Artykuł metodologiczny

Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym: funkcjonalny biomarker do oceny niekorzystnych skutków toksyn i toksyn oraz korzyści zdrowotnych produktów naturalnych

DOI:

10.3791/54281

⸱

25 grudnia 2016

 ,  , 
1Department of Pediatrics & Human Development, Institute for Integrative Toxicology, Michigan State University, 2RECETOX — Research Centre for Toxic Compounds in the Environment, Faculty of Science, Masaryk University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje technikę przenoszenia barwnika metodą skalpela i fluorescencyjnego, która mierzy komunikację międzykomórkową poprzez kanały połączeń szczelinowych. Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym jest głównym procesem komórkowym, w którym utrzymywana jest homeostaza tkanek, a zakłócenie tej sygnalizacji komórkowej ma niekorzystne skutki zdrowotne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje technikę transferu barwnika fluorescencyjnego (SL-DT) za pomocą skalpela, która mierzy komunikację międzykomórkową poprzez kanały połączeń szczelinowych, co jest głównym procesem międzykomórkowym, dzięki któremu utrzymywana jest homeostaza tkanek. Przerwanie komunikacji międzykomórkowej (GJIC) przez toksyny, toksyny, leki itp. wiąże się z licznymi niekorzystnymi skutkami zdrowotnymi. Wiele chorób genetycznych u ludzi jest powiązanych z mutacjami w genach połączeń szczelinowych. Technika SL-DT jest prostym testem funkcjonalnym do jednoczesnej oceny GJIC w dużej populacji komórek. Test polega na wstępnym załadowaniu komórek barwnikiem fluorescencyjnym poprzez krótkie zakłócenie błony komórkowej ostrzem skalpela przez populację komórek. Barwnik fluorescencyjny może następnie przechodzić przez kanały połączeń szczelinowych do sąsiednich komórek przez określony czas. Test jest następnie przerywany przez dodanie formaliny do komórek. Rozprzestrzenianie się barwnika fluorescencyjnego w populacji komórek ocenia się za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego, a obrazy są analizowane za pomocą dowolnej liczby dostępnych pakietów oprogramowania morfometrycznego, w tym pakietów bezpłatnego oprogramowania znalezionych w domenie publicznej. Test ten został również przystosowany do badań in vivo z wykorzystaniem wycinków tkanek z różnych narządów leczonych zwierząt. Ogólnie rzecz biorąc, test SL-DT może zaspokoić szeroki zakres potrzeb farmakologicznych i toksykologicznych in vitro i może być potencjalnie dostosowany do wysokowydajnych systemów konfiguracyjnych z automatycznym obrazowaniem i analizą mikroskopii fluorescencyjnej w celu wyjaśnienia większej liczby próbek w krótszym czasie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólnym celem tej metody jest dostarczenie prostej, wszechstronnej i stosunkowo taniej techniki oceny potencjalnej toksyczności związków. Jest to podejście in vitro, które można zastosować w wielu liniach komórkowych. Standardowe laboratoria biologii komórki wyposażone w mikroskopy epifluorescencyjne mogą prowadzić badania przy użyciu tego testu.

Nasza podstawowa wiedza na temat funkcji komórek była w dużym stopniu zależna od testów biologicznych in vitro i stała się niezbędnym składnikiem w ocenach toksykologicznych farmaceutyków, zanieczyszczeń środowiska i zanieczyszczeń żywności. Niestety, nie ma jednego systemu testów biologicznych in vitro, który byłby w stanie kompleksowo spełnić wymagania dotyczące wszystkich ocen toksykologicznych. Wiele testów in vitro jest zaprojektowanych i zoptymalizowanych pod kątem oceny, a także oceny określonego biochemicznego lub molekularnego punktu końcowego. Są one dość często łączone w konfigurację o wysokiej przepustowości, aby odzwierciedlić zaburzenie pewnego szlaku transdukcji sygnału, takiego jak sygnalizacja receptora estrogenowego1. Strategia ta okazała się całkiem skuteczna, ale ogromna liczba szlaków transdukcji sygnału zaangażowanych w ekspresję genów sprawia, że zadanie wyboru konkretnego szlaku sygnałowego do oceny jest dość złożone. Obecnie opracowywane są protokoły o wysokiej przepustowości, które są wykorzystywane do jednoczesnego pomiaru wielu ścieżek sygnałowych, co jest jednym z podejść do przezwyciężenia niektórych ograniczeń pojedynczych testów. Jednak nie wszystkie szlaki sygnałowe zostały z powodzeniem włączone do bardziej kompleksowych podejść, a ponadto stale odkrywane są nowe szlaki sygnałowe, co jeszcze bardziej komplikuje ten proces oceny. Stosowanie dużej liczby podejść in vitro, w szczególności systemów o wysokiej przepustowości, do kompleksowych ocen toksykologicznych jest również bardzo kosztowne i nie sprzyja większości projektów badawczych prowadzonych przez jednego badacza.

