Rekonstytucja podstawowych wrzecion mitotycznych w sferycznych kropelkach emulsji

Summary

Montaż i ustawienie wrzeciona mitotycznego zależy od połączonych sił generowanych przez dynamikę mikrotubul, białka motoryczne i sieciery. Tutaj przedstawiamy nasze ostatnio opracowane metody, w których geometryczne uwięzienie sferycznych kropelek emulsji jest wykorzystywane do odtworzenia od dołu do góry podstawowych wrzecion mitotycznych.

Abstract

Montaż, pozycjonowanie i orientacja wrzeciona mitotycznego zależą od połączonych sił generowanych przez dynamikę mikrotubul, białka motoryczne mikrotubul i środki sieciujące. Rosnące mikrotubule mogą generować siły pchające, podczas gdy mikrotubule depolimeryzujące mogą przekształcać energię skurczu mikrotubul w siły ciągnące, gdy są przyłączone, na przykład, do dyneiny korowej lub chromosomów. Ponadto białka motoryczne i dyfuzyjne środki sieciujące w obrębie wrzeciona przyczyniają się do architektury wrzeciona poprzez łączenie i przesuwanie antyrównoległych mikrotubul. In vivo okazało się, że trudno jest ustalić względny wkład poszczególnych graczy w ogólny układ sił. Poniżej przedstawiamy metody, które niedawno opracowaliśmy w naszych wysiłkach na rzecz odtworzenia podstawowych wrzecion mitotycznych od dołu do góry in vitro. Stosując techniki mikroprzepływowe, centrosomy i tubulina są kapsułkowane w kropelkach emulsji typu woda w oleju, co prowadzi do powstania geometrycznie ograniczonych (podwójnych) astry mikrotubul. Poprzez dodatkowe wprowadzenie dyneiny zakotwiczonej w korze mózgowej, silników mikrotubul ukierunkowanych na plusie i dyfuzyjnych środków sieciujących, system ten jest używany do odtwarzania struktur przypominających wrzeciona. Przedstawione tutaj metody stanowią punkt wyjścia do odtworzenia bardziej kompletnych wrzecion mitotycznych, co pozwala na szczegółowe badanie udziału każdego pojedynczego składnika oraz na uzyskanie zintegrowanego ilościowego obrazu równowagi sił w wrzecionie mitotycznym.

Introduction

Podczas mitozy, chromosomy replikowanego genomu są zorganizowane na równiku komórki, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie chromatyd siostrzanych nad nowo powstałymi komórkami potomnymi. Pozycjonowanie i segregacja chromosomów odbywa się za pośrednictwem ich przyczepiania się do wrzecionowatych mikrotubul pochodzących z dwóch przeciwstawnych centrosomów. Oprócz zapewnienia wiernej dystrybucji chromosomów, orientacja wrzeciona mitotycznego dyktuje również płaszczyznę podziału komórki¹. Skoordynowana orientacja podziału komórki jest niezbędna na wielu etapach rozwoju i dla homeostazy tkanek². W szczególności regulowane pozycjonowanie wrzeciona mitotycznego może skutkować asymetrycznym rozkładem zawartości komórkowej, a nawet wytwarzać komórki potomne o różnych rozmiarach². Montaż i orientacja wrzeciona mitotycznego rozpoczyna się w profazie i jest koordynowana przez złożoną interakcję między współpracującymi i antagonizującymi generatorami sił^3,4. Generowane siły składają się zarówno z sił ciągnących, jak i pchających. Siły te pochodzą zarówno z kontaktów wrzeciona z korą komórkową, jak i z wnętrza wrzeciona i mogą być generowane przez dynamikę mikrotubul, a także przez silniki molekularne i środki sieciujące (ryc. 1).

Siły nacisku mogą być generowane, gdy mikrotubule rosną na sztywnych strukturach, takich jak kora komórkowa. W zależności od całkowitej siły oporu generowanej w systemie, może to spowodować przemieszczenie wrzeciona mitotycznego (małe siły) lub wywołanie wyboczenia mikrotubul lub katastrofę (duże siły)^5-8. Wielkość siły, która może być generowana przez pchanie, zależy od długości mikrotubul, ponieważ długość jest silnym wyznacznikiem wyboczenia mikrotubuli⁹. Ponadto mikrotubule pochodzące z jednego centrosomu mogą napierać na drugi centrosom, co sugeruje mechanizm napędzający separację centrosomów we wczesnej fazie^{profazy 3,10}.

Oprócz sił nacisku generowanych przez rosnące mikrotubule, końce mikrotubul stykające się z korą komórkową mogą również pośredniczyć w siłach ciągnących¹¹. Badania przeprowadzone w wielu laboratoriach wykazały, że kontrolowana aktywność generatorów siły korowej jest wymagana do asymetrycznego pozycjonowania wrzecion mitotycznych in vivo¹. Zasadnicze znaczenie dla tych sił ciągnących ma zlokalizowana w korze cytoplazmatyczna dyneina (zwana dalej "dyneiną"), białko motoryczne mikrotubul skierowane na minus^{end 8,12,13}. Na przykład u pączkujących drożdży boczne oddziaływania dyneiny korowej z siatką mikrotubul powodują przesuwanie się mikrotubul zależnych od motoryki wzdłuż kory¹⁴. Jednak korowe siły ciągnące mogą być również generowane przez zdolność dyneiny do tworzenia przyczepów końcowych do depolimeryzujących mikrotubul⁸. Energia generowana przez skurcz mikrotubul może prowadzić do sił, które są na ogół o rząd wielkości wyższe (~50 pN (odniesienie¹⁵)) niż siły generowane przez pojedyncze białka motoryczne (~7-8 pN (odnośnik ¹⁶)). Końcowe przyłączenie dyneiny korowej do mikrotubul depolimeryzujących sprzyja pozycjonowaniu wrzeciona u pączkujących drożdży¹⁷ i C. elegans¹³. Obecnie nie wiadomo, czy zarówno zależne od silnika siły ciągnące, jak i siły ciągnące napędzane depolimeryzacją mikrotubul mogą ze sobą współpracować, czy też wzajemnie się wykluczają in vivo.

Oprócz sił nacisku mikrotubul i sił ciągnących kory mózgowej za pośrednictwem dyneiny, pozycjonowanie centrosomów jest kontrolowane z wnętrza wrzeciona mitotycznego przez wiele innych białek. Na przykład silniki Kinesin-5 istnieją jako tetramery, które mogą sieciować antyrównoległe mikrotubule międzybiegunowe, co powoduje generowanie sił poślizgowych na zewnątrz^18-20. Członkowie rodziny motorycznej kinezyny-5 są wymagani do separacji centrosomów i montażu wrzeciona dwubiegunowego u wszystkich badanych eukariontów, z wyjątkiem C. elegans (przegląd w odnośniku²¹).

