Artykuł metodologiczny

Produkcja kardiomiocytów na dużą skalę z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu wysoce powtarzalnego protokołu różnicowania opartego na małych cząsteczkach

10K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54276

⸱

25 lipca 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Stem Cells and Developmental Biology, Cell Science Research Center, Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, 2Developmental and Stem Cell Biology Division, Victor Chang Cardiac Research Institute, 3St. Vincent´s Clinical School, Faculty of Medicine, University of New South Wales, 4School of Biotechnology and Biomolecular Sciences, University of New South Wales, 5Department of Developmental Biology, University of Science and Culture, 6Heart Centre for Children, The Children´s Hospital at Westmead, 7Sydney Medical School, University of Sydney, 8Department of Developmental Biology, University of Science and Culture, Tehran, Iran

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy solidny, szybki i skalowalny protokół różnicowania kardiomiocytów dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). Kardiomiocyty uzyskane przy użyciu tej metody na dużą skalę mogą zapewnić wystarczającą liczbę komórek do ich skutecznego wykorzystania w modelowaniu chorób sercowo-naczyniowych u ludzi, wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków i potencjalnie zastosowaniach klinicznych.

Streszczenie

Maksymalizacja korzyści z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) do badań, modelowania chorób, zastosowań farmaceutycznych i klinicznych wymaga solidnych metod produkcji na dużą skalę funkcjonalnych typów komórek, w tym kardiomiocytów. Tutaj pokazujemy, że czasowa manipulacja szlakami sygnałowymi WNT, TGF-β i SHH prowadzi do wysoce wydajnego różnicowania kardiomiocytów jednokomórkowych pasażowanych linii hPSC zarówno w zawiesinie statycznej, jak i w układach bioreaktorów z mieszaniem zawiesiny. Zastosowanie tej strategii spowodowało ~ 100% pokonanie sferoid, konsekwentnie zawierających > 80% komórek T-dodatnich troponiny sercowej po 15 dniach hodowli, zwalidowanych w wielu liniach hPSC. Informujemy również o odmianie tego protokołu do stosowania z liniami komórkowymi, które nie są obecnie przystosowane do pasażowania pojedynczych komórek, których powodzenie zostało zweryfikowane na 42 liniach hPSC. Kardiomiocyty wygenerowane przy użyciu tych protokołów wyrażają markery specyficzne dla linii i wykazują oczekiwane funkcje elektrofizjologiczne. Nasz protokół stanowi prostą, wydajną i solidną platformę do produkcji ludzkich kardiomiocytów na dużą skalę.

Wprowadzenie

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC), w tym ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC), mają zdolność do samoodnawiania się i zdolność do różnicowania się w komórki trzech embrionalnych listków rozrodczych 1,2. Ze względu na te cechy, hPSC stanowią cenne i nieograniczone źródło do generowania i skalowalnej produkcji typów komórek istotnych dla choroby do modelowania chorób u ludzi 3-5, do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków i testów toksyczności 6,7 oraz potencjalnie do zastosowań klinicznych 8. Generowanie kardiomiocytów z hPSC daje możliwość szczegółowego zbadania mechanizmów złożonych chorób sercowo-naczyniowych u ludzi i ich możliwych metod leczenia, które wcześniej pozostawały poza zakresem naszych możliwości ze względu na brak odpowiednich modeli zwierzęcych i/lub dostępność dotkniętych tkanek pierwotnych.

Wszystkie wyżej wymienione zastosowania hPSC wymagają produkcji ogromnej liczby wysoce wzbogaconych i funkcjonalnych kardiomiocytów. W związku z tym kluczowe znaczenie ma dostępność wydajnego, powtarzalnego i skalowalnego protokołu różnicowania serca in vitro, odpowiedniego dla wielu linii hPSC. W konwencjonalnych protokołach różnicowania kardiomiocytów stosowano różne strategie, takie jak tworzenie ciała zarodka 9, techniki współhodowli 10, indukcja koktajlami cytokin 11 i metody transdukcji białek 12. Pomimo postępów w tych technikach, większość z nich nadal cierpi z powodu niskiej wydajności, wymaga drogich czynników wzrostu lub oferuje ograniczoną uniwersalność przy próbie użycia wielu linii hPSC. Do tej pory wyzwania te wyznaczyły ograniczenia w produkcji kardiomiocytów pochodzących z hPSC do badań nad terapią komórkową na modelach zwierzęcych, a także w przemyśle farmaceutycznym do odkrywania leków. W związku z tym opracowanie solidnych i przystępnych cenowo technik produkcji na dużą skalę funkcjonalnych kardiomiocytów pochodzących z hPSC w skalowalnych systemach hodowli znacznie ułatwiłoby ich komercyjne i kliniczne zastosowania.

