Artykuł metodologiczny

Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym: funkcjonalny biomarker do oceny niekorzystnych skutków toksyn i toksyn oraz korzyści zdrowotnych produktów naturalnych

14.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54281

⸱

25 grudnia 2016

 ,  , 
1Department of Pediatrics & Human Development, Institute for Integrative Toxicology, Michigan State University, 2RECETOX — Research Centre for Toxic Compounds in the Environment, Faculty of Science, Masaryk University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje technikę przenoszenia barwnika metodą skalpela i fluorescencyjnego, która mierzy komunikację międzykomórkową poprzez kanały połączeń szczelinowych. Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym jest głównym procesem komórkowym, w którym utrzymywana jest homeostaza tkanek, a zakłócenie tej sygnalizacji komórkowej ma niekorzystne skutki zdrowotne.

Streszczenie

Ten protokół opisuje technikę transferu barwnika fluorescencyjnego (SL-DT) za pomocą skalpela, która mierzy komunikację międzykomórkową poprzez kanały połączeń szczelinowych, co jest głównym procesem międzykomórkowym, dzięki któremu utrzymywana jest homeostaza tkanek. Przerwanie komunikacji międzykomórkowej (GJIC) przez toksyny, toksyny, leki itp. wiąże się z licznymi niekorzystnymi skutkami zdrowotnymi. Wiele chorób genetycznych u ludzi jest powiązanych z mutacjami w genach połączeń szczelinowych. Technika SL-DT jest prostym testem funkcjonalnym do jednoczesnej oceny GJIC w dużej populacji komórek. Test polega na wstępnym załadowaniu komórek barwnikiem fluorescencyjnym poprzez krótkie zakłócenie błony komórkowej ostrzem skalpela przez populację komórek. Barwnik fluorescencyjny może następnie przechodzić przez kanały połączeń szczelinowych do sąsiednich komórek przez określony czas. Test jest następnie przerywany przez dodanie formaliny do komórek. Rozprzestrzenianie się barwnika fluorescencyjnego w populacji komórek ocenia się za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego, a obrazy są analizowane za pomocą dowolnej liczby dostępnych pakietów oprogramowania morfometrycznego, w tym pakietów bezpłatnego oprogramowania znalezionych w domenie publicznej. Test ten został również przystosowany do badań in vivo z wykorzystaniem wycinków tkanek z różnych narządów leczonych zwierząt. Ogólnie rzecz biorąc, test SL-DT może zaspokoić szeroki zakres potrzeb farmakologicznych i toksykologicznych in vitro i może być potencjalnie dostosowany do wysokowydajnych systemów konfiguracyjnych z automatycznym obrazowaniem i analizą mikroskopii fluorescencyjnej w celu wyjaśnienia większej liczby próbek w krótszym czasie.

Wprowadzenie

Ogólnym celem tej metody jest dostarczenie prostej, wszechstronnej i stosunkowo taniej techniki oceny potencjalnej toksyczności związków. Jest to podejście in vitro, które można zastosować w wielu liniach komórkowych. Standardowe laboratoria biologii komórki wyposażone w mikroskopy epifluorescencyjne mogą prowadzić badania przy użyciu tego testu.

Nasza podstawowa wiedza na temat funkcji komórek była w dużym stopniu zależna od testów biologicznych in vitro i stała się niezbędnym składnikiem w ocenach toksykologicznych farmaceutyków, zanieczyszczeń środowiska i zanieczyszczeń żywności. Niestety, nie ma jednego systemu testów biologicznych in vitro, który byłby w stanie kompleksowo spełnić wymagania dotyczące wszystkich ocen toksykologicznych. Wiele testów in vitro jest zaprojektowanych i zoptymalizowanych pod kątem oceny, a także oceny określonego biochemicznego lub molekularnego punktu końcowego. Są one dość często łączone w konfigurację o wysokiej przepustowości, aby odzwierciedlić zaburzenie pewnego szlaku transdukcji sygnału, takiego jak sygnalizacja receptora estrogenowego1. Strategia ta okazała się całkiem skuteczna, ale ogromna liczba szlaków transdukcji sygnału zaangażowanych w ekspresję genów sprawia, że zadanie wyboru konkretnego szlaku sygnałowego do oceny jest dość złożone. Obecnie opracowywane są protokoły o wysokiej przepustowości, które są wykorzystywane do jednoczesnego pomiaru wielu ścieżek sygnałowych, co jest jednym z podejść do przezwyciężenia niektórych ograniczeń pojedynczych testów. Jednak nie wszystkie szlaki sygnałowe zostały z powodzeniem włączone do bardziej kompleksowych podejść, a ponadto stale odkrywane są nowe szlaki sygnałowe, co jeszcze bardziej komplikuje ten proces oceny. Stosowanie dużej liczby podejść in vitro, w szczególności systemów o wysokiej przepustowości, do kompleksowych ocen toksykologicznych jest również bardzo kosztowne i nie sprzyja większości projektów badawczych prowadzonych przez jednego badacza.