Ponadto, dyfuzyjne sieciery z rodziny Ase1/PRC1 są również znane z lokalizacji w nakładających się na siebie obszarach mikrotubul mikrotubul międzypolarnych in vivo i in vitro^22-27. Siły generowane przez napędzaną przez Ase1 ekspansję nakładającego się obszaru mikrotubuli są wystarczająco duże, aby zrównoważyć siły ślizgowe za pośrednictwem kinezyny-14 in vitro^28,29. W komórkach Ase1 / PRC1 jest wymagany do stabilnego tworzenia nakładających się regionów mikrotubul w strefie środkowej wrzeciona^25-27,30, co sugeruje, że siły generowane przez dyfuzyjne środki sieciujące mogą znacząco przyczyniać się do organizacji wrzeciona. Wreszcie, siły z chromatyny mitotycznej i kinetochorów wpływają na montaż i pozycjonowanie wrzeciona mitotycznego poprzez różne szlaki³. Ponieważ składniki te nie są częścią opisanych tutaj testów rekonstytucji, nie będą one szczegółowo omawiane.

Istnieją różne teorie na temat tego, jak różne składniki molekularne i siły opisane powyżej współpracują przy montażu i pozycjonowaniu wrzeciona, ale wciąż jesteśmy daleko od ilościowego zrozumienia. Oprócz eksperymentów na żywych komórkach, eksperymenty in vitro z oczyszczonymi składnikami stanowią skuteczną drogę do osiągnięcia tego celu. Poniżej przedstawiamy wizualny przewodnik po zaadaptowanej i rozszerzonej wersji ostatnio opublikowanych metod (Roth i wsp.³¹), w którym podstawowe wrzeciona są odtwarzane w kropelkach emulsji typu woda w oleju, zaczynając od minimalnej liczby komponentów. Korzystając z technik mikroprzepływowych, generowane są kuliste kropelki o rozmiarach porównywalnych z komórkami mitotycznymi. W obrębie tych kropelek oczyszczone centrosomy i tubulina mogą być łączone w celu zbadania dynamiki asteru mikrotubul, generowania sił i interakcji aster-aster. Wprowadzając korowe (takie jak dyneina) i międzybiegunowe (takie jak kinezyna-5/Ase1) generatory siły, odtwarzamy coraz bardziej złożone struktury wrzecionowate, które zaczynają przypominać sytuację in vivo.

Protocol

1. Przygotowanie chipów mikrofluidycznych

UWAGA: Do badania montażu wrzeciona od dołu do góry używane są sferyczne kropelki emulsji typu woda w oleju. Są to wodne mikrokropelki oddzielone od otaczającej fazy olejowej monowarstwą fosfolipidów i środka powierzchniowo czynnego. Te kropelki emulsji są wytwarzane w mikroprzepływowych chipach polidimetylosiloksanu (PDMS). Zmiany w geometrii kanałów i natężeniach przepływu mogą być wykorzystane do dostrojenia wielkości kropli. W opisanym tutaj projekcie mikroprzepływowym generowane są kropelki o średnicy około 15 μm, aby naśladować geometryczne uwięzienie komórki mitotycznej ssaków.

1. Projektowanie fotomasek i produkcja form
   1. Zaprojektuj fotomaskę zawierającą trzy kanały wlotowe³¹. Kanał wlotowy 1 łączy się z fazą wodną, która zawiera zawartość kropel (patrz rozdział 3 "Odtwarzanie podstawowych astry mikrotubul"). Kanał wlotowy 2 łączy się z fazą olejową (patrz punkt 2.1 "Przygotowanie fazy lipidowej/olejowej"). Użyj kanału wlotowego 3, aby rozcieńczyć kropelki emulsji dodatkową fazą lipidową/olejową przed obserwacją (opcjonalnie) (Rysunek 2a-b).
      UWAGA: Za wszystkimi kanałami wlotowymi znajduje się filtr przeciwpyłowy (labirynt kanałów 2 μm), który zatrzymuje kurz, cząstki PDMS i agregaty (białkowe) oraz zapobiega blokowaniu przez nie kanałów mikroprzepływowych (rysunek 2d). Kanały mają szerokość 75 μm, a faza lipidowa/olejowa i faza wodna spotykają się w złączu o szerokości 12,5 μm, gdzie tworzą się kropelki emulsji (rysunek 2c).
   2. Zamów i otrzymaj wydrukowane fotomaski na podłożu filmowym, o polaryzacji ujemnej (fotomaska będzie ciemna z przezroczystymi zaprojektowanymi strukturami).
2. Produkcja form
   1. Wytwarzaj formy poprzez powlekanie spinowe fotorezystu SU-8 3025 na 4-calowej płytce krzemowej za pomocą powlekarki spinowej (500 obr./min, 10 s, a następnie 1,800 obr./min, 45 s) w środowisku pomieszczenia czystego.
   2. Naświetl płytkę silikonową pokrytą SU-8 przez fotomaskę. Opracuj płytki zgodnie z instrukcjami producenta, aby utworzyć kanały o grubości ~40 μm.
3. Tworzenie chipa mikroprzepływowego
   1. Wymieszaj 10 części prepolimeru PDMS z 1 częścią utwardzacza (łącznie ~40 gr) w naczyniu przypominającym łódkę za pomocą plastikowej szpatułki. Umieść PDMS zawierający naczynie przypominające łódź w komorze próżniowej na ~30 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Owiń folię aluminiową wokół formy, aby utworzyć filiżankę o pionowych krawędziach ~1 cm.
   2. Wlej PDMS (~75% całkowitej objętości) do formy, pozostaw w komorze próżniowej na kolejne ~30 minut (w celu usunięcia pęcherzyków powietrza) i utwardź przez 1 godzinę w temperaturze 100 °C w piekarniku.
   3. Pozostałe PDMS należy odwirować na szkiełkach podstawowych (5 s przy 200 obr./min, a następnie 30 s przy 4 000 obr./min), a następnie utwardzać przez 1 godzinę w temperaturze 100 °C. Usunąć kurz ze szkiełek za pomocą sprężonego powietrza/N_2-flow, czyszczenie wstępne nie jest konieczne.
      UWAGA: Szkiełka szklane z powłoką PDMS mogą być używane zarówno do produkcji chipów mikroprzepływowych, jak i komór przepływowych (patrz również 2.2).
   4. Delikatnie zdejmij PDMS z formy za pomocą żyletki i przebij otwory (0,5 mm dla wlotów, 0,75 mm dla wylotu). Przez kilka sekund poddawać obróbce koronowej chip mikroprzepływowy i szkiełko szklane pokryte PDMS za pomocą laboratoryjnej obróbki powierzchni koronowej.
   5. Umieść chip mikroprzepływowy na szkiełku podstawowym (kanały skierowane w dół) i upiecz frytki w temperaturze 100 °C (Rysunek 3a). Przechowuj chipy mikroprzepływowe przez kilka miesięcy w środowisku wolnym od kurzu.

