Oparte na interferencji RNA badanie funkcji białka szoku cieplnego 27 podczas gojenia się ran nabłonka rogówki

Podsumowanie

Niniejszym przedstawiamy protokół wykorzystania małego interferującego RNA specyficznego dla białka szoku cieplnego 27 (HSP27) do oceny funkcji HSP27 podczas gojenia się ran nabłonka rogówki. Interferencja RNA jest najlepszą metodą skutecznego obniżania ekspresji genów w celu zbadania funkcji białek w różnych typach komórek.

Streszczenie

Małe interferujące RNA (siRNA) jest jedną z najczęściej używanych metod interferencji RNA do krótkoterminowego wyciszania genów kodujących białka. siRNA to syntetyczny dupleks RNA stworzony specjalnie do celowania w transkrypt mRNA w celu wywołania jego degradacji i został wykorzystany do identyfikacji nowych szlaków w różnych procesach komórkowych. Istnieje niewiele doniesień dotyczących roli fosforylowanego białka szoku cieplnego 27 (HSP27) w gojeniu się ran nabłonka rogówki. W tym przypadku hodowane ludzkie komórki nabłonka rogówki podzielono na grupę transfekowaną z zakodowaną kontrolną transfekcją siRNA i grupę transfekowaną siRNA specyficzną dla HSP27. Następnie przeprowadzono testy kierunkowego zranienia wywołanego zadrapaniem, western blot i cytometrię przepływową. Wnioskujemy, że HSP27 odgrywa rolę w gojeniu się ran nabłonka rogówki, które mogą obejmować apoptozę i migrację komórek nabłonka. W tym miejscu znajdują się opisy krok po kroku przygotowania próbki oraz protokół badania.

Wprowadzenie

Komórki nabłonka rogówki (CEC) są nieustannie zrzucane do filmu łzowego, podczas gdy są jednocześnie zastępowane przez komórki z warstwy podstawnej rąbka i nabłonka rogówki. ¹ Różne zewnętrzne czynniki stresogenne mogą indukować apoptozę i złuszczanie CEC. ² Białka szoku cieplnego (HSP) są wysoce konserwatywne i można je podzielić na dwie rodziny w zależności od wielkości cząsteczki. ³ Największa rodzina HSP obejmuje HSP90, HSP70 i HSP60, a mniejsza rodzina HSP27. ⁴ Wiadomo, że fosforylacja HSP27 odgrywa ważną rolę w przetrwaniu komórek i jest niezbędna do migracji komórek ze względu na rolę tego białka w przebudowie aktyny. ^5-7 Dlatego podjęliśmy próbę przetestowania potencjalnej roli fosforylacji HSP27 w migracji CEC i apoptozie w modelu gojenia się ran nabłonkowych in vitro.

Interferencja RNA (RNAi) wykorzystująca małe lub krótkie interferujące RNA (siRNA) wzbudziła zainteresowanie zarówno w biologii podstawowej, jak i stosowanej, ponieważ potencjalnie pozwala na obniżenie ekspresji dowolnego interesującego genu. ⁸ W niniejszym artykule wykorzystano siRNA specyficzne dla HSP27 do oceny udziału HSP27 w gojeniu się ran i apoptozie CEC. Tradycyjne metody RNAi do knock-downu genów w komórkach wykorzystują syntetyczne dupleksy RNA, w tym dwa niemodyfikowane 21-merowe oligonukleotydy, które można złożyć w celu wytworzenia siRNA. RNAi siRNA, którego użyliśmy w tym badaniu, jest prostą i bardzo wydajną metodą transfekcji komórek, a ten odczynnik działa z różnymi unieśmiertelnionymi liniami komórkowymi. W niniejszym badaniu pokazujemy metody zastosowane do tej analizy, w tym kierunkowy test rany wywołany zadrapaniem, western blotting, test transfekcji siRNA, test immunofluorescencji i cytometrię przepływową.