GJIC to proces ściśle kontrolowany przez zmiany napięcia, stężenia wapnia, pH, równowagi redoks, regulowany przez główne wewnątrzkomórkowe szlaki transdukcji sygnału i interakcje z białkami błony i cytoszkieletu2,3. Tak więc hamowanie GJIC może odzwierciedlać różne rodzaje stresu komórkowego, zakłócenia różnych funkcji komórkowych lub zaburzenia różnych szlaków transdukcji sygnału. Innym podejściem do przezwyciężenia stosowania ograniczonych testów biologicznych transdukcji sygnału jest wykorzystanie zjawisk biologicznych polegających na tym, że wiele, jeśli nie większość, szlaków transdukcji sygnału jest dalej modulowanych przez współpracujące systemy sygnalizacji międzykomórkowej przez kanały połączeń szczelinowych4-8. Chociaż międzykomórkowe systemy sygnalizacyjne są również liczne i podlegają kontroli wielu ścieżek, sygnalizacja międzykomórkowa przez kanały połączeń szczelinowych jest ostatecznie funkcją kanałów, które są otwierane, częściowo zamknięte lub całkowicie zamknięte. Zapewnia to punkt końcowy, który można łatwo zmierzyć za pomocą różnych systemów testów biologicznych in vitro 7. Biorąc pod uwagę, że homeostatyczna wartość zadana tkanki wymaga otwartych kanałów, określenie wpływu związków na komunikację międzykomórkową w szczelinie (GJIC) jest bardziej kompleksowym podejściem do określania potencjalnych skutków toksycznych związków4,8. W istocie, to krytyczne zjawisko biologiczne, które odgrywa kluczową rolę w koordynowaniu wielu zdarzeń transdukcji sygnału kontrolujących ekspresję genów, pozwala na szeroką ocenę skutków toksycznych. W związku z tym testy biologiczne, które oceniają GJIC, są doskonałym punktem wyjścia do oceny potencjału toksycznego związków.

Najbardziej rozbudowane techniki używane do oceny GJIC opierają się na wstępnym załadowaniu komórek sondą fluorescencyjną, a następnie monitorowaniu migracji barwnika z załadowanej komórki lub komórek do sąsiednich komórek. Techniki wstępnego ładowania barwnika obejmowały mikroiniekcję9, ładowanie skrobanie10 i estry metylowe sond11. Metoda obciążenia skalpelem i fluorescencyjnego transferu barwnika (SL-DT) jest modyfikacją testu obciążenia skrobaniem - transferu barwnika opracowanego przez El Fouly10. Zamiast bardziej inwazyjnego skrobania, metoda ładowania skalpelem opisana w tym raporcie polega na delikatnym przetaczaniu skalpela z okrągłym ostrzem przez monowarstwę komórek, które minimalizują uszkodzenia inwazyjne (ryc. 1). Zaletą tej techniki jest ocena toksykologiczna populacji komórek, a nie pojedynczych komórek w teście mikroiniekcji. Co więcej, prostota tego testu pozwala na szybkie wykrycie wielu płytek w krótkim czasie, podczas gdy metody wykorzystujące techniki mikroiniekcji oraz techniki wykorzystujące estry metylowe sond fluorescencyjnych są znacznie bardziej czasochłonne i wymagają znacznie wyższego poziomu umiejętności.