2. Konfiguracja mikroprzepływowa

UWAGA: Kropelki emulsji typu woda w oleju są generowane przy użyciu układu mikroprzepływowego i układów mikroprzepływowych opisanych powyżej. Skład fazy lipidowej/olejowej może być zróżnicowany w zależności od wymagań doświadczalnych. Lipidy rozpuszczone w oleju utworzą monowarstwę na granicy faz woda-olej z ich polarnymi grupami głowy skierowanymi w stronę wody wewnątrz. W celu ukierunkowania białek (np. dyniny) na granicę kropelek można dodać niewielkie ilości lipidów biotynylofosfatydyloetanoloaminy (biotynyl-PE). Pozwala to na rekrutację biotynylowanej dyneiny (patrz punkt 4.1 "Dyneina ukierunkowana na korę kropelkową") poprzez multimeryzację za pośrednictwem streptawidyny. Kropelki są stabilizowane przez dodanie środka powierzchniowo czynnego i przechowywane w komórkach przepływowych pokrytych PDMS.

1. Przygotowanie fazy lipidowej/olejowej
   1. Wymieszać rozpuszczoną w chloroformie 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfo-L-serynę (DOPS) i lipidy biotynylo-PE w stosunku molowym 4:1 w szklanej probówce za pomocą szklanych pipet (przed użyciem dokładnie spłukać pipety chloroformem). Przygotuj łącznie ~250 μg lipidów, co daje stężenie lipidów ~0,5 mg/ml.
   2. Ostrożnie wysuszyć mieszaninę lipidów za pomocą przepływu_N2, a następnie w komorze próżniowej przez ~1 godzinę. Wysuszone lipidy rozpuścić w oleju mineralnym i 2,5% środku powierzchniowo czynnym do 0,5 mg/ml (zrobić ~500 μl).
   3. Umieścić próbkę lipidów/oleju w kąpieli ultradźwiękowej i poddać sonikacji przez 30 minut przy 40 kHz, aby całkowicie rozpuścić lipidy.
2. Przygotowanie komory przepływowej
   1. Przędzić PDMS (patrz również sekcja 1.3) na szkłach nakrywkowych (5 s przy 200 obr./min, a następnie 30 s przy 4 000 obr./min) i szkiełkach podstawowych (5 s przy 100 obr./min, a następnie 30 s 1 500 obr./min) w celu nałożenia jednorodnej warstwy PDMS.
      UWAGA: Aby uzyskać optymalną jakość obrazowania, należy używać szkieł nakrywkowych o grubości dopasowanej do obiektywu mikroskopu. W tym przypadku: 1,5 (~0,17 mm).
   2. Utwardzać szkła nakrywkowe i szkiełka podstawowe z powłoką PDMS przez 1 godzinę w temperaturze 100 °C w piekarniku. Wykonać komory przepływowe, umieszczając w krótkich odstępach (~2 mm) cienkie plasterki laboratoryjnej folii uszczelniającej (o szerokości ~3 mm) na szkiełkach pokrytych PDMS. W przypadku przechowywania w środowisku wolnym od kurzu, kanały, które nie były używane, mogą być używane w innym czasie.
   3. Przykryj komory przepływowe szkiełkiem nakrywkowym pokrytym PDMS i uszczelnij, topiąc laboratoryjną folię uszczelniającą ~1 min w temperaturze 100 °C, delikatnie docisnąć (Rysunek 3c). Zamknąć laboratoryjną folię uszczelniającą -szklane granice za pomocą Valap (Rysunek 3c). Przechowuj komory przepływowe przez kilka miesięcy w środowisku wolnym od kurzu.
3. Przygotowanie kubka PDMS
   1. W przypadku długotrwałego obrazowania należy wykonać kubek PDMS, wybijając otwór o średnicy 4 mm w plastrze PDMS (o grubości ~3 mm)
   2. Poddaj obróbce koronowej plaster PDMS i szkło nakrywkowe pokryte PDMS i umieść je jeden na drugim. Upiecz filiżankę PDMS o/n (w temperaturze 100 °C) (Rysunek 5a).
4. Tworzenie się emulsji i kropelek
   1. Monitoruj tworzenie się kropel pod mikroskopem odwróconego jasnego pola. Podłącz regulator ciśnienia do układu mikroprzepływowego za pomocą rurek PEEK (średnice: 510 μm (zewnętrzna) i 125 μm (wewnętrzna)) (Rysunek 3a). Napełnij chipy mikroprzepływowe całkowicie fazą lipidową/olejową z wlotu 2.
   2. Wprowadzić fazę wodną na bazie MRB80 (patrz rozdział 3 "Odtwarzanie podstawowych astry mikrotubul") z wlotu 1. Kontroluj wielkość kropel, zmieniając ciśnienie w fazie lipidowej/olejowej i wodnej, aby utworzyć kropelki o średnicy ~15 μm (Rysunek 3b).
      UWAGA: Korzystając z tej konfiguracji, użyj ~800 mbar dla fazy lipidowej/olejowej i ~200 mbar dla fazy wodnej, aby utworzyć kropelki o pożądanej wielkości.
   3. Po uzyskaniu pożądanej wielkości kropli i wymaganej ilości (~10 μl na próbkę), należy pobrać kropelki z kanału wylotowego i załadować do komory przepływowej (całkowicie napełnić komorę przepływową).
   4. Ostrożnie zamknij końce komory przepływowej za pomocą Valap (niecałkowicie zamknięte komory przepływowe mogą powodować rozległy ruch kropel, co utrudnia ich obrazowanie). Ponadto zapobiegają tworzeniu się pęcherzyków powietrza, które powodują ruch kropel.
   5. Dokładnie przepłucz rurki PEEK izopropanolem przed i po użyciu, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu próbki i zatkaniu.

