Artykuł metodologiczny

Filtracja izolacji kwasów nukleinowych: prosta i szybka metoda ekstrakcji DNA

DOI:

10.3791/54289

⸱

6 sierpnia 2016

 ,  ,  , 
1Center for Innovation in Global Health Technologies (CIGHT), Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 2Pritzker School of Medicine, The University of Chicago

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj prostą i szybką metodę ekstrakcji DNA prowirusa HIV z pełnej krwi, wykrywaną metodą ilościowego PCR. Protokół ten może zostać rozszerzony do wykorzystania w wykrywaniu innych markerów genetycznych lub przy użyciu alternatywnych metod amplifikacji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FINA, filtracja kwasów nukleinowych, to nowatorska metoda ekstrakcji, która wykorzystuje pionową filtrację za pomocą membrany separacyjnej i podkładki absorpcyjnej do ekstrakcji komórkowego DNA z krwi pełnej w czasie krótszym niż 2 minuty. Próbka krwi jest traktowana detergentem, krótko mieszana i nakładana pipetą na membranę separacyjną. Lis przenika do wkładki bibułkowej w wyniku działania kapilarnego, wychwytując genomowe DNA na powierzchni błony separacyjnej. Wyekstrahowane DNA jest zatrzymywane na membranie podczas prostego etapu mycia, w którym inhibitory PCR są wprowadzane do chłonnej wkładki bibułkowej. Błona zawierająca uwięzione DNA jest następnie dodawana do reakcji PCR bez dalszego oczyszczania. Ta prosta metoda nie wymaga sprzętu laboratoryjnego i można ją łatwo wdrożyć za pomocą niedrogich materiałów laboratoryjnych. W tym miejscu opisujemy protokół bardzo czułego wykrywania i ilościowego oznaczania DNA prowirusa HIV-1 ze 100 μl krwi pełnej jako model wczesnej diagnostyki HIV u niemowląt, który można łatwo dostosować do innych celów genetycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kilka raportów omawiało rozwój metod ekstrakcji opartych na papierze lub membranie do stosowania w urządzeniach przyłóżkowych (POC) 1-5 w celu udostępnienia wszystkim wyjątkowej czułości i specyficzności diagnostyki molekularnej. Inicjatywa Diagnostyki Chorób Przenoszonych drogą Płciową Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) ukuła termin ASSURED (Affordable, Sensitive, Specific, User-friendly, Rapid and Robust, Equipment-free and Delivered to those who need) w celu opisania idealnych cech testu POC 6. Spośród tych wytycznych, charakterystyka braku sprzętu jest szczególnie trudna do osiągnięcia w diagnostyce molekularnej. Jednak każda innowacja w tej dziedzinie przyczyni się do osiągnięcia celu, jakim jest dotarcie do osób najbardziej potrzebujących, i istnieje nadzieja na krótkoterminową poprawę wydajności testów poprzez dostosowanie istniejącej technologii 7.

Tutaj opisujemy prosty protokół ekstrakcji DNA z krwi pełnej, który nie wymaga skomplikowanej chemii ani laboratoryjnego oprzyrządowania. Metoda przygotowania próbki FINA (filtracja izolacji kwasów nukleinowych) została pierwotnie opracowana w celu ekstrakcji DNA leukocytów z krwi pełnej w celu wykrycia prowirusa HIV-1 w ramach platformy ilościowej diagnostyki PCR (qPCR) (EID) w miejscu opieki nad pacjentem (POC) do użytku w warunkach ograniczonych zasobów 8-11. Ekstrakcja FINA różni się od konwencjonalnych metod oczyszczania, które wykorzystują membrany krzemionkowe lub cząstki paramagnetyczne pokryte krzemionką do odwracalnego wiązania DNA w obecności czynników chaotropowych 12. Zamiast tego FINA wykorzystuje filtrację pionową przez membranę separacyjną do bezpośredniego wyodrębnienia DNA komórkowego z krwi pełnej. Błonę zawierającą uwięzione DNA można umieścić bezpośrednio w probówce do PCR i albo natychmiast użyć w reakcji PCR, albo wysuszyć na powietrzu w celu późniejszej amplifikacji 9. W ekstrakcji próbki nie stosuje się żadnych środków chaotropowych, fenolu ani alkoholi, co eliminuje rozległe etapy płukania potrzebne do usunięcia silnych inhibitorów qPCR pochodzących z procesu ekstrakcji 13,14.

