Artykuł metodologiczny

Rekonstytucja podstawowych wrzecion mitotycznych w sferycznych kropelkach emulsji

11.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54278

⸱

13 sierpnia 2016

 ,  ,  , 
1Department of Bionanoscience, Delft University of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Montaż i ustawienie wrzeciona mitotycznego zależy od połączonych sił generowanych przez dynamikę mikrotubul, białka motoryczne i sieciery. Tutaj przedstawiamy nasze ostatnio opracowane metody, w których geometryczne uwięzienie sferycznych kropelek emulsji jest wykorzystywane do odtworzenia od dołu do góry podstawowych wrzecion mitotycznych.

Streszczenie

Montaż, pozycjonowanie i orientacja wrzeciona mitotycznego zależą od połączonych sił generowanych przez dynamikę mikrotubul, białka motoryczne mikrotubul i środki sieciujące. Rosnące mikrotubule mogą generować siły pchające, podczas gdy mikrotubule depolimeryzujące mogą przekształcać energię skurczu mikrotubul w siły ciągnące, gdy są przyłączone, na przykład, do dyneiny korowej lub chromosomów. Ponadto białka motoryczne i dyfuzyjne środki sieciujące w obrębie wrzeciona przyczyniają się do architektury wrzeciona poprzez łączenie i przesuwanie antyrównoległych mikrotubul. In vivo okazało się, że trudno jest ustalić względny wkład poszczególnych graczy w ogólny układ sił. Poniżej przedstawiamy metody, które niedawno opracowaliśmy w naszych wysiłkach na rzecz odtworzenia podstawowych wrzecion mitotycznych od dołu do góry in vitro. Stosując techniki mikroprzepływowe, centrosomy i tubulina są kapsułkowane w kropelkach emulsji typu woda w oleju, co prowadzi do powstania geometrycznie ograniczonych (podwójnych) astry mikrotubul. Poprzez dodatkowe wprowadzenie dyneiny zakotwiczonej w korze mózgowej, silników mikrotubul ukierunkowanych na plusie i dyfuzyjnych środków sieciujących, system ten jest używany do odtwarzania struktur przypominających wrzeciona. Przedstawione tutaj metody stanowią punkt wyjścia do odtworzenia bardziej kompletnych wrzecion mitotycznych, co pozwala na szczegółowe badanie udziału każdego pojedynczego składnika oraz na uzyskanie zintegrowanego ilościowego obrazu równowagi sił w wrzecionie mitotycznym.

Wprowadzenie

Podczas mitozy, chromosomy replikowanego genomu są zorganizowane na równiku komórki, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie chromatyd siostrzanych nad nowo powstałymi komórkami potomnymi. Pozycjonowanie i segregacja chromosomów odbywa się za pośrednictwem ich przyczepiania się do wrzecionowatych mikrotubul pochodzących z dwóch przeciwstawnych centrosomów. Oprócz zapewnienia wiernej dystrybucji chromosomów, orientacja wrzeciona mitotycznego dyktuje również płaszczyznę podziału komórki1. Skoordynowana orientacja podziału komórki jest niezbędna na wielu etapach rozwoju i dla homeostazy tkanek2. W szczególności regulowane pozycjonowanie wrzeciona mitotycznego może skutkować asymetrycznym rozkładem zawartości komórkowej, a nawet wytwarzać komórki potomne o różnych rozmiarach2. Montaż i orientacja wrzeciona mitotycznego rozpoczyna się w profazie i jest koordynowana przez złożoną interakcję między współpracującymi i antagonizującymi generatorami sił3,4. Generowane siły składają się zarówno z sił ciągnących, jak i pchających. Siły te pochodzą zarówno z kontaktów wrzeciona z korą komórkową, jak i z wnętrza wrzeciona i mogą być generowane przez dynamikę mikrotubul, a także przez silniki molekularne i środki sieciujące (ryc. 1).

Siły nacisku mogą być generowane, gdy mikrotubule rosną na sztywnych strukturach, takich jak kora komórkowa. W zależności od całkowitej siły oporu generowanej w systemie, może to spowodować przemieszczenie wrzeciona mitotycznego (małe siły) lub wywołanie wyboczenia mikrotubul lub katastrofę (duże siły)5-8. Wielkość siły, która może być generowana przez pchanie, zależy od długości mikrotubul, ponieważ długość jest silnym wyznacznikiem wyboczenia mikrotubuli9. Ponadto mikrotubule pochodzące z jednego centrosomu mogą napierać na drugi centrosom, co sugeruje mechanizm napędzający separację centrosomów we wczesnej fazieprofazy 3,10.

Oprócz sił nacisku generowanych przez rosnące mikrotubule, końce mikrotubul stykające się z korą komórkową mogą również pośredniczyć w siłach ciągnących11. Badania przeprowadzone w wielu laboratoriach wykazały, że kontrolowana aktywność generatorów siły korowej jest wymagana do asymetrycznego pozycjonowania wrzecion mitotycznych in vivo1. Zasadnicze znaczenie dla tych sił ciągnących ma zlokalizowana w korze cytoplazmatyczna dyneina (zwana dalej "dyneiną"), białko motoryczne mikrotubul skierowane na minusend 8,12,13. Na przykład u pączkujących drożdży boczne oddziaływania dyneiny korowej z siatką mikrotubul powodują przesuwanie się mikrotubul zależnych od motoryki wzdłuż kory14. Jednak korowe siły ciągnące mogą być również generowane przez zdolność dyneiny do tworzenia przyczepów końcowych do depolimeryzujących mikrotubul8. Energia generowana przez skurcz mikrotubul może prowadzić do sił, które są na ogół o rząd wielkości wyższe (~50 pN (odniesienie15)) niż siły generowane przez pojedyncze białka motoryczne (~7-8 pN (odnośnik 16)). Końcowe przyłączenie dyneiny korowej do mikrotubul depolimeryzujących sprzyja pozycjonowaniu wrzeciona u pączkujących drożdży17 i C. elegans13. Obecnie nie wiadomo, czy zarówno zależne od silnika siły ciągnące, jak i siły ciągnące napędzane depolimeryzacją mikrotubul mogą ze sobą współpracować, czy też wzajemnie się wykluczają in vivo.

Oprócz sił nacisku mikrotubul i sił ciągnących kory mózgowej za pośrednictwem dyneiny, pozycjonowanie centrosomów jest kontrolowane z wnętrza wrzeciona mitotycznego przez wiele innych białek. Na przykład silniki Kinesin-5 istnieją jako tetramery, które mogą sieciować antyrównoległe mikrotubule międzybiegunowe, co powoduje generowanie sił poślizgowych na zewnątrz18-20. Członkowie rodziny motorycznej kinezyny-5 są wymagani do separacji centrosomów i montażu wrzeciona dwubiegunowego u wszystkich badanych eukariontów, z wyjątkiem C. elegans (przegląd w odnośniku21).

Ponadto, dyfuzyjne sieciery z rodziny Ase1/PRC1 są również znane z lokalizacji w nakładających się na siebie obszarach mikrotubul mikrotubul międzypolarnych in vivo i in vitro22-27. Siły generowane przez napędzaną przez Ase1 ekspansję nakładającego się obszaru mikrotubuli są wystarczająco duże, aby zrównoważyć siły ślizgowe za pośrednictwem kinezyny-14 in vitro28,29. W komórkach Ase1 / PRC1 jest wymagany do stabilnego tworzenia nakładających się regionów mikrotubul w strefie środkowej wrzeciona25-27,30, co sugeruje, że siły generowane przez dyfuzyjne środki sieciujące mogą znacząco przyczyniać się do organizacji wrzeciona. Wreszcie, siły z chromatyny mitotycznej i kinetochorów wpływają na montaż i pozycjonowanie wrzeciona mitotycznego poprzez różne szlaki3. Ponieważ składniki te nie są częścią opisanych tutaj testów rekonstytucji, nie będą one szczegółowo omawiane.

