Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar fagocytozy granulocytów i monocytów oraz aktywności oksydacyjnej we krwi ludzkiej

13.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54264

⸱

12 września 2016

 ,  ,  ,  , 
1Human Performance Laboratory, North Carolina Research Campus, Appalachian State University, 2Department of Biology, Appalachian State University, 3David H. Murdock Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego manuskryptu jest przedstawienie metody pomiaru fagocytozy monocytów i granulocytów oraz aktywności wybuchu oksydacyjnego w próbkach ludzkiej krwi.

Streszczenie

Test fagocytozy granulocytów i monocytów oraz aktywności wybuchu oksydacyjnego (OB) może być wykorzystany do badania wrodzonego układu odpornościowego. Niniejszy manuskrypt zawiera niezbędną metodologię do dodania tego testu do arsenału immunologii próbnej. Pierwszym krokiem w tym teście jest przygotowanie dwóch podwielokrotności ("H" i "F") krwi pełnej (heparyny). Następnie do podwielokrotności H dodaje się dihydroethidium i obie podwielokrotności inkubuje się w ciepłej łaźni wodnej, a następnie w zimnej kąpieli wodnej. Następnie do podwielokrotności H dodaje się Staphylococcus aureus (S. aureus), a do podwielokrotności F dodaje się Staphylococcus aureus znakowany izotiocyjanianem fluoresceiny (bakterie: fagocyt = 8:1), a obie podwielokrotności inkubuje się w ciepłej łaźni wodnej, a następnie w kąpieli w zimnej wodzie. Następnie do każdej podwielokrotności dodaje się błękit trypanowy w celu wygaszenia fluorescencji zewnątrzkomórkowej, a komórki przemywa się solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Następnie czerwone krwinki są poddawane lizie, a białe krwinki są utrwalane. Na koniec stosuje się cytometr przepływowy i odpowiednie oprogramowanie analityczne do pomiaru fagocytozy granulocytów i monocytów oraz aktywności OB. Ten test jest stosowany od ponad 20 lat. Po ciężkim i długotrwałym wysiłku sportowcy doświadczają znacznego, ale przejściowego wzrostu fagocytozy i przedłużonego spadku aktywności OB. Wzrost fagocytozy po wysiłku jest skorelowany ze stanem zapalnym. W przeciwieństwie do osób o normalnej masie ciała, fagocytoza granulocytów i monocytów jest przewlekle podwyższona u uczestników z nadwagą i otyłością i jest umiarkowanie skorelowana z białkiem C-reaktywnym. Podsumowując, ten test oparty na cytometrii przepływowej mierzy fagocytozę i aktywność OB fagocytów i może być stosowany jako dodatkowa miara stanu zapalnego wywołanego wysiłkiem fizycznym i otyłością.

Wprowadzenie

Test aktywności fagocytozy granulocytów i monocytów/wybuchu oksydacyjnego (OB) jest prostą, nieskomplikowaną techniką, która jest często używana do zbierania informacji o wrodzonej funkcji immunologicznej po długotrwałym i intensywnym wysiłku.1-4 Podczas badania odpowiedzi układu odpornościowego na bodziec, granulocyty i monocyty są szczególnie interesujące, ponieważ odgrywają kluczową rolę w obronie gospodarza i są pierwszymi komórkami odpornościowymi, które gromadzą się w miejscu infekcji. 5 Neutrofile, rodzaj granulocytów, są pierwszymi komórkami, które przemieszczają się do uszkodzonej tkanki mięśniowej po intensywnym wysiłku. 6 Fagocytoza i aktywność OB są najczęstszymi miarami funkcji granulocytów i monocytów,7 i są preferowane jako wskaźniki wrodzonej funkcji komórek odpornościowych ze względu na ich centralną rolę zarówno w procesie infekcji, jak i w procesie naprawy.

Test opisany w tym manuskrypcie wykorzystuje podstawowy cytometr przepływowy, aby zapewnić ilościowe określenie fagocytozy granulocytów i monocytów oraz aktywności OB w pełnej krwi. Zastosowanie krwi pełnej w tej technice jest korzystne, ponieważ pozwala na przeprowadzenie testu bez czasochłonnej procedury oczyszczania. Test ten można łatwo modyfikować, aby dostosować go do różnych projektów badawczych i możliwości laboratoryjnych. Na przykład Liao i in. zastosowali podobną technikę, aby wykazać, że aktywność neutrofili OB jest zwiększona, a fagocytoza neutrofili zmniejszona po urazowym uszkodzeniu mózgu. 8 W innym przykładzie McFarlin i in. opisali elegancką modyfikację tej techniki, która wykorzystuje CD66b sprzężoną z allofikocyjaniną (APC) i wysokowydajne tandemowe znakowanie CD45 sprzężonego z APC za pomocą cytometrii przepływowej opartej na obrazie w celu sklasyfikowania granulocytów pod względem ich fagocytozy i aktywności OB. 7,9

Nasza grupa badawcza używała różnych adaptacji tej techniki jako wskaźnika wrodzonej funkcji immunologicznej w populacjach z nadwagą, otyłością i atletyzmem przez prawie 20 lat. 10,11 Poniższy tekst dostarczy czytelnikowi instrukcji krok po kroku dotyczących wykonywania tego testu i podkreśli obszary, które czytelnik może dostosować do potrzeb swoich badań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie procedury pobierania krwi zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi określonymi przez Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB).