W tym manuskrypcie opisujemy rozwój opłacalnego i zintegrowanego systemu różnicowania serca o wysokiej skuteczności, odtwarzalności i możliwości zastosowania do hESC i hiPSC generowanych z różnych źródeł i metod hodowli, w tym metody produkcji na dużą skalę wysoko wzbogaconych populacji kardiomiocytów pochodzących z hPSC za pomocą bioreaktora. Dodatkowo zoptymalizowaliśmy ten protokół dla linii hPSC, które nie są przystosowane do hodowli bezkomórkowych i/lub jednokomórkowych, takich jak nowo utworzone hiPSC lub duże kohorty linii hPSC istotne dla analizy mechanizmu choroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie pożywek hodowlanych, powlekanie płytek do hodowli komórkowych i utrzymanie niezróżnicowanych hPSC

  1. Przygotowanie podłoża
    nuta: Wysterylizuj pożywkę za pomocą urządzenia filtrującego 0,22 μm i przechowuj w temperaturze 4 °C w chronionej przed światłem przez okres do 4 tygodni. Nazwy odczynników, dostawcy i numery katalogowe są wymienione w tabeli materiałów.
    1. W przypadku pożywki dla fibroblastów embrionalnych myszy (MEF) połącz 445 ml DMEM, 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 5 ml pożywki do hodowli komórkowych (np. Glutamax).
    2. W przypadku pożywki z hESC należy połączyć 390 ml Knockout-DMEM (KO-DMEM), 100 ml zamiennika surowicy nokautującej (KO-SR), 5 ml pożywki do hodowli komórkowych, 5 ml roztworu minimalnej ilości aminokwasów egzogennych MEM i 0,5 ml 55 mM β-merkaptoetanolu.
      UWAGA: β-merkaptoetanol jest toksyczny. Unikać wdychania, spożycia i kontaktu ze skórą.
    3. W przypadku pożywki RPMI-B27 (RB) należy połączyć 475 ml RPMI 1640, 10 ml witaminy B27 minus insuliny, 5 ml pożywki do hodowli komórkowych, 5 ml roztworu minimalnych aminokwasów egzogennych MEM, 5 ml penicyliny/streptomycyny i 0,5 ml 55 mM β-merkaptoetanolu.
    4. W celu uzyskania roztworu dysocjacyjnego (DS) należy połączyć 10 ml 0,05% trypsyny, 4 ml KO-SR, 1 ml kolagenazy typu IV (1 mg / ml), 5 ml KO-DMEM i 20 μl CaCl2 (1 M).
    5. W przypadku pożywki kondycjonowanej komórkami zasilającymi dodać 15 ml pożywki hESC (bez bFGF) do kolby T75 ze zbiegającymi się komórkami zasilającymi (MEF lub ludzkimi fibroblastami napletka), które zostały wcześniej inaktywowane przez leczenie mitomycyną C lub przez napromienianie. Po 24 godzinach zebrać kondycjonowaną pożywkę i zastąpić świeżą pożywką z hESC. Ogniwa można stosować do 2 tygodni.
  2. Powlekanie płytek do hodowli komórkowych
    1. Powłoka żelowa ECM:
      1. Przy zakupie rozmrozić ekstrakt żelowy ECM w temperaturze 4 °C, aż osiągnie równomiernie spójny stan płynny, zgodnie z instrukcjami producenta. Rozcieńczyć w stosunku 1:2 w zimnym podłożu KO-DMEM, podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -20 °C.
        nuta: Podczas przygotowywania żelu ECM należy przechowywać wszystkie materiały wymagane do użycia w procedurze porcjowania i powlekania w niskiej temperaturze. Stężenie żelu ECM różni się w zależności od numeru partii. Upewnij się, że stężenie jest odnotowane na podwielokrotnościach. Podwielokrotności można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.
      2. Rozmrozić podwielokrotność żelu ECM w temperaturze 4 °C. Po rozmrożeniu dodać zimną pożywkę KO-DMEM do końcowego stężenia 0,34 mg/ml. Dobrze odpipetować i dodać 0,75 ml na jedno zagłębienie płytki 6-dołkowej. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    2. Mitotycznie inaktywowana powłoka embrionalnej komórki zasilającej fibroblasty myszy (MEF)
      nuta: Przygotowanie ogniw zasilających MEF zostało opisane wcześniej. 14
      1. Pokryć 6-dołkową płytkę do hodowli komórkowej współczynnikiem przyłączenia (AF) lub 0,1% żelatyny (patrz krok 1.2.3) w temperaturze pokojowej przez 5 minut (0,75 ml na jedno zagłębienie płytki 6-dołkowej). Wyjmij płytkę i pozostaw ją w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC) do wyschnięcia.
      2. Rozmrozić MEF, przenosząc zamrożoną fiolkę do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na około 2 - 3 minuty.
      3. Dodać 7 ml pożywki MEF do probówki o pojemności 15 ml. Po rozmrożeniu fiolki z komórkami powoli przenieść zawartość do probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 300 x g przez 4 min. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce MEF.
      4. Policz komórki i płytkę 1 × 106komórek na płytkę 6 dołków (~ 1,7 x 105 komórek/dołek). Przenieść do inkubatora o temperaturze 37 °C / 5% CO2 i pozwolić komórkom przyłączyć O/N przed użyciem.
    3. Powłoka żelatynowa:
      1. Rozpuść 1 g żelatyny w proszku w ultraczystej wodzie, aby uzyskać 0,1% (w/v) roztwór. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C, a następnie autoklawować roztwór w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Po schłodzeniu dodać do wymaganej liczby dołków (0,75 ml na jedno zagłębienie na płytce 6-dołkowej) i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
        nuta: Pozostały 0,1% roztwór żelatyny można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