Istnieją różne teorie na temat tego, jak różne składniki molekularne i siły opisane powyżej współpracują przy montażu i pozycjonowaniu wrzeciona, ale wciąż jesteśmy daleko od ilościowego zrozumienia. Oprócz eksperymentów na żywych komórkach, eksperymenty in vitro z oczyszczonymi składnikami stanowią skuteczną drogę do osiągnięcia tego celu. Poniżej przedstawiamy wizualny przewodnik po zaadaptowanej i rozszerzonej wersji ostatnio opublikowanych metod (Roth i wsp.31), w którym podstawowe wrzeciona są odtwarzane w kropelkach emulsji typu woda w oleju, zaczynając od minimalnej liczby komponentów. Korzystając z technik mikroprzepływowych, generowane są kuliste kropelki o rozmiarach porównywalnych z komórkami mitotycznymi. W obrębie tych kropelek oczyszczone centrosomy i tubulina mogą być łączone w celu zbadania dynamiki asteru mikrotubul, generowania sił i interakcji aster-aster. Wprowadzając korowe (takie jak dyneina) i międzybiegunowe (takie jak kinezyna-5/Ase1) generatory siły, odtwarzamy coraz bardziej złożone struktury wrzecionowate, które zaczynają przypominać sytuację in vivo.

Protokół

1. Przygotowanie chipów mikrofluidycznych

UWAGA: Do badania montażu wrzeciona od dołu do góry używane są sferyczne kropelki emulsji typu woda w oleju. Są to wodne mikrokropelki oddzielone od otaczającej fazy olejowej monowarstwą fosfolipidów i środka powierzchniowo czynnego. Te kropelki emulsji są wytwarzane w mikroprzepływowych chipach polidimetylosiloksanu (PDMS). Zmiany w geometrii kanałów i natężeniach przepływu mogą być wykorzystane do dostrojenia wielkości kropli. W opisanym tutaj projekcie mikroprzepływowym generowane są kropelki o średnicy około 15 μm, aby naśladować geometryczne uwięzienie komórki mitotycznej ssaków.

  1. Projektowanie fotomasek i produkcja form
    1. Zaprojektuj fotomaskę zawierającą trzy kanały wlotowe31. Kanał wlotowy 1 łączy się z fazą wodną, która zawiera zawartość kropel (patrz rozdział 3 "Odtwarzanie podstawowych astry mikrotubul"). Kanał wlotowy 2 łączy się z fazą olejową (patrz punkt 2.1 "Przygotowanie fazy lipidowej/olejowej"). Użyj kanału wlotowego 3, aby rozcieńczyć kropelki emulsji dodatkową fazą lipidową/olejową przed obserwacją (opcjonalnie) (Rysunek 2a-b).
      UWAGA: Za wszystkimi kanałami wlotowymi znajduje się filtr przeciwpyłowy (labirynt kanałów 2 μm), który zatrzymuje kurz, cząstki PDMS i agregaty (białkowe) oraz zapobiega blokowaniu przez nie kanałów mikroprzepływowych (rysunek 2d). Kanały mają szerokość 75 μm, a faza lipidowa/olejowa i faza wodna spotykają się w złączu o szerokości 12,5 μm, gdzie tworzą się kropelki emulsji (rysunek 2c).
    2. Zamów i otrzymaj wydrukowane fotomaski na podłożu filmowym, o polaryzacji ujemnej (fotomaska będzie ciemna z przezroczystymi zaprojektowanymi strukturami).
  2. Produkcja form
    1. Wytwarzaj formy poprzez powlekanie spinowe fotorezystu SU-8 3025 na 4-calowej płytce krzemowej za pomocą powlekarki spinowej (500 obr./min, 10 s, a następnie 1,800 obr./min, 45 s) w środowisku pomieszczenia czystego.
    2. Naświetl płytkę silikonową pokrytą SU-8 przez fotomaskę. Opracuj płytki zgodnie z instrukcjami producenta, aby utworzyć kanały o grubości ~40 μm.
  3. Tworzenie chipa mikroprzepływowego
    1. Wymieszaj 10 części prepolimeru PDMS z 1 częścią utwardzacza (łącznie ~40 gr) w naczyniu przypominającym łódkę za pomocą plastikowej szpatułki. Umieść PDMS zawierający naczynie przypominające łódź w komorze próżniowej na ~30 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Owiń folię aluminiową wokół formy, aby utworzyć filiżankę o pionowych krawędziach ~1 cm.
    2. Wlej PDMS (~75% całkowitej objętości) do formy, pozostaw w komorze próżniowej na kolejne ~30 minut (w celu usunięcia pęcherzyków powietrza) i utwardź przez 1 godzinę w temperaturze 100 °C w piekarniku.
    3. Pozostałe PDMS należy odwirować na szkiełkach podstawowych (5 s przy 200 obr./min, a następnie 30 s przy 4 000 obr./min), a następnie utwardzać przez 1 godzinę w temperaturze 100 °C. Usunąć kurz ze szkiełek za pomocą sprężonego powietrza/N2-flow, czyszczenie wstępne nie jest konieczne.
      UWAGA: Szkiełka szklane z powłoką PDMS mogą być używane zarówno do produkcji chipów mikroprzepływowych, jak i komór przepływowych (patrz również 2.2).
    4. Delikatnie zdejmij PDMS z formy za pomocą żyletki i przebij otwory (0,5 mm dla wlotów, 0,75 mm dla wylotu). Przez kilka sekund poddawać obróbce koronowej chip mikroprzepływowy i szkiełko szklane pokryte PDMS za pomocą laboratoryjnej obróbki powierzchni koronowej.
    5. Umieść chip mikroprzepływowy na szkiełku podstawowym (kanały skierowane w dół) i upiecz frytki w temperaturze 100 °C (Rysunek 3a). Przechowuj chipy mikroprzepływowe przez kilka miesięcy w środowisku wolnym od kurzu.

2. Konfiguracja mikroprzepływowa

UWAGA: Kropelki emulsji typu woda w oleju są generowane przy użyciu układu mikroprzepływowego i układów mikroprzepływowych opisanych powyżej. Skład fazy lipidowej/olejowej może być zróżnicowany w zależności od wymagań doświadczalnych. Lipidy rozpuszczone w oleju utworzą monowarstwę na granicy faz woda-olej z ich polarnymi grupami głowy skierowanymi w stronę wody wewnątrz. W celu ukierunkowania białek (np. dyniny) na granicę kropelek można dodać niewielkie ilości lipidów biotynylofosfatydyloetanoloaminy (biotynyl-PE). Pozwala to na rekrutację biotynylowanej dyneiny (patrz punkt 4.1 "Dyneina ukierunkowana na korę kropelkową") poprzez multimeryzację za pośrednictwem streptawidyny. Kropelki są stabilizowane przez dodanie środka powierzchniowo czynnego i przechowywane w komórkach przepływowych pokrytych PDMS.