1. Przygotowanie testu

  1. Zbierz, przygotuj i uporządkuj materiały przeznaczone do zabiegu (patrz Tabela Konkretnych Materiałów/Sprzętu).
    1. Oznacz probówki 12 x 75 mm.
      1. Oznacz dwie probówki dla każdego uczestnika: jedną probówkę do testu fagocytozy (oznacz tę probówkę czarnym tuszem i "F" dla izotiocyjanianu fluoresceiny [FITC]) i jedną probówkę do testu aktywności OB (oznacz tę probówkę czerwonym tuszem i "H" dla dihydroetydydy [HE]).
        UWAGA: Zaleca się stosowanie sterylnych probówek o wymiarach 12 x 75 mm w celu zminimalizowania niezamierzonej aktywacji komórkowej i związanego z tym wzrostu hałasu w tle.
      2. Oznacz trzy probówki do testów kontrolnych: jedną probówkę do testu fagocytozy (kontrola FITC: oznacz tę probówkę czarnym tuszem i literą "F"), jedną probówkę do testu aktywności OB (kontrola HE: oznacz tę probówkę czerwonym atramentem i "H") i jedną probówkę do kontroli ujemnej (tylko krew: oznacz tę probówkę zielonym atramentem i "tylko krew").
    2. Przygotować roztwory podstawowe co najmniej jeden dzień przed dniem próby.
      1. Przygotować sterylny roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS). Rozcieńczyć 100 ml 10x PBS 900 ml 18,2 MΩH2O. Filtr sterylizować filtrem 0,2 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
      2. Przygotować sterylną PBS-glukozę. Rozpuścić 1,0 g glukozy w 100 ml PBS. Filtr sterylizować filtrem 0,2 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
      3. Przygotować sterylny 0,1 M bufor cytrynianu. Rozpuścić 1,2 g kwasu cytrynowego i 1,1 g cytrynianu sodu w 100 ml 18,2 MΩH2O. Doprowadzić pH do 4,0. Filtr sterylizować filtrem 0,2 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
      4. Przygotować roztwór podstawowy HE. Zawiesić 1,0 mg HE w 1,0 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Delikatnie wymieszać, porcję i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
      5. Przygotować roztwór podstawowy Staphylococcus aureus (S. aureus) znakowany metodą FITC (2 x 10 9 cząstek/ml). Zawiesić 10 mg S. aureus znakowanego FITC w 1,5 ml (lub odpowiedniej ilości) PBS. Podzielić na trzy podwielokrotności po 500 μl i poddać sonizacji zgodnie z zaleceniami producenta. Porcję i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
      6. Przygotować nieznakowany roztwór podstawowy S. aureus (2 x 10 9 cząstek/ml). Zawiesić 100 mg nieznakowanego S. aureus w 15 ml (lub odpowiedniej ilości) PBS. Podzielić na trzydzieści 500 μl podwielokrotności i poddać sonikacji zgodnie z zaleceniami producenta. Porcję i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
    3. Przygotować świeże roztwory robocze w dniu próby.
      1. Przygotować roztwór roboczy dla programu "Horyzont Sześć". Przenieść 10 μl rozmrożonego roztworu podstawowego HE do 990 μl PBS-glukozy. Chronić przed światłem i przechowywać na lodzie do czasu użycia.