    4. Powłoka laminowa:
      1. Rozmrozić lamininę (1 mg/ml) w temperaturze 4 °C aż do rozmrożenia. Do 5 μl roztworu lamininy dodać 1 ml zimnego PBS. Dobrze odpipetować, a następnie dodać do wymaganej liczby dołków (0,75 ml na jedno zagłębienie na płytce 6-dołkowej) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    5. Powłoka silikonowa wewnętrznej powierzchni kolby obrotowej:
      1. Dokładnie umyć kolbę wirową o pojemności 100 ml (z 1 szklanym wahadłem) wodą destylowaną, używając szczoteczki do czyszczenia, aby usunąć kurz i/lub pozostałości kultur. Napełnij 70% etanolem i po 30 minutach spłucz wodą destylowaną. Dodać 5 M NaOH i pozostawić O/N.
      2. Usunąć roztwór NaOH i płukać kolbę pod bieżącą wodą przez 5 minut. Napełnić kolbę 1 M HCl i pozostawić na 15 minut. Umyć kolbę bieżącą wodą przez 5 minut, a następnie dwukrotnie wodą podwójnie destylowaną, aby całkowicie usunąć wszelkie ślady HCl. Pozostawić kolbę do całkowitego wyschnięcia w BSC.
      3. Dodać 1,5 ml roztworu silikonowego do kolby i obrócić w poziomie, aby pokryć wszystkie powierzchnie. Powtórz tę samą procedurę dla szklanego wahadła.
      4. Podgrzewać powlekaną kolbę w suchym piecu w temperaturze 100 °C przez 1 godzinę lub pozostawić do wyschnięcia O/N w temperaturze pokojowej. Jeśli jest podgrzewany w piekarniku, pozostaw do ostygnięcia do temperatury RT przez 30 - 60 minut.
      5. Przepłukać kolbę 3 razy wodą dejonizowaną przez 15 minut każde, a następnie sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut.
  3. Utrzymanie niezróżnicowanych hPSC
    Uwaga:     Dla każdego z opisanych protokołów, o ile nie określono inaczej, komórki są hodowane i hodowane w studzienkach z 6-dołkowymi płytkami hodowlanymi, a objętości zostaną podane odpowiednie dla tego formatu.
    1. hPSC hodowane jako niezróżnicowane sferoidy w statycznym układzie zawiesinowym
      nuta: Komórki wykorzystywane w tych krokach powinny być już przystosowane do hodowli jednokomórkowej. 15
      1. Rozpocznij eksperyment z hPSC hodowanymi na żelu ECM w 6-dołkowej płytce hodowlanej przy około 70-80% zgrywaniu. Usuń wszelkie zróżnicowane kolonie za pomocą mikroskopu stereoskopowego w BSC. Dodać 10 μM inhibitora ROCK Y-27632 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godz.
        nuta: Aby usunąć zróżnicowane kolonie, użyj końcówki pipety, aby odłączyć i delikatnie usunąć wszystkie zróżnicowane części ręcznie pod mikroskopem stereoskopowym. Uważaj, aby nie usunąć niezróżnicowanych kolonii.
      2. Usunąć komórki z inkubatora i odessać pożywkę. Umyj komórki 1 ml PBS, usuń i dodaj 0,5 ml enzymu dysocjacji komórek. Inkubować komórki przez 4-5 minut w temperaturze 37 °C.
      3. Dodać 1 ml pożywki z hESC i zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek. Zdysocjuj komórki na pojedyncze komórki za pomocą pipety p1,000. Policz żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru.
      4. Zawiesić komórki na 2 × 105 żywotnych komórek/ml w pożywce kondycjonowanej przez komórki zasilające, uzupełnionej 100 ng / ml bFGF i 10 μM inhibitorem ROCK Y-27632. Przenieś komórki na płytki o bardzo niskim stopniu przylegania za pomocą pipety o pojemności 5 ml (3 ml na dołek na płytkę 6-dołkową).
      5. Po 2 dniach ostrożnie wyjmij komórki z inkubatora i odessaj połowę pożywki (około 1,5 ml). Zastąp świeżo kondycjonowaną pożywką uzupełnioną 100 ng/ml bFGF.
      6. Codziennie zmieniaj połowę pożywki na kondycjonowaną pożywkę uzupełnioną 100 ng/ml bFGF do 5 dnia. Teraz albo dalsza hodowla komórek, pasaż w celu kontynuacji niezróżnicowanej hodowli (krok 1.3.1.2 - 5), albo zastosowanie do różnicowania serca (sekcja 2). Jeśli kontynuujesz hodowlę, pasażuj komórki co 4 - 8 dni.
    2. hPSC hodowane na komórkach zasilających i pasażowane przy użyciu kolagenazy typu IV
      1. Przed pasażowaniem hPSC należy usunąć wszelkie zróżnicowane kolonie za pomocą mikroskopu stereoskopowego w BSC. Odessać pożywkę i przemyć komórki 1 ml PBS na studzienkę. Wyjąć, a następnie dodać 0,75 ml kolagenazy typu IV (1 mg/ml) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 - 15 minut, w zależności od potrzeb, aby brzegi kolonii zaczęły się odklejać.
      2. Odessać kolagenazę i dodać 1 ml pożywki hESC do dołka. Odłącz kolonie do małych skupisk za pomocą skrobaka do komórek, a następnie przenieś komórki za pomocą pipety p1,000 do probówki o pojemności 15 ml. Uważaj, aby nie rozbić grona na małe kawałki.
      3. Przemyć studzienkę 1 ml pożywki hESC, aby zebrać pozostałe komórki i dodać do probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 100 x g przez 2 min. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce hESC uzupełnionej 100 ng/ml bFGF.
      4. Wyjąć z inkubatora płytkę pokrytą MEF i zassać podłoże MEF. Przenieś komórki w proporcji od 1:3 do 1:10, w zależności od przypadku. Codziennie zmieniaj pożywkę na świeżą pożywkę hESC uzupełnioną 100 ng/ml bFGF. Przejście komórek co 4 - 8 dni.