  1. Przygotowanie fazy lipidowej/olejowej
    1. Wymieszać rozpuszczoną w chloroformie 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfo-L-serynę (DOPS) i lipidy biotynylo-PE w stosunku molowym 4:1 w szklanej probówce za pomocą szklanych pipet (przed użyciem dokładnie spłukać pipety chloroformem). Przygotuj łącznie ~250 μg lipidów, co daje stężenie lipidów ~0,5 mg/ml.
    2. Ostrożnie wysuszyć mieszaninę lipidów za pomocą przepływuN2, a następnie w komorze próżniowej przez ~1 godzinę. Wysuszone lipidy rozpuścić w oleju mineralnym i 2,5% środku powierzchniowo czynnym do 0,5 mg/ml (zrobić ~500 μl).
    3. Umieścić próbkę lipidów/oleju w kąpieli ultradźwiękowej i poddać sonikacji przez 30 minut przy 40 kHz, aby całkowicie rozpuścić lipidy.
  2. Przygotowanie komory przepływowej
    1. Przędzić PDMS (patrz również sekcja 1.3) na szkłach nakrywkowych (5 s przy 200 obr./min, a następnie 30 s przy 4 000 obr./min) i szkiełkach podstawowych (5 s przy 100 obr./min, a następnie 30 s 1 500 obr./min) w celu nałożenia jednorodnej warstwy PDMS.
      UWAGA: Aby uzyskać optymalną jakość obrazowania, należy używać szkieł nakrywkowych o grubości dopasowanej do obiektywu mikroskopu. W tym przypadku: 1,5 (~0,17 mm).
    2. Utwardzać szkła nakrywkowe i szkiełka podstawowe z powłoką PDMS przez 1 godzinę w temperaturze 100 °C w piekarniku. Wykonać komory przepływowe, umieszczając w krótkich odstępach (~2 mm) cienkie plasterki laboratoryjnej folii uszczelniającej (o szerokości ~3 mm) na szkiełkach pokrytych PDMS. W przypadku przechowywania w środowisku wolnym od kurzu, kanały, które nie były używane, mogą być używane w innym czasie.
    3. Przykryj komory przepływowe szkiełkiem nakrywkowym pokrytym PDMS i uszczelnij, topiąc laboratoryjną folię uszczelniającą ~1 min w temperaturze 100 °C, delikatnie docisnąć (Rysunek 3c). Zamknąć laboratoryjną folię uszczelniającą -szklane granice za pomocą Valap (Rysunek 3c). Przechowuj komory przepływowe przez kilka miesięcy w środowisku wolnym od kurzu.
  3. Przygotowanie kubka PDMS
    1. W przypadku długotrwałego obrazowania należy wykonać kubek PDMS, wybijając otwór o średnicy 4 mm w plastrze PDMS (o grubości ~3 mm)
    2. Poddaj obróbce koronowej plaster PDMS i szkło nakrywkowe pokryte PDMS i umieść je jeden na drugim. Upiecz filiżankę PDMS o/n (w temperaturze 100 °C) (Rysunek 5a).
  4. Tworzenie się emulsji i kropelek
    1. Monitoruj tworzenie się kropel pod mikroskopem odwróconego jasnego pola. Podłącz regulator ciśnienia do układu mikroprzepływowego za pomocą rurek PEEK (średnice: 510 μm (zewnętrzna) i 125 μm (wewnętrzna)) (Rysunek 3a). Napełnij chipy mikroprzepływowe całkowicie fazą lipidową/olejową z wlotu 2.
    2. Wprowadzić fazę wodną na bazie MRB80 (patrz rozdział 3 "Odtwarzanie podstawowych astry mikrotubul") z wlotu 1. Kontroluj wielkość kropel, zmieniając ciśnienie w fazie lipidowej/olejowej i wodnej, aby utworzyć kropelki o średnicy ~15 μm (Rysunek 3b).
      UWAGA: Korzystając z tej konfiguracji, użyj ~800 mbar dla fazy lipidowej/olejowej i ~200 mbar dla fazy wodnej, aby utworzyć kropelki o pożądanej wielkości.
    3. Po uzyskaniu pożądanej wielkości kropli i wymaganej ilości (~10 μl na próbkę), należy pobrać kropelki z kanału wylotowego i załadować do komory przepływowej (całkowicie napełnić komorę przepływową).
    4. Ostrożnie zamknij końce komory przepływowej za pomocą Valap (niecałkowicie zamknięte komory przepływowe mogą powodować rozległy ruch kropel, co utrudnia ich obrazowanie). Ponadto zapobiegają tworzeniu się pęcherzyków powietrza, które powodują ruch kropel.
    5. Dokładnie przepłucz rurki PEEK izopropanolem przed i po użyciu, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu próbki i zatkaniu.

3. Odtwarzanie podstawowych astry mikrotubul

UWAGA: Zawartość kropli może być zróżnicowana w zależności od wymagań eksperymentalnych. Wszystkie są oparte na MRB80 (80 mM PIPES, 1 mM EGTA, 4 mM MgCl2 (pH 6,8)), a wszystkie próbki są przygotowywane na lodzie. Ogólnie rzecz biorąc, kropelki zawsze zawierają centrosomy, składniki niezbędne do polimeryzacji mikrotubul, system pochłaniania tlenu i środek blokujący (patrz sekcja 3.1). W razie potrzeby można uwzględnić generatory siły mikrotubul oraz wymagane kofaktory i czynniki docelowe (patrz punkty 4.1 i 4.2).

  1. Ogólna konfiguracja do tworzenia asteru w kropelkach emulsji (rysunek 3d)
    1. Przygotować wcześniej wymieszać oksydazę glukozową (20 mg/ml oksydazy glukozowej w 200 mM DTT i 10 mg/ml katalazy) i przechowywać w małych porcjach w temperaturze -80 °C.
    2. Przygotować wcześniej "mieszankę blokującą" zawierającą κ-kazeinę, albuminę surowicy bydlęcej (BSA), Tween-20 i dekstran fluorescencyjny (jako marker obojętny) (patrz tabela 1) i przechowywać w małych porcjach w temperaturze -80 °C. Zapobiec powtarzającym się cyklom zamrażania i rozmrażania. Upewnij się, że wszystkie składniki są świeżo przygotowane.
    3. Oczyść centrosomy z ludzkich limfoblastycznych linii komórkowych KE37, jak opisano przez Moudjou i wsp.32 i przechowywać w temperaturze -150 °C w małych porcjach.
    4. Rozmrażamy centrosomy w temperaturze pokojowej i inkubujemy w temperaturze 37 °C przez ~20 minut przed użyciem, aby zapewnić prawidłowe zarodkowanie mikrotubul.
      UWAGA: Sprzyja to zarodkowaniu mikrotubul podczas eksperymentu.
    5. W międzyczasie należy przygotować na lodzie "mieszaninę do oznaczania", zawierającą tubulinę (fluorescencyjną i "ciemną"), trifosforan guanozyny (GTP), system pochłaniania tlenu (glukozę, oksydazę glukozową, katalazę i 1,4-ditiotreitol (DTT)), generatory sił molekularnych (np. silniki mikrotubul/środki sieciujące), trifosforan adenozyny (ATP) oraz system regenerujący ATP (fosfoenolopirogronian (PEP), kinazę pirogronianową (PK) i dehydrogenazę mleczanową (LDH)) (patrz tabela 2).
    6. Wstępnie schłodzić wirnik powietrza na lodzie. Zakręcić próbkę w schłodzonym wirniku powietrza (30 psi przez 3 minuty). Dodaj wstępnie podgrzane centrosomy (zoptymalizuj ilość centrosomów, aby dążyć do kropelek zawierających 1-2 centrosomy).
    7. Użyć połączonej mieszaniny do wytworzenia kropelek emulsji, stosując metody opisane w sekcji 2.3.
składnikKoncentracja zapasówStężenie końcowe (w teście)głośnośćkomentarz
Dekstran-647nm75 μM3,75 uM (0,6 μM)5 μl
κ-kazeina20 mg/ml12,5 mg/ml (2 mg/ml)62,5 μl
Tween-20 (Kanał Telewizyjny)5 proc.0,375% (0,06%)7,5 μl
Bsa200 mg/ml12 mg/ml (1,9 mg/ml)6 μl
Zobacz materiał MRB8019 μl
100 μl wersja ostatecznaPrzechowywać w porcjach 2 μl