Chociaż nie ma jednej metody na zaspokojenie wszystkich potrzeb badania GJIC; test SL-DT jest prostym, dość tanim i wszechstronnym testem, który może zaspokoić wiele potrzeb związanych z początkową oceną toksyczności różnych związków. Do głównych zalet należą: prostota, brak specjalnego zapotrzebowania na sprzęt lub umiejętności, które są wymagane przy innych metodach, takich jak mikroiniekcja, odzyskiwanie fluorescencyjne po fotowybielaniu (FRAP) i lokalna aktywacja molekularnych testów fluorescencyjnych, szybka i jednoczesna ocena GJIC w dużej liczbie komórek, sprzyjająca konfiguracji o wysokiej przepustowości z automatycznym obrazowaniem i analizą mikroskopii fluorescencyjnej, a także jego zdolność adaptacji do badań in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół tego badania został zatwierdzony przez Komitet do spraw Opieki nad Zwierzętami i ich Wykorzystania Narodowych Instytutów Nauk Medycznych Japonii, gdzie przeprowadzono eksperymenty in vivo, aby zapewnić, że szczury były traktowane w sposób humanitarny oraz z uwzględnieniem minimalizacji cierpienia.

1. Test bioanalityczny SL-DT

  1. Zasadź 3 x 105 komórek nabłonkowych wątroby szczura WB-F344 na płytkach hodowlanych o średnicy 35 mm zawierających zmodyfikowane medium Eaglesa z dodatkiem 5% cielęcego surowicy fetalnej i hoduj komórki w inkubatorze w temperaturze 37 ºC, wilgotności względnej 100% (RH) i 5% CO2.
  2. Hoduj komórki aż do osiągnięcia 100% konfluentności (zwykle po 2 dniach) i przeprowadź wymagane eksperymentalne zabiegi na komórkach, zgodnie z poniższym opisem.
    1. Przeprowadź eksperymenty dotyczące odpowiedzi dawkowej
      1. Dodaj 10 µl i 20 µl 2 mM roztworu zapasowego fenantrenu w 100% acetonitrylu oraz 4 µl, 6 µl i 8 µl 20 mM roztworu zapasowego fenantrenu w 100% acetonitrylu do trzech płytek komórkowych zawierających po 2 ml ośrodka wzrostu dla każdej dodanej objętości roztworu zapasowego.
      2. Dodaj 4 µl, 6 µl, 8 µl, 10 µl i 20 µl 100% roztworu acetonitrylu do trzech płytek komórkowych zawierających po 2 ml ośrodka wzrostu dla każdej dodanej objętości roztworu acetonitrylu, aby uzyskać kontrolę pojazdu.
      3. Umieść płytki w inkubatorze na 15 min w temperaturze 37 °C, wilgotności względnej 100% i 5% CO2.
      4. Przejdź do kroku 1.3.
    2. Przeprowadź eksperymenty dotyczące odpowiedzi czasowej
      1. Dodaj 7 µl 20 mM roztworu zapasowego fenantrenu w 100% acetonitrylu do trzech płytek komórkowych zawierających po 2 ml ośrodka wzrostu dla każdego punktu czasowego (tj. 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 min).
      2. Dodaj 7 µl 100% acetonitrylu do trzech płytek komórkowych zawierających po 2 ml ośrodka wzrostu dla każdego punktu czasowego, aby uzyskać kontrolę pojazdu.
      3. Umieść płytki w inkubatorze na każdy wyznaczony punkt czasowy w temperaturze 37 °C, wilgotności względnej 100% i 5% CO2.
      4. Przejdź do kroku 1.3.
    3. Przeprowadź eksperymenty dotyczące czasu regeneracji
      1. Dodaj 7 µl 20 mM roztworu zapasowego fenantrenu w 100% acetonitrylu do trzech płytek komórkowych zawierających po 2 ml ośrodka wzrostu na 15 min.
      2. Dodaj 7 µl 100% acetonitrylu do trzech płytek komórkowych zawierających po 2 ml ośrodka wzrostu na 15 min, aby uzyskać kontrolę pojazdu.
      3. Odlaj medium zawierające fenantren lub acetonitryl i przepłucz trzykrotnie po 3 ml buforu fosforanowego (PBS).