GJIC to proces ściśle kontrolowany przez zmiany napięcia, stężenia wapnia, pH, równowagi redoks, regulowany przez główne wewnątrzkomórkowe szlaki transdukcji sygnału i interakcje z białkami błony i cytoszkieletu2,3. Tak więc hamowanie GJIC może odzwierciedlać różne rodzaje stresu komórkowego, zakłócenia różnych funkcji komórkowych lub zaburzenia różnych szlaków transdukcji sygnału. Innym podejściem do przezwyciężenia stosowania ograniczonych testów biologicznych transdukcji sygnału jest wykorzystanie zjawisk biologicznych polegających na tym, że wiele, jeśli nie większość, szlaków transdukcji sygnału jest dalej modulowanych przez współpracujące systemy sygnalizacji międzykomórkowej przez kanały połączeń szczelinowych4-8. Chociaż międzykomórkowe systemy sygnalizacyjne są również liczne i podlegają kontroli wielu ścieżek, sygnalizacja międzykomórkowa przez kanały połączeń szczelinowych jest ostatecznie funkcją kanałów, które są otwierane, częściowo zamknięte lub całkowicie zamknięte. Zapewnia to punkt końcowy, który można łatwo zmierzyć za pomocą różnych systemów testów biologicznych in vitro 7. Biorąc pod uwagę, że homeostatyczna wartość zadana tkanki wymaga otwartych kanałów, określenie wpływu związków na komunikację międzykomórkową w szczelinie (GJIC) jest bardziej kompleksowym podejściem do określania potencjalnych skutków toksycznych związków4,8. W istocie, to krytyczne zjawisko biologiczne, które odgrywa kluczową rolę w koordynowaniu wielu zdarzeń transdukcji sygnału kontrolujących ekspresję genów, pozwala na szeroką ocenę skutków toksycznych. W związku z tym testy biologiczne, które oceniają GJIC, są doskonałym punktem wyjścia do oceny potencjału toksycznego związków.

Najbardziej rozbudowane techniki używane do oceny GJIC opierają się na wstępnym załadowaniu komórek sondą fluorescencyjną, a następnie monitorowaniu migracji barwnika z załadowanej komórki lub komórek do sąsiednich komórek. Techniki wstępnego ładowania barwnika obejmowały mikroiniekcję9, ładowanie skrobanie10 i estry metylowe sond11. Metoda obciążenia skalpelem i fluorescencyjnego transferu barwnika (SL-DT) jest modyfikacją testu obciążenia skrobaniem - transferu barwnika opracowanego przez El Fouly10. Zamiast bardziej inwazyjnego skrobania, metoda ładowania skalpelem opisana w tym raporcie polega na delikatnym przetaczaniu skalpela z okrągłym ostrzem przez monowarstwę komórek, które minimalizują uszkodzenia inwazyjne (ryc. 1). Zaletą tej techniki jest ocena toksykologiczna populacji komórek, a nie pojedynczych komórek w teście mikroiniekcji. Co więcej, prostota tego testu pozwala na szybkie wykrycie wielu płytek w krótkim czasie, podczas gdy metody wykorzystujące techniki mikroiniekcji oraz techniki wykorzystujące estry metylowe sond fluorescencyjnych są znacznie bardziej czasochłonne i wymagają znacznie wyższego poziomu umiejętności.