3. Odtwarzanie podstawowych astry mikrotubul

UWAGA: Zawartość kropli może być zróżnicowana w zależności od wymagań eksperymentalnych. Wszystkie są oparte na MRB80 (80 mM PIPES, 1 mM EGTA, 4 mM MgCl₂ (pH 6,8)), a wszystkie próbki są przygotowywane na lodzie. Ogólnie rzecz biorąc, kropelki zawsze zawierają centrosomy, składniki niezbędne do polimeryzacji mikrotubul, system pochłaniania tlenu i środek blokujący (patrz sekcja 3.1). W razie potrzeby można uwzględnić generatory siły mikrotubul oraz wymagane kofaktory i czynniki docelowe (patrz punkty 4.1 i 4.2).

1. Ogólna konfiguracja do tworzenia asteru w kropelkach emulsji (rysunek 3d)
   1. Przygotować wcześniej wymieszać oksydazę glukozową (20 mg/ml oksydazy glukozowej w 200 mM DTT i 10 mg/ml katalazy) i przechowywać w małych porcjach w temperaturze -80 °C.
   2. Przygotować wcześniej "mieszankę blokującą" zawierającą κ-kazeinę, albuminę surowicy bydlęcej (BSA), Tween-20 i dekstran fluorescencyjny (jako marker obojętny) (patrz tabela 1) i przechowywać w małych porcjach w temperaturze -80 °C. Zapobiec powtarzającym się cyklom zamrażania i rozmrażania. Upewnij się, że wszystkie składniki są świeżo przygotowane.
   3. Oczyść centrosomy z ludzkich limfoblastycznych linii komórkowych KE37, jak opisano przez Moudjou i wsp.³² i przechowywać w temperaturze -150 °C w małych porcjach.
   4. Rozmrażamy centrosomy w temperaturze pokojowej i inkubujemy w temperaturze 37 °C przez ~20 minut przed użyciem, aby zapewnić prawidłowe zarodkowanie mikrotubul.
      UWAGA: Sprzyja to zarodkowaniu mikrotubul podczas eksperymentu.
   5. W międzyczasie należy przygotować na lodzie "mieszaninę do oznaczania", zawierającą tubulinę (fluorescencyjną i "ciemną"), trifosforan guanozyny (GTP), system pochłaniania tlenu (glukozę, oksydazę glukozową, katalazę i 1,4-ditiotreitol (DTT)), generatory sił molekularnych (np. silniki mikrotubul/środki sieciujące), trifosforan adenozyny (ATP) oraz system regenerujący ATP (fosfoenolopirogronian (PEP), kinazę pirogronianową (PK) i dehydrogenazę mleczanową (LDH)) (patrz tabela 2).
   6. Wstępnie schłodzić wirnik powietrza na lodzie. Zakręcić próbkę w schłodzonym wirniku powietrza (30 psi przez 3 minuty). Dodaj wstępnie podgrzane centrosomy (zoptymalizuj ilość centrosomów, aby dążyć do kropelek zawierających 1-2 centrosomy).
   7. Użyć połączonej mieszaniny do wytworzenia kropelek emulsji, stosując metody opisane w sekcji 2.3.

składnik	Koncentracja zapasów	Stężenie końcowe (w teście)	głośność	komentarz
Dekstran-647nm	75 μM	3,75 uM (0,6 μM)	5 μl
κ-kazeina	20 mg/ml	12,5 mg/ml (2 mg/ml)	62,5 μl
Tween-20 (Kanał Telewizyjny)	5 proc.	0,375% (0,06%)	7,5 μl
Bsa	200 mg/ml	12 mg/ml (1,9 mg/ml)	6 μl
Zobacz materiał MRB80			19 μl
			100 μl wersja ostateczna	Przechowywać w porcjach 2 μl

Tabela 1: Składniki 'Blokującej Mieszanki'. Składniki mieszaniny blokującej, niezbędne do odtworzenia struktur wrzecionowatych w kropelkach emulsji typu woda w oleju. Opis znajduje się w tekście głównym, rozdział 3 "Odtwarzanie podstawowych astry mikrotubul". Szczegółowe informacje na temat materiałów można znaleźć w "Tabeli materiałów.

składnik	Koncentracja zapasów	Stężenie końcowe	głośność	komentarz
Mieszanka blokująca			1,6 μl
Tubuliny	500 μM	30 μM	0,6 μl
Tubulina-488/561	50 μM	3 μM	0,6 μl
GTP (GTP)	50 mM	5 mM	1,0 μl
Dyneina-TMR	178 nM	30 nM	1,7 μl
Streptawidyna	5 mg/ml	200 nM	0,4 μl	Tylko dla dyneiny korowej
Kinezyna-5	1,6 mln	80 nM	0,5 μl
Atp	25 mM	1 mM	0,4 μl	Tylko dla silników
Pep	0,5 mln	25,6 mln	0,5 μl	Tylko dla silników
PK/LDH (wirus PK/LDH)	800 U/1 100 U	23 U/32 U	0,3 μl	Tylko dla silników
Ase1-GFP (Oprogramowanie ASE1-GFP)	400 nM	80 nM	2,0 μl
glukoza	2,5 mln	50 mM	0,3 μl	Ostatni krok
Oksydaza glukozowa	50-krotnie	1,0 razy	0,3 μl	Ostatni krok
Zobacz materiał MRB80			x
			9 μl końcowy

Tabela 2: Składniki 'Assay Mix'. Składniki mieszaniny do oznaczania, wymagane do odtworzenia struktur wrzecionowatych w kropelkach emulsji typu woda w oleju. Opis znajduje się w tekście głównym, rozdział 3 "Odtwarzanie podstawowych astry mikrotubul". Szczegółowe informacje na temat materiałów można znaleźć w tabeli materiałów.

4. Przedstawiamy czynniki montażu wrzeciona

UWAGA: W opisanych tutaj testach użyto oznaczonej zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) skróconej wersji dyneiny S. cerevisiae, która jest sztucznie dimeryzowana za pomocą amino-końcowej S-transferazy glutationowej (GST)-znacznik³³. Białko to jest oczyszczane za pomocą znacznika powinowactwa, który zawiera dwie kopie domeny wiążącej białko A IgG. Zastosowany tutaj wariant jest znakowany etykietą tetrametylorodaminy (TMR) na końcu karboksylowym, a N-końcowy znacznik SNAP służy do biotynylacji oczyszczonych białek. Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat konstrukcji, zobacz Roth et al.^{Lokal mieszkalny 31}; aby uzyskać szczegółowe informacje na temat oczyszczania, zobacz Reck-Peterson i wsp.³³. GFP-biotyna-dyneina-TMR może być ukierunkowana na korę kropelkową poprzez tworzenie kompleksów biotyna-streptawidyna, które łączą dyneinę z lipidami biotynylo-PE (ryc. 3e).