      2. Przygotować roztwór roboczy S. aureus znakowany znakiem FITC (133,333 cząstki/μl). Przenieść 70 μl rozmrożonego roztworu podstawowego S. aureus znakowanego FITC do 980 μl PBS. Chronić przed światłem i przechowywać na lodzie do czasu użycia.
      3. Przygotować nieznakowany roztwór roboczy S. aureus (133,333 cząstki/μl). Przenieść 70 μl rozmrożonego, nieznakowanego roztworu podstawowego S. aureus do 980 μl PBS. Chronić przed światłem i przechowywać na lodzie do czasu użycia.
      4. Przygotuj roztwór hartowniczy. Dodać 750 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego do 11,25 ml sterylnego 0,1 M buforu cytrynianowego. Przechowywać w lodowatej kąpieli wodnej do czasu użycia.
    4. Zleć certyfikowanemu flebotomiście pobranie krwi zgodnie z wytycznymi Światowej Organizacji Zdrowia dotyczącymi pobierania krwi.
      1. Pobrać krew do jednej 4 ml probówki do pobierania krwi zawierającejK2EDTA. Odwróć probówkę do pobierania krwi zgodnie z instrukcjami producenta. Trzymaj probówkę do pobierania krwi w temperaturze pokojowej na bujaku stołowym do czasu użycia. Krwi tej należy użyć do pełnej morfologii krwi (CBC) z analizą różnicową białych krwinek (WBC) opisaną w kroku 1.2.1.
      2. Pobrać krew do jednej probówki o pojemności 4 ml zawierającej heparynę litową. Odwróć probówkę do pobierania krwi zgodnie z instrukcjami producenta. Trzymaj probówkę do pobierania krwi w RT na bujaku stołowym do czasu użycia. Użyj tej krwi do fagocytozy monocytów i granulocytów oraz testu aktywności OB opisanego w kroku 2.
  2. Określić ilość bakterii (tj. S. aureus), która będzie potrzebna do wykonania testu dla każdej próbki.
    1. Użyj analizatora hematologicznego, aby wykonać morfologię krwi z analizą różnicową WBC we krwi, zgodnie z opisem w instrukcjach producenta. Zanotuj liczbę krwinek białych (w komórkach/ml), % neutrofili i %monocytów.
    2. Skorzystaj z poniższych równań, aby określić liczbę neutrofili i monocytów dla każdej próbki.
      Liczba neutrofili (w komórkach/ml) = %neutrofile × WBC (w komórkach/ml)
      Liczba monocytów (w komórkach/ml) = %Monocyte × WBC (w komórkach/ml)
    3. Skorzystaj z poniższych równań, aby określić liczbę fagocytów dla każdej próbki oraz liczbę fagocytów obecnych w 100 μl próbki.
      Liczba fagocytów (w komórkach/ml) = liczba neutrofili (w komórkach/ml) + liczba monocytów (w komórkach/ml)
      Liczba fagocytów w 100 μl = (liczba fagocytów (w komórkach/ml))/10
    4. Użyj poniższego równania, aby określić liczbę bakterii (tj. S. aureus) potrzebnych dla każdej próbki oraz ilość znakowanego FITC roztworu roboczego S. aureus lub nieznakowanego S. aureus (133,333 cząstek/ml), które należy dodać do każdej probówki.
      UWAGA: Docelowy stosunek bakterii do fagocytów wynosi 8:1,
      Liczba potrzebnych bakterii = Liczba fagocytów w 100 μl × 8
      Potrzebna objętość FITC lub nieznakowanego roztworu roboczego (w μl) = (liczba potrzebnych bakterii)/(133,333 cząstki/μl)