Membrana FINA może wychwycić zarówno komórki 9, jak i genomowe DNA uwolnione przez lizę komórkową 11 przed dodaniem próbki do membrany. W celu wychwycenia komórek krew pełną dodaje się bezpośrednio do błony. Komórki są następnie poddawane lizie w błonie przez dodanie 10 mM NaOH. Zaletą tej metody jest to, że obejmuje tylko 3 etapy: 1) dodanie próbki; 2) liza / płukanie komórek i 3) umieszczenie dysku filtra w probówce qPCR. Wadą tej metody jest to, że membrana może pomieścić tylko określoną liczbę komórek wprost proporcjonalną do średnicy dysku membrany. Aby osiągnąć granicę wykrywalności wymaganą dla EID, do wprowadzenia próbki potrzeba 100 μl krwi pełnej, co wiąże się z filtrem, który jest zbyt duży, aby można go było umieścić w probówce qPCR. Liza komórek krwi detergentem przed dodaniem próbki do membrany zbiorczej dodaje etap przetwarzania, ale pozwala na użycie mniejszego filtra dla tej samej wielkości próbki. Byliśmy w stanie wykazać wysoką odtwarzalność, wykrywanie pojedynczej kopii i kwantyfikację zaledwie 10 kopii prowirusowego DNA wirusa HIV-1 ze 100 μl krwi przy użyciu tej konfiguracji testowej 11.

W tym raporcie opisujemy protokół FINA jako pierwotnie opracowany do użytku laboratoryjnego. Przekładka membranowo-filtracyjna, znana jako moduł przygotowania próbek FINA, może być przygotowywana w dużych partiach i składowana do późniejszego wykorzystania. Gdy próbki mają zostać pobrane, proces ten trwa 2 minuty i może być wykonywany w partiach o różnej wielkości. qPCR można uruchomić natychmiast lub filtry zawierające osadzone DNA mogą być przechowywane do czasu, gdy będzie to wygodne do wykonania qPCR. Ta metoda jest bardzo wygodna w rutynowej analizie próbek zarówno w warunkach niskich, jak i wysokich zasobów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie etyczne: Próbki krwi pełnej użyte w tym badaniu nie są uważane za badania z udziałem ludzi. Próbki zostały pozyskane do klinicznych celów diagnostycznych, które zostały spełnione, a pozostała część tych próbek została przekazana do testu badawczego FINA. Próbki zostały zakodowane w taki sposób, że badacze nie byli w stanie łatwo ustalić tożsamości osób.

1. Przygotowanie modułu przygotowania próbek FINA

  1. Przygotuj bibułkę, wycinając 35 x 35mm2 ze 100% wacika o grubości 2,6 mm. Wytnij jedną podkładkę na próbkę.
  2. Przygotuj plastikową folię parafinową za pomocą papierowej taśmy podkładowej, wycinając kawałek folii parafinowej (25 mm (wys.) na 50 mm (szer.)), a następnie wybijając otwór o średnicy 7,14 mm w środku taśmy za pomocą dziurkacza wbijanego młotkiem. Przygotuj jedną taśmę na próbkę.
  3. Przygotuj związany dysk szklanej membrany separatora krwi (membrany wychwytującej), przebijając okrąg o średnicy 8,35 mm za pomocą dziurkacza wbijanego młotkiem. Przebij jeden krążek na próbkę. Dysk ma zdolność zatrzymywania cząstek na poziomie 2,3 μm.
  4. Zmontuj moduł przygotowania próbki FINA, umieszczając dysk przechwytujący na środku bibuły za pomocą kleszczy. Umieść taśmę z folii parafinowej na dysku przechwytującym tak, aby otwór taśmy parafinowej pozostawiał odsłonięty środek dysku przechwytującego.
  5. Zapewnij maksymalny kontakt między krążkiem a podkładką bibułkową, lekko rozciągając taśmę parafinową, aby zakryć podkładkę bibułkową i mocno dociskając taśmę parafinową, aby przykleić ją do bibułki wokół wszystkich krawędzi dysku.
  6. Zbuduj tyle modułów, ile potrzeba do eksperymentu lub zgromadź do wykorzystania w przyszłości.

