D molecular cutaneous absorption in human skin using label free nonlinear microscopy. J. of Control. Release. 200, 78-86 (2015).
  23. Kano, H., Hamaguchi, H. In vivo multi-nonlinear optical imaging of a living cell using a supercontinuum light source generated from a photonic crystal fiber. Opt. Express. 14 (7), 2798-2804 (2006).
  24. Brustlein, S., Ferrand, P., Walther, N., Brasselet, S., Billaudeau, C., Marguet, D., Rigneault, H. Optical parametric oscillator-based light source for coherent Raman scattering microscopy: practical overview. J. Biomed. Opt. 16 (2), 021106(2011).
  25. Chen, H., et al. A multimodal platform for nonlinear optical microscopy and microspectroscopy. Opt. Express. 17 (3), 1282-1290 (2009).
  26. Yue, S., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Multimodal nonlinear optical microscopy. Laser Photonics Rev. 5 (4), 496-512 (2011).
  27. Sun, Q., Li, Y., He, S., Situ, C., Wu, Z., Qu, J. Y. Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals fundamental insights of skeletal muscle development. Biomed Opt Express. 5 (1), 158-166 (2013).
  28. Le, T. T., Langohr, I. M., Locker, M. J., Sturek, M., Cheng, J. X. Label-free molecular imaging of atherosclerotic lesions using multimodal nonlinear optical microscopy. J. Biomed. Opt. 12 (5), 054007(2007).
  29. Ellis, D. I., Cowcher, D. P., Ashton, L., O'Hagana, S., Goodacre, R. Illuminating disease and enlightening biomedicine: Raman spectroscopy as a diagnostic tool. Analyst. 138, 3871-3884 (2013).
  30. A•P•E Angewandte Physik & Elektronik GmbH. , Germany. Available from: http://www.ape-berlin.de/en/page/calculator (2015).
  31. Ozçelik, M., et al. Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves. J Neurosci. 30 (11), 4120-4131 (2010).
  32. Heinrich, C., Hofer, A., Ritsch, A., Ciardi, C., Bernet, S., Ritsch-Marte, M. Selective imaging of saturated and unsaturated lipids by wide-field CARS-microscopy. Opt. Express. 16 (4), 2699-2708 (2008).
  33. Kyriakidis, N. B., Skarkalis, P. Fluorescence spectra measurement of olive oil and other vegetable oils. J. AOAC Int. 83 (6), 1435-1439 (2000).
  34. King, R. Microscopic anatomy: normal structure. Handb. Clin. Neurol. 115, 7-27 (2013).
  35. Monsma, P. C., Brown, A. FluoroMyelin Red is a bright, photostable and non-toxic fluorescent stain for live imaging of myelin. J. Neurosci. Methods. 209 (2), 344-350 (2012).
  36. Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys. J. 89 (1), 581-591 (2005).
  37. Wang, H. W., Fu, Y., Huff, T. B., Le, T. T., Wang, H., Cheng, J. X. Chasing lipids in health and diseases by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Vib. Spectrosc. 50 (1), 160-167 (2009).
  38. Jung, Y., Tam, J., Jalian, H. R., Anderson, R. R., Evans, C. L. Longitudinal, 3D in vivo imaging of sebaceous glands by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: normal function and response to cryotherapy. J. Invest. Dermatol. 135 (1), 39-44 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia CARSlaser tytanowo szafirowysynchronizacja laser wimplementacja linii op niaj cejnieliniowy obrazowanie optycznegenerowanie drugiej harmonicznejobrazowanie os onek mielinowychbezznacznikowe obrazowanie chemicznemikroskop wielofotonowy
Implementacja koherentnego systemu rozpraszania Ramana (CARS) na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym Ti:Sapphire i OPO
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.