2. Wykonaj test

  1. Przygotuj krew pełną do testu.
    1. Dla każdego uczestnika i probówki kontrolnej użyj przedłużonej końcówki pipety, aby przenieść 100 μl krwi pełnej z probówki do pobierania krwi z heparyną litową na dno odpowiednio oznakowanej probówki o wymiarach 12 x 75 mm. Wymień caps.
      UWAGA: Uważaj, aby nie dostać się krwi na boki rurek 12 x 75 mm.
    2. Za pomocą mikropipety dodać 10 μl roztworu roboczego HE do probówek oznaczonych czerwonym tuszem i literą "H", w tym do probówki kontrolnej HE. Załóż nasadki i krótko wiruj.
    3. Inkubować wszystkie probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15 minut. Następnie natychmiast przenieś wszystkie probówki do łaźni lodowatej na 12 minut.
      UWAGA: Użyj otwartego metalowego stojaka i delikatnie potrząsaj stojakiem co 5 minut, aby upewnić się, że rurki są szybko i odpowiednio ogrzane lub schłodzone.
  2. Dodać bakterie (tj. S. aureus) do próbki i probówek kontrolnych.
    1. Za pomocą mikropipety dodać odpowiednią ilość (obliczoną w kroku 1.2.4) nieznakowanego roztworu roboczego S. aureus do probówek oznaczonych czerwonym tuszem i literą "H", w tym probówki kontrolnej HE. Załóż nasadki i krótko wiruj.
    2. Za pomocą mikropipety dodać odpowiednią ilość (obliczoną w kroku 1.2.4) roztworu roboczego S. aureus znakowanego FITC do probówek oznaczonych czarnym tuszem i literą "F", w tym probówki kontrolnej FITC. Załóż nasadki i krótko wiruj.
    3. Wirować probówkę kontrolną "tylko krew", ale nie dodawać do niej żadnego rodzaju bakterii (np. S. aureus).
    4. Inkubować wszystkie probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 minut. Używać otwartego metalowego stojaka i delikatnie potrząsać stojakiem co 5 minut, aby upewnić się, że probówki są szybko i odpowiednio ogrzane. Po okresie inkubacji natychmiast przenieść wszystkie probówki do łaźni lodowatej na 1 minutę.
  3. Umyj komórki.
    1. Za pomocą pipety powtarzalnej dodaj 100 μl lodowatego roztworu hartowniczego do wszystkich probówek. Załóż nakrętki, krótko zwiruj, a następnie inkubuj wszystkie probówki na lodzie przez 1 minutę.
    2. Za pomocą pipety powtarzalnej dodać 1 ml lodowatego PBS do wszystkich probówek. Krótko zmieszaj, a następnie dodaj dodatkowe 2 ml lodowatego PBS do wszystkich probówek i załóż nakrętki. Odwirować wszystkie probówki przez 5 minut w temperaturze 4 °C i 270 x g, a następnie odessać supernatant.
    3. Powtórz krok 2.3.2 jeden raz (w sumie 2 prania).
  4. Przygotować próbki do cytometrii przepływowej.
    1. Za pomocą pipety powtarzalnej dodaj 50 μl lodowatej płodowej surowicy bydlęcej do wszystkich probówek. Krótko przekręć wszystkie rurki.
    2. Przenieś wszystkie probówki do odpowiedniej karuzeli i użyj zautomatyzowanej stacji roboczej do przygotowywania lizy komórek z odczynnikami do lizy czerwonych krwinek (RBC) i utrwalania krwinek białych w celu lizy krwinek czerwonych i utrwalenia krwinek białych zgodnie z opisem w instrukcjach producenta.
    3. Po zakończeniu pracy zautomatyzowanej stacji roboczej do przygotowywania lizy komórek, zawiń probówki w folię aluminiową i przechowuj w lodówce o temperaturze 4 °C do czasu przeprowadzenia analizy cytometrii przepływowej.