1. Celowanie Dyneiny do kory kropel
   1. Włączyć GFP-biotynę-dyneinę-TMR do "mieszaniny testowej" (zob. tabela 2) przy końcowym stężeniu kropelki wynoszącym 30 nM. Włączyć streptawidynę do "mieszaniny testowej" (patrz tabela 2) przy końcowym stężeniu kropel wynoszącym 200 nM.
      UWAGA: Dyneina zależy od hydrolizy ATP dla stopniowego ruchu na mikrotubulach. W związku z tym należy włączyć ATP i system regeneracji ATP (zawierający PEP i PK/LDH) do "mieszaniny testów" (zob. tabela 2).
      UWAGA: Rekombinowany pełnowymiarowy S. pombe GFP-Cut7 (kinezyna-5) został dostarczony przez laboratorium Diez (Centrum Bioinżynierii Molekularnej, Technische Universität Dresden, Drezno, Niemcy), patrz . Rekombinowany, znakowany histydyną S. pombe GFP-Ase1 o pełnej długości został dostarczony z laboratorium Jansons (Uniwersytet Wageningen, Wageningen, Holandia) i dodany do "mieszanki testowej" w stężeniach 80 nM.

5. Obrazowanie

UWAGA: Podczas eksperymentu, wzrost mikrotubul może być kontrolowany poprzez zmianę temperatury. Przy wyborze warunków obrazowania należy dokonać kompromisu między wysoką jakością obrazowania a możliwością monitorowania montażu wrzeciona przez długi czas. Aby porównać kinetykę formowania wrzeciona w różnych warunkach, kropelki o różnej zawartości można mieszać i obrazować w tym samym kanale przepływowym.

1. Podstawowe ustawienia obrazowania
   1. Obraz w środowisku o kontrolowanej temperaturze przy użyciu zamkniętej komory. Wizualizacja pojedynczych mikrotubul po ~30 min w temperaturze 26 °C. Podczas obrazowania promuj wzrost mikrotubul, zwiększając temperaturę do ~30 °C.
      UWAGA: Poniższe ustawienia są specyficzne dla konfiguracji naszego mikroskopu i mogą się różnić w zależności od różnych systemów i oprogramowania operacyjnego. Wszystkie opisane tutaj testy są obrazowane w zmotoryzowanym systemie odwróconym z głowicą konfokalną z wirującym dyskiem i obsługiwane za pomocą oprogramowania do obrazowania, takiego jak Andor iQ 3.1. Uzyskaj wszystkie obrazy za pomocą obiektywu 100X z zanurzeniem w oleju i kamery EmCCD.
   2. Ustaw lasery wzbudzające 488, 561 i 641 nm na około ~10% intensywności. Przejdź do panelu "akwizycja", kliknij zakładkę "AOTF" i przesuń intensywność lasera do 10%. Kliknij "nagraj", aby zapisać ustawienia.
   3. W przypadku projekcji z należy wykonywać stosy w odstępach co 1 μm (~20 obrazów/kroplę). Przejdź do głównego panelu "kamera", kliknij "edytuj z" i ustaw "krok z" na 1.0. Kliknij "Dalej", aby zapisać ustawienia.
   4. Ustaw maksymalne liniowe wzmocnienie EM, klikając zakładkę "kamera" w panelu "akwizycja" i przesuń pasek wzmocnienia EM do 300. Ustaw czasy naświetlania na 200 ms w tej samej karcie. Kliknij "nagraj", aby zapisać ustawienia.
2. Obrazowanie na żywo
   1. W przypadku obrazowania na żywo, za pomocą sterowania programowego, wykonuj projekcje z co 2 minuty przez 1-2 godziny, skracając czas ekspozycji do ~100 ms (jak opisano w 5.1.4) i zwiększając odstępy z do 2 μm (jak opisano w 5.1.3). Ustaw szeregi czasowe w głównym panelu "kamery", kliknij "powtórz t" i ustaw na 2 minuty interwały, co daje łączny czas 120 minut.
   2. Do testów na żywo należy użyć kubka PDMS zamiast zwykłej komory przepływowej, aby upewnić się, że kropelki są jak najbardziej nieruchome.
3. Połączone obrazowanie 2 stanów
   1. Wytwarzaj kropelki za pomocą mikrofluidyki i przechowuj na szkiełku podstawowym z powłoką PDMS na lodzie. Zapobiega to zarodkowaniu mikrotubul do momentu uformowania się drugiego zestawu kropel. Przed wyprodukowaniem drugiego zestawu kropel należy przepłukać rurki PEEK i chip mikroprzepływowy MRB80 i całkowicie napełnić chip mikroprzepływowy fazą lipidową/olejową.
   2. Generuj kropelki z dekstranem fluorescencyjnym i bez niego (lub używając dekstranu o różnych fluoroforach o różnych długościach fali) w celu rozróżnienia kropelek o różnych kolorach. Po wyprodukowaniu drugiej partii kropel delikatnie wymieszaj kropelki za pomocą pipetowania i załaduj do pojedynczej komory przepływowej/kubka PDMS.
4. Analiza obrazu.
   1. Analizuj obrazy za pomocą Fidżi (oprogramowanie open source dostępne online)³⁴.
   2. W przypadku testów na żywo przekształć stosy w hiperstosy za pomocą "obrazu"-"hyperstacks"-"stosu do hiperstosu". Ustaw prawidłową liczbę wycinków z i przedziałów czasu.
   3. Aby wykonać projekcje z, wybierz 'obraz'-'stosy'-'z-projekt'. Wybierz projekcję "maksymalna intensywność".
   4. W przypadku rekonstrukcji 3D, najpierw przejdź do "image"-"properties" i ustaw odpowiedni piksel za pomocą, wysokością piksela, głębią wokseli i interwałami klatek. Kliknij "OK". Wybierz "obraz" - "stosy" - "projekt 3D", zaznacz pole "interpoluj" i kliknij "OK".

Results

Metody przedstawione w poprzednich sekcjach pozwalają na odtworzenie struktur wrzecionowatych o rosnącej złożoności przy użyciu geometrycznego uwięzienia kropelek emulsji typu woda w oleju. W niniejszej sekcji opisano reprezentatywne wyniki, które jakościowo wykazują zdolność tych testów.