2. Różnicowanie hPSC jako sferoid w statycznym systemie zawieszenia

  1. Rozpocznij eksperyment od niezróżnicowanych sferoid dnia 5, jak przygotowano w sekcji 1.3.1.
    nuta: Na tym etapie średnia wielkość sferoid powinna wynosić 175 ± 25 μm. Rozpoczynając eksperyment różnicowania, należy użyć co najmniej 50 sferoid.
  2. Przenieść sferoidy do probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 5 ml. Przemyć studzienkę 1 ml pożywki RB, aby zebrać wszelkie pozostałe sferoidy i dodać do tej samej probówki o pojemności 15 ml. Pozostaw komórki na 5 minut, aż sferoidy osiądą, tworząc luźny osad (NIE WOLNO wirować). Odessać supernatant, uważając, aby nie pobrać żadnych sferoid.
  3. Dodać 3 ml pożywki RB uzupełnionej 12 μM CHIR99021. Przenieś komórki z powrotem do jednego dołka 6-dołkowej płytki o bardzo niskim przyłączeniu. Po 24 godzinach powtórz krok 2.2.
    nuta: Podłoże RB jest wrażliwe na światło. Podczas pracy z medium RB należy pozostawić lampkę BSC wyłączoną.
  4. Dodać 3 ml pożywki RB do osadu komórkowego. Przenieś komórki z powrotem do jednego dołka 6-dołkowej płytki o bardzo niskim przyłączeniu. Po 24 godzinach powtórz krok 2.2.
  5. Dodać 3 ml pożywki RB uzupełnionej IWP2, purmorfaminą i SB431542 (po 5 μM). Przenieś komórki z powrotem do jednego dołka 6-dołkowej płytki o bardzo niskim przyłączeniu. Po 2 dniach powtórz krok 2.2.
  6. Zawiesić komórki w 3 ml pożywki RB i przenieść na płytkę pokrytą żelatyną, aby umożliwić połączenie komórek.
    nuta: Na tym etapie komórki mogą być również utrzymywane w zawiesinie. Aby kontynuować hodowlę zawiesiny statycznej, przenieś komórki z powrotem na bardzo niską płytkę mocującą.
  7. Po 2 dniach zmienić pożywkę na 3 ml pożywki RB. Kultury zaczną bić następnego dnia. Zmieniaj pożywkę co 3 - 4 dni z pożywką RB.