Tabela 1: Składniki 'Blokującej Mieszanki'. Składniki mieszaniny blokującej, niezbędne do odtworzenia struktur wrzecionowatych w kropelkach emulsji typu woda w oleju. Opis znajduje się w tekście głównym, rozdział 3 "Odtwarzanie podstawowych astry mikrotubul". Szczegółowe informacje na temat materiałów można znaleźć w "Tabeli materiałów.

składnikKoncentracja zapasówStężenie końcowegłośnośćkomentarz
Mieszanka blokująca1,6 μl
Tubuliny500 μM30 μM0,6 μl
Tubulina-488/56150 μM3 μM0,6 μl
GTP (GTP)50 mM5 mM1,0 μl
Dyneina-TMR178 nM30 nM1,7 μl
Streptawidyna5 mg/ml200 nM0,4 μlTylko dla dyneiny korowej
Kinezyna-51,6 mln80 nM0,5 μl
Atp25 mM1 mM0,4 μlTylko dla silników
Pep0,5 mln25,6 mln0,5 μlTylko dla silników
PK/LDH (wirus PK/LDH)800 U/1 100 U23 U/32 U0,3 μlTylko dla silników
Ase1-GFP (Oprogramowanie ASE1-GFP)400 nM80 nM2,0 μl
glukoza2,5 mln50 mM0,3 μlOstatni krok
Oksydaza glukozowa50-krotnie1,0 razy0,3 μlOstatni krok
Zobacz materiał MRB80x
9 μl końcowy

Tabela 2: Składniki 'Assay Mix'. Składniki mieszaniny do oznaczania, wymagane do odtworzenia struktur wrzecionowatych w kropelkach emulsji typu woda w oleju. Opis znajduje się w tekście głównym, rozdział 3 "Odtwarzanie podstawowych astry mikrotubul". Szczegółowe informacje na temat materiałów można znaleźć w tabeli materiałów.

4. Przedstawiamy czynniki montażu wrzeciona

UWAGA: W opisanych tutaj testach użyto oznaczonej zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) skróconej wersji dyneiny S. cerevisiae, która jest sztucznie dimeryzowana za pomocą amino-końcowej S-transferazy glutationowej (GST)-znacznik33. Białko to jest oczyszczane za pomocą znacznika powinowactwa, który zawiera dwie kopie domeny wiążącej białko A IgG. Zastosowany tutaj wariant jest znakowany etykietą tetrametylorodaminy (TMR) na końcu karboksylowym, a N-końcowy znacznik SNAP służy do biotynylacji oczyszczonych białek. Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat konstrukcji, zobacz Roth et al.Lokal mieszkalny 31; aby uzyskać szczegółowe informacje na temat oczyszczania, zobacz Reck-Peterson i wsp.33. GFP-biotyna-dyneina-TMR może być ukierunkowana na korę kropelkową poprzez tworzenie kompleksów biotyna-streptawidyna, które łączą dyneinę z lipidami biotynylo-PE (ryc. 3e).

  1. Celowanie Dyneiny do kory kropel
    1. Włączyć GFP-biotynę-dyneinę-TMR do "mieszaniny testowej" (zob. tabela 2) przy końcowym stężeniu kropelki wynoszącym 30 nM. Włączyć streptawidynę do "mieszaniny testowej" (patrz tabela 2) przy końcowym stężeniu kropel wynoszącym 200 nM.
      UWAGA: Dyneina zależy od hydrolizy ATP dla stopniowego ruchu na mikrotubulach. W związku z tym należy włączyć ATP i system regeneracji ATP (zawierający PEP i PK/LDH) do "mieszaniny testów" (zob. tabela 2).
      UWAGA: Rekombinowany pełnowymiarowy S. pombe GFP-Cut7 (kinezyna-5) został dostarczony przez laboratorium Diez (Centrum Bioinżynierii Molekularnej, Technische Universität Dresden, Drezno, Niemcy), patrz . Rekombinowany, znakowany histydyną S. pombe GFP-Ase1 o pełnej długości został dostarczony z laboratorium Jansons (Uniwersytet Wageningen, Wageningen, Holandia) i dodany do "mieszanki testowej" w stężeniach 80 nM.

5. Obrazowanie

UWAGA: Podczas eksperymentu, wzrost mikrotubul może być kontrolowany poprzez zmianę temperatury. Przy wyborze warunków obrazowania należy dokonać kompromisu między wysoką jakością obrazowania a możliwością monitorowania montażu wrzeciona przez długi czas. Aby porównać kinetykę formowania wrzeciona w różnych warunkach, kropelki o różnej zawartości można mieszać i obrazować w tym samym kanale przepływowym.