      4. Dodaj po 2 ml świeżego ośrodka wzrostu do każdej płytki i inkubuj przez wymagane czasy regeneracji (tj. 25, 35, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360 min) w inkubatorze w temperaturze 37 °C, wilgotności względnej 100% i 5% CO2.
      5. Przejdź do kroku 1.3.
    4. Przeprowadź eksperymenty mechanistyczne
      1. Dodaj inhibitor transdukcji sygnału, tj. 5 µl 20 mM roztworu zapasowego D609 w 100% acetonitrylu do trzech płytek komórkowych zawierających po 2 ml ośrodka wzrostu na 15 min.
      2. Dodaj 5 µl 100% acetonitrylu do trzech płytek komórkowych zawierających po 2 ml ośrodka wzrostu na 15 min, aby uzyskać kontrolę pojazdu.
      3. Dodaj 7 µl 20 mM roztworu zapasowego fenantrenu w 100% acetonitrylu do trzech płytek komórkowych zawierających po 2 ml ośrodka wzrostu z dodatkiem D609 na dodatkowe 15 min.
      4. Dodaj 7 µl 100% acetonitrylu do trzech płytek komórkowych zawierających po 2 ml ośrodka wzrostu z dodatkiem 100% acetonitrylu na dodatkowe 15 min, aby uzyskać kontrolę pojazdu.
      5. Przejdź do kroku 1.3.
  3. Usuń medium hodowlane poprzez ostrożne wylanie go lub odsączenie pod próżnią.
    Uwaga: Zużyte medium zawierające substancje niebezpieczne należy odpowiednio zutylizować.
  4. Przepłucz komórki trzykrotnie po 3 ml PBS, odlając lub odsączając między poszczególnymi przepłukaniami.
  5. Pipetą dodaj po 1 ml barwnika Lucifer Yellow (LY) o stężeniu 1 mg/ml rozpuszczonego w PBS do każdej płytki komórkowej.
  6. Wstępnie nasyć komórki barwnikiem, delikatnie przetaczając ostrze chirurgiczne ze stali nierdzewnej nr 20 z zaokrąglonym brzegiem przez populację komórek w trzech różnych miejscach płytki.
    1. Zacznij od ustawienia skalpela prostopadle (pod kątem 90°) i w odległości 5 mm od krawędzi płytki hodowlanej, a następnie przetocz skalpel z tej pozycji prostopadłej do pozycji pod kątem około 15° (patrz Rycina 1).
      Uwaga: Ruch ten wykonuje się, trzymając skalpel między kciukiem a palcem wskazującym. Wykorzystaj siłę grawitacji, aby delikatnie przetoczyć skalpel z pozycji 90° do 15° (zaokrąglone ostrze po prostu przetacza się po komórkach). Ruch ten pozostawia widoczną linię wgłębienia.
  7. Umieść komórki w roztworze LY na 3 min w temperaturze pokojowej.
  8. Odlaj lub odsącz roztwór LY i przepłucz trzykrotnie po 3 ml PBS, aby usunąć cały barwnik pozakomórkowy i zminimalizować tło fluorescencyjne pozakomórkowe.
  9. Dodaj po 0,5 ml 10% roztworu formaliny buforowanej fosforanem w celu utrwalenia komórek.
    Uwaga: Po utrwaleniu w formalinie komórki należy wysuszyć na powietrzu i przechowywać w ciemności do dwóch lat, minimalizując wybielanie fotometryczne barwnika LY. W razie potrzeby ponownie nawilżyć komórki roztworem 10% formaliny, aby móc obserwować front fluorescencyjny barwnika.
  10. Obserwuj utrwalone komórki za pomocą mikroskopu epi-fluorescencyjnego wyposażonego w kostkę dichroiczną do długości fali wzbudzenia/emisji 428/536 nm przy powiększeniu 200X. Ustaw wszystkie płytki tak, aby linia wgłębienia była równoległa do poziomego pola widzenia.
    Uwaga: Kostka dichroiczna FITC nadaje się bardzo dobrze.
    1. Uzyskaj obraz za pomocą kamery CCD i odpowiedniego oprogramowania.
      1. Otwórz oprogramowanie obsługujące kamerę CCD i ustaw automatyczne nasycenie ekspozycji. Użyj przycisku „capture” (przechwyć), aby cyfrowo uzyskać obraz. Zapisz obraz w formacie .tif, korzystając z przycisku „Save” (zapisz).