3. Różnicowanie hPSC jako sferoid w bioreaktorze zawiesinowym z mieszadłem

  1. Rozpocząć eksperyment z niezróżnicowanymi sferoidami hodowanymi w zawiesinie statycznej przez co najmniej 3 pasaże (patrz sekcja 1.3.1). Dodać 10 μM inhibitora ROCK Y-27632 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  2. Usunąć komórki z inkubatora i przenieść wszystkie sferoidy do probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 5 ml. Przemyć studzienkę 1 ml pożywki hESC, aby zebrać wszelkie pozostałe sferoidy i dodać do tej samej probówki o pojemności 15 ml. Pozostaw komórki na 5 minut, aż sferoidy osiądą, tworząc luźny osad (NIE WOLNO wirować). Odessać supernatant, uważając, aby nie pobrać żadnych sferoid.
  3. Umyj komórki, dodając 1 ml PBS. Pozostaw na 5 minut, aż sferoidy osiądą, tworząc luźny osad (NIE wirować). Usunąć supernatant i dodać 0,5 ml 0,05% trypsyny plus 0,53 mM EDTA. Inkubować komórki przez 4-5 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Usunąć komórki z inkubatora i dodać 1 ml pożywki z hESC. Za pomocą pipety p1,000 rozdziel komórki na pojedyncze komórki, policz komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru. Zawiesić do 2 × 105 żywotnych komórek/ml w kondycjonowanym podłożu uzupełnionym 100 ng/ml bFGF i 10 μM inhibitorem ROCK Y-27632.
  5. Przenieść 100 ml zawiesiny komórek do silikonowanej kolby bioreaktora z 1 wahadłem (patrz sekcja 1.2.5). Zacznij od mieszania 35 obr./min, a po 24 godzinach zwiększ do 40 obr./min.
  6. Po 48 godzinach przerwać mieszanie na 5-10 minut, aż wszystkie sferoidy osiądą na dnie kolby. Zastąp połowę pożywki kondycjonowaną pożywką uzupełnioną 100 ng/ml bFGF. Powtarzaj ten sam proces co 24 godziny do 5,< dnia /> nuta: Na tym etapie powinny powstać niezróżnicowane sferoidy o średniej wielkości 175 ± 25 μm.
  7. Przerwać mieszanie na 5 - 10 minut, aż wszystkie sferoidy osiądą na dnie kolby. Przenieść wszystkie sferoidy do probówki o pojemności 50 ml w minimalnej ilości pożywki (mniej niż 50 ml). Wyrzucić pozostałą pożywkę w kolbie bioreaktora, ostrożnie upewniając się, że w naczyniu nie pozostały żadne sferoidy.
  8. Pozostawić na 5 - 10 minut, aż wszystkie sferoidy osiądą na dnie probówki o pojemności 50 ml, a następnie ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając luźnych osadów komórkowych. Przemyć 25 ml PBS z wapniem i magnezem lub podłożem RB, a następnie ponownie pozostawić na 5 - 10 minut, aż wszystkie sferoidy osiądą na dnie probówki o pojemności 50 ml i ponownie utworzą luźne osady.
  9. Ostrożnie usunąć sklarowany nad osadem i dodać 40 ml pożywki RB uzupełnionej 12 μM CHIR99021, 10 μM inhibitorem Rock i 0,1% polialkoholem winylowym (PVA). Ponownie zawiesić sferoidy i przenieść wszystkie komórki z powrotem do kolby bioreaktora. Dodaj pożywkę, aby całkowita objętość wynosiła 100 ml. Wznowić mieszanie przy 40 obr./min przez 24 godziny
    nuta: Podłoże RB jest wrażliwe na światło. Podczas pracy z medium RB należy utrzymywać BSC w trybie lekkiego wyłączenia.
  10. Powtórz kroki 3.7 - 3.8.
  11. Ostrożnie usunąć supernatant i dodać 40 ml pożywki RB uzupełnionej 0,1% PVA. Ponownie zawiesić sferoidy i przenieść wszystkie komórki z powrotem do kolby bioreaktora. Dodaj pożywkę, aby całkowita objętość wynosiła 100 ml. Wznów mieszanie przy 40 obr./min na 24 godziny.
  12. Powtórz kroki 3.7 - 3.8.
  13. Ostrożnie usunąć supernatant i dodać 40 ml pożywki RB uzupełnionej IWP2, purmorfaminą i SB431542 (po 5 μM). Ponownie zawiesić sferoidy i przenieść wszystkie komórki z powrotem do kolby bioreaktora. Dodaj pożywkę, aby całkowita objętość wynosiła 100 ml. Wznów mieszanie przy 40 obr./min na 2 dni.
  14. Powtórz kroki 3.7-3.8.
  15. Ostrożnie usunąć sklarowany osad i dodać tylko 40 ml pożywki RB. Ponownie zawiesić sferoidy i przenieść wszystkie komórki z powrotem do kolby bioreaktora. Dodaj pożywkę, aby całkowita objętość wynosiła 100 ml. Wznów mieszanie przy 40 obr./min. Bicie sferoid należy obserwować 48 - 72 godziny później.
  16. Zmieniaj połowę pożywki co 3 - 4 dni na pożywkę RB tylko poprzez zatrzymanie mieszania na 5 - 10 minut, aż wszystkie sferoidy osiądą na dnie naczynia. Ostrożnie usunąć 50 ml pożywki, nie naruszając sferoid i ostrożnie zastąpić 50 ml świeżej pożywki RB.