  1. Podstawowe ustawienia obrazowania
    1. Obraz w środowisku o kontrolowanej temperaturze przy użyciu zamkniętej komory. Wizualizacja pojedynczych mikrotubul po ~30 min w temperaturze 26 °C. Podczas obrazowania promuj wzrost mikrotubul, zwiększając temperaturę do ~30 °C.
      UWAGA: Poniższe ustawienia są specyficzne dla konfiguracji naszego mikroskopu i mogą się różnić w zależności od różnych systemów i oprogramowania operacyjnego. Wszystkie opisane tutaj testy są obrazowane w zmotoryzowanym systemie odwróconym z głowicą konfokalną z wirującym dyskiem i obsługiwane za pomocą oprogramowania do obrazowania, takiego jak Andor iQ 3.1. Uzyskaj wszystkie obrazy za pomocą obiektywu 100X z zanurzeniem w oleju i kamery EmCCD.
    2. Ustaw lasery wzbudzające 488, 561 i 641 nm na około ~10% intensywności. Przejdź do panelu "akwizycja", kliknij zakładkę "AOTF" i przesuń intensywność lasera do 10%. Kliknij "nagraj", aby zapisać ustawienia.
    3. W przypadku projekcji z należy wykonywać stosy w odstępach co 1 μm (~20 obrazów/kroplę). Przejdź do głównego panelu "kamera", kliknij "edytuj z" i ustaw "krok z" na 1.0. Kliknij "Dalej", aby zapisać ustawienia.
    4. Ustaw maksymalne liniowe wzmocnienie EM, klikając zakładkę "kamera" w panelu "akwizycja" i przesuń pasek wzmocnienia EM do 300. Ustaw czasy naświetlania na 200 ms w tej samej karcie. Kliknij "nagraj", aby zapisać ustawienia.
  2. Obrazowanie na żywo
    1. W przypadku obrazowania na żywo, za pomocą sterowania programowego, wykonuj projekcje z co 2 minuty przez 1-2 godziny, skracając czas ekspozycji do ~100 ms (jak opisano w 5.1.4) i zwiększając odstępy z do 2 μm (jak opisano w 5.1.3). Ustaw szeregi czasowe w głównym panelu "kamery", kliknij "powtórz t" i ustaw na 2 minuty interwały, co daje łączny czas 120 minut.
    2. Do testów na żywo należy użyć kubka PDMS zamiast zwykłej komory przepływowej, aby upewnić się, że kropelki są jak najbardziej nieruchome.
  3. Połączone obrazowanie 2 stanów
    1. Wytwarzaj kropelki za pomocą mikrofluidyki i przechowuj na szkiełku podstawowym z powłoką PDMS na lodzie. Zapobiega to zarodkowaniu mikrotubul do momentu uformowania się drugiego zestawu kropel. Przed wyprodukowaniem drugiego zestawu kropel należy przepłukać rurki PEEK i chip mikroprzepływowy MRB80 i całkowicie napełnić chip mikroprzepływowy fazą lipidową/olejową.
    2. Generuj kropelki z dekstranem fluorescencyjnym i bez niego (lub używając dekstranu o różnych fluoroforach o różnych długościach fali) w celu rozróżnienia kropelek o różnych kolorach. Po wyprodukowaniu drugiej partii kropel delikatnie wymieszaj kropelki za pomocą pipetowania i załaduj do pojedynczej komory przepływowej/kubka PDMS.
  4. Analiza obrazu.
    1. Analizuj obrazy za pomocą Fidżi (oprogramowanie open source dostępne online)34.
    2. W przypadku testów na żywo przekształć stosy w hiperstosy za pomocą "obrazu"-"hyperstacks"-"stosu do hiperstosu". Ustaw prawidłową liczbę wycinków z i przedziałów czasu.
    3. Aby wykonać projekcje z, wybierz 'obraz'-'stosy'-'z-projekt'. Wybierz projekcję "maksymalna intensywność".
    4. W przypadku rekonstrukcji 3D, najpierw przejdź do "image"-"properties" i ustaw odpowiedni piksel za pomocą, wysokością piksela, głębią wokseli i interwałami klatek. Kliknij "OK". Wybierz "obraz" - "stosy" - "projekt 3D", zaznacz pole "interpoluj" i kliknij "OK".

Wyniki

Metody przedstawione w poprzednich sekcjach umożliwiają rekonstytucję struktur przypominających wrzeciona o rosnącym stopniu złożoności, wykorzystując geometryczne ograniczenie kropli emulsji woda w oleju. W tej sekcji opisano reprezentatywne wyniki, które jakościowo demonstrują możliwości tych analiz.

Podczas mitozy, w momencie formowania się dwubiegunowego wrzeciona, komórki zaokrąglają się, tworząc sfery o średnicy około 15 µm, jak zmierzono dla komórek ludzkich. Ta charakterystyczna budowa komórki w stanie mitozy wyznacza granicę geometryczną, która zarówno ogranicza, jak i kieruje rozmiarem oraz orientacją wrzeciona.35,36Techniki mikroprzepływowe zapewniają stopień ograniczenia geometrycznego, który wiernie odzwierciedla sytuację obserwowaną w żywych komórkach, a tym samym umożliwiają rekonstrukcję wrzecion mitotycznych metodą oddolną (bottom-up). in vitro.

Astery mikrotubul same w sobie są zdolne do wykazania złożonych zachowań, gdy wzrost mikrotubul jest ograniczony przez bariery geometryczne. Wraz ze wzrostem mikrotubul siły pchające generowane przez wbudowywanie nowych dimerów tubuliny przesuwają dwa centrosomy na przeciwległe strony kropli emulsji. Początkowo centrosomy swobodnie dyfundują w ograniczonej objętości (Rysunek 4a, lewy panel). Po około 20-30 min stają się widoczne pierwsze mikrotubule, a dyfuzja centrosomów zostaje ograniczona, ponieważ mikrotubule rosną w stronę kory we wszystkich kierunkach. Astery z mikrotubulami o średniej długości (około 50% średnicy kropli) mogą (sterycznie) odpychać się nawzajem, przy czym mikrotubule napierają na siebie, na pozostałe centrosomy oraz na korę. Prowadzi to do typowego „bipolarnego” układu przypominającego wrzeciono, w którym dwa centrosomy znajdują się naprzeciw siebie (Rysunek 4a, środkowy panel). Gdy mikrotubule przekroczą długość ~50% średnicy kropli, centrosomy zostają przesunięte dalej do przeciwległych krawędzi kropli, a mikrotubule rosną wzdłuż kory kropli (Rysunek 4a, prawy panel). Należy zauważyć, że szybkość wzrostu mikrotubul w tych testach jest bardzo wrażliwa zarówno na temperaturę, jak i na stężenie tubuliny. Parametry te będą zatem w dużym stopniu wpływać na czas pierwszego zaobserwowania nukleacji oraz moment osiągnięcia stanu stacjonarnego pozycji asterów.

W komórkach siły ciągnące kory są generowane poprzez tworzenie nośnych połączeń między końcami plus mikrotubul a dyneiną związaną z korą. W komórkach zwierzęcych powiązanie to zależy od kompleksu Gαi/LGN/NuMA, który jest kierowany do błony plazmatycznej poprzez mirystoilację N-końca Gαi1. W tych testach rekonstrukcyjnych wymóg obecności kompleksu Gαi/LGN/NuMA jest pomijany poprzez bezpośrednie sprzężenie dyneiny z biotynilowanymi lipidami za pomocą tworzenia kompleksów biotyna-streptawidyna-biotyna. Wiązania te są stosunkowo stabilne (KD ~10-14 M)37 i tworzą się szybko (zazwyczaj w ciągu 10 min po utworzeniu kropli emulsji, zanim stanie się widoczna nukleacja mikrotubul) (Rysunek 4b). W obecności dyneiny korowej centrosomy zazwyczaj zachowują bardziej centralną pozycję, podczas gdy w przypadku braku dyneiny centrosomy są wypychane na przeciwległe strony kory kropli (Rysunek 4c). Uważamy, że jest to wynik dwóch efektów, które zapobiegają siłom pchającym mikrotubul i przeciwdziałają im. (1) Dyneina bezpośrednio promuje katastrofy mikrotubul, ograniczając tym samym ich długość i zapobiegając nadmiernemu wyginaniu mikrotubul, oraz (2) siły ciągnące kory prowadzą do wypadkowych sił centrujących działających na poszczególne astry8, które przeciwdziałają siłom odpychania między astrami.

Dyfuzyjny łącznik sieciujący Ase1 indukuje siły, które dążą do zwiększenia regionu nakładania się antyrównoległych mikrotubul29. Zgodnie z tym, w obecności Ase1 (i przy braku dyneiny) centrosomy znajdują się blisko siebie, a Ase1 lokalizuje się w wiązkach mikrotubul interpolarnych (Ryc. 4d). Białka z rodziny kinezyny-5 napędzają separację centrosomów, generując siły pchające wewnątrz wrzeciona (patrz wstęp). W obecności Cut7 (ortologu kinezyny-5 u S. pombe) centrosomy są spychane na przeciwległe strony kropli emulsji, nawet w obecności Ase1 (Ryc. 4e). Dzięki połączeniu generatorów sił kortykalnych i interpolarnych, stopień złożoności w tych eksperymentach może zostać dalej zwiększony, co w rezultacie doprowadzi do kompleksowego zrozumienia procesu montażu bipolarnego wrzeciona mitotycznego. Szczegółowy opis ilościowy tych wyników będzie dostępny w przyszłości (Roth et al., rękopis w przygotowaniu).