Chociaż nie ma jednej metody na zaspokojenie wszystkich potrzeb badania GJIC; test SL-DT jest prostym, dość tanim i wszechstronnym testem, który może zaspokoić wiele potrzeb związanych z początkową oceną toksyczności różnych związków. Do głównych zalet należą: prostota, brak specjalnego zapotrzebowania na sprzęt lub umiejętności, które są wymagane przy innych metodach, takich jak mikroiniekcja, odzyskiwanie fluorescencyjne po fotowybielaniu (FRAP) i lokalna aktywacja molekularnych testów fluorescencyjnych, szybka i jednoczesna ocena GJIC w dużej liczbie komórek, sprzyjająca konfiguracji o wysokiej przepustowości z automatycznym obrazowaniem i analizą mikroskopii fluorescencyjnej, a także jego zdolność adaptacji do badań in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół tego badania został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Utylizacji Narodowego Instytutu Nauk o Zdrowiu w Japonii, gdzie przeprowadzono eksperymenty in vivo, aby zapewnić, że szczury były traktowane humanitarnie i z poszanowaniem łagodzenia cierpienia.

1. Test biologiczny SL-DT

  1. Wysiew 3 x 105 WB-F344 komórek nabłonka wątroby szczura na płytkach hodowlanych o średnicy 35 mm zawierających zmodyfikowaną pożywkę Eagles plus 5% płodowej surowicy bydlęcej i hodowlę komórek w inkubatorze w temperaturze 37 ºC, 100% wilgotności względnej (RH), 5% CO2 .
  2. Hoduj komórki, aż osiągną 100% zbieżności (zwykle 2 dni) i przeprowadź pożądane eksperymentalne leczenie komórek, jak opisano poniżej.
    1. Przeprowadzanie eksperymentów z odpowiedzią na dawkę
      1. Dodać 10 μl i 20 μl 20 mM roztworu podstawowego fenantrenu w 100 % acetonitrylu oraz 4 μl, 6 μl i 8 μl 20 mM roztworu podstawowego fenantrenu w 100 % acetonitrylu do trzech płytek komórek zawierających 2 ml pożywki wzrostowej na każdą dodaną objętość roztworu podstawowego.
      2. Dodać 4 μl, 6 μl, 8 μl, 10 μl i 20 μl 100% roztworu acetonitrylu do trzech płytek komórek zawierających 2 ml pożywki wzrostowej na każdą dodaną objętość roztworu acetonitrylu, który ma służyć jako kontrola nośnika.
      3. Inkubować płytki przez 15 minut w inkubatorze ustawionym na 37 °C, 100% wilgotności względnej i 5% CO2 .
      4. Przejdź do kroku 1.3.
    2. Przeprowadzanie eksperymentów z reakcją czasową
      1. Dodać 7 μl 20 mM roztworu podstawowego fenantrenu w 100% acetonitrylu do trzech płytek komórek zawierających 2 ml pożywki wzrostowej na każdy punkt czasowy (tj. 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 min).
      2. Dodać 7 μl 100% acetonitrylu do trzech płytek z komórkami zawierającymi 2 ml pożywki wzrostowej dla każdego punktu czasowego, który ma służyć jako kontrola nośnika.
      3. Inkubować płytki dla każdego wyznaczonego punktu czasowego w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 100% wilgotności względnej i 5% CO2 .
      4. Przejdź do kroku 1.3.
    3. Przeprowadzanie eksperymentów z odzyskiwaniem czasu
      1. Dodać 7 μl 20 mM roztworu podstawowego fenantrenu w 100% acetonitrylu do trzech płytek komórek zawierających 2 ml pożywki wzrostowej przez 15 minut.
      2. Dodać 7 μl 100% acetonitrylu do trzech płytek komórek zawierających 2 ml pożywki wzrostowej przez 15 minut, aby służyły jako kontrola nośnika.
      3. Zdekantować pożywkę zawierającą fenantren lub acetonitryl i przepłukać po 3 razy po 3 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
