To badanie porównuje dwie różne metody izolacji ludzkich monocytów w celu uzyskania in vitro komórek dendrytycznych (DC). Monocyty są selekcjonowane przez przyleganie lub ujemnie wzbogacane przez separację magnetyczną. Wydajność i żywotność monocytów wraz z żywotnością, proliferacją MDDC i ekspresją markera powierzchniowego CD11c/CD14 zostaną porównane między obiema metodami.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Charakterystyka ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej: porównanie dwóch protokołów izolacji monocytów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Komórki dendrytyczne (DCs) to komórki układu odpornościowego prezentujące antygen, które odgrywają kluczową rolę w odpowiedziach limfocytów, mechanizmach obronnych gospodarza i patogenezie stanu zapalnego. Izolacja i badanie DC były ważne w badaniach biologicznych ze względu na ich charakterystyczne cechy. Chociaż są one niezbędnymi kluczowymi mediatorami układu odpornościowego, DC są bardzo rzadkie we krwi, stanowiąc około 0,1 - 1% wszystkich komórek jednojądrzastych krwi. Dlatego alternatywy dla metod izolacji opierają się na różnicowaniu DC od monocytów wyizolowanych z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Konieczne jest rozważenie zastosowania odpowiednich technik izolacji, które łączą prostotę, przystępność cenową, wysoką czystość i wysoką wydajność komórek. W niniejszym badaniu porównane zostaną dwie odrębne metody wytwarzania prądów stałych. Monocyty wybierano przez adherencję lub ujemnie wzbogacano za pomocą procedury separacji magnetycznej, a następnie różnicowano w DC z IL-4 i GM-CSF. Żywotność, proliferację i fenotyp monocytów i MDDC oceniano za pomocą barwników żywotności, testu MTT i analizy markerów powierzchniowych CD11c/CD14 za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej. Chociaż metoda separacji magnetycznej pozwoliła uzyskać znacznie wyższy odsetek monocytów o wyższej zdolności proliferacyjnej w porównaniu z metodą adhezyjną, odkrycia wykazały zdolność obu technik do jednoczesnego generowania monocytów, które są zdolne do proliferacji i różnicowania się w żywotne MDDC CD11c+ po siedmiu dniach w hodowli. Obie metody dały > 70% MDDC CD11c+. Dlatego nasze wyniki dostarczają spostrzeżeń, które przyczyniają się do opracowania wiarygodnych metod izolacji i charakterystyki ludzkich DC.
Wprowadzenie
Komórki dendrytyczne (DC) są niezbędnymi mediatorami wrodzonego i adaptacyjnego układu odpornościowego. Ich zadaniem jest wywoływanie pierwotnych odpowiedzi immunologicznych i ułatwianie rozwoju pamięci immunologicznej. Komórki te są przede wszystkim odpowiedzialne za wychwytywanie antygenu, migrację i stymulację limfocytów T i dlatego są określane jako profesjonalne komórki prezentujące antygen (APC) 1. Manipulacja DC może być wykorzystywana w wielu różnych dziedzinach badawczych i w warunkach klinicznych do leczenia różnych chorób zapalnych, takich jak HIV 6,7, rak 8, choroby autoimmunologiczne 9 i reakcje alergiczne ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ogólne badania krwi ludzkiej zostały przejrzane i zatwierdzone przez Institutional Review Board (IRB) FIU, zatwierdzenie protokołu IRB # IRB-13-0440. Ludzkie leukopaki zostały zakupione w lokalnym banku krwi w Miami na Florydzie.
1. Izolacja PBMC za pomocą techniki gradientu gęstości standardowej
- Wykonać rozcieńczenie krwi w stosunku 1:1 solą fizjologiczną buforowaną 1x fosforanem w kolbie T75.
- Odpipetować 15 ml roztworu gradientu gęstości do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i ostrożnie nałożyć (25 - 30 ml na probówkę) rozcieńczoną krew na ten gradient .
- Wirować przez 20 minut przy 1 200 x g z przyspies....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wydajność izolacji monocytów metodą separacji magnetycznej jest wyższa w porównaniu z wydajnością izolacji monocytów metodą adhezji
Dane przedstawione na Rysunku 1 obrazują liczbę komórek PBMC i monocytów wyznaczoną metodą wykluczania błękitu trypanowego w dniu izolacji PBMC i separacji monocytów. Średnio monocyty izolowane metodą adhezyjną stanowiły około 6,2 procent całkowitej liczby PBMC, pod.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opierając się na znanych trudnościach związanych z izolowaniem i wytwarzaniem MDDC z ludzkiej krwi, niniejsze badanie miało na celu zapewnienie kompleksowego porównania dwóch dobrze znanych metod wytwarzania MDDC. Pierwsza porównana metoda jest dobrze ugruntowaną tradycyjną metodą generowania MDDC poprzez wykorzystanie zdolności monocytów do przylegania do szkła lub tworzywa sztucznego (metoda przylegania) 21,22,27. Metoda przylegania jest szybka i opłacalna oraz nie wymaga użycia skomplikowanego sprzętu. Jedn.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Wszyscy autorzy nie ujawniają żadnych sprzecznych interesów finansowych.
Podziękowania
To badanie jest wspierane przez National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, przyznając K99/R00 AA021264. Dodatkowe wsparcie laboratoryjne w ramach pakietu startowego otrzymano od Wydziału Immunologii, Instytutu Farmakologii Neuroimmunologicznej, Herbert Wertheim College of Medicine oraz FIU - Biura Badań i Rozwoju Gospodarczego. Gianna Casteleiro była wspierana przez NIH/NIGMS R25 GM061347. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | Należy stosować w RT |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Life Technologies | 10010-023 | |
| ACK Bufor lizujący | Jakość Biologiczna | 118-156-101 | |
| RPMI 1640 średni | Life Technologies | 22400-089 | |
| Antybiotyk-Antybiotyk (100x) | Life Technologies | 15240-062 | |
| Surowica bydlęca płodu (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| Bufor | RoboSep StemCell | 20104 | |
| Zestaw do wzbogacania monocytów ludzkich EasySep | StemCell | 19059 | |
| TC20 Automatyczny licznik komórek | Bio-Rad | 145-0101 | |
| FITC-Dextran | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Niebieska plama trypanowa (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Czytnik wielomodowy Synergy 2 | Biotek | 7131000 | |
| XTT Bioodczynnik soli sodowej (XTT) | Sigma Aldrich | X4626-100MG | |
| Bioreagent do dimetylosulfotlenku (DMS) | Sigma Aldrich | D8418-500ML | |
| Bromek tetrazolowy błękitu tiazolylowego (MTT) | Sigma Aldrich | m5655-500MG | |
| Dodecylosiarczan sodu (SDS) | Bio-Rad | 161-0302 | |
| Metosiarczan fenazyny (DMSO) | Sigma Aldrich | P9626-1G | |
| Inaktywowana (HI) surowica ludzka | Chemicon | S1-100ML | |
| Cytometr przepływowy Accuri C6 | BD Accuri | 653119 | |
| FlowSight Cytometr przepływowy Amnis | EMD Millipore | 100300 |
Bibliografia
- Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).
- Banchereau, J., et al. Immunobiology of Dendritic Cells. Ann Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
- Banchereau, J., Stein....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