Protokół

1. Linia komórkowa

1. Hodowla 10⁶ unieśmiertelnionych telomerazą ludzkich komórek nabłonka rogówki (HCEC) na 6-dołkowej płytce (gęstość: 1039,9 komórki/^mm2) w inkubatorze o temperaturze 37 °C z atmosferą 5%_CO2 przy użyciu pożywki do wzrostu nabłonka oskrzeli (BEGM), aż osiągną 95% zbieżności.

2. Analiza Western Blot po utworzeniu nabłonkowych ran po zadrapaniach

1. Sterylną końcówkę pipety o pojemności 200 μl przetoczyć po powierzchni studzienki z nalewającymi się kulturami HCEC cztery razy na szalkę w komorze bezpieczeństwa biologicznego (klasa II, typ A2) i oddzielnie inkubować HCEC w inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5%_CO2 przez 1, 5, 10, 30, 60 i 120 minut.
2. Użyj jednej płytki 6-dołkowej do sześciu różnych próbek w zależności od czasu inkubacji po zranieniu nabłonka rogówki.
3. Przemyć zranione monowarstwy HCEC trzykrotnie 1x PBS, a następnie dodać 2,0 ml BEGM do każdej studzienki.
4. Odłączyć HCEC, używając 2 ml 0,25% kwasu trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) na studzienkę przez 5 minut, odwirować przy 900 x g przez 5 minut w probówce o pojemności 15 ml i odessać trypsynę-EDTA za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
5. Zawiesić HCEC za pomocą 1 ml 1x PBS i przenieść je do probówki o pojemności 1,5 ml.
6. Odwirować HCEC przy 10 000 x g przez 15 sekund i odessać 1x PBS za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
7. Zawiesić HCEC w 100 μl lodowatego buforu do lizy (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 2 mM EDTA, 25 mM NaF, 2 mM Na₃VO₄, 1 mM fluorku fenylometanosulfonylu [PMSF], inhibitorach proteazy [1 μM pepstatyna A, 1 μM leupeptyna i 0,1 μM aprotynina] oraz 0,5% Triton X-100 [pH 7]) i dobrze je wymieszać.
8. Inkubuj komórki przez 30 minut na lodzie, aby wywołać lizę komórek.
9. Odwirować lizaty w temperaturze 4 °C przy 10 000 x g przez 15 minut, a następnie przenieść supernatanty do świeżych probówek o pojemności 1,5 ml (podwielokrotności 90 μl) i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
10. Określ całkowite stężenia białek w lizatach komórkowych za pomocą testu białek Bradforda. ⁹
11. Załaduj 30 μg całkowitych białek komórkowych do 10% lub 12% żelu akrylowego do elektroforezy w żelu dodecylosiarczanowo-poliakrylamidowym dodecylu sodu (SDS-PAGE), a następnie elektroforetycznie przenieś oddzielone pasma białkowe do filtrów nitrocelulozowych prądem 200 mA przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C do użycia w testach western blot.
12. Zablokować nitrocelulozowe membrany filtracyjne 5% odtłuszczonym mlekiem w soli fizjologicznej buforowanej Tris z Tween 20 (TBST) na 1 godzinę, dodać pierwszorzędowe królicze przeciwciała poliklonalne przeciwko niefosforylowanemu HSP27 (rozcieńczenie 1:1,000) lub pierwotnemu króliczemu przeciwciału poliklonalnemu przeciwko fosforylowanemu HSP27 (rozcieńczenie 1:1,000) w 5% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) i inkubować błony przez noc w temperaturze 4 °C na shakerze.
13. Wykryj prążki immunoreaktywne za pomocą kozich przeciwciał anty-króliczych sprzężonych z peroksydazą chrzanową (rozcieńczenie 1:10 000) w 5% BSA po przemyciu przez 10 minut 3 razy TBST.
14. Inkubować błonę w odczynnikach western blotting luminol (6-7 ml na 10 cm × 5 cm membrany) przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
15. Usuń membranę z roztworu odczynnika, usuń nadmiar płynu chłonnym ręcznikiem i umieść w plastikowym ochraniaczu na arkusz.
16. Pracując w ciemnym pomieszczeniu z bezpiecznym światłem, umieść zakrytą membranę w kasecie z filmem stroną z białkiem skierowaną do góry.
17. Umieść film rentgenowski na membranie i naświetlaj przez 1 minutę.

