Method Article

Zrobotyzowana platforma do wysokowydajnej izolacji i transformacji protoplastów

DOI:

10.3791/54300

⸱

September 27th, 2016

 ,  , 
1Department of Plant Sciences, University of Tennessee, Knoxville, 2Center for Renewable Carbon, University of Tennessee, Knoxville, 3Department of Mechanical, Aerospace, and Biomedical Engineering, University of Tennessee, Knoxville

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana jest wysokoprzepustowa, zautomatyzowana metodologia produkcji i przetwarzania protoplastów tytoniu. Zrobotyzowany system umożliwia masowo równoległą ekspresję i odkrywanie genów w modelowym systemie BY-2, które powinno być możliwe do przełożenia na uprawy niemodelowe.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatniej dekady nastąpiło odrodzenie użycia protoplastów roślinnych, które obejmują różne gatunki modelowe, do analizy szlaków transdukcji sygnału, transkrypcyjnych sieci regulacyjnych, ekspresji genów, edycji genomu i wyciszania genów. Ponadto poczyniono znaczne postępy w regeneracji roślin z protoplastów, co spowodowało jeszcze większe zainteresowanie wykorzystaniem tych systemów w genomice roślin. W ramach niniejszej pracy opracowano protokół automatyzacji izolacji i transformacji protoplastów z kultury zawiesiny tytoniu "Bright Yellow" 2 (BY-2) przy użyciu platformy robotycznej. Procedury transformacji poddano walidacji przy użyciu genu reporterowego pomarańczowego białka fluorescencyjnego (OFP) (pporRFP) pod kontrolą promotora 35S wirusa mozaiki kalafiora (35S). Ekspresję OFP w protoplastach potwierdzono za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej. Analizy objęły również metody efektywności produkcji protoplastów z wykorzystaniem jodku propidyny. Wreszcie, do procedury izolacji protoplastów wykorzystano tanie enzymy spożywcze, omijając potrzebę stosowania enzymów klasy laboratoryjnej, które są zbyt kosztowne w przypadku wysokowydajnej automatycznej izolacji i analizy protoplastów. W oparciu o protokół opracowany w tej pracy, całą procedurę od izolacji protoplastów do transformacji można przeprowadzić w czasie krótszym niż 4 godziny, bez żadnego wkładu ze strony operatora. Chociaż protokół opracowany w ramach tej pracy został zwalidowany za pomocą hodowli komórkowej BY-2, procedury i metody powinny być możliwe do przełożenia na dowolny system hodowli zawiesiny roślinnej/protoplastów, co powinno umożliwić przyspieszenie badań nad genomiką roślin.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich latach położono znaczący nacisk na projektowanie upraw transgenicznych, aby przezwyciężyć różne choroby1, zapewnić odporność na herbicydy2, zapewnić suszę3,4 i tolerancję na sól5, zapobiec roślinożerności6, zwiększyć plony biomasy7 i zmniejszyć oporność ścian komórkowych8. Trend ten został wsparty przez rozwój nowych narzędzi molekularnych do generowania roślin transgenicznych, w tym edycji genomu za pomocą CRISPR i TALENs9 oraz wyciszania genów za pomocą dsRNA10, miRNA11 i siRNA12. Chociaż technologie te uprościły wytwarzanie roślin tra....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zakładanie zawiesinowych kultur komórkowych