3. Akwizycja cytometrii przepływowej

  1. Skonfiguruj system cytometrii przepływowej.
    1. Rozgrzej system cytometrii przepływowej zgodnie z zaleceniami zawartymi w instrukcji obsługi dostarczonej przez producenta. Następnie sprawdź poziom odczynnika i poziomu w zbiorniku na odpady. W razie potrzeby napełnij zbiorniki odczynnika i/lub opróżnij zbiornik na odpady.
    2. Użyj funkcji "Wyczyść panel", aby uruchomić cykl czyszczenia systemu. Następnie uruchom fluorosfery do weryfikacji wyrównania i płynności i upewnij się, że półszczytowy współczynnik zmienności (HPCV) dla każdego detektora mieści się w predefiniowanym zakresie opisanym w protokołach kontroli jakości (QC) dostarczonych przez producenta.
  2. Twórz protokoły akwizycji i ustawień instrumentów specyficzne dla testu.
    1. Utwórz protokoły akwizycji specyficzne dla testu dla testów aktywności fagocytozy i OB.
      UWAGA: Opisane tutaj protokoły akwizycji można dostosować do użycia na dowolnym cytometrze przepływowym z niebieskim laserem (488 nm), filtrem (530/30) dla FITC i filtrem (575/26) dla HE.
      1. Otwórz oprogramowanie do akwizycji systemu cytometrii przepływowej i utwórz "Nowy protokół".
      2. Wybierz "Parametr FL1" dla testu fagocytozy (FITC) i "Parametr FL2" dla testu aktywności OB (HE).
      3. Utwórz wykresy (tj. wykres punktowy rozproszenia do przodu [FSC] vs. punktowy rozrzutu bocznego [SSC], histogram FL1, histogram FL2) wymagane do akwizycji.
      4. Utwórz regiony wielokątne dla populacji WBC (białych krwinek), granulocytów i monocytów na wykresie FSC w porównaniu z SSC i utwórz regiony liniowe na histogramach FL1 i FL2. Ustaw "Licznik zatrzymań" na 50 000 wydarzeń dla bramki WBC.
      5. Zapisz protokoły z nazwami specyficznymi dla testu.
    2. Tworzenie specyficznych dla testu protokołów ustawień przyrządów dla testów fagocytozy i aktywności OB.
      1. Przeciągnij i upuść "protokoły akwizycji specyficzne dla testu" (zdefiniowane w kroku 3.2.1) z "Eksploratora zasobów" do "Menedżera akwizycji" w oprogramowaniu do akwizycji systemu cytometrii przepływowej.
        UWAGA: Informacje dodane w ten sposób zawsze pojawią się na końcu listy roboczej.
      2. Wprowadź przykładowe informacje do listy roboczej i zapisz listę roboczą.
      3. Wyjąć probówki z próbkami kontrolnymi z lodówki o temperaturze 4 °C i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej przez 15 minut. Następnie krótko zmieszaj każdą probówkę z próbką kontrolną.
      4. Stosować "protokoły pobierania specyficzne dla testu" określone w kroku 3.2.1 w celu przeprowadzenia ujemnej próbki kontrolnej (tj. tylko krwi) i dodatnich próbek kontrolnych (tj. kontroli HE, kontroli FITC) przez system cytometrii przepływowej. Przejrzyj histogramy i dostosuj napięcia lampy fotopowielacza (PMT) kanałów FITC i fikoerytryny (PE) zgodnie z potrzebami.
      5. Wirować próbki kontrolne i przesyłać je do karuzeli systemu cytometrii przepływowej zgodnie z kolejnością na liście roboczej. Następnie umieść karuzelę w komorze do pobierania próbek i kliknij przycisk "Start" na pasku narzędzi cytometru, aby uzyskać dane dla próbek kontrolnych. Zapisz protokół ustawień "xxx Setting Pro".
  3. Pobieranie próbek do badań w systemie cytometrii przepływowej.
    1. Wyjąć probówki z próbkami badawczymi z lodówki o temperaturze 4 °C i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej na 15 minut.
    2. Gdy próbki są równoważne, przeciągnij wstępnie zdefiniowane protokoły pozyskiwania specyficzne dla badania do obszaru listy roboczej, aby utworzyć listę roboczą projektu.
    3. Upewnij się, że "protokół ustawienia" jest powiązany z "protokołami ustawień specyficznymi dla testu" zdefiniowanymi w kroku 3.2.2. Następnie wprowadź informacje identyfikujące (np. nazwę badania, numer losowania, numer wizyty, identyfikator podmiotu) dla każdej probówki do listy zadań.
    4. Po 15-minutowym okresie równowagi należy odwirować próbki badawcze i przenieść je do karuzeli systemu cytometrii przepływowej zgodnie z kolejnością na liście roboczej. Następnie umieść karuzelę w komorze do pobierania próbek i kliknij przycisk "Start" na pasku narzędzi cytometru, aby uzyskać dane dla badanych próbek.
    5. Przejrzyj jakość danych, sprawdzając skuteczność lizy RBC i rozkład podgrup komórek WBC, proporcje, liczby bezwzględne i intensywności fluorescencji w panelu raportów każdej próbki.
      UWAGA: Jakość danych jest uważana za akceptowalną, jeśli wszystkie te kryteria mieszczą się w swoich predefiniowanych granicach. Jeżeli wszystkie kryteria nie są spełnione, próbka powinna zostać poddana ponownemu procesowi.
    6. Wyczyść i wyłącz system cytometrii przepływowej. Przechowuj dane cytometrii przepływowej na dwóch różnych dyskach komputera, aby zapobiec przypadkowej utracie danych.