4. Różnicowanie hPSC przy użyciu kultur nieprzystosowanych do pasażowania pojedynczych komórek

Uwaga: Podejście to jest szczególnie przydatne do szybkiego różnicowania dużej liczby linii hPSC bez konieczności dostosowywania się do technik hodowli jednokomórkowych, co jest niezwykle pracochłonnym i czasochłonnym procesem. Technika ta ma zastosowanie do linii komórkowych, które są bardzo wrażliwe na enzymatyczną dysocjację komórek, takich jak nowo powstałe linie hPSC.

  1. Rozpocznij eksperyment z hPSC hodowanymi na MEF (jak w sekcji 1.3.2), które w około 70 - 80% zlewają się. Usuń wszelkie zróżnicowane kolonie za pomocą mikroskopu stereoskopowego w BSC.
  2. Usunąć pożywkę i dodać 0,5 ml roztworu dysocjacyjnego (DS). Inkubować przez 0,5 - 1 minutę, aż komórki MEF zaokrąglą się w górę, a krawędzie kolonii hPSC staną się czyste. Szybko usuń DS i dodaj 0,75 ml kolagenazy typu IV (1 mg/ml).
  3. Inkubować komórki przez 5 - 15 minut w temperaturze 37 °C. Sprawdzić komórki pod mikroskopem w okresie inkubacji, a gdy całe kolonie zaczynają się podnosić i odrywać, usunąć kolagenazę i dodać 1,5 ml pożywki hESC.
    nuta: Jeśli po 15 minutach większość kolonii jest nadal przyczepiona, umieść komórki z powrotem w inkubatorze. Sprawdzaj komórki pod mikroskopem co 5 minut. Uważaj, aby nie pozostawić komórek w kolagenazie na dłużej niż 30 minut. Jeśli w roztworze kolagenazy znajduje się wiele pływających kolonii, nie usuwaj kolagenazy; wystarczy dodać 1 ml pożywki hESC.
  4. Używając pipety p1,000, delikatnie odpipetuj kolonie, aby odłączyły się jako całe kolonie. Nie rozbijaj kolonii na małe kawałki. Przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 5 ml. Przemyć studzienkę 1 ml pożywki hESC, aby zebrać pozostałe komórki, które należy dodać do tej samej probówki. Pozostaw na 5 minut, aż wszystkie kolonie się osadzą (NIE wiruj).
  5. Ostrożnie usunąć sklarowany osad i dodać 2 ml pożywki z hESC uzupełnionej 100 ng/ml bFGF. Przenieść komórki do płytki o bardzo niskim stopniu przylegania za pomocą pipety o pojemności 5 ml (1 ml do każdego dołka płytki 24-dołkowej i 3 ml do każdej studzienki płytki 6-dołkowej). Inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez co najmniej 6 godzin (maksymalnie 12 godzin).
  6. W tym czasie należy przygotować wymaganą liczbę studzienek/płytek pokrytych lamininą dla kroku 4.7. Zalecane współczynniki transferu komórek to 1 studzienka zlewająca się z płytki 6-dołkowej do 2 studzienek płytki 24-dołkowej (lub równoważna ilość na powierzchnię).
  7. Po 6 godzinach ostrożnie przenieść agregaty kolonii do probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 5 ml. Przemyć płytkę pożywką RB, aby zebrać wszelkie pozostałe kruszywa i dodać do tej samej probówki o pojemności 15 ml (0,5 ml na studzienkę dla płytek 24-dołkowych i 1 ml na studzienkę dla płytek 6-dołkowych). Odczekać 5 minut, aż agregaty opadną, a następnie ostrożnie zassać supernatant. Uważaj, aby nie naruszyć luźnego pelletu.
  8. Dodać 2 ml pożywki RB uzupełnionej 12 μM CHIR99021 i ostrożnie przenieść pipetą o pojemności 5 ml do wstępnie przygotowanych studzienek pokrytych lamininą (jak w sekcji 1.2.4), aby umożliwić połączenie komórek.
  9. Po 24 godzinach ostrożnie usunąć pożywkę z każdej studzienki i dodać tylko 1 ml pożywki RB.
    nuta: Niektóre skupiska będą bardzo słabo przyczepione do płytki hodowlanej; Dlatego ważne jest, aby nie usuwać żadnych dużych kruszyw, które mogły się poluzować podczas procedury wymiany podłoża. Ważne jest jednak, aby usunąć jak najwięcej resztek małych komórek.
  10. Po 24 godzinach ostrożnie usunąć pożywkę i dodać pożywkę RB uzupełnioną IWP2, purmorfaminą i SB431542 (po 5 μM).
  11. Zmień pożywkę po 2 dniach na samą pożywkę RB. Komórki zaczną bić następnego dnia.
  12. Zmieniaj pożywkę co 3 - 4 dni na samą pożywkę RB.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby opracować prostą metodę wielkoskalowego różnicowania kardiomiocytów z hPSC, stworzono protokół, w którym komórki były początkowo traktowane aktywatorem szlaku WNT/β-katenina (CHIR99021)16 , następnie inhibitorami szlaków WNT/β-katenina oraz czynnika wzrostu TGF-β (odpowiednio IWP216 i SB43154217), a na koniec aktywatorem szlaku sonic hedgehog (SHH) (purmorfaminą)17 (Rycina 1A). W zastosowanej strategii różnicowania około 50%...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kardiomiocyty pochodzące z hPSC są niezwykle atrakcyjnym źródłem do wykorzystania w modelowaniu chorób u ludzi, badaniach przesiewowych leków/testach toksyczności oraz, być może w przyszłości, w terapiach regeneracyjnych. Jedną z głównych przeszkód w korzystaniu z tych ogniw jest jednak możliwość zapewnienia wystarczającej ilości wysokiej jakości materiału do ich efektywnego wykorzystania. Korzystając z opisanego przez nas protokołu, oferujemy metodę, która pokonuje to ograniczenie.