2. Przygotowanie probówki qPCR

  1. Przygotuj krążek taśmy o średnicy 5,1 mm, który zakotwiczy błonę wychwytującą komórki z boku probówki qPCR, aby zapobiec blokowaniu detekcji fluorescencji przez membranę poprzez przebicie koła podwójnie powlekanej poliestrowej taśmy diagnostycznej za pomocą stempla wbijanego młotkiem z arkusza taśmy. Przygotuj jeden krążek taśmowy na próbkę.
  2. Usuń jedną stronę paska ochronnego taśmy klejącej. Umieść taśmę w probówce do PCR o pojemności 200 μl, przyklejając ją z jednej strony i w kierunku dolnej części probówki. Usuń drugi wkładek do naklejek. Tuba jest teraz gotowa do przyjęcia przygotowanego dysku.
  3. Wyprodukuj tyle probówek, ile potrzeba do eksperymentu lub zgromadź zapasy do wykorzystania w przyszłości.

3. Spreparuj próbkę krwi

Uwaga: Jeśli przygotowywana jest oryginalna próbka testowa, przejdź do kroku 4.

  1. Rozmrozić komórki 8e5-LAV 15 zawierające pojedynczą kopię prowirusa HIV-1 uzyskanego z Laboratorium Zapewnienia Jakości Wirusologii (VQA; Rush Presbyterian/St. Luke's Medical Center, Chicago, IL).
    Uwaga: Są one przechowywane w postaci zamrożonych granulek komórkowych w stężeniu 4 000 komórek/μl. Liczba komórek została zweryfikowana zgodnie z wcześniejszym opisem 9.
  2. Przygotować seryjne rozcieńczenia w pożywce zamrażającej (90% płodowa surowica bydlęca, 10% dimetylosulfotlenek) do stężeń w zakresie od 1 do 400 komórek/μl.
  3. Odpipetować 10 μl komórek z każdego z seryjnych rozcieńczeń do probówki mikrowirówkowej. Dodaj 100 μl świeżej próbki krwi pełnej poddanej działaniu HIV-1 z ujemnym wynikiem EDTA do każdej probówki, aby utworzyć standardową krzywą liczby kopii 8e5-LAV 10-4,000. Wymieszaj, delikatnie przesuwając spód tubki 5 razy.

4. Wykonaj ekstrakcję FINA

  1. Lizować krwinki, dodając Triton-X100) do końcowego stężenia 1% (11 μl 10% Triton-X100 do 110 μl pełnej krwi i komórek z kroku 3.3).
  2. Wymieszaj, delikatnie przesuwając spód tubki 5 razy. Krew powinna zmienić kolor na półprzezroczysty czerwony.
  3. Zlosuj całą próbkę krwi na dysk przechwytujący.
    Uwaga: Wodoszczelne uszczelnienie między taśmą parafinową a membraną wychwytującą zapewnia przepływ krwi przez membranę, a dobry kontakt między membraną wychwytującą a zespołem podkładki bibułkowej zapewnia szybkie odprowadzanie próbki.
  4. Pozwól próbce przesiąknąć przez filtr.
    Uwaga: Lizat krwi przenika do podkładki bibułkowej w wyniku działania kapilarnego, wychwytując genomowe DNA na powierzchni dysku wychwytującego. Lisat wsiąkł w dysk, gdy wydaje się matowy.
  5. Dodaj kroplami 600-1,000 μl 10 mM NaOH na dysk przechwytujący.
    Uwaga: Bufor do płukania można również dodać jako dodatek luzem 600 μl. Bufor utworzy kropelkę na hydrofobowej taśmie parafinowej i przeniknie przez otwór do dysku w ciągu około 20 sekund. Filtr zmieni kolor z czerwonego na biały, wskazując na klirens hemoglobiny.
  6. Oddziel krążek od bibułki za pomocą kleszczyków i przyłóż krążek do taśmy w przygotowanej probówce PCR. Jeśli na filtrze pozostał czerwony kolor, dodaj 50-100 μl buforu do płukania, aby wyczyścić filtr przed umieszczeniem w probówce.
    Uwaga: W rzadkich przypadkach nadciśnienie stosowane podczas przygotowywania modułów FINA powoduje podział warstw membrany podczas oddzielania od bibuły. Wyrzuć te krążki i przygotuj nową próbkę.
  7. Po umieszczeniu filtra w probówce do PCR należy od razu przeanalizować próbki. Alternatywnie, wysuszyć przez noc w pudełku zawierającym środek osuszający z siarczanem wapnia, a następnie zakryć i umieścić w foliowej torebce ze środkiem osuszającym krzemionkę i przechowywać do momentu, aż będzie gotowy do analizy.