3. Test transfekcji siRNA¹⁰

1. Hodowla HCEC w 5×10⁵ komórek/basenik na 6-dołkowej płytce w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% atmosferą CO_{2 przy} użyciu BEGM aż do osiągnięcia 95% konfluencji.
2. Rozcieńczyć odczynnik do transfekcji (2,5 lub 7,5 μl) 100 μl zredukowanej pożywki surowicy do transfekcji (współczynnik rozcieńczenia wynosił 41 lub 14,3) i rozpuścić specyficzne dla HSP27 i zakodowane kontrolne siRNA w 100 μl zredukowanej pożywki surowicy, aby wytworzyć 10 lub 50 nM specyficznego dla HSP27 i zakodowanego kontrolnego siRNA.
3. Zmieszać 100 μl roztworu siRNA ze 100 μl rozcieńczonego odczynnika do transfekcji (stosunek 1:1) i inkubować mieszaninę przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
4. Dodaj kompleksy siRNA-lipid do komórek. Następnie, po 4 godzinach, zmienić pożywkę, aby zakończyć BEGM i inkubować komórki przez 2 dni w temperaturze 37 °C.
5. Analizować transfekowane komórki metodą western blot, zgodnie z opisem w punktach 4.1 do 4.7.

4. Test Western Blot dla komórek transfekowanych siRNA¹¹

1. Ekstrahować HCEC transfekowane siRNA specyficzne dla HSP27 i zaszyfrowane w komorze bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu 100 μl lodowatego buforu do lizy (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 2 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), 25 mM NaF, 2 mM Na₃VO₄, 1 mM fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF), inhibitory proteazy i 0,5% Triton X-100, pH 7).
2. Inkubuj komórki przez 30 minut na lodzie, aby wywołać lizę komórek.
3. Granulki lizaty w ilości 10 000 x g przez 15 minut, a następnie przenieść supernatanty do świeżych probówek o pojemności 1,5 ml (podwielokrotności 90 μl) i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
4. Określ stężenia białek w lizatach komórkowych za pomocą testu białka Bradforda. ⁹
5. Załadować próbki z równymi ilościami wszystkich białek komórkowych na 10% lub 12% żelu akrylowym, poddać żel SDS-PAGE i elektroforetycznie przenieść oddzielone pasma białkowe do filtrów nitrocelulozowych prądem 200 mA przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C do stosowania w testach western blot.
6. Zablokuj nitrocelulozowe membrany filtracyjne z 5% odtłuszczonym mlekiem w soli fizjologicznej buforowanej Tris z Tween 20 (TBST) przez 1 godzinę, dodaj pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko fosforylowanemu i niefosforylowanemu HSP27 (rozcieńczenie 1:1,000), fosforylowanemu Aktowi (rozcieńczenie 1:1,000), niefosforylowanemu Aktowi (rozcieńczenie 1:1,000, stosowane jako marker przeżycia komórki), białku X związanemu z Bcl-2 (rozcieńczenie 1:1,000, stosowane jako białko proapoptotyczne) i dehydrogenazie 3-fosforanowej aldehydu glicerynowego (GAPDH; rozcieńczenie 1:200, stosowany jako kontrola obciążenia) w 5% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) i inkubować błony przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce.
7. Wykryj prążki immunoreaktywne za pomocą kozich przeciwciał anty-króliczych sprzężonych z peroksydazą chrzanową (rozcieńczenie 1:10 000) w 5% BSA po 3-krotnym umyciu TBST, 10 minut każde pranie.
8. Inkubować błonę w odczynnikach western blotting luminol (6-7 ml na 10 cm × 5 cm membrany) przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
9. Usuń membranę z roztworu odczynnika, usuń nadmiar płynu chłonnym ręcznikiem i umieść w plastikowym ochraniaczu na arkusz.
10. Pracując w ciemnym pomieszczeniu z bezpiecznym światłem, umieść zakrytą membranę w kasecie z folią stroną z białkiem skierowaną do góry.
11. Umieść film rentgenowski na membranie i naświetlaj przez 1 minutę.