Ostatnio o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Instytut Badań Kardiologicznych Victora Changa nie angażuje się ani nie akceptuje niszczenia ludzkich embrionów w celach badawczych. Jego wkład w to badanie ograniczał się do prac nad ludzkimi indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi.

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane z grantów dostarczonych przez Royan Institute, Iranian Council of Stem Cell Research and Technology, Iran National Science Foundation (INSF), National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC; 354400), National Heart Foundation of Australia/Heart Kids Australia (G11S5629) oraz New South Wales Cardiovascular Research Network. HF był wspierany przez Międzynarodowe Stypendium Podyplomowe Uniwersytetu Nowej Południowej Walii w Australii. RPH było wspierane przez stypendium NHMRC Australia. Autorzy wyrażają wdzięczność ludziom, którzy wzięli udział w tych badaniach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Knockout DMEMLife Technologies10829018
Wymiana surowicy nokautującej (KO-SR)Technologie życia10828028
GlutamaxLife Technologies35050061
MEM Aminokwasy endogenneLife Technologies11140-050
β-merkaptoetanolLife Technologies21985-023
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)Miltenyi Biotec130-093-843
RPMI1640Life Technologies11875093
DPBS, bez wapnia, bez magnezuTechnologie życia14190144
DPBSLife Technologies14287072
Współczynnik przyłączenia (AF)Life TechnologiesS006100
ECM GelSigma-AldrichE1270
LamininInvitrogen23017-015
DMEMLife Technologies11965-092                                                                                                                                                                                                             
Śmiertelna surowica bydlęca (FBS)Life Technologies16140-071
B27 bez insulinyGibcoA18956-01
Penicylina/StreptomycynaLife Technologies15070063
0,05% Trypsyna/EDTALife Technologies25300-054
Kolagenaza typu IVLife Technologies17140-019
Chlorek wapnia (CaCl2)Sigma-AldrichC7902
Mitomycyna CBioaustralisBIA-M1183
CHIR99021Miltenyi Biotec130-104-172
IWP2Miltenyi Biotec130-105-335
SB431542Miltenyi Biotec130-095-561
PurmorphamineMiltenyi Biotec130-104-465
Inhibitor ROCK Y-27632Miltenyi Biotec130-104-169
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma-AldrichE6758
Alkohol poliwinylowy (PVA)Sigma-Aldrich363073
ŻelatynaSigma-AldrichG1890
Błękit trypanowyBio-Rad145-0013
Akumulator Innowacyjne technologie komórkowe Inc.AM105
Sigmacote Sigma-AldrichSL2 
CELLSPINIntegra Biosciences183 001
Kolba obrotowa z 1 wahadłem, 100 ml Integra Biosciences182 023
Mysie fibroblasty embrionalne (MEF)Przygotowane we własnym zakresie (lub dostępne na rynku)
Linie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC)Przygotowane we własnym zakresie (lub dostępne na rynku)