5. Reakcja qPCR

  1. Przygotować 100 μl głównej mieszaniny qPCR na reakcję, używając starterów i sond specyficznych dla wirusa HIV, jak opisano poprzednio 9,11. Uwzględnij wewnętrzną kontrolę amplifikacji w celu monitorowania obecności inhibitorów amplifikacji i sprawdzenia, czy próbka ujemna jest prawdziwie ujemna. Upewnij się, że filtr jest całkowicie pokryty mieszanką główną i że filtr pozostaje przymocowany do boku rurki przez cały czas trwania reakcji.
  2. Wykonaj amplifikację za pomocą urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym, jak opisano wcześniej 9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proces ekstrakcji prowirusowego DNA z krwi pełnej wzbogaconej komórkami 8e5-LAV pokazano na rysunku 1. Rysunek 2 przedstawia moduł próbki FINA i przygotowaną probówkę qPCR. Metoda ta pozwala na efektywną amplifikację prowirusa HIV-1 z komórek 8e5-LAV przy różnej liczbie kopii, jak pokazano na krzywej standardowej spreparowanych próbek (ryc. 3). PCR miał skuteczność 103%, obliczoną ze Wydajność = -1+10(-1/nachylenie). Równanie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykazano, że EID związane z szybkim dostępem do leczenia zmniejsza śmiertelność niemowląt z powodu zakażenia wirusem HIV 16. Ze względu na utrzymywanie się przeciwciał matczynych we krwi niemowlęcia, szybkie testy na obecność przeciwciał HIV mają ograniczoną użyteczność w określaniu statusu niemowląt narażonych na HIV. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) zaleca, aby wszystkie niemowlęta urodzone przez matki zakażone wirusem HIV-1 były badane w wieku 4-6 tygodni za pomocą testu wirusologicznego. Infor...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten rozwój protokołu był wspierany przez grant Fundacji Billa i Melindy Gatesów Grand Challenges in Global Health 37774. Odczynniki do PCR w czasie rzeczywistym i porady zostały dostarczone przez firmę Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. Komórki 8E5-LAV zostały dostarczone przez Laboratorium Zapewnienia Jakości Wirusologii, Rush Presbyterian; Centrum Medyczne św. Łukasza. Krew z ujemnym wynikiem testu na obecność wirusa HIV-1 została dostarczona przez Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Podziękowania dla Marka Fishera za pomoc fotograficzną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fusion 5GE Healthcare Life Sciences8151-9915
707 bibułaVWR International28298-014
PARAFILM MVWR International52858-000
Podwójnie powlekana poliestrowa taśma diagnostyczna 3M 3M Specjalizacje Medyczne9965
200 &mikro; l Probówki paskowe qPCRNasadki optyczne Agilent401428
Agilent401425
Mx3005p System qPCRAgilent401456
wodorotlenek soduSigma-Aldrich221465A.C.S.
Odczynnik Triton X-100Sigma-AldrichT9284BioXtra
dimetylosulfotlenekSigma-AldrichD8418w dziedzinie biologii molekularnej
płodowa surowica bydlęca, certyfikowana, pochodzenia amerykańskiegoThermo Fisher Scientific16000-044
Dziurkacz do małych otworów z młotkiem o średnicy otworu 3/16" (5,1 mm)McMaster Carr3424A16
Dziurkacz o średnicy 1/4" (7,14 mm) Dziurkacz o średnicy 1/4" (7,14 mm)McMaster Carr3424A19
Dziurkacz o małych otworach z młotkiem o średnicy 5/16" (8,35 mm)McMaster Carr3424A23

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Byrnes, S. A., et al. One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications. Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).
  2. Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. "Paper Machine" for Molecular Diagnostics. Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).
  3. Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami. Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).
  4. Linnes, J. C., et al. Paper-based molecular diagnostic for. RSC Adv. 4 (80), 42245-42251 (2014).
  5. Rodriguez, N. M., et al. Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens. Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).
  6. Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward. Sex Transm Infect. 82, Suppl 5 1-6 (2006).
  7. Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. Diagnostics for the developing world. Nat Rev Microbiol. 2 (3), 231-240 (2004).
  8. Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings. Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).
  9. Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR. J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).
  10. Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. Google Patents. , (2012).
  11. McFall, S. M., et al. A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR. Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).
  12. Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).
  13. Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples. Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).
  14. Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
  15. Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. Google Patents. , (1991).
  16. Violari, A., et al. Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants. N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).
  17. World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2010).
  18. Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried blood spots--preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques. J Vis Exp. (97), (2015).
  19. Maiers, T. J., et al. An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa. S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pr bka krwikapilarnoinhibitory PCRPCR w czasie rzeczywistymprowirus HIV 1wczesna diagnostyka u niemowl tprzygotowanie pr bki

Powiązane artykuły