Filtracja izolacji kwasów nukleinowych: prosta i szybka metoda ekstrakcji DNA

Kilka raportów omawiało rozwój metod ekstrakcji opartych na papierze lub membranie do stosowania w urządzeniach przyłóżkowych (POC) ^1-5 w celu udostępnienia wszystkim wyjątkowej czułości i specyficzności diagnostyki molekularnej. Inicjatywa Diagnostyki Chorób Przenoszonych drogą Płciową Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) ukuła termin ASSURED (Affordable, Sensitive, Specific, User-friendly, Rapid and Robust, Equipment-free and Delivered to those who need) w celu opisania idealnych cech testu POC ⁶. Spośród tych wytycznych, charakterystyka braku sprzętu jest szczególnie trudna do osiągnięcia w diagnostyce molekularnej. Jednak każda innowacja w tej dziedzinie przyczyni się do osiągnięcia celu, jakim jest dotarcie do osób najbardziej potrzebujących, i istnieje nadzieja na krótkoterminową poprawę wydajności testów poprzez dostosowanie istniejącej technologii ⁷.

Tutaj opisujemy prosty protokół ekstrakcji DNA z krwi pełnej, który nie wymaga skomplikowanej chemii ani laboratoryjnego oprzyrządowania. Metoda przygotowania próbki FINA (filtracja izolacji kwasów nukleinowych) została pierwotnie opracowana w celu ekstrakcji DNA leukocytów z krwi pełnej w celu wykrycia prowirusa HIV-1 w ramach platformy ilościowej diagnostyki PCR (qPCR) (EID) w miejscu opieki nad pacjentem (POC) do użytku w warunkach ograniczonych zasobów ^8-11. Ekstrakcja FINA różni się od konwencjonalnych metod oczyszczania, które wykorzystują membrany krzemionkowe lub cząstki paramagnetyczne pokryte krzemionką do odwracalnego wiązania DNA w obecności czynników chaotropowych ¹². Zamiast tego FINA wykorzystuje filtrację pionową przez membranę separacyjną do bezpośredniego wyodrębnienia DNA komórkowego z krwi pełnej. Błonę zawierającą uwięzione DNA można umieścić bezpośrednio w probówce do PCR i albo natychmiast użyć w reakcji PCR, albo wysuszyć na powietrzu w celu późniejszej amplifikacji ⁹. W ekstrakcji próbki nie stosuje się żadnych środków chaotropowych, fenolu ani alkoholi, co eliminuje rozległe etapy płukania potrzebne do usunięcia silnych inhibitorów qPCR pochodzących z procesu ekstrakcji ^13,14.

Membrana FINA może wychwycić zarówno komórki ⁹, jak i genomowe DNA uwolnione przez lizę komórkową ¹¹ przed dodaniem próbki do membrany. W celu wychwycenia komórek krew pełną dodaje się bezpośrednio do błony. Komórki są następnie poddawane lizie w błonie przez dodanie 10 mM NaOH. Zaletą tej metody jest to, że obejmuje tylko 3 etapy: 1) dodanie próbki; 2) liza / płukanie komórek i 3) umieszczenie dysku filtra w probówce qPCR. Wadą tej metody jest to, że membrana może pomieścić tylko określoną liczbę komórek wprost proporcjonalną do średnicy dysku membrany. Aby osiągnąć granicę wykrywalności wymaganą dla EID, do wprowadzenia próbki potrzeba 100 μl krwi pełnej, co wiąże się z filtrem, który jest zbyt duży, aby można go było umieścić w probówce qPCR. Liza komórek krwi detergentem przed dodaniem próbki do membrany zbiorczej dodaje etap przetwarzania, ale pozwala na użycie mniejszego filtra dla tej samej wielkości próbki. Byliśmy w stanie wykazać wysoką odtwarzalność, wykrywanie pojedynczej kopii i kwantyfikację zaledwie 10 kopii prowirusowego DNA wirusa HIV-1 ze 100 μl krwi przy użyciu tej konfiguracji testowej ¹¹.

