Method Article

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa z wykorzystaniem nanocząstek kropek kwantowych

DOI:

10.3791/54307

⸱

August 7th, 2016

 , 
1South Western Sydney Clinical School, Faculty of Medicine, University of New South Wales Australia, 2School of Medicine, Western Sydney University, 3Correlative Microscopy Group, Ingham Institute for Applied Medical Research, 4Electron Microscopy Laboratory, Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service, New South Wales Health Pathology, 5School of Medical Sciences, Faculty of Medicine, University of New South Wales Australia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano metodę, dzięki której nanocząstki kropek kwantowych (QD) mogą być używane do korelacyjnych badań immunocytochemicznych osadzonych w żywicy epoksydowej ludzkiej tkance patologicznej. Stosujemy komercyjne QD sprzężone z fragmentami przeciwciał, które są wizualizowane za pomocą szerokokątnej fluorescencyjnej mikroskopii świetlnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano metodę, dzięki której nanocząstki kropek kwantowych (QD) mogą być używane do korelacyjnych badań immunocytochemicznych ludzkiej tkanki patologicznej przy użyciu szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Aby zademonstrować protokół, mamy znakowane immunologicznie ultracienkie skrawki epoksydowe ludzkiego guza somatostatynomy przy użyciu pierwotnego przeciwciała przeciwko somatostatynie, a następnie biotynylowanego przeciwciała wtórnego i wizualizacji za pomocą kropek kwantowych (QD) kadmowo-selenowych (CdSe) sprzężonych z streptawidyną 585 nm kadm-selen (CdSe). Sekcje są montowane na siatce próbek TEM, a następnie umieszczane na szklanym szkiełku w celu obserwacji za pomocą szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej. Mikroskopia świetlna ujawnia znakowanie QD 585 nm jako jasnopomarańczową fluorescencję tworzącą ziarnisty wzór w cytoplazmie komórek nowotworowych. Przy małym i średnim zakresie powiększenia za pomocą mikroskopii świetlnej można łatwo rozpoznać wzór etykietowania i ocenić poziom oznakowania niespecyficznego lub tła. Jest to kluczowy krok dla późniejszej interpretacji wzorca znakowania immunologicznego za pomocą TEM i oceny kontekstu morfologicznego. Ten sam fragment jest następnie osuszany i oglądany przez TEM. Obserwuje się, że sondy QD są przyłączone do materiału amorficznego zawartego w pojedynczych granulkach wydzielniczych. Obrazy są pozyskiwane z tego samego obszaru zainteresowania (ROI), który jest widziany pod mikroskopią świetlną w celu analizy korelacyjnej. Odpowiednie obrazy z każdej modalności mogą być następnie mieszane w celu nałożenia danych fluorescencyjnych na ultrastrukturę TEM odpowiedniego regionu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korelacyjne mikroskopie świetlne i elektronowe (CLEM) to potężne podejście do analizy przejściowych zdarzeń dynamicznych1, rzadkich zdarzeń2, 3 i układów złożonych4. Dostępnych jest wiele różnych permutacji technicznych5 w zależności od zadawanego pytania, jednak powszechnym wymogiem jest, aby ta sama struktura w pojedynczej próbce6 była obrazowana za pomocą wielu modalności mikroskopowych. Nasze szczególne podejście do CLEM zostało opracowane do badania archiwalnych tkanek patologicznych człowieka, a zastosowany tutaj przypadek został dobrze scharakteryzowany i opublikowany wcześniej7. Celem było, po p....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sekcja i utrwalenie tkanek

  1. Rozwarstwienie tkanek
    1. Wypreparuj fragmenty tkanek z chirurgicznie wyciętej próbki guza lub biopsji tkanki.
      Uwaga: Tkanka użyta w tym badaniu była rutynowo utrwalana w formalinie, ale odpowiednia jest również świeża tkanka. Wybraliśmy obszar potwierdzony i zgłoszony przez patologa anatomicznego, który zawiera guz somatostatynoma po rutynowym barwieniu histologicznym i barwieniu immunologicznym anty-somatostatyny (nie pokazano).
    2. Używaj kawałków chusteczek nie większych niż około 1,0 mm3.
  2. Przygotowanie buforu kakodylowego
      <....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbka guza somatostatinoma użyta do tego badania składała się z komórek nowotworowych tworzących struktury przewodowe zmieszane z kolagenową tkanką stomijną. Za pomocą mikroskopii światła fluorescencyjnego pojedyncze komórki nowotworowe, które zawierały obfite ziarnistości wydzielnicze, wykazywały dodatnie znakowanