Pomiar fagocytozy granulocytów i monocytów oraz aktywności oksydacyjnej we krwi ludzkiej

Mary Pat Meaney; David C. Nieman; Dru A. Henson; Qi Jiang; Fu-Zhang Wang

doi:10.3791/54264

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar fagocytozy granulocytów i monocytów oraz aktywności oksydacyjnej we krwi ludzkiej

13.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54264

⸱

12 września 2016

Mary Pat Meaney¹ , David C. Nieman¹ , Dru A. Henson² , Qi Jiang³ , Fu-Zhang Wang³

¹Human Performance Laboratory, North Carolina Research Campus, Appalachian State University, ²Department of Biology, Appalachian State University, ³David H. Murdock Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego manuskryptu jest przedstawienie metody pomiaru fagocytozy monocytów i granulocytów oraz aktywności wybuchu oksydacyjnego w próbkach ludzkiej krwi.

Streszczenie

Test fagocytozy granulocytów i monocytów oraz aktywności wybuchu oksydacyjnego (OB) może być wykorzystany do badania wrodzonego układu odpornościowego. Niniejszy manuskrypt zawiera niezbędną metodologię do dodania tego testu do arsenału immunologii próbnej. Pierwszym krokiem w tym teście jest przygotowanie dwóch podwielokrotności ("H" i "F") krwi pełnej (heparyny). Następnie do podwielokrotności H dodaje się dihydroethidium i obie podwielokrotności inkubuje się w ciepłej łaźni wodnej, a następnie w zimnej kąpieli wodnej. Następnie do podwielokrotności H dodaje się Staphylococcus aureus (S. aureus), a do podwielokrotności F dodaje się Staphylococcus aureus znakowany izotiocyjanianem fluoresceiny (bakterie: fagocyt = 8:1), a obie podwielokrotności inkubuje się w ciepłej łaźni wodnej, a następnie w kąpieli w zimnej wodzie. Następnie do każdej podwielokrotności dodaje się błękit trypanowy w celu wygaszenia fluorescencji zewnątrzkomórkowej, a komórki przemywa się solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Następnie czerwone krwinki są poddawane lizie, a białe krwinki są utrwalane. Na koniec stosuje się cytometr przepływowy i odpowiednie oprogramowanie analityczne do pomiaru fagocytozy granulocytów i monocytów oraz aktywności OB. Ten test jest stosowany od ponad 20 lat. Po ciężkim i długotrwałym wysiłku sportowcy doświadczają znacznego, ale przejściowego wzrostu fagocytozy i przedłużonego spadku aktywności OB. Wzrost fagocytozy po wysiłku jest skorelowany ze stanem zapalnym. W przeciwieństwie do osób o normalnej masie ciała, fagocytoza granulocytów i monocytów jest przewlekle podwyższona u uczestników z nadwagą i otyłością i jest umiarkowanie skorelowana z białkiem C-reaktywnym. Podsumowując, ten test oparty na cytometrii przepływowej mierzy fagocytozę i aktywność OB fagocytów i może być stosowany jako dodatkowa miara stanu zapalnego wywołanego wysiłkiem fizycznym i otyłością.

Wprowadzenie

Test aktywności fagocytozy granulocytów i monocytów/wybuchu oksydacyjnego (OB) jest prostą, nieskomplikowaną techniką, która jest często używana do zbierania informacji o wrodzonej funkcji immunologicznej po długotrwałym i intensywnym wysiłku.^1-4 Podczas badania odpowiedzi układu odpornościowego na bodziec, granulocyty i monocyty są szczególnie interesujące, ponieważ odgrywają kluczową rolę w obronie gospodarza i są pierwszymi komórkami odpornościowymi, które gromadzą się w miejscu infekcji. ⁵ Neutrofile, rodzaj granulocytów, są pierwszymi komórkami, które przemieszczają się do uszkodzonej tkanki mięśniowej po intensywnym wysiłku. ^6....