Podczas mitozy, gdy wrzeciono dwubiegunowe jest złożone, komórki zaokrąglają się w górę, tworząc kule o średnicy około 15 μm, mierzonej dla komórek ludzkich. Ten charakterystyczny mitotyczny kształt komórki zapewnia geometryczną granicę, która zarówno ogranicza, jak i kieruje rozmiarem i orientacją wrzeciona^35,36. Techniki mikroprzepływowe zapewniają poziom geometrycznego zamknięcia, który dokładnie odzwierciedla sytuację obserwowaną w żywych komórkach, a tym samym pozwala na oddolną rekonstrukcję wrzecion mitotycznych in vitro.

Astry mikrotubul same w sobie są już zdolne do skomplikowanego zachowania, gdy wzrost mikrotubul jest ograniczony przez granice geometryczne. W miarę wzrostu mikrotubul, siły popychające generowane przez włączenie nowych dimerów tubuliny kierują dwa centrosomy na przeciwne strony kropelek emulsji. Na początku centrosomy swobodnie dyfundują w ograniczonej objętości (ryc. 4a, lewy panel). Po około 20-30 minutach pierwsze mikrotubule stają się widoczne, a dyfuzja centrosomów zostaje ograniczona, ponieważ mikrotubule rosną w stosunku do kory we wszystkich kierunkach. Astry z mikrotubulami o średniej długości (około 50% średnicy kropli) mogą (sterycznie) odpychać się nawzajem, przy czym mikrotubule napierają na siebie, inne centrosomy i korę. Powoduje to typowy "dwubiegunowy" układ wrzecionowaty, w którym dwa centrosomy są naprzeciwko siebie (ryc. 4a, środkowy panel). Gdy mikrotubule rosną dłużej niż ~ 50% średnicy kropli, centrosomy są popychane dalej do przeciwległych granic kropli, przy czym mikrotubule rosną wzdłuż kory kropelki (ryc. 4a, prawy panel). Ważne jest, aby pamiętać, że tempo wzrostu mikrotubul w tych testach jest bardzo wrażliwe zarówno na temperaturę, jak i stężenie tubuliny. Parametry te będą zatem silnie wpływały na czas, w którym po raz pierwszy obserwuje się zarodkowanie i kiedy osiągane są pozycje asteru w stanie ustalonym.

W komórkach siły ciągnące korowe są generowane poprzez tworzenie nośnych przyczepów między końcami plusów mikrotubul a dyneiną związaną z korą. W komórkach zwierzęcych asocjacja ta zależy od kompleksu Gαi/LGN/NuMA, który jest ukierunkowany na błonę plazmatyczną poprzez N-końcową mirystoylację Gαi¹. W tych testach rekonstytucji wymóg kompleksu Gαi/LGN/NuMA jest omijany przez bezpośrednie sprzężenie dyneiny z biotynylowanymi lipidami poprzez tworzenie kompleksów biotyna-streptawidyna-biotyna. Wiązania te są stosunkowo stabilne (K_D ~ ^10-14 M)³⁷ i tworzą się szybko (zwykle w ciągu 10 minut po utworzeniu kropli emulsji, zanim widoczne stanie się zarodkowanie mikrotubul) (Figura 4b). W obecności dyneiny korowej centrosomy zazwyczaj zachowują bardziej centralną pozycję, podczas gdy przy braku dyneiny centrosomy są wypychane na przeciwne strony kory kropelkowej (ryc. 4c). Uważamy, że jest to wynik dwóch efektów, które zapobiegają i przeciwdziałają siłom wypychania mikrotubul. (1) Dyneina bezpośrednio sprzyja katastrofom mikrotubul, ograniczając w ten sposób długość mikrotubul i zapobiegając nadmiernemu wyboczeniu mikrotubul, oraz (2) korowe siły ciągnące prowadzą do sił centrujących sieć na poszczególnych astry⁸, które przeciwdziałają siłom odpychania aster-aster

.

Dyfuzyjny środek sieciujący Ase1 indukuje siły, które mają tendencję do zwiększania nakładającego się na siebie obszaru antyrównoległych mikrotubul²⁹. Zgodnie z tym, w obecności Ase1 (i braku dyneiny) centrosomy znajdują się blisko siebie, a Ase1 lokalizują się w wiązkach międzypolarnych mikrotubul (Figura 4d). Członkowie rodziny kinezyny-5 napędzają separację centrosomów poprzez dostarczanie sił pchających z wnętrza wrzeciona (patrz wprowadzenie). W obecności Cut7 (ortolog S. pombe kinesin-5) centrosomy są wypychane na przeciwne strony kropelek emulsji, nawet w obecności Ase1 (ryc. 4e). Łącząc korowe i międzybiegunowe generatory sił, poziom złożoności może być jeszcze bardziej zwiększony w tych eksperymentach, ostatecznie prowadząc do kompleksowego zrozumienia dwubiegunowego zespołu wrzecion mitotycznych. Szczegółowy opis ilościowy tych wyników będzie dostępny w przyszłości (Roth et al., manuskrypt w przygotowaniu).

Oprócz obserwacji pozycji centrosomów w ustalonych momentach w czasie i powiązania ich zachowania z obserwowanymi długościami mikrotubul, cenne informacje można uzyskać, śledząc proces pozycjonowania w czasie. Dzięki skróceniu czasu ekspozycji i intensywności lasera, możliwe jest teraz śledzenie pozycjonowania asteru w odstępach 2-minutowych przez co najmniej 1 godzinę przy zaledwie ~30% wybielaniu. Umożliwia to monitorowanie składania i pozycjonowania astrów od swobodnie dyfuzyjnych centrosomów (0 min.) przez scentralizowane (12 min.) do zdecentralizowanych astry (36 min i więcej) (ryc. 5c). Ułatwia to badanie zarówno zachowania w stanie ustalonym, jak i kinetyki montażu wrzeciona. Łącząc kropelki o różnej zawartości w tej samej próbce, możliwe jest na przykład bezpośrednie porównanie położenia centrosomów i kinetyki montażu wrzeciona w kropelkach z generatorami siły korowej i bez nich (ryc. 5b).