4. Analiza danych

  1. Wykonaj analizę fagocytozy.
    1. Skonsoliduj wszystkie pliki danych próbki fagocytozy (tj. znakowanej F) i danych w trybie listy kontrolnej (LMD) w jednym folderze. Następnie otwórz oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej i przeciągnij pliki do przestrzeni próbki.
    2. Ustaw bramki WBC, granulocytów, monocytów i limfocytów.
      1. Kliknij dwukrotnie nazwę pliku, aby otworzyć dowolną z "próbek kontrolnych FITC". Użyj menu rozwijanych, aby ustawić oś x na "FSC" i "liniową", a oś y na "SSC" i "liniową".
      2. Użyj "selektora bramek wielokątnych", aby przygotować bramkę dla całej populacji WBC.
        UWAGA: Pamiętaj, aby uwzględnić wszystkie komórki na krawędziach wykresu. Oznacz tę bramkę jako "WBC".
      3. Kliknij dwukrotnie "nową bramkę WBC" i za pomocą menu rozwijanych ustaw oś x na "FSC" i "Liniową", a oś y na "SSC" i "Liniową".
      4. Użyj "selektora bramki wielokątnej", aby ustawić "bramkę granulocytów" i bramkę monocytów", a następnie użyj "selektora bramki eliptycznej", aby ustawić "bramkę limfocytów". Oznacz odpowiednio każdą bramę. Przeciągnij "dane bramki (%)" na bok, aby komórki były łatwo widoczne.
    3. Ustaw "Bramkę dodatnią fagocytozy" i "Bramkę ujemną fagocytozy" dla populacji granulocytów i monocytów.
      1. Kliknij dwukrotnie "próbkę kontrolną FITC" użytą w kroku 4.1.2.1. Następnie kliknij "Bramka granulocytów" i użyj menu rozwijanych, aby ustawić oś x na "FL1" i "Log", a oś y na "SSC" i "Liniową".
      2. Użyj "selektora bramki kwadratowej", aby ustawić "bramkę ujemną fagocytozy" i "bramkę dodatnią fagocytozy".
        UWAGA: Ponieważ próbki kontrolne FITC nie otrzymywały bodźców bakteryjnych (tj. S. aureus), wszystkie komórki powinny teoretycznie być ujemne pod względem fagocytozy. Zachowaj ostrożność przy ustalaniu granic dla tych populacji.
      3. Powtórz kroki 4.1.3.1 i 4.1.3.2 dla populacji monocytów.
    4. Dodaj statystyki dla "% WBC", "intensywności fluorescencji" i "% komórek dodatnich fagocytozy" dla populacji granulocytów i monocytów.
      1. Kliknij na "próbkę kontrolną FITC" użytą w kroku 4.1.2.1. Zaznacz "Brama granulocytów", a następnie kliknij "Obszar roboczy" i "Dodaj statystykę". Zaznacz "Średnia geometryczna" i "FL1 Log" i kliknij "Dodaj". Następnie wybierz statystykę "Częstotliwość rodzica" i kliknij "Dodaj".
        UWAGA: Spowoduje to podanie intensywności fluorescencji (średniej geometrycznej) całej populacji granulocytów i procentu WBC (rodzicielskich), które są granulocytami.
      2. Kliknij na "próbkę kontrolną FITC" użytą w kroku 4.1.2.1. Zaznacz "Bramę dodatnią fagocytozę" populacji granulocytów, a następnie kliknij "Obszar roboczy" i "Dodaj statystykę". Zaznacz "Średnia geometryczna" i "FL1 Log" i kliknij "Dodaj". Następnie wybierz statystykę "Częstotliwość rodzica" i kliknij "Dodaj".
        UWAGA: To da intensywność fluorescencji (średnią geometryczną) granulocytów dodatnich fagocytozy i procent granulocytów (rodzicielskich), które są dodatnie pod względem fagocytozy.
      3. Powtórz kroki 4.1.4.1 i 4.1.4.2 dla populacji monocytów.
      4. Kliknij na "próbkę kontrolną FITC" użytą w kroku 4.1.2.1. Zaznacz "Brama limfocytów", a następnie kliknij "Obszar roboczy" i "Dodaj statystykę". Podświetl statystykę "Częstotliwość rodzica" i kliknij "Dodaj".
        UWAGA: Spowoduje to podanie procentu WBC (rodzicielskich), które są limfocytami.
      5. Proszę zwrócić uwagę na wszystkie bramki i statystyki utworzone w próbie kontrolnej FITC użytej w kroku 4.1.2.1. Przeciągnij je do sekcji "Wszystkie próbki" w panelu "Grupa" u góry ekranu.
        UWAGA: Spowoduje to zastosowanie tych ustawień do wszystkich próbek badawczych.
      6. Zapisz i nazwij pracę jako plik .wsp w tym samym folderze, który zawiera folder LMD.
    5. Dostosuj poszczególne bramki próbek.
      1. Kliknij na "pierwszą próbkę" w zbiorze danych i potwierdź, że bramka WBC odpowiednio pasuje do rozkładu komórek na ekranie. Jeśli tak się nie stanie, kliknij i przeciągnij krawędzie bramki, dostosuj bramkę dla tej próbki. Kliknij "strzałkę w prawo" (np. "˃"), aby przejść do następnej próbki. Powtarzaj ten krok, aż wszystkie próbki zostaną przejrzane.
      2. Kliknij "Bramka WBC" dla pierwszej próbki w zestawie danych i potwierdź, że "Bramka granulocytów", "Bramka monocytowa" i "Bramka limfocytów" dla każdej próbki odpowiednio pasują do rozmieszczenia komórek na ekranie. Dostosuj w razie potrzeby. Kliknij "strzałkę w prawo" (np. "˃"), aby przejść do następnej próbki.