  1. Przygotować płynną pożywkę BY-2, dodając 4,43 g pożywki podstawowej Linsmaier & Skoog, 30 g sacharozy, 200 mg KH2PO4 i 200 μg kwasu 2,4-dichlorofenoksyoctowego (2,4-D) do 900 ml wody destylowanej i pH do 5,8 z 0,1 M KOH. Po dostosowaniu pH dostosuj końcową objętość do 1,000 ml za pomocą wody destylowanej i autoklawu. Media można przechowywać do 2 tygodni w temperaturze 4 °C.
  2. Zaszczepić 250 ml kolby Erlenmeyera 100 ml płynnej pożywki BY-2 i pojedynczym kawałkiem kalusa BY-2 (o średnicy >1 cm) wyhodowanym na stałym podłożu BY-2 (płynna pożywka BY-2 z dodatkiem 1% agaru) i zamknąć ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W obecnym badaniu, szybkość podwajania BY-2 wahała się od 14 do 18 godzin w zależności od temperatury, w której kultury były inkubowane, co jest zgodne z wcześniejszymi raportami o średniej długości cyklu komórkowego wynoszącej 15 godzin. Przy tym podwojeniu szybkości, do zainicjowania hodowli użyto inokulum wyjściowego w stosunku 1:100, co doprowadziło do uzyskania kultur o objętości upakowanych komórek (PCV) wynoszącej 50% w ciągu 5-7 dni. W obecnym protokole, w którym kultury hodowano .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany powyżej protokół został pomyślnie zwalidowany pod kątem izolacji, liczenia i transformacji protoplastów przy użyciu hodowli komórek zawiesiny tytoniu BY-2; Protokół można jednak łatwo rozszerzyć na dowolną hodowlę zawiesiny roślinnej. Obecnie izolację i przemianę protoplastów osiągnięto w wielu roślinach, w tym w kukurydzy (Zea mays)10, marchwi (Daucus carota)32, topoli (Populus euphratica)33, winogronach (Vitis vinifera)34, palmie

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Orbitor RS Microplate moverThermo Scientific
Bravo Liquid HandlerAgilent
Synergy H1 Multi-mode ReaderBioTek
MultiFlo FX Multi-mode DispenserBioTek Teleshake
Inheco3800048
CPAC Ultraflat Heater/coolerInheco
Vworks Automation SoftwareAgilentSoftware służące do sterowania i pisania protokołów dla Agilent Bravo
Momentum SoftwareThermo ScientificOprogramowanie do planowania zadań do sterowania Orbiter RS
Liquid Handling Control 2.17 OprogramowanieBiotekużywane do sterowania i zapisu protokołów dla
mikroskopu odwróconego MultiFlo FX IX81Kamera mikroskopowa Olympus
Zyla 3-TapAndor
ET-CY3/TRITCChroma Technology Corp49004
Rohament CLButelka na próbkęenzymówtania celulaza
Rohapect UFButelka na próbkęenzymówTanie pestynazy
Rohapect 10LAB Butelkana próbkę enzymówtania pektynaza/arabinaza
Linsmaier & Skoog Basal MediumPhytotechnology LaboratoriesL689
Kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowyLaboratoria FitotechnologiczneD295
jodek propidynySigma AldrichP4170
Poli(glikol etylenowy) 4000Sigma Aldrich95904-250G-FDawniej Fluka PEG
Jodek propidiumFisher Scientific25535-16-4Acros Organics
CaCl2Sigma AldrichC7902-1KG
Octan soduFisher ScientificBP333-500
MannitolSigma AldrichM1902-1KG
SacharozaFisher ScientificS5-3
KH2PO4Fisher ScientificAC424205000
KOHSigma AldrichP1767
Gelzan CMSigma AldrichG1910-250G
Płytka 6-dołkowaThermo Scientific 103184
96-dołkowa 1,2 ml płytka głębinowaThermo ScientificAB-0564
96-dołkowa optyczna płyta dolnaThermo Scientific165305
Finntip 1000 Końcówki do pipet o szerokim otworzeThermo Scientific9405 163
NaClFisher ScientificBP358-10
KClSigma AldrichP4504-1KG
MESFisher ScientificAC17259-5000
MgCl2Fisher ScientificM33-500
7000190 Zestaw filtrów AB AB

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops. Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).
  2. Duke, S. O. Perspectives on transgenic, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protoplast IsolationProtoplast TransformationRobotic PlatformHigh throughput ScreeningBY 2 TobaccoEnzyme DigestionFluorescent MicroscopyPropidium IodideOrange Fluorescent ProteinPolyethylene Glycol

Related Articles