W tym raporcie opisujemy protokół FINA jako pierwotnie opracowany do użytku laboratoryjnego. Przekładka membranowo-filtracyjna, znana jako moduł przygotowania próbek FINA, może być przygotowywana w dużych partiach i składowana do późniejszego wykorzystania. Gdy próbki mają zostać pobrane, proces ten trwa 2 minuty i może być wykonywany w partiach o różnej wielkości. qPCR można uruchomić natychmiast lub filtry zawierające osadzone DNA mogą być przechowywane do czasu, gdy będzie to wygodne do wykonania qPCR. Ta metoda jest bardzo wygodna w rutynowej analizie próbek zarówno w warunkach niskich, jak i wysokich zasobów.

Oświadczenie etyczne: Próbki krwi pełnej użyte w tym badaniu nie są uważane za badania z udziałem ludzi. Próbki zostały pozyskane do klinicznych celów diagnostycznych, które zostały spełnione, a pozostała część tych próbek została przekazana do testu badawczego FINA. Próbki zostały zakodowane w taki sposób, że badacze nie byli w stanie łatwo ustalić tożsamości osób.

1. Przygotowanie modułu przygotowania próbek FINA

1. Przygotuj bibułkę, wycinając 35 x 35^mm2 ze 100% wacika o grubości 2,6 mm. Wytnij jedną podkładkę na próbkę.
2. Przygotuj plastikową folię parafinową za pomocą papierowej taśmy podkładowej, wycinając kawałek folii parafinowej (25 mm (wys.) na 50 mm (szer.)), a następnie wybijając otwór o średnicy 7,14 mm w środku taśmy za pomocą dziurkacza wbijanego młotkiem. Przygotuj jedną taśmę na próbkę.
3. Przygotuj związany dysk szklanej membrany separatora krwi (membrany wychwytującej), przebijając okrąg o średnicy 8,35 mm za pomocą dziurkacza wbijanego młotkiem. Przebij jeden krążek na próbkę. Dysk ma zdolność zatrzymywania cząstek na poziomie 2,3 μm.
4. Zmontuj moduł przygotowania próbki FINA, umieszczając dysk przechwytujący na środku bibuły za pomocą kleszczy. Umieść taśmę z folii parafinowej na dysku przechwytującym tak, aby otwór taśmy parafinowej pozostawiał odsłonięty środek dysku przechwytującego.
5. Zapewnij maksymalny kontakt między krążkiem a podkładką bibułkową, lekko rozciągając taśmę parafinową, aby zakryć podkładkę bibułkową i mocno dociskając taśmę parafinową, aby przykleić ją do bibułki wokół wszystkich krawędzi dysku.
6. Zbuduj tyle modułów, ile potrzeba do eksperymentu lub zgromadź do wykorzystania w przyszłości.

2. Przygotowanie probówki qPCR

1. Przygotuj krążek taśmy o średnicy 5,1 mm, który zakotwiczy błonę wychwytującą komórki z boku probówki qPCR, aby zapobiec blokowaniu detekcji fluorescencji przez membranę poprzez przebicie koła podwójnie powlekanej poliestrowej taśmy diagnostycznej za pomocą stempla wbijanego młotkiem z arkusza taśmy. Przygotuj jeden krążek taśmowy na próbkę.
2. Usuń jedną stronę paska ochronnego taśmy klejącej. Umieść taśmę w probówce do PCR o pojemności 200 μl, przyklejając ją z jednej strony i w kierunku dolnej części probówki. Usuń drugi wkładek do naklejek. Tuba jest teraz gotowa do przyjęcia przygotowanego dysku.
3. Wyprodukuj tyle probówek, ile potrzeba do eksperymentu lub zgromadź zapasy do wykorzystania w przyszłości.

3. Spreparuj próbkę krwi

Uwaga: Jeśli przygotowywana jest oryginalna próbka testowa, przejdź do kroku 4.