5. Test kierunkowego zranienia wywołanego zadrapaniami Ocena migracji komórek¹²

1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego wykonaj ranę, przeciągając sterylną końcówkę pipety po powierzchni studzienki z konfluentnymi kulturami HCEC transfekowanych siRNA specyficznych dla HSP27 lub zakodowanych HCEC transfekowanych siRNA w kontroli.
2. Natychmiast po zranieniu przemyć komórki dwukrotnie solą fizjologiczną buforowaną 1x fosforanem (PBS) i utrzymywać je w kulturach BEGM w inkubatorze o temperaturze 37 °C z atmosferą 5%_CO2 przez 24 godziny po zranieniu.
3. Fotografuj obrazy HCEC za pomocą mikroskopu pionowego w powiększeniu 100x 24 godziny po zranieniu i wykonaj spłaszczanie tła za pomocą polecenia Filtruj w oprogramowaniu do analizy obrazu.
4. Za pomocą polecenia Wybierz pomiary zdefiniuj obszar zainteresowania (AOI) o kształcie wielokąta o tym samym rozmiarze, który może pokrywać się prostopadle od końca do końca początkowej rany, i określ trzy różne obszary zainteresowania w zranionym obszarze każdej próbki.
5. Automatycznie zliczaj liczbę komórek w każdym polu, korzystając z opcji menu Miara liczby/rozmiaru.

6. Analiza apoptozy metodą cytometrii przepływowej

1. Hodowla swoistych dla HSP27 komórek transfekowanych siRNA i kontrola transfekowanych siRNA HCEC zawierających każde 10 nM siRNA w stężeniu 5×10⁵ komórek/dołek na płytkach 6-dołkowych, aż komórki osiągną 95% konfluencji w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% atmosferą CO₂ w BEGM.
2. Odłączyć HCEC, używając 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA na studzienkę przez 5 minut, odwirować przy 900 x g przez 5 minut w probówce o pojemności 15 ml i odessać trypsynę-EDTA za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
3. Umyj komórki dwukrotnie zimnym PBS, a następnie ponownie zawieś komórki w 1x buforze wiążącym (0,1 M HEPES/NaOH [pH 7,4], 1,4 M NaCl i 25 mM CaCl₂) w stężeniu 10⁶ komórek/ml.
4. Przenieść 100 μl zawiesiny komórek (1 x 10⁵ komórek) do probówki hodowlanej o pojemności 5 ml.
5. Dodać 5 μl aneksyny V sprzężonej z izotiocyjanianem fluoresceiny i 5 μl jodku propidyny.
6. Delikatnie zwiruj komórki i inkubuj je przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
7. Dodaj 200 μl 1x buforu wiążącego do każdej probówki i przeanalizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego w ciągu 1 godziny.

Wyniki

Ekspresja fosforylowanych HSP27 znacznie wzrosła po 5, 10 i 30 minutach od zranienia w porównaniu z nieuszkodzonymi HCECs¹³. Analiza Western blot wykazała, że ekspresja fosforylowanego HSP27 i fosforylowanego Akt była znacznie zmniejszona, podczas gdy ekspresja Bax była znacznie zwiększona w HCEC transfekowanych siRNA specyficznych dla HSP27 (Figura 1A-E). Ufosforylowana ekspresja HSP27 została zmniejszona o 30% i 40% odpowiednio w 10 nM i 50 nM komórek transfe...