      3. Powtarzaj krok 4.1.5.2, aż wszystkie próbki zostaną przejrzane. Następnie kliknij "Zapisz".
    6. Wyświetlanie danych w programie do elektronicznego arkusza kalkulacyjnego.
      1. Kliknij ikonę "Edytor tabel" u góry ekranu. Kliknij "Edytuj", "Słowa kluczowe" i "$DATE", aby uwzględnić datę próbkowania w końcowym arkuszu kalkulacyjnym. Następnie kliknij "Edytuj", "Słowa kluczowe" i "@SAMPLEID1", aby dołączyć identyfikację próbki do końcowego arkusza kalkulacyjnego. Powtórz te czynności dla "@SAMPLEID2", "@SAMPLEID3" i "@SAMPLEID4".
      2. Dostosuj ekran "Edytor tabel" i ekran "próbki" tak, aby można je było wyświetlić na ekranie komputera. Wybierz dowolną "próbkę" na arkuszu próbki. Następnie przeciągnij każdą interesującą Cię statystykę do "Edytora tabel".
        1. Przeciągnij statystykę "Częstotliwość rodzica" wymienioną w sekcji "Bramka granulocytów" do "Edytora tabel". Wpisz "% WBC jako granulocyty" w kolumnie "Nazwa" w "Edytorze tabel
          2. ".
        2. Przeciągnij statystykę "Średnia geometryczna" wymienioną w sekcji "Bramka granulocytów" do "Edytora tabel". Wpisz "Średnia geometryczna Fluorescencja, Granulocyty" w kolumnie "Nazwa" w "Edytorze tabel".
        3. Przeciągnij statystykę "Freq. of Parent" wymienioną w sekcji "Bramka dodatnia granulocytów/fagocytozy" do "Edytora tabel". Wpisz "% granulocytów dodatnich pod względem fagocytozy" w kolumnie "Nazwa" w "Edytorze tabel".
        4. Przeciągnij statystykę "Średnia geometryczna" wymienioną w polu "Bramka dodatnia granulocytów/fagocytozy" do "Edytora tabel". Wpisz "Średnia geometryczna fluorescencji, granulocyty dodatnie pod kolumną "Nazwa" w "Edytorze tabel
          5. ".
        5. Przeciągnij statystykę "Freq. of Parent" wymienioną pod "Monocyte gate" do "Table Editor". Wpisz "% WBC jako Monocyty" w kolumnie "Nazwa" w "Edytorze tabel
          6. ".
        6. Przeciągnij statystykę "Średnia geometryczna" wymienioną pod "Bramką monocytów" do "Edytora tabel". Wpisz "Średnia geometryczna fluorescencji, monocyty" w kolumnie "Nazwa" w "Edytorze tabel".
        7. Przeciągnij statystykę "Freq. of Parent" wymienioną pod "Monocyte/Fagocytoza Dodatnia bramka" do "Edytora tabel". Wpisz "% fagocytozy dodatnich monocytów" w kolumnie "Nazwa" w "Edytorze tabel".
        8. Przeciągnij statystykę "Średnia geometryczna" wymienioną pod "Bramką dodatnią monocytów/fagocytozy" do "Edytora tabel". Wpisz "Średnia geometryczna Fluorescencja, Fagocytoza Dodatnie monocyty" w kolumnie "Nazwa" w "Edytorze tabel".
        9. Przeciągnij statystykę "Freq. of Parent" wymienioną w sekcji "Bramka limfocytów" do "Edytora tabel". Wpisz "% WBC jako limfocyty" w kolumnie "Nazwa" w "Edytorze tabel
          10. ".
      3. Przeciągnij i upuść parametry widoczne w "Edytorze tabel", aż zostaną ułożone w preferowanej kolejności.
      4. Kliknij "Zapisz". Następnie kliknij "Utwórz tabelę", aby wyświetlić dane w formacie arkusza kalkulacyjnego. Kliknij "zapisz jako", aby zapisać i nazwać pracę jako .xlsx plik.
  2. Powtórz krok 4.1 dla próbek do oznaczania aktywności OB (tj. znakowanych H) i kontrolnych plików danych LMD.
    UWAGA: Pamiętaj, aby zastąpić wszystkie odniesienia do fagocytozy odniesieniami do aktywności OB.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedłużony i intensywny wysiłek fizyczny wywiera głęboki wpływ na funkcje odporności wrodzonej, w tym na funkcję komórek naturalnych zabójców (NK), odpowiedź makrofagów opartą na cytokinach w reakcji na infekcję wirusową oraz fagocytozę i aktywność oksydacyjną (OB) granulocytów i monocytów. Liczne badania wskazują, że fagocytoza granulocytów i monocytów znacząco wzrasta po wysiłku, co odzwierciedla stan zapalny wywołany uszkodzeniem mięśni i zapotrzebowaniem metabolicznym. Przeciwnie, ak...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejszy manuskrypt zawiera protokół krok po kroku do oznaczania dwóch wskaźników funkcji granulocytów i monocytów. Zidentyfikowaliśmy kilka kroków, które mają kluczowe znaczenie dla powodzenia tego testu. Jednym z takich etapów jest inkubacja w łaźni lodowej, która odbywa się bezpośrednio przed dodaniem bakterii. Dokładne schłodzenie wszystkich próbek zminimalizuje wpływ temperatury na fagocytozę i aktywność OB. Kolejnym krytycznym krokiem jest dodanie bakterii do każdej próbki. Stosunek bakterii do fagocytów wynoszący...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Zackowi Shue, Caseyowi Johnowi i Lynn Cialdella-Kam za pomoc podczas optymalizacji tej procedury.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki 12 x 75 mm, z nasadkąVWR20170-579Potrzebne będą 2 probówki na próbkę ("H" i "F") oraz 3 probówki na partię (do kontroli testów; "F", "H" i "Tylko krew").