2. Adaptacja testu SL-DT do tkanki wątroby

  1. Usunięcie za pomocą nożyczek do mikrochirurgii kawałka wątroby o wymiarach około 2 x 2 cm z lewej płata wątroby samca szczura linii Fischer 344 w wieku 5 tygodni i umieszczenie go na plastikowej talii wagowej przykrytej wilgotną gazą12.
  2. Pipetowanie 0,5 ml roztworu PBS zawierającego po 1 mg/ml lucyfernej żółci i dekstranu rodaminowego (RD) na powierzchnię kawałka wątroby umieszczonego na plastikowej talii wagowej.
    Uwaga: RD to barwnik, który nie może przenikać przez kanały stykowe i oznaczy komórki, które zostały załadowane.
  3. Wykonanie trzech do pięciu nacięć o długości około 1 cm na powierzchni kawałka wątroby, na którym znajduje się roztwór barwnika, za pomocą ostrego noża, a następnie dodanie dodatkowej ilości barwnika w ilości wystarczającej do wypełnienia nacięć.
  4. Incynacja tkanki przez 3 minuty w temperaturze pokojowej na plastikowej talii wagowej.
  5. Przemywanie trzykrotnie 5 ml roztworu PBS.
  6. Utwardzanie tkanki przez całą noc w 30 ml 10% formaliny buforowanej fosforanem w 50 ml stożkowej probówce do wirowania w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej.
  7. Następnego dnia przemyć kawałki wodą, przyciąć tkankę wokół nacięć nożyczkami do mikrochirurgii na paski o wymiarach 1 x 1 x 0,5 cm3, a następnie wykorzystać standardowe techniki do wtopienia kawałków w parafinie13.
  8. Przecinać kawałki prostopadle do linii nacięcia na cienkie warstwy o grubości 5 µm i przechowywać próbki w ciemnym miejscu do momentu wykonania obrazowania, stosując standardowe techniki przecinania mikrotomem13.
  9. Wykorzystać mikroskop epi-fluorescencyjny wyposażony w cyfrową kamerę CCD do wizualizacji i rejestracji obrazów frontów fluorescencyjnych barwników zgodnie z punktem 1.107.