1. Rozmrozić komórki 8e5-LAV ¹⁵ zawierające pojedynczą kopię prowirusa HIV-1 uzyskanego z Laboratorium Zapewnienia Jakości Wirusologii (VQA; Rush Presbyterian/St. Luke's Medical Center, Chicago, IL).
   Uwaga: Są one przechowywane w postaci zamrożonych granulek komórkowych w stężeniu 4 000 komórek/μl. Liczba komórek została zweryfikowana zgodnie z wcześniejszym opisem ⁹.
2. Przygotować seryjne rozcieńczenia w pożywce zamrażającej (90% płodowa surowica bydlęca, 10% dimetylosulfotlenek) do stężeń w zakresie od 1 do 400 komórek/μl.
3. Odpipetować 10 μl komórek z każdego z seryjnych rozcieńczeń do probówki mikrowirówkowej. Dodaj 100 μl świeżej próbki krwi pełnej poddanej działaniu HIV-1 z ujemnym wynikiem EDTA do każdej probówki, aby utworzyć standardową krzywą liczby kopii 8e5-LAV 10-4,000. Wymieszaj, delikatnie przesuwając spód tubki 5 razy.

4. Wykonaj ekstrakcję FINA

1. Lizować krwinki, dodając Triton-X100) do końcowego stężenia 1% (11 μl 10% Triton-X100 do 110 μl pełnej krwi i komórek z kroku 3.3).
2. Wymieszaj, delikatnie przesuwając spód tubki 5 razy. Krew powinna zmienić kolor na półprzezroczysty czerwony.
3. Zlosuj całą próbkę krwi na dysk przechwytujący.
   Uwaga: Wodoszczelne uszczelnienie między taśmą parafinową a membraną wychwytującą zapewnia przepływ krwi przez membranę, a dobry kontakt między membraną wychwytującą a zespołem podkładki bibułkowej zapewnia szybkie odprowadzanie próbki.
4. Pozwól próbce przesiąknąć przez filtr.
   Uwaga: Lizat krwi przenika do podkładki bibułkowej w wyniku działania kapilarnego, wychwytując genomowe DNA na powierzchni dysku wychwytującego. Lisat wsiąkł w dysk, gdy wydaje się matowy.
5. Dodaj kroplami 600-1,000 μl 10 mM NaOH na dysk przechwytujący.
   Uwaga: Bufor do płukania można również dodać jako dodatek luzem 600 μl. Bufor utworzy kropelkę na hydrofobowej taśmie parafinowej i przeniknie przez otwór do dysku w ciągu około 20 sekund. Filtr zmieni kolor z czerwonego na biały, wskazując na klirens hemoglobiny.
6. Oddziel krążek od bibułki za pomocą kleszczyków i przyłóż krążek do taśmy w przygotowanej probówce PCR. Jeśli na filtrze pozostał czerwony kolor, dodaj 50-100 μl buforu do płukania, aby wyczyścić filtr przed umieszczeniem w probówce.
   Uwaga: W rzadkich przypadkach nadciśnienie stosowane podczas przygotowywania modułów FINA powoduje podział warstw membrany podczas oddzielania od bibuły. Wyrzuć te krążki i przygotuj nową próbkę.
7. Po umieszczeniu filtra w probówce do PCR należy od razu przeanalizować próbki. Alternatywnie, wysuszyć przez noc w pudełku zawierającym środek osuszający z siarczanem wapnia, a następnie zakryć i umieścić w foliowej torebce ze środkiem osuszającym krzemionkę i przechowywać do momentu, aż będzie gotowy do analizy.

5. Reakcja qPCR

1. Przygotować 100 μl głównej mieszaniny qPCR na reakcję, używając starterów i sond specyficznych dla wirusa HIV, jak opisano poprzednio ^9,11. Uwzględnij wewnętrzną kontrolę amplifikacji w celu monitorowania obecności inhibitorów amplifikacji i sprawdzenia, czy próbka ujemna jest prawdziwie ujemna. Upewnij się, że filtr jest całkowicie pokryty mieszanką główną i że filtr pozostaje przymocowany do boku rurki przez cały czas trwania reakcji.
2. Wykonaj amplifikację za pomocą urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym, jak opisano wcześniej ⁹.