PBS (10x), pH 7,4Life Technologies70011-044
Nakrętka do butelki 0,2 i mikro; m filtr z octanu celulozy (pojemność 500 ml)Fisher Scientific09-741-07 
Glukoza, proszekLife Technologies15023-021
Kwas cytrynowy (bezwodny, testowany na kulturach komórkowych, testowany na kulturach komórkowych roślin)Sigma-AldrichC2404-100G
Cytrynian sodu trójzasadowy dwuwodnySigma-AldrichS4641-25G
Dihydroethidium (Hydroethidine) (HE)Life TechnologiesD11347
Dimetyl sulftlenek (DMSO) Bezwodnetechnologie życiaD12345
Staphylococcus aureus ( Szczep drewna bez białka A) BioParticles, koniugat fluoresceiny (FITC)Life TechnologiesS2851
Staphylococcus aureus ( Szczep drewna bez białka A) BioParticles, nieoznakowanyLife TechnologiesS-2859
Trypan Blue Solution, 0,4%Life Technologies15250-061
4,0 ml vacutainer zawierający 7,2 mg K2EDTA, suszony rozpyłowoVWRBD367861 Na próbkę potrzebna będzie 1 probówka do pobierania krwi K2EDTA.
Vacutainer o pojemności 4,0 ml zawierający 68 jednostek USP Heparyna litowa, powlekana natryskowoVWRBD367884Na próbkę potrzebna będzie 1 probówka do pobierania krwi z heparyną litową.
REDLICA Ac· T 5diff CPBeckman Coulter6605705i.e., analizator hematologiczny
COULTER Ac· T 5diff Płukanieredlic Beckman 8547167
COULTER Ac· T 5diff FixBeckman Coulter8547171
COULTER Ac· T 5diff WBC LyseBeckman Coulter8547170
COULTER Ac· T 5diff Hgb LyseBeckman Coulter8547168
COULTER Ac· T 5diff Kalibrator Cal BeckmanCoulter7547175
COULTER Ac· T 5diff Control PlusBeckman Coulter7547198
AcT 5diff DiluentBeckman Coulter8547169
200 µ l Końcówki do pipet o przedłużonej długościVWR37001-526
Izolowana miska na lódVWR89198-980Do kąpieli w lodowatej wodzie.
Otwarty metalowy stojak na probówkiVWR60916-702
Płodowa surowica bydlęcaLife Technologies26140-111
Stacja robocza TQ-PrepBeckman Coulter6605429i.e., zautomatyzowana stacja robocza do przygotowywania lizy komórek
System odczynników ImmunoPrepBeckman Coulter7546999i.e., system odczynników RBC lyse/WBC fix
System cytometrii przepływowej Cytomics FC500 MCL z oprogramowaniem CXPBeckman Coulter626553
IsoFlow Sheath FluidBeckman Coulter8547008
COULTER CLENZBeckman Coulter8546929
Flow-Check Fluorospheres Beckman Coulter6605359i.e., weryfikacja osiowania i płynności fluorosfery
Oprogramowanie FlowJoFlowJo FlowJoi.e., oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej
Oprogramowanie ExcelMicrosoftMicrosoft Exceli.e., program do elektronicznego arkusza kalkulacyjnego

Bibliografia

  1. Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725(2014).
  2. Knab, A. M., et al. Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists. Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).
  3. Konrad, M., et al. The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).
  4. Nieman, D. C., et al. Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling. Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).
  5. Nieman, D. C., et al. Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running. Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).
  6. Tidball, J. G. Inflammatory cell response to acute muscle injury. Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).
  7. McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (2013).
  8. Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human. PLoS One. 8, e68963(2013).
  9. McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro. J Vis Exp. , (2014).
  10. Nieman, D. C., et al. Immune response to obesity and moderate weight loss. Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).
  11. Nieman, D. C., et al. Immune function in female elite rowers and non-athletes. Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).
  12. Ichii, H., et al. Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes. Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).
  13. Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).
  14. Gruger, T., et al. Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro. Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).
  15. Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PLoS One. 7, e32621(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Fagocytoza granulocyt wcytometria przep ywowaanaliza krwi pe nejStaphylococcus aureusbakterie znakowane FITCdihydroetydiumgaszenie trypanem b kitnymliza kom rek krwi
Pomiar fagocytozy granulocytów i monocytów oraz aktywności oksydacyjnej we krwi ludzkiej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.