3. Ilościowe określanie komunikacji przez połączenia szczelinowe

  1. Zmierz rozprzestrzenienie barwnika fluorescencyjnego za pomocą oprogramowania morfometrycznego (np. ImageJ).
    1. Kliknij kartę „Plik”, a następnie kliknij „Otwórz”, aby otworzyć zapisany obraz.
    2. Kliknij narzędzie „Kształt swobodny” na pasku narzędzi, aby prześledzić kontur czoła barwnika.
    3. Kliknij kartę „Analiza”, a następnie kliknij „Pomiary”.
      Uwaga: Spowoduje to wygenerowanie wartości powierzchni w arkuszu, którą można skopiować do innego programu arkusza kalkulacyjnego, jeśli jest taka potrzeba.
  2. Używając programu arkusza kalkulacyjnego, oblicz ułamek kontroli (FOC), dzieląc powierzchnię rozprzestrzenienia barwnika na talii doświadczalnej przez powierzchnię, na jaką rozprzestrzenił się barwnik na talii kontrolnej, zgodnie z poniższym równaniem:
    Równanie równowagi statycznej Ae/Ac=FOC, symbol analizy stosunku sił, diagram edukacyjny.
    Ae = powierzchnia rozprzestrzenienia barwnika w komórkach narażonych na zmienną doświadczalną, taką jak komórki traktowane substancją chemiczną w określonym stężeniu lub czasie
    Ac = powierzchnia rozprzestrzenienia barwnika w kontrolce, czyli w komórkach traktowanych rozpuszczalnikiem używanym do rozpuszczenia badanej substancji chemicznej
    Uwaga: Aby określić wpływ rozpuszczalnika, Ae oznacza powierzchnię rozprzestrzenienia barwnika w komórkach traktowanych rozpuszczalnikiem, a Ac – powierzchnię rozprzestrzenienia barwnika w komórkach nie traktowanych rozpuszczalnikiem. Wpływ rozpuszczalnika powinien być zazwyczaj mniejszy niż 10%.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zaburzenie komunikacji poprzez połączenia szczelinowe (GJIC) jest szeroko wykorzystywane jako biomarker do identyfikacji związków toksycznych na niegenotoksycznym, epigenetycznym poziomie kontroli genów, które wywołują niekorzystne skutki zdrowotne14. Na przykład wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA) są powszechnymi zanieczyszczeniami środowiska, jednak ich toksyczność epigenetyczna różni się w zależności od ich struktury molekularnej15. W wielu zróżnicowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Test SL-DT jest prostą i wszechstronną techniką pomiaru GJIC, ale istnieje kilka krytycznych problemów, które należy wziąć pod uwagę przy projektowaniu odpowiednich protokołów eksperymentalnych. Aby uzyskać solidne pomiary GJIC przy użyciu testu SL-DT, musi istnieć dobre rozprzestrzenianie się barwnika LY przez połączenia szczelinowe komórek. Jako minimum należy wybrać odpowiedni czas, aby zapewnić, że barwnik rozprzestrzeni się przez osiem lub więcej rzędów komórek z komórek obciążonych skalpelem w obu kierunkach. Ponad...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Wspierane przez granty NIEHS #R01 ES013268-01A2, a treść jest wyłączną odpowiedzialnością autora i niekoniecznie reprezentuje oficjalne poglądy NIEHS, i wspierane przez CETOCOEN UPgrade project No. CZ.1.05/2.1.00/19.0382.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
WB-F344 komórki nabłonkowe wątroby szczuraOd dr J. W. Grishama i MS Tsao z Uniwersytetu Karoliny Północnej (Chapel Hill, NC)brakDostarczone przez dr J. W. Grishama i MS Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC
Płytki hodowlane 35 mmCorning430165
25 cm2 kolby hodowlaneCorning430639
Kolby hodowlane 75 cm2Corning430641
D-medium, pożywka modyfikowana przez Eagles ThermoFisher/GIBCO Wzór nr 78-5470EF
płodowa surowica bydlęcaThermoFisher/GIBCO 10437
0,25% trypsyna-EDTA ThermoFisher/GIBCO 15050
sól fizjologiczna buforowana fosforanamidomowej robotypatrz poniżej dla składnika cat#137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4
KClJT Baker - Mallinckrodt 3040-01
NaClJT Baker - Mallinckrodt 3624-05
Na2HPO4JT Baker - Mallinckrodt 3819--01
KH2PO4JT Baker - Mallinckrodt 3246-01
Lucyfer Żółty CH, sól litowaSigma-Aldrich ChemicalL0259
rodamina-dekstranSigma-Aldrich ChemicalR9379
1-metyloantracenSigma-Aldrich Chemical
fenantrenSigma-Aldrich ChemicalP11409
resweratrolSigma-Aldrich ChemicalR5010
D609Tocris Bioscience 1437
acetonitrylEMDAX0145-1
37% roztwór formaldehyduJT Baker - Mallinckrodt 2106-01
#20 ostrze chirurgiczneFine Science Tools Inc. 10317-14
50 ml stożkowe sterylne probówkiThermo scientific 
Mikroskop epifluorescencyjny firmy Nikon Nikon -Mager ScientificEclipse TE300
Nikon FITC dichroiczna kostkaNikon -Mager Scientific96107
Kamera CCDNikon -Mager ScientificNikon Cool Snap EZ
Nikon -Mager ScientificNikon NIS-Elements F2.2.
ImageJNarodowy Instytut Zdrowiahttp://imagej.nih.gov/ij/
339652 System obrazowania CCD