Bibliografia

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  3. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465, 808-812 (2010).
  4. Vitale, A. M., Wolvetang, E., Mackay-Sim, A. Induced pluripotent stem cells: a new technology to study human diseases. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 843-846 (2011).
  5. Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circ Res. 115, 556-566 (2014).
  6. Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
  7. Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. Korean J Intern Med. 29, 547-557 (2014).
  8. Kimbrel, E. A., Lanza, R. Current status of pluripotent stem cells: moving the first therapies to the clinic. Nat. Rev. Drug Discov. 14, 681-692 (2015).
  9. Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108, 407-414 (2001).
  10. Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107, 2733-2740 (2003).
  11. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  12. Fonoudi, H., et al. ISL1 protein transduction promotes cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells. PLoS One. 8, e55577(2013).
  13. Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. Human embryonic stem cells and cardiac repair. Transplant Rev (Orlando). 23, 53-68 (2009).
  14. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854(2012).
  15. Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol Biol. 767, 137-146 (2011).
  16. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109, E1848-E1857 (2012).
  17. Gonzalez, R., Lee, J. W., Schultz, P. G. Stepwise chemically induced cardiomyocyte specification of human embryonic stem cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11181-11185 (2011).
  18. Fonoudi, H., et al. A Universal and Robust Integrated Platform for the Scalable Production of Human Cardiomyocytes From Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. , (2015).
  19. Abbasalizadeh, S., Larijani, M. R., Samadian, A., Baharvand, H. Bioprocess development for mass production of size-controlled human pluripotent stem cell aggregates in stirred suspension bioreactor. Tissue Eng Part C Methods. 18, 831-851 (2012).
  20. Larijani, M. R., et al. Long-term maintenance of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells in suspension. Stem Cells Devt. 20, 1911-1923 (2011).
  21. Baharvand, H., Larijani, M. R., Yousefi, M. Protocol for expansion of undifferentiated human embryonic and pluripotent stem cells in suspension. Methods Mol Biol. 873, 217-226 (2012).
  22. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11, 855-860 (2014).
  23. Minami, I., et al. A small molecule that promotes cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined, cytokine- and xeno-free conditions. Cell reports. 2, 1448-1460 (2012).
  24. Buskirk, A. R., Liu, D. R. Creating small-molecule-dependent switches to modulate biological functions. Chem Bio. 12, 151-161 (2005).
  25. McKinsey, T. A., Kass, D. A. Small-molecule therapies for cardiac hypertrophy: moving beneath the cell surface. Nat Rev Drug Discov. 6, 617-635 (2007).
  26. Niebruegge, S., et al. Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor. Biotechnol Bioeng. 102, 493-507 (2009).
  27. Bauwens, C. L., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Eng Part A. 17, 1901-1909 (2011).
  28. Hwang, Y. S., et al. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16978-16983 (2009).
  29. Nguyen, D. C., et al. Microscale generation of cardiospheres promotes robust enrichment of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3, 260-268 (2014).
  30. Kempf, H., et al. Controlling expansion and cardiomyogenic differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 3, 1132-1146 (2014).
  31. Hemmi, N., et al. A massive suspension culture system with metabolic purification for human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Transl Med. 3, 1473-1483 (2014).
  32. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell stem cell. 12, 127-137 (2013).
  33. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat meth. 10, 781-787 (2013).
  34. Devalla, H. D., et al. Atrial-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells are a robust preclinical model for assessing atrial-selective pharmacology. EMBO Mol Med. 7, 394-410 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

R nicowanie kardiomiocyt whodowla w bioreaktorzeprotok z u yciem ma ych cz steczeksygnalizacja WNT TGF betatroponina T sercapasa owanie pojedynczych kom rekzawiesina statycznazawiesina mieszanalinie hPSC

Powiązane artykuły