Oprócz obserwacji pozycji centrosomów w stałych momentach czasu i wiązania ich zachowania z obserwowaną długością mikrotubul, cenne informacje można uzyskać poprzez śledzenie procesu pozycjonowania w czasie. Dzięki skróceniu czasu ekspozycji i zmniejszeniu intensywności laserów możliwe jest obecnie śledzenie pozycjonowania asterów w odstępach 2 min przez co najmniej 1 hr, przy fotobleachingu wynoszącym jedynie ~30%. Pozwala to na monitorowanie składania i pozycjonowania asterów, zaczynając od swobodnie dyfundujących centrosomów (0 min.), poprzez astery scentralizowane (12 min.), aż po astery zdecentralizowane (36 min i dalej) (Rycina 5c). Ułatwia to badanie zarówno zachowania w stanie stacjonarnym, jak i kinetyki składania wrzeciona. Poprzez łączenie kropli o różnej zawartości w tej samej próbce możliwe jest, na przykład, bezpośrednie porównanie pozycjonowania centrosomów i kinetyki składania wrzecion w kroplach z generatorami sił korowych oraz bez nich (Rycina 5b).

Schemat podziału komórki przedstawiający dynamikę mikrotubul, dyneiny, kinezyny i kinetochorów.
Rysunek 1: Siły działające na wrzeciono mitotyczne. Kilka cząsteczek generujących siłę działa na mikrotubule wrzeciona mitotycznego, aby wspomagać formowanie i pozycjonowanie wrzeciona. Mikrotubule wrastające w korę komórkową generują siłę pchającą działającą na centrosom. Dyneina korowa (fioletowa) przechwytuje depolimeryzujące mikrotubule i generuje siłę ciągnącą działającą na centrosomy. W obrębie wrzeciona białka motorowe Kinesin-5/Cut7 zapewniają siłę poślizgu skierowaną na zewnątrz w przypadku mikrotubul antyrównoległych, podczas gdy białka sieciujące z rodziny PRC1/Ase1 generują przeciwną siłę poślizgu skierowaną na zewnątrz. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat urządzenia mikroprzepływowego z kanałami rozcieńczającymi, wymiarami i układem chipa do zastosowań lab-on-a-chip.
Rycina 2: Projekt chipa mikroprzepływowego. (A) Projekt 4-calowej fotomaski zawierającej 4 chipy mikroprzepływowe. (B) Szczegółowa reprezentacja pojedynczego chipa. Chipy zawierają jeden kanał wylotowy i trzy kanały wlotowe, za którymi znajduje się filtr przeciwpyłowy. Kanał wlotowy 1 zawiera fazę wodną, kanał 2 fazę lipidową/olejową, a kanał 3 może być wykorzystany do rozcieńczania utworzonych kropel dodatkową fazą lipidową/olejową. (C) Szczegółowa reprezentacja złącza, w którym faza lipidowa/olejowa (nadchodząca z góry i z dołu) spotyka się z fazą wodną (nadchodzącą z lewej strony). W złączu powstaną krople, które będą przepływać w kierunku kanału wylotowego po prawej stronie. (D) Szczegółowa reprezentacja filtra przeciwpyłowego z kanałami o rozmiarze 2 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat chipa mikrofluidycznego: szkiełka powlekane PDMS, dynamika mikrotubul, centrosom, oddziaływanie dyneiny.
Rycina 3: Metodyka tworzenia kropel emulsji woda w oleju. (A) Chip mikrofluidyczny i przewody mikrofluidyczne w mikroskopie w świetle przechodzącym. Przewody fazy wodnej oraz fazy lipidowej/olejowej są podłączone odpowiednio do wlotów chipa 1 i 2. (B) Zwężenie na chipie mikrofluidycznym, w którym spotykają się fazy wodna i lipidowa/olejowa. Poprzez zmianę ciśnień można kontrolować rozmiar kropel. (C) Konstrukcja komór przepływowych powlekanych PDMS. Po wprowadzeniu kropel do komory przepływowej, otwarte końce zamyka się dodatkową warstwą Valap. (D) Schemat tworzenia kropel. Krople są wykorzystywane do enkapsulacji centrosomów, tubuliny i dodatkowych komponentów niezbędnych do tworzenia wrzeciona mitotycznego. (E) Schemat ukierunkowania dyneiny kortykalnej. Biotynilowana (Bio) dyneina jest kierowana do biotynilowanych lipidów za pomocą streptawidyny (Strp). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna oddziaływań tubuliny i dyneiny; lokalizacja białek Ase1 i Cut7.
Rycina 4: Reprezentatywne wyniki rekonstrukcji wrzeciona o rosnącym stopniu złożoności. (A) Maksymalne projekcje intensywności kropli zawierających dwa centrosomy, pokazujące przykłady krótkich, średnich i długich mikrotubul. Centrosomy i mikrotubule są wizualizowane poprzez dodanie 10% tubuliny znakowanej HiLyte-488. Paski skali = 10 µm. (B) Lokalizacja GFP-biotyny-dyneiny-TMR w przypadku braku (-, lewo) i obecności (+, prawo) streptawidyny (Strp). (C) Pozycjonowanie aster mikrotubul w przypadku braku (-, lewo) lub obecności (+, prawo) kortykalnej GFP-biotyny-dyneiny-TMR. (D) Pozycjonowanie aster mikrotubul (panel lewy, zielony) w obecności Ase1 (panel środkowy, czerwony). (E) Pozycjonowanie aster mikrotubul (panel lewy, zielony) w obecności Ase1 i Cut7 (kinezyna-5) (panel środkowy, czerwony). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat układu PDMS; mikroskopia z oświetleniem 641 nm; analiza dyfuzji w czasie na szkiełku nakrywnym.
Rysunek 5: Obrazowanie dynamiki pozycjonowania asterów in vitro. (A) Projekt naczynia z PDMS, który umożliwia obrazowanie kropli przez okres do kilku godzin. (B) Generowanie, przechowywanie i obrazowanie (w świetle przechodzącym) kropli o różnej zawartości, zilustrowane brakiem (lewo) lub obecnością (prawo) fluorescencyjnego dekstranu (Alexa 647). (C) Obrazy z pojedynczej płaszczyzny z sekwencji time-lapse trwającej 60 min (interwały 2 min), pobrane ze stosu z-stack (odstępy 2 µm) kropli zawierającej pojedynczy centrosom. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Opisane tu metody prezentują najnowsze wysiłki zmierzające do odtworzenia podstawowych wrzecion mitotycznych w kropelkach emulsji typu woda w oleju. Badanie montażu wrzecion w granicach geometrycznych ma wiele zalet. Istnieją ważne mechanizmy sprzężenia zwrotnego między mikrotubulami wrzeciona mitotycznego a ograniczeniami geometrycznymi, w których są one złożone. Mikrotubule mogą generować siły pchające, gdy rosną do granic geometrycznych, co może powodować mitotyczne przemieszczenie wrzeciona. Ponadto wyrastanie na fizyczną barierę może wywołać katastrofy mikrotubul. Ponadto montaż wrzeciona w ograniczonej geometrii może prowadzić do stopniowego wyczerpywania się poszczególnych komponentów, takich jak tubulina, co z kolei bezpośrednio wpływa na tempo wzrostu mikrotubul36. Są to wszystkie podstawowe determinanty montażu wrzeciona, które można badać za pomocą opisanych tutaj testów.