Rysunek 1: Siły działające na wrzeciono mitotyczne. Kilka cząsteczek generujących siłę działa na mikrotubule wrzeciona mitotycznego, aby ułatwić tworzenie i pozycjonowanie wrzeciona. Mikrotubule, które wrastają do kory komórkowej, generują siłę nacisku na centrosom. Dyneina korowa (fioletowa) wychwytuje depolimeryzujące mikrotubule i generuje siłę ciągnącą na centrosomy. Wewnątrz wrzeciona białka motoryczne Kinesin-5/Cut7 zapewniają siłę poślizgu na zewnątrz na antyrównoległych mikrotubulach, podczas gdy środki sieciujące z rodziny PRC1/Ase1 generują przeciwną siłę poślizgu na zewnątrz. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Konstrukcja układu mikroprzepływowego. (A) Projekt 4-calowej fotomaski zawierającej 4 chipy mikroprzepływowe. (B) Szczegółowe odwzorowanie pojedynczego chipa. Chipy zawierają jeden kanał wylotowy i trzy kanały wlotowe, za którymi znajduje się filtr przeciwpyłowy. Kanał wlotowy 1 zawiera fazę wodną, kanał 2 fazę lipidowo-olejową, a kanał 3 może być użyty do rozcieńczenia powstałych kropelek dodatkową fazą lipidową/olejową. (C) Szczegółowe przedstawienie połączenia, w którym faza lipidowo-olejowa (pochodząca z góry i z dołu) spotyka się z fazą wodną (pochodzącą z lewej). Na skrzyżowaniu utworzą się kropelki, które będą płynąć w kierunku kanału wylotowego po prawej stronie. (D) Szczegółowa reprezentacja filtra przeciwpyłowego z kanałami 2 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Metodologia tworzenia kropelek emulsji typu woda w oleju. (A) Chip mikroprzepływowy i rurki mikroprzepływowe pod mikroskopem jasnego pola. Zarówno rurki wodne, jak i lipidowo-olejowe są podłączone odpowiednio do wlotów chipów 1 i 2. (B) Ograniczenie układu mikroprzepływowego w miejscu, w którym spotykają się fazy wodnej i lipidowej/olejowej. Zmieniając ciśnienie, można kontrolować wielkość kropel. (C) Projektowanie komór przepływowych pokrytych PDMS. Po załadowaniu kropel do komory przepływowej, otwarte końce są zamykane dodatkowym Valapem. (D) Schemat formowania kropel. Kropelki służą do kapsułkowania centrosomów, tubuliny i dodatkowych składników wymaganych do tworzenia wrzeciona mitotycznego. (E) Schemat celowania w dyneinę korową. Biotynylowana (Bio)dyneina jest ukierunkowana na biotynylowane lipidy za pomocą streptawidyny (Strp). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki rekonstytucji wrzeciona o rosnącej złożoności. (A) Projekcje maksymalnej intensywności kropelek zawierających dwa centrosomy z przykładami krótkich, pośrednich i długich mikrotubul. Centrosomy i mikrotubule są wizualizowane przez dodanie 10% tubuliny znakowanej HiLyte-488. Podziałka = 10 μm. (B) Lokalizacja GFP-biotyny-dyneiny-TMR w przypadku braku (-, po lewej) i obecności (+, po prawej) streptawidyny (Strp). (C) Umiejscowienie asteru mikrotubul przy braku (-, po lewej) lub obecności (+, po prawej) korowego GFP-biotyny-dyneiny-TMR. (D) Pozycjonowanie asteru mikrotubul (lewy panel, zielony) w obecności Ase1 (środkowy panel, czerwony). (E) Umiejscowienie asteru mikrotubul (lewy panel, zielony) w obecności Ase1 i Cut7 (kinezyna-5) (środkowy panel, czerwony). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Obrazowanie dynamiki pozycjonowania asteru in vitro. (A) Konstrukcja kubka PDMS, który umożliwia obrazowanie kropelek przez okres do kilku godzin. (B) Generowanie, przechowywanie i obrazowanie kropelek (przesyłanych) zawierających różną zawartość, zilustrowane brakiem (po lewej) inkluzji (po prawej) fluorescencyjnego dekstranu (Alexa 647). (C) Jednopłaszczyznowe obrazy 60-minutowego filmu poklatkowego (2-minutowe odstępy) wykonane ze stosu z (odległości 2 μm) kropli zawierającej pojedynczy centrosom. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Opisane tu metody prezentują najnowsze wysiłki zmierzające do odtworzenia podstawowych wrzecion mitotycznych w kropelkach emulsji typu woda w oleju. Badanie montażu wrzecion w granicach geometrycznych ma wiele zalet. Istnieją ważne mechanizmy sprzężenia zwrotnego między mikrotubulami wrzeciona mitotycznego a ograniczeniami geometrycznymi, w których są one złożone. Mikrotubule mogą generować siły pchające, gdy rosną do granic geometrycznych, co może powodować mitotyczne przemieszczenie wrzeciona. Ponadto wyrastanie na fizyczną barierę może wywołać katastrofy mikrotubul. Ponadto montaż wrzeciona w ograniczonej geometrii może prowadzić do stopniowego wyczerpywania się poszczególnych komponentów, takich jak tubulina, co z kolei bezpośrednio wpływa na tempo wzrostu mikrotubul³⁶. Są to wszystkie podstawowe determinanty montażu wrzeciona, które można badać za pomocą opisanych tutaj testów.

Opisane testy są bardzo wrażliwe na niewielkie różnice stężeń składników kropelk. Tak jest w przypadku tubuliny, gdzie niewielkie różnice w stężeniach mogą powodować zbyt wolny lub zbyt szybki wzrost mikrotubul. W takim przypadku tempo wzrostu mikrotubul często można jeszcze skorygować, dostosowując temperaturę podczas pierwszych ~ 30 minut eksperymentu. Montaż i pozycjonowanie wrzeciona mitotycznego jest również bardzo wrażliwe na zmiany stężenia generatorów siły (korowej). Prawdopodobnie zależy to od stężenia, czystości i aktywności oczyszczonych składników i musi być starannie miareczkowane dla każdego nowo oczyszczonego białka.

Ponadto należy dokonać pewnych kompromisów w ustawieniach obrazowania, w zależności od charakteru testu. Początkowo wysoki poziom rozpuszczalnych dimerów fluorescencyjnych tubuliny utrudnia obrazowanie pojedynczych mikrotubul. W miarę wydłużania się mikrotubul i powolnego wyczerpywania się rozpuszczalnej tubuliny, stosunek sygnału do szumu stopniowo wzrasta i umożliwia obrazowanie pojedynczych mikrotubul. W przeciwieństwie do konfiguracji z systemami otwartymi, geometryczne ograniczenie zapobiega wymianie cząsteczek fluorescencyjnych i elementów systemu pochłaniania tlenu w zbiorniku zbiorczym, co powoduje znaczne bielenie. Szczególnie w przypadku monitorowania montażu i pozycjonowania wrzeciona w czasie wymagane jest obrazowanie przy niskim natężeniu światła, nawet w obecności silnego systemu pochłaniania tlenu.