      4. Dodać 2 ml świeżej pożywki wzrostowej do każdej płytki i inkubować przez żądany czas regeneracji (tj. 25, 35, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360 min) w inkubatorze w temperaturze 37 °C, wilgotności względnej 100% i 5%CO2.
      5. Przejdź do kroku 1.3.
    4. Przeprowadzanie eksperymentów z mechanizmami
      1. Dodać inhibitor transdukcji sygnału, tj. 5 μl 20 mM roztworu podstawowego D609 w 100% acetonitrylu do trzech płytek komórek zawierających 2 ml pożywki wzrostowej przez 15 minut.
      2. Dodać 5 μl 100% acetonitrylu do trzech płytek komórek zawierających 2 ml pożywki wzrostowej przez 15 minut, aby służyły jako kontrola nośnika.
      3. Dodać 7 μl 20 mM roztworu podstawowego fenantrenu w 100% acetonitrylu do trzech płytek komórek zawierających 2 ml pożywki wzrostowej plus D609 przez dodatkowe 15 minut.
      4. Dodać 7 μl 100% acetonitrylu do trzech płytek komórek zawierających 2 ml pożywki wzrostowej plus 100% acetonitrylu przez dodatkowe 15 minut, aby służyły jako kontrola nośnika.
      5. Przejdź do kroku 1.3.
  3. Wyrzucić pożywkę hodowlaną, delikatnie wylewając pożywkę lub odsysając próżniowo.
    Uwaga: Pożywkę hodowlaną zawierającą odpady niebezpieczne należy odpowiednio zutylizować.
  4. Przepłukać komórki trzykrotnie po 3 ml PBS i albo zdekantować, albo odessać między płukaniami.
  5. Odpipetować 1 ml 1 mg/ml żółtego barwnika Lucyfera rozpuszczonego w PBS (LY) do każdej płytki komórkowej.
  6. Wstępnie załaduj barwnik do komórek, delikatnie tocząc ostrze ze stali chirurgicznej #20 z zaokrągloną krawędzią przez populację komórek w trzech różnych obszarach płytki.
    1. Zacznij od umieszczenia skalpela prostopadle (kąt 90°) i 5 mm od krawędzi płytki hodowlanej, a następnie przetocz skalpel z tego prostopadłego kąta do około 15° (patrz rysunek 1).
      Uwaga: Osiąga się to poprzez ściśnięcie skalpela między palcem wskazującym a kciukiem. Użyj grawitacji, aby skalpel delikatnie przesunął się z pozycji 90° do 15° (gdy zaokrąglone ostrze po prostu toczy się po komórkach). Ten ruch pozostawi wizualnie zauważalną linię wcięcia.
  7. Inkubować komórki z roztworem LY przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  8. Zdekantować lub odessać LY i przepłukać trzykrotnie 3 ml PBS w celu usunięcia całego barwnika zewnątrzkomórkowego w celu wyeliminowania zewnątrzkomórkowej fluorescencji tła.
  9. Dodać 0,5 ml 10% buforowanego fosforanem roztworu formaliny, aby utrwalić komórki.
    Uwaga: Po utrwaleniu w formalinie wysuszyć komórki na powietrzu i przechowywać w ciemności przez okres do dwóch lat przy minimalnym fotowybielaniu barwnika LY. W razie potrzeby nawodnij się 10% roztworem formaliny, aby uwidocznić fluorescencyjny front barwnika.
  10. Obejrzyj stałe komórki za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w sześcian dichroiczny dla pików wzbudzenia/emisji 428/536 nm przy powiększeniu 200X. Ustaw wszystkie płytki tak, aby linia wcięcia była równoległa do poziomego pola widzenia.
    Uwaga: Dobrze sprawdza się kostka dichroiczna FITC.
    1. Przechwyć obraz za pomocą kamery CCD i oprogramowania pomocniczego.
      1. Otwórz oprogramowanie pomocnicze dla kamery CCD i użyj ustawień automatycznej ekspozycji. Użyj przycisku "przechwytywanie", aby cyfrowo uzyskać obraz. Zapisz obraz jako .tif plików za pomocą przycisku "Zapisz".