Opisane testy są bardzo wrażliwe na niewielkie różnice stężeń składników kropelk. Tak jest w przypadku tubuliny, gdzie niewielkie różnice w stężeniach mogą powodować zbyt wolny lub zbyt szybki wzrost mikrotubul. W takim przypadku tempo wzrostu mikrotubul często można jeszcze skorygować, dostosowując temperaturę podczas pierwszych ~ 30 minut eksperymentu. Montaż i pozycjonowanie wrzeciona mitotycznego jest również bardzo wrażliwe na zmiany stężenia generatorów siły (korowej). Prawdopodobnie zależy to od stężenia, czystości i aktywności oczyszczonych składników i musi być starannie miareczkowane dla każdego nowo oczyszczonego białka.

Ponadto należy dokonać pewnych kompromisów w ustawieniach obrazowania, w zależności od charakteru testu. Początkowo wysoki poziom rozpuszczalnych dimerów fluorescencyjnych tubuliny utrudnia obrazowanie pojedynczych mikrotubul. W miarę wydłużania się mikrotubul i powolnego wyczerpywania się rozpuszczalnej tubuliny, stosunek sygnału do szumu stopniowo wzrasta i umożliwia obrazowanie pojedynczych mikrotubul. W przeciwieństwie do konfiguracji z systemami otwartymi, geometryczne ograniczenie zapobiega wymianie cząsteczek fluorescencyjnych i elementów systemu pochłaniania tlenu w zbiorniku zbiorczym, co powoduje znaczne bielenie. Szczególnie w przypadku monitorowania montażu i pozycjonowania wrzeciona w czasie wymagane jest obrazowanie przy niskim natężeniu światła, nawet w obecności silnego systemu pochłaniania tlenu.

Metody te umożliwiają odtworzenie od dołu uproszczonych struktur wrzecionowatych in vitro. Oprócz przedstawionych tutaj komponentów, opisano wiele innych czynników wpływających na powstawanie, pozycjonowanie, orientację, kształtowanie wrzeciona dwubiegunowego itp.3. System ten może być dalej rozbudowywany w celu zbadania indywidualnych i łącznych efektów dodatkowych generatorów siły. Ważnymi czynnikami przyczyniającymi się do tworzenia wrzeciona, które są obecnie nieobecne w tym systemie, są chromosomy mitotyczne. Wykazano, że chromatyna mitotyczna kieruje tworzeniem wrzeciona przez (1) chromoksynyny, które mogą generować tak zwane "siły wyrzutu polarnego"3, (2) tworzenie gradientu RanGTP przez związany z chromatyną RanGEF RCC138, (3) kinetochory, które mogą wchodzić w interakcje z (depolimeryzującymi) mikrotubulami39 i (4) samą chromatynę, która może działać jako mechaniczna sprężyna pomiędzy przeciwstawnymi mikrotubulami40.

Wreszcie, opisany system zapewnia obecnie ograniczoną czasową i przestrzenną kontrolę nad aktywnością i lokalizacją wprowadzanych generatorów siły. W komórkach wiele czynników montażu wrzeciona lokalizuje się w określonych przedziałach lub jest aktywnych w ograniczonym oknie czasowym. Uderzającym przykładem jest aktywność dyneiny, która jest specjalnie wzbogacona w tylnej części jednokomórkowego zarodka C. elegans, aby promować asymetryczne pozycjonowanie wrzeciona i podział komórek. W tym systemie badamy obecnie możliwość naśladowania takiej czasowej i asymetrycznej aktywności przy użyciu metod zapożyczonych z technik optogenetycznych. Ponadto, podobnie jak w przypadku zarodka C. elegans i komórek ze sztywną ścianą komórkową, wiele komórek nie zaokrągla się w mitozie. Kształt ograniczenia geometrycznego będzie miał zasadniczy wpływ na siły działające na wrzeciono41. W związku z tym ważne będzie odtworzenie montażu i pozycjonowania wrzeciona również w kroplach niesferycznych, potencjalnie przy użyciu bardziej złożonych systemów mikroprzepływowych, które umożliwiają kształtowanie i przechowywanie kropel emulsji42,43. Wreszcie, w tkankach, sygnalizacja i przyłączanie komórka-komórka i komórka-substrat dostarczają zewnętrznych wskazówek, które można przełożyć na ukierunkowaną orientację wrzeciona, jak to często obserwuje się w komórkach nabłonkowych i komórkach macierzystych. Wszystkie te specjalistyczne aspekty nie zostały wzięte pod uwagę w obecnym badaniu i mogą stanowić przyszłe wyzwania związane z budowaniem w kierunku bardziej podobnych do in vivo rekonstrukcji mitotycznego montażu i pozycjonowania wrzeciona.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować członkom laboratorium Dogterom za cenne dyskusje. Dziękujemy Stefanowi Diezowi i Marcelowi Jansonowi za odczynniki oraz Samarze Reck-Peterson za pomoc w oczyszczaniu dyneiny. Prace te zostały sfinansowane przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERC Synergy grant: MODEL-CELL).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1. Przygotowanie chipów mikroprzepływowych
Photomask (Fotomaska na podłożu filmowym)Selba S.A. Szwajcaria
SU-8 3025MicroChem
Wafel krzemowy (4-calowy wafel krzemowy p/Bor < 1-0-0>10-20 Ω-cm, 500-550 μ m, SSP, z 2 płaskimi)WRS Materials4P0SSP-005
Powlekarka wirowa PolosSPIN150I
PDMS prepolimer RVT615 A+BLubribond9481
Obróbka koronowaProdukty elektrotechniczneBD-20ACV
2. Zestaw mikroprzepływowy
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-seryna)Avanti Polar Lipids840035
Biotinyl PE (1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-( biotynyl)))AvantiPolar Lipids870285
ChloroformSigma-Aldrich650498
Pipety
Rurki szklane Pompa próżniowa
LaboportKNF
Komora próżniowaKartellPolipropylen Eksykator
OlejmineralnySigma-AldrichM5904
Surfaktant (Span80)Sigma-Aldrich85548
SonicatorBransonM2800H
Szkiełka24 mm x 60 mm, grubość 1,5
Szkiełkapodstawowe 26 mm x 76 mm
DziurkaczHarris Uni-Core135840/135841/135843
Uszczelnienie laboratoryjne FilmParafilm
Valap (wazelina, lanolina, wosk parafinowy stopiony w równych stężeniach)Domowy
mikroskop BrightfieldLeicaPMIRB Wystarczyłoby dowolne odwrócone jasne pole
Regulator ciśnieniaFluigentMFCS-FLEX-4C-1000
PEEK RurkaCluzeau Info. Labo, Francja
Fiolki mikrofluidyki (probówki Micrew 0,5 ml i 1 ml)VWR, Holandia
3. Odtwarzanie formowania i pozycjonowania wrzeciona
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10 000 MW, Anionowy, Fixable)Life Technologies
Tween-20Sigma-Aldrich
BSA - Albumina surowicy bydlęcejSigma-Aldrich
Glukoza (D-(+)-Glukoza)Sigma-AldrichG8270
Oksydaza glukozowa (Oksydaza glukozowa z Aspergillus niger)Sigma-AldrichG6125
DTT (DL-ditioltheitol)Sigma-Aldrich646563
Katalaza (katalaza z wątroby bydlęcej)Sigma-AldrichC9322
Tubulina (tubulina z mózgu bydlęcego)Cytoskeleton Inc.
Tubulina-488/561 (tubulina znakowana HiLyte-488/rodaminą z mózgu świni)Cytoskeleton Inc.
GTP (guanozyno-'5-trifosforan, hydrat soli sodowej)Sigma-Aldrich51120
κ-kazeina (κ-kazeina z surowicy bydlęcej)Sigma-AldrichC0406
Airfuge (ultrawirówka napędzana powietrzem)Beckman-CoulterCLS
strong>4. Przedstawiamy czynniki montażowe wrzeciona
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
NeutravidinSigma-AldrichA2666
ATP (adenozyno-'5-trifosforan, sól disodowa hydrat sodowy)Sigma-AldrichA9187
PEP (Sól monosodowa kwasu fosfo(enol)pirogronowego, hydrat ≥ 97% (enzymatyczny))Sigma-AldrichP0564
PK/LDH -(Kinaza pirogronianowa/enzymy dehydrogenazy mlekowej z mięśni królika)Sigma-AldrichP0294
szklanepróżniowy nakrywkowe <