Metody te umożliwiają odtworzenie od dołu uproszczonych struktur wrzecionowatych in vitro. Oprócz przedstawionych tutaj komponentów, opisano wiele innych czynników wpływających na powstawanie, pozycjonowanie, orientację, kształtowanie wrzeciona dwubiegunowego itp.3. System ten może być dalej rozbudowywany w celu zbadania indywidualnych i łącznych efektów dodatkowych generatorów siły. Ważnymi czynnikami przyczyniającymi się do tworzenia wrzeciona, które są obecnie nieobecne w tym systemie, są chromosomy mitotyczne. Wykazano, że chromatyna mitotyczna kieruje tworzeniem wrzeciona przez (1) chromoksynyny, które mogą generować tak zwane "siły wyrzutu polarnego"³, (2) tworzenie gradientu RanGTP przez związany z chromatyną RanGEF RCC1³⁸, (3) kinetochory, które mogą wchodzić w interakcje z (depolimeryzującymi) mikrotubulami³⁹ i (4) samą chromatynę, która może działać jako mechaniczna sprężyna pomiędzy przeciwstawnymi mikrotubulami⁴⁰.

Wreszcie, opisany system zapewnia obecnie ograniczoną czasową i przestrzenną kontrolę nad aktywnością i lokalizacją wprowadzanych generatorów siły. W komórkach wiele czynników montażu wrzeciona lokalizuje się w określonych przedziałach lub jest aktywnych w ograniczonym oknie czasowym. Uderzającym przykładem jest aktywność dyneiny, która jest specjalnie wzbogacona w tylnej części jednokomórkowego zarodka C. elegans, aby promować asymetryczne pozycjonowanie wrzeciona i podział komórek. W tym systemie badamy obecnie możliwość naśladowania takiej czasowej i asymetrycznej aktywności przy użyciu metod zapożyczonych z technik optogenetycznych. Ponadto, podobnie jak w przypadku zarodka C. elegans i komórek ze sztywną ścianą komórkową, wiele komórek nie zaokrągla się w mitozie. Kształt ograniczenia geometrycznego będzie miał zasadniczy wpływ na siły działające na wrzeciono⁴¹. W związku z tym ważne będzie odtworzenie montażu i pozycjonowania wrzeciona również w kroplach niesferycznych, potencjalnie przy użyciu bardziej złożonych systemów mikroprzepływowych, które umożliwiają kształtowanie i przechowywanie kropel emulsji^42,43. Wreszcie, w tkankach, sygnalizacja i przyłączanie komórka-komórka i komórka-substrat dostarczają zewnętrznych wskazówek, które można przełożyć na ukierunkowaną orientację wrzeciona, jak to często obserwuje się w komórkach nabłonkowych i komórkach macierzystych. Wszystkie te specjalistyczne aspekty nie zostały wzięte pod uwagę w obecnym badaniu i mogą stanowić przyszłe wyzwania związane z budowaniem w kierunku bardziej podobnych do in vivo rekonstrukcji mitotycznego montażu i pozycjonowania wrzeciona.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Przygotowanie chipów mikroprzepływowych
Photomask (Fotomaska na podłożu filmowym)	Selba S.A. Szwajcaria
SU-8 3025	MicroChem
Wafel krzemowy (4-calowy wafel krzemowy p/Bor < 1-0-0>10-20 Ω-cm, 500-550 μ m, SSP, z 2 płaskimi)	WRS Materials	4P0SSP-005
Powlekarka wirowa	Polos	SPIN150I
PDMS prepolimer RVT615 A+B	Lubribond	9481
Obróbka koronowa	Produkty elektrotechniczne	BD-20ACV
2. Zestaw mikroprzepływowy
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-seryna)	Avanti Polar Lipids	840035
Biotinyl PE (1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-( biotynyl)))Avanti	Polar Lipids	870285
Chloroform	Sigma-Aldrich	650498
Pipety
Rurki szklane Pompa próżniowa
	Laboport	KNF
Komora próżniowa	Kartell	Polipropylen Eksykator
Olej	mineralnySigma-Aldrich	M5904
Surfaktant (Span80)	Sigma-Aldrich	85548
Sonicator	Branson	M2800H
Szkiełka			24 mm x 60 mm, grubość 1,5
Szkiełka			podstawowe 26 mm x 76 mm
Dziurkacz	Harris Uni-Core	135840/135841/135843
Uszczelnienie laboratoryjne Film	Parafilm
Valap (wazelina, lanolina, wosk parafinowy stopiony w równych stężeniach)			Domowy
mikroskop Brightfield	Leica	PMIRB	Wystarczyłoby dowolne odwrócone jasne pole
Regulator ciśnienia	Fluigent	MFCS-FLEX-4C-1000
PEEK Rurka	Cluzeau Info. Labo, Francja
Fiolki mikrofluidyki (probówki Micrew 0,5 ml i 1 ml)	VWR, Holandia
3. Odtwarzanie formowania i pozycjonowania wrzeciona
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10 000 MW, Anionowy, Fixable)	Life Technologies
Tween-20	Sigma-Aldrich
BSA - Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich
Glukoza (D-(+)-Glukoza)	Sigma-Aldrich	G8270
Oksydaza glukozowa (Oksydaza glukozowa z Aspergillus niger)	Sigma-Aldrich	G6125
DTT (DL-ditioltheitol)	Sigma-Aldrich	646563
Katalaza (katalaza z wątroby bydlęcej)	Sigma-Aldrich	C9322
Tubulina (tubulina z mózgu bydlęcego)	Cytoskeleton Inc.
Tubulina-488/561 (tubulina znakowana HiLyte-488/rodaminą z mózgu świni)	Cytoskeleton Inc.
GTP (guanozyno-'5-trifosforan, hydrat soli sodowej)	Sigma-Aldrich	51120
κ-kazeina (κ-kazeina z surowicy bydlęcej)	Sigma-Aldrich	C0406
Airfuge (ultrawirówka napędzana powietrzem)	Beckman-Coulter	CLS
strong>4. Przedstawiamy czynniki montażowe wrzeciona
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
Neutravidin	Sigma-Aldrich	A2666
ATP (adenozyno-'5-trifosforan, sól disodowa hydrat sodowy)	Sigma-Aldrich	A9187
PEP (Sól monosodowa kwasu fosfo(enol)pirogronowego, hydrat ≥ 97% (enzymatyczny))	Sigma-Aldrich	P0564
PK/LDH -(Kinaza pirogronianowa/enzymy dehydrogenazy mlekowej z mięśni królika)	Sigma-Aldrich	P0294