2. Adaptacja testu SL-DT do tkanki wątroby

  1. Usuń około 2 x 2 cm plasterek z lewego płata wątroby od 5-tygodniowego samca szczura Fischer 344 za pomocą nożyczek preparacyjnych i umieść go na plastikowej szalce przykrytej mokrą gazą12.
  2. Odpipetować 0,5 ml roztworu PBS zawierającego po 1 mg/ml żółcieni lucyferowej i rodaminy-dekstranu (RD) na powierzchnię wycinka wątroby na plastikowej płytce wagowej.
    Uwaga: RD to barwnik, który nie może przechodzić przez kanały połączeń szczelinowych i oznacza załadowane komórki.
  3. Wykonaj ostre ostrze od trzech do pięciu nacięć o długości około 1 cm na powierzchni wycinka wątroby, w którym znajduje się roztwór barwnika na szalce wagowej, a następnie dodaj dodatkowy barwnik wystarczający do wypełnienia nacięć.
  4. Inkubować tkankę przez 3 minuty w temperaturze pokojowej na plastikowej płytce wagowej.
  5. Spłukać trzykrotnie 5 ml PBS.
  6. Utrwal tkankę na noc w 30 ml 10% buforowanej fosforanem formaliny w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml w ciemności w temperaturze pokojowej.
  7. Następnego dnia umyj plastry wodą, przytnij tkankę wokół nacięcia nożyczkami do preparowania napaski 1 x 1 x 0,5 cm 3, a następnie użyj standardowych technik, aby zatopić plastry w parafinie13.
  8. Plastry należy podzielić prostopadle do linii nacięcia na grubość 5 μm i przechowywać próbki w ciemności do czasu, gdy będą gotowe do zobrazowania przy użyciu standardowych technik cięcia za pomocą mikrotomu13.
  9. Użyj mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w kamerę cyfrową CCD, aby zobrazować i uchwycić obrazy fluorescencyjnych frontów barwnika zgodnie z sekcją 1.107.