Bibliografia

  1. Kotak, S., Gonczy, P. Mechanisms of spindle positioning: cortical force generators in the limelight. Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 741-748 (2013).
  2. Williams, S. E., Fuchs, E. Oriented divisions, fate decisions. Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 749-758 (2013).
  3. Tanenbaum, M. E., Medema, R. H. Mechanisms of centrosome separation and bipolar spindle assembly. Dev Cell. 19, 797-806 (2010).
  4. Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. Mitotic force generators and chromosome segregation. Cell Mol Life Sci. 67 (13), 2231-2250 (2010).
  5. Faivre-Moskalenko, C., Dogterom, M. Dynamics of microtubule asters in microfabricated chambers: the role of catastrophes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (26), 16788-16793 (2002).
  6. Janson, M. E., de Dood, M. E., Dogterom, M. Dynamic instability of microtubules is regulated by force. J Cell Biol. 161 (6), 1029-1034 (2003).
  7. Laan, L., Husson, J., Munteanu, E. L., Kerssemakers, J. W., Dogterom, M. Force-generation and dynamic instability of microtubule bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8920-8925 (2008).
  8. Laan, L., et al. Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters. Cell. 148 (3), 502-514 (2012).
  9. Dogterom, M., Yurke, B. Measurement of the force-velocity relation for growing microtubules. Science. 278 (5339), 856-860 (1997).
  10. Cytrynbaum, E. N., Scholey, J. M., Mogilner, A. A force balance model of early spindle pole separation in Drosophila embryos. Biophys J. 84 (2 Pt 1), 757-769 (2003).
  11. Kozlowski, C., Srayko, M., Nedelec, F. Cortical microtubule contacts position the spindle in C. elegans embryos. Cell. 129 (3), 499-510 (2007).
  12. Carminati, J. L., Stearns, T. Microtubules orient the mitotic spindle in yeast through dynein-dependent interactions with the cell cortex. J Cell Biol. 138 (3), 629-641 (1997).
  13. Nguyen-Ngoc, T., Afshar, K., Gonczy, P. Coupling of cortical dynein and G alpha proteins mediates spindle positioning in Caenorhabditis elegans. Nat Cell Biol. 9 (11), 1294-1302 (2007).
  14. Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).
  15. Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. Force production by disassembling microtubules. Nature. 438 (7066), 384-388 (2005).
  16. Toba, S., Watanabe, T. M., Yamaguchi-Okimoto, L., Toyoshima, Y. Y., Higuchi, H. Overlapping hand-over-hand mechanism of single molecular motility of cytoplasmic dynein. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (15), 5741-5745 (2006).
  17. Ten Hoopen, R., et al. Mechanism for astral microtubule capture by cortical Bud6p priming spindle polarity in S. cerevisiae. Curr Biol. 22 (12), 1075-1083 (2012).
  18. Kapitein, L. C., et al. The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks. Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).
  19. van den Wildenberg, S. M., et al. The homotetrameric kinesin-5 KLP61F preferentially crosslinks microtubules into antiparallel orientations. Curr Biol. 18 (23), 1860-1864 (2008).
  20. Kapitein, L. C., et al. Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5. J Cell Biol. 182 (3), 421-428 (2008).
  21. Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. Mitotic functions of kinesin-5. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 255-259 (2010).
  22. Schuyler, S. C., Liu, J. Y., Pellman, D. The molecular function of Ase1p: evidence for a MAP-dependent midzone-specific spindle matrix. Microtubule-associated proteins. J Cell Biol. 160 (4), 517-528 (2003).
  23. Loiodice, I., et al. Ase1p organizes antiparallel microtubule arrays during interphase and mitosis in fission yeast. Mol Biol Cell. 16 (4), 1756-1768 (2005).
  24. Kapitein, L. C., et al. Microtubule-driven multimerization recruits ase1p onto overlapping microtubules. Curr Biol. 18 (21), 1713-1717 (2008).
  25. Janson, M. E., et al. Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast. Cell. 128 (2), 357-368 (2007).
  26. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  27. Mollinari, C., et al. PRC1 is a microtubule binding and bundling protein essential to maintain the mitotic spindle midzone. J Cell Biol. 157 (7), 1175-1186 (2002).
  28. Braun, M., et al. Adaptive braking by Ase1 prevents overlapping microtubules from sliding completely apart. Nat Cell Biol. 13 (10), 1259-1264 (2011).
  29. Lansky, Z., et al. Diffusible crosslinkers generate directed forces in microtubule networks. Cell. 160 (6), 1159-1168 (2015).
  30. Yamashita, A., Sato, M., Fujita, A., Yamamoto, M., Toda, T. The roles of fission yeast ase1 in mitotic cell division, meiotic nuclear oscillation, and cytokinesis checkpoint signaling. Mol Biol Cell. 16 (3), 1378-1395 (2005).
  31. Roth, S., Laan, L., Dogterom, M. Reconstitution of cortical Dynein function. Methods Enzymol. 540, 205-230 (2014).
  32. Moudjou, M., Bornens, M. Method of centrosome isolation from cultured animal cells. Cell Biology: A laboratory handbook. Celis, J. E. 2, 111-119 (1998).
  33. Reck-Peterson, S. L., et al. Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior. Cell. 126 (2), 335-348 (2006).
  34. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  35. Lancaster, O. M., et al. Mitotic rounding alters cell geometry to ensure efficient bipolar spindle formation. Dev Cell. 25 (3), 270-283 (2013).
  36. Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
  37. Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
  38. Moore, W., Zhang, C., Clarke, P. R. Targeting of RCC1 to chromosomes is required for proper mitotic spindle assembly in human cells. Curr Biol. 12 (16), 1442-1447 (2002).
  39. Akiyoshi, B., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
  40. Lawrimore, J., et al. DNA loops generate intracentromere tension in mitosis. J Cell Biol. 210 (4), 553-564 (2015).
  41. Minc, N., Burgess, D., Chang, F. Influence of cell geometry on division-plane positioning. Cell. 144 (3), 414-426 (2011).
  42. Taberner, N., et al. In vitro systems for the study of microtubule-based cell polarity in fission yeast. Methods Cell Biol. 128, 1-22 (2015).
  43. Boukellal, H., Selimovic, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. Simple robust storage of drops and fluids in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rekonstrukcja wrzeciona mitotycznegomikrofluidyczne krople emulsjienkapsulacja centrosom wtworzenie aster mikrotubulrekrutacja dyneiny kortykalnejemulsja woda w olejustruktury przypominaj ce wrzecionoograniczenie geometrycznepodej cie oddolneanaliza r wnowagi si

Powiązane artykuły