Bibliografia

  1. Rotroff, D. M., et al. Predictive endocrine testing in the 21st century using in vitro assays of estrogen receptor signaling responses. Environ.Sci.Technol. 48 (15), 8706-8716 (2014).
  2. Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Managing the complexity of communication: regulation of gap junctions by post-translational modification. Front Pharmacol. 4, 130(2013).
  3. Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Compr.Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).
  4. Sovadinova, I., et al. Phosphatidylcholine specific PLC-induced dysregulation of gap junctions, a robust cellular response to environmental toxicants, and prevention by resveratrol in a rat liver cell model. PLoS.One. 10 (5), e0124454(2015).
  5. Trosko, J. E., Chang, C. C. Biologically Based Methods for Cancer Risk Assessment. Travis, C. C. , Plenum Press. New York. 165-179 (1989).
  6. Trosko, J. E. Biomarkers and occupational health: progess and perspectives. Mendelsohn, M. D., Peeters, J. P., Normandy, M. J. , John Henry Press. Washington D.C. 264-274 (1995).
  7. Upham, B. L. Role of integrative signaling through gap junctions in toxicology. Curr.Protoc.Toxicol. 47, 2.18:2.18.1-2.18:2.18.18 (2011).
  8. Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell.Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
  9. Browne, C. L., Wiley, H. S., Dumont, J. N. Oocyte-follicle cell gap junctions in Xenopus laevis and the effects of gonadotropin on their permeability. Science. 203 (4376), 182-183 (1979).
  10. El-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer. A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp.Cell Res. 168 (2), 422-430 (1987).
  11. Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. A fluorescence photobleaching assay of gap junction-mediated communication between human cells. Science. 232 (4749), 525-528 (1986).
  12. Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environ. Health Perspect. 117 (4), 545-551 (2009).
  13. Paraffin Processing of Tissue. Protoplasma. , http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue (2012).
  14. Trosko, J. E. Gap junctional intercellular communication as a biological "Rosetta stone" in understanding, in a systems biological manner, stem cell behavior, mechanisms of epigenetic toxicology, chemoprevention and chemotherapy. J. Membr. Biol. 218 (1-3), 93-100 (2007).
  15. Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated gap junctional intercellular communication as a biomarker of PAH epigenetic toxicity: structure-function relationship. Environ.Health Perspect. 106, 975-981 (1998).
  16. Upham, B. L., et al. Tumor promoting properties of a cigarette smoke prevalent polycyclic aromatic hydrocarbon as indicated by the inhibition of gap junctional intercellular communication via phosphatidylcholine-specific phospholipase. C. Cancer Sci. 99 (4), 696-705 (2008).
  17. Sai, K., Kanno, J., Hasegawa, R., Trosko, J. E., Inoue, T. Prevention of the down-regulation of gap junctional intercellular communication by green tea in the liver of mice fed pentachlorophenol. Carcinogenesis. 21 (9), 1671-1676 (2000).
  18. Upham, B. L., Deocampo, N. D., Wurl, B., Trosko, J. E. Inhibition of gap junctional intercellular communication by perfluorinated fatty acids is dependent on the chain length of the fluorinated tail. Int. J. Cancer. 78 (4), 491-495 (1998).
  19. Trosko, J. E., Tai, M. H. Infections and inflammation: Impacts on oncogenesis. Impacts on Oncogenesis. Contrib Microbiol. Dittmar, T., Zaenkar, K. S., Schmidt, A. , Karger. Basel. 45-65 (2006).
  20. Trosko, J. E. Human stem cells as targets for the aging and diseases of aging processes. Med. Hypotheses. 60 (3), 439-447 (2003).
  21. JE, T. rosko Stem Cells and Cancer. Dittmar, T., Zaenkar, K. , Nova Publishers. New York. 147-188 (2008).
  22. Osgood, R. S., et al. Polycyclic aromatic hydrocarbon-induced signaling events relevant to inflammation and tumorigenesis in lung cells are dependent on molecular structure. PLoS. One. 8 (6), e65150(2014).
  23. Weis, L. M., Rummel, A. M., Masten, S. J., Trosko, J. E., Upham, B. L. Bay or baylike regions of polycyclic aromatic hydrocarbons were potent inhibitors of gap junctional intercellular communication. Environ.Health Perspect. 106 (1), 17-22 (1998).
  24. Yotti, L. P., Chang, C. C., Trosko, J. E. Elimination of metabolic cooperation in Chinese hamster cells by a tumor promoter. Science. 206 (4422), 1089-1091 (1979).
  25. Zhao, Y., et al. New caged coumarin fluorophores with extraordinary uncaging cross sections suitable for biological imaging applications. J. Am. Chem. Soc. 126 (14), 4653-4663 (2004).
  26. Goldberg, G. S., Bechberger, J. F., Naus, C. C. A pre-loading method of evaluating gap junctional communication by fluorescent dye transfer. Biotechniques. 18 (3), 490-497 (1995).
  27. Ziambaras, K., Lecanda, F., Steinberg, T. H., Civitelli, R. Cyclic stretch enhances gap junctional communication between osteoblastic cells. J.Bone Miner.Res. 13 (2), 218-228 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przenoszenie barwnika fluorescencyjnego metod skalpelaprzenoszenie barwnika Lucifer Yellowmikroskopia epifluorescencyjnatest toksyczno ci fenantrenuzaburzenia b ony kom rkowejanaliza migracji barwnikaocena wp ywu toksykant wtoksykologia in vitrotest funkcjonalnego biomarkera

Powiązane artykuły