3. Kwantyfikacja GJIC

  1. Zmierz rozprzestrzenianie się barwnika fluorescencyjnego za pomocą pakietu oprogramowania morfometrycznego (np. ImageJ).
    1. Kliknij kartę "Plik", a następnie kliknij "otwórz", aby otworzyć zapisany obraz.
    2. Kliknij "Narzędzie wolnej ręki" w zakładce paska narzędzi, aby prześledzić kontur przodu barwnika.
    3. Kliknij kartę "Analizuj", a następnie kliknij "Zmierz".
      Uwaga: Spowoduje to wygenerowanie wartości obszaru w arkuszu kalkulacyjnym, którą w razie potrzeby można skopiować do innych programów do obsługi arkuszy kalkulacyjnych.
  2. Korzystając z arkusza kalkulacyjnego, oblicz frakcję kontrolną (FOC), dzieląc powierzchnię rozprowadzania barwnika na płytce doświadczalnej przez obszar, który barwnik przebył na płytce kontrolnej, używając następującego równania:
    figure-protocol-1
    Ae = obszar rozprzestrzeniania się barwnika w komórkach narażonych na zmienną doświadczalną, taką jak komórki potraktowane substancją chemiczną w określonej dawce lub czasie
    Ac = obszar barwnika rozprzestrzenionego w grupie kontrolnej, którą są komórki poddane działaniu nośnika używanego do rozpuszczenia substancji chemicznej będącej przedmiotem zainteresowania
    Uwaga: W celu określenia wpływu nośnika, Ae byłoby obszarem rozprzestrzeniania się barwnika w komórkach poddanych działaniu nośnika, a Ac byłoby obszarem rozprzestrzeniania się barwnika w komórkach niepoddanych działaniu nośnika. Efekt działania pojazdu powinien być mniejszy niż 10%.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przerwanie GJIC było szeroko stosowane jako biomarker do identyfikacji toksycznych związków na niegenotoksycznym, epigenetycznym poziomie kontroli genów, które wywołują niekorzystne skutki zdrowotne14. Na przykład wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA) są wszechobecnymi zanieczyszczeniami środowiska, ale różnią się toksycznością epigenetyczną w zależności od ich struktury molekularnej15. WWA o niższej masie cząsteczkowej występują zazwyczaj w stosunkowo wyż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test SL-DT jest prostą i wszechstronną techniką pomiaru GJIC, ale istnieje kilka krytycznych problemów, które należy wziąć pod uwagę przy projektowaniu odpowiednich protokołów eksperymentalnych. Aby uzyskać solidne pomiary GJIC przy użyciu testu SL-DT, musi istnieć dobre rozprzestrzenianie się barwnika LY przez połączenia szczelinowe komórek. Jako minimum należy wybrać odpowiedni czas, aby zapewnić, że barwnik rozprzestrzeni się przez osiem lub więcej rzędów komórek z komórek obciążonych skalpelem w obu kierunkach. Ponad...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wspierane przez granty NIEHS #R01 ES013268-01A2, a treść jest wyłączną odpowiedzialnością autora i niekoniecznie reprezentuje oficjalne poglądy NIEHS, i wspierane przez CETOCOEN UPgrade project No. CZ.1.05/2.1.00/19.0382.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
WB-F344 komórki nabłonkowe wątroby szczuraOd dr J. W. Grishama i MS Tsao z Uniwersytetu Karoliny Północnej (Chapel Hill, NC)brakDostarczone przez dr J. W. Grishama i MS Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC
Płytki hodowlane 35 mmCorning430165
25 cm2 kolby hodowlaneCorning430639
Kolby hodowlane 75 cm2Corning430641
D-medium, pożywka modyfikowana przez Eagles ThermoFisher/GIBCO Wzór nr 78-5470EF
płodowa surowica bydlęcaThermoFisher/GIBCO 10437
0,25% trypsyna-EDTA ThermoFisher/GIBCO 15050
sól fizjologiczna buforowana fosforanamidomowej robotypatrz poniżej dla składnika cat#137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4
KClJT Baker - Mallinckrodt 3040-01
NaClJT Baker - Mallinckrodt 3624-05
Na2HPO4JT Baker - Mallinckrodt 3819--01
KH2PO4JT Baker - Mallinckrodt 3246-01
Lucyfer Żółty CH, sól litowaSigma-Aldrich ChemicalL0259
rodamina-dekstranSigma-Aldrich ChemicalR9379
1-metyloantracenSigma-Aldrich Chemical
fenantrenSigma-Aldrich ChemicalP11409
resweratrolSigma-Aldrich ChemicalR5010
D609Tocris Bioscience 1437
acetonitrylEMDAX0145-1
37% roztwór formaldehyduJT Baker - Mallinckrodt 2106-01
#20 ostrze chirurgiczneFine Science Tools Inc. 10317-14
50 ml stożkowe sterylne probówkiThermo scientific 
Mikroskop epifluorescencyjny firmy Nikon Nikon -Mager ScientificEclipse TE300
Nikon FITC dichroiczna kostkaNikon -Mager Scientific96107
Kamera CCDNikon -Mager ScientificNikon Cool Snap EZ
Nikon -Mager ScientificNikon NIS-Elements F2.2.
ImageJNarodowy Instytut Zdrowiahttp://imagej.nih.gov/ij/
339652 System obrazowania CCD