Proces ekstrakcji prowirusowego DNA z krwi pełnej wzbogaconej komórkami 8e5-LAV pokazano na rysunku 1. Rysunek 2 przedstawia moduł próbki FINA i przygotowaną probówkę qPCR. Metoda ta pozwala na efektywną amplifikację prowirusa HIV-1 z komórek 8e5-LAV przy różnej liczbie kopii, jak pokazano na krzywej standardowej spreparowanych próbek (ryc. 3). PCR miał skuteczność 103%, obliczoną ze Wydajność = -1+10(-1/nachylenie). Równanie prostej wyglądało następująco: y= -3,25x + 27,95, z korelacją R² = 0,996. Powtórzenia krzywej standardowej DNA prowirusa HIV mają również wysoce odtwarzalną amplifikację, jak pokazano w Tabeli 1. Dodatkowo, wewnętrzna kontrola 500 kopii reduktazy hydroksypirogronianowej jest obecna, aby wykazać, że nie ma hamowania PCR wynikającego z ekstrakcji krwi za pomocą FINA, niezależnie od liczby kopii obecnego prowirusa HIV-1 (Figura 4). Amplifikację IC uzyskano skutecznie we wszystkich 18 testowanych próbkach, ze średnim Cq wynoszącym 21,92 ± 0,25 i CV wynoszącym 1%.

Rycina 1: Przebieg pracy wykrywania prowirusowego DNA z krwi pełnej wzbogaconej komórkami 8e5-LAV do qPCR. (A) Od lewej do prawej, przygotowany moduł FINA, po dodaniu krwi do membrany wychwytującej i po dodaniu buforu do płukania. (B) probówki qPCR z krążkami wychwytującymi przyklejonymi do podwójnie powlekanej taśmy z dodatkiem głównej mieszanki qPCR. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przygotowanie wewnętrznego modułu FINA i probówki qPCR. (A) Dysk membrany wychwytującej o średnicy 8,35 mm został umieszczony pomiędzy kwadratową podkładką do bibuły 707 a cienkim arkuszem taśmy parafinowej zawierającym otwór o średnicy 7,14 mm w środku, tak że otwór taśmy parafinowej był wyśrodkowany na dysku wychwytującym w celu bezpośredniego nałożenia lizy krwi za pomocą pipety. (B) Podwójnie powlekana poliestrowa taśma diagnostyczna o grubości 5,1 mm jest przyklejona z boku probówki qPCR o pojemności 200 μl. Druga wkładka taśmy jest usuwana, aby odsłonić lepką powierzchnię do nałożenia dysku przechwytującego, gdy jest gotowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Krzywa standardowa spreparowanych próbek DNA wirusa HIV-1. (A) Poletka amplifikacyjne uzyskane ze 100 μl 4 powtórzeń krwi pełnej z ujemnym wynikiem HIV-1 wzbogaconej 4 000, 400, 40 i 10 komórkami 8e5-LAV z 500 kopiami/reakcja kontroli wewnętrznej Linie stałe = wykresy amplifikacji; Linia przerywana = próg. Oś Y to jednostki fluorescencji, a oś X to numer cyklu qPCR. (B) Krzywe wzorcowe wartości Cq obliczone na podstawie wykresu amplifikacji w funkcji logarytmu liczby kopii komórek 8e5-LAV na 100 μl krwi pełnej. Równanie linii: y = -3,25x + 27,95; R² = 0,996; Wydajność PCR = 103,23% obliczona za pomocą Wydajność = -1+10(-1/nachylenie) Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego wykresu.

Ryc. 4: Kontrola wewnętrzna wskazuje na brak hamowania qPCR. 500 kopii plazmidu kontrolnego amplifikacji reduktazy hydroksypirogronianowej dodanego na reakcję. Linie ciągłe = wykresy amplifikacji; Linia przerywana = próg. Średnie Cq IC = 21,92 ± 0,25. Cqs wahał się od 21,21 do 22,32. Współczynnik zmienności (CV %) = 1%; N = 18. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Średnie Cq, odchylenie standardowe (SD) i współczynnik zmienności (CV %) wynoszące 4 000, 400, 40 i 10 kopii standardowej krzywej 8e5-LAV z ekstrakcją FINA oraz starterami i sondami specyficznymi dla HIV-1. N = 4. WB = krew pełna.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.