Dyskusja

W niniejszym badaniu oceniliśmy potencjalną rolę HSP27 w zranianiu nabłonka rogówki przy użyciu metod in vitro . Kluczowe etapy obejmowały transfekcję siRNA w celu knock-down HSP27 w celu obserwacji funkcji HSP27 w komórkach poddanych stresowi. Warto zauważyć, że rola HSP27 została ujawniona w tych eksperymentach w migracji komórek nabłonka i apoptozie podczas gojenia się ran nabłonka rogówki. W przeciwieństwie do poprzednich badań¹⁰ , w których wykorzystano siRNA specyficzne dla HSP27 szczurów do tra...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szafa bezpieczeństwa biologicznego	CHC LAB Co., Ltd,  Daejeon, Korea Południowa	CHC-777A2-06	Klasa II, Typ A2
Stealth RNAi™ siRNA	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA		RNAi siRNA; zaszyfrowane siRNA kontrolne i swoiste dla HSP27 siRNA
BEGMTMLonza	, Inc., Walkersville, MD	CC-3171, CC4175	Pożywka do wzrostu nabłonka oskrzeli
Inhibitor proteazy	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	P8340 ,P7626	1 μ M Pepstatyna A, 1 μ M Leupeptin, 0,1 i #956; Test białka M Aprotynina
Bradforda	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	#500-0001	Test białka Bradford
Filtry nitrocelulozowe	Amersham, Little Chalfont, Wielka Brytania	RPN3032D	Membrana Western blotting
Niefosforylowany HSP27	Abcam Inc., Cambridge, MA	ab12351	Rozcieńczenie 1:1,000 (Total HSP27)
Fosforylowane HSP27 (Ser85)	Abcam Inc., Cambridge, MA	ab5594	Rozcieńczenie 1:1,000 HSP27 fosforylowano w Ser85
Odczynnik lipofekctaminy® RNAiMAX	Invitrogen, Carlsbad, CA	13-778-075	Odczynnik do transfekcji
Fosforylowany Akt (Ser473)	Technologia sygnalizacji komórkowej, Danvers, MA	nr 4060	Rozcieńczenie 1:1,000 Akt został ufosforylowany w Ser473 (marker przeżycia komórki)
Niefosforylowany Akt	Technologia sygnalizacji komórkowej, Danvers, MA	nr 4061	Rozcieńczenie 1:1,000 (Total Akt)
Białko X związane z Bcl-2	Technologia sygnalizacji komórkowej, Danvers, MA	nr 4062	1:1,000 (antyapoptotyczny marker białkowy)
GAPDH	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA	nr 4063	1:1,000 marker kontroli ładowania (gen utrzymania domu)
Przeciwciała anty-królicze sprzężone z peroksydazą chrzanową Thermo	Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	NCI1460KR	rozcieńczenie 1:10 000
OPTI-MEM	Invitrogen, Carlsbad, CA	31985	zredukowana pożywka surowicy do transfekcji
Oprogramowanie do analizy obrazu	Olympus, Inc., Tokio, Japonia	Image-Pro Plus 5.0
Odtłuszczone mleko w proszku	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Niemcy	T145.2
Tris	Amresco LCC, Inc. Solon, OH	No-0497
Chlorek sodu	Amresco LCC, Inc. Solon, OH	No-0241
Sześciodołkowa płytka	hodowlana Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	140675	średnica 35,00 mm / studnia
24-dołkowa miska do hodowli	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	142475
Wytrząsarka orbitalna	N-Bioteck, Inc., Seul, Korea Południowa	NB1015
Albumina surowicy bydlęcej	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA	sc-2323
BDFACSCantoTM II	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ		cytometrii przepływowej
	Kodak, Rochester, NY		Medyczna kaseta rentgenowska z zielonym ekranem 400
odczynnik do western blot luminol	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA	sc-2048
Zestaw do wykrywania apoptozy FITC Annexin V I	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ	556547