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rotroff, D. M., et al. Predictive endocrine testing in the 21st century using in vitro assays of estrogen receptor signaling responses. Environ.Sci.Technol. 48 (15), 8706-8716 (2014).
  2. Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Managing the complexity of communication: regulation of gap junctions by post-translational modification. Front Pharmacol. 4, 130(2013).
  3. Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Compr.Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).
  4. Sovadinova, I., et al. Phosphatidylcholine specific PLC-induced dysregulation of gap junctions, a robust cellular response to environmental toxicants, and prevention by resveratrol in a rat liver cell model. PLoS.One. 10 (5), e0124454(2015).
  5. Trosko, J. E., Chang, C. C. Biologically Based Methods for Cancer Risk Assessment. Travis, C. C. , Plenum Press. New York. 165-179 (1989).
  6. Trosko, J. E. Biomarkers and occupational health: progess and perspectives. Mendelsohn, M. D., Peeters, J. P., Normandy, M. J. , John Henry Press. Washington D.C. 264-274 (1995).
  7. Upham, B. L. Role of integrative signaling through gap junctions in toxicology. Curr.Protoc.Toxicol. 47, 2.18:2.18.1-2.18:2.18.18 (2011).
  8. Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell.Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
  9. Browne, C. L., Wiley, H. S., Dumont, J. N. Oocyte-follicle cell gap junctions in Xenopus laevis and the effects of gonadotropin on their permeability. Science. 203 (4376), 182-183 (1979).
  10. El-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer. A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp.Cell Res. 168 (2), 422-430 (1987).
  11. Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. A fluorescence photobleaching assay of gap junction-mediated communication between human cells. Science. 232 (4749), 525-528 (1986).
  12. Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environ. Health Perspect. 117 (4), 545-551 (2009).
  13. Paraffin Processing of Tissue. Protoplasma. , http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue (2012).
  14. Trosko, J. E. Gap junctional intercellular communication as a biological "Rosetta stone" in understanding, in a systems biological manner, stem cell behavior, mechanisms of epigenetic toxicology, chemoprevention and chemotherapy. J. Membr. Biol. 218 (1-3), 93-100 (2007).
  15. Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated gap junctional intercellular communication as a biomarker of PAH epigenetic toxicity: structure-function relationship. Environ.Health Perspect. 106, 975-981 (1998).
  16. Upham, B. L., et al. Tumor promoting properties of a cigarette smoke prevalent polycyclic aromatic hydrocarbon as indicated by the inhibition of gap junctional intercellular communication via phosphatidylcholine-specific phospholipase. C. Cancer Sci. 99 (4), 696-705 (2008).
  17. Sai, K., Kanno, J., Hasegawa, R., Trosko, J. E., Inoue, T. Prevention of the down-regulation of gap junctional intercellular communication by green tea in the liver of mice fed pentachlorophenol. Carcinogenesis. 21 (9), 1671-1676 (2000).
  18. Upham, B. L., Deocampo, N. D., Wurl, B., Trosko, J. E. Inhibition of gap junctional intercellular communication by perfluorinated fatty acids is dependent on the chain length of the fluorinated tail. Int. J. Cancer. 78 (4), 491-495 (1998).
  19. Trosko, J. E., Tai, M. H. Infections and inflammation: Impacts on oncogenesis. Impacts on Oncogenesis. Contrib Microbiol. Dittmar, T., Zaenkar, K. S., Schmidt, A. , Karger. Basel. 45-65 (2006).
  20. Trosko, J. E. Human stem cells as targets for the aging and diseases of aging processes. Med. Hypotheses. 60 (3), 439-447 (2003).
  21. JE, T. rosko Stem Cells and Cancer. Dittmar, T., Zaenkar, K. , Nova Publishers. New York. 147-188 (2008).
  22. Osgood, R. S., et al. Polycyclic aromatic hydrocarbon-induced signaling events relevant to inflammation and tumorigenesis in lung cells are dependent on molecular structure. PLoS. One. 8 (6), e65150(2014).
  23. Weis, L. M., Rummel, A. M., Masten, S. J., Trosko, J. E., Upham, B. L. Bay or baylike regions of polycyclic aromatic hydrocarbons were potent inhibitors of gap junctional intercellular communication. Environ.Health Perspect. 106 (1), 17-22 (1998).
  24. Yotti, L. P., Chang, C. C., Trosko, J. E. Elimination of metabolic cooperation in Chinese hamster cells by a tumor promoter. Science. 206 (4422), 1089-1091 (1979).
  25. Zhao, Y., et al. New caged coumarin fluorophores with extraordinary uncaging cross sections suitable for biological imaging applications. J. Am. Chem. Soc. 126 (14), 4653-4663 (2004).
  26. Goldberg, G. S., Bechberger, J. F., Naus, C. C. A pre-loading method of evaluating gap junctional communication by fluorescent dye transfer. Biotechniques. 18 (3), 490-497 (1995).
  27. Ziambaras, K., Lecanda, F., Steinberg, T. H., Civitelli, R. Cyclic stretch enhances gap junctional communication between osteoblastic cells. J.Bone Miner.Res. 13 (2), 218-228 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Scalpel Loading Fluorescent Dye TransferLucifer Yellow Dye TransferEpifluorescence MicroscopyPhenanthrene Toxicity AssayCell Membrane PerturbationDye Migration AnalysisToxicant Effects AssessmentIn Vitro ToxicologyFunctional Biomarker Assay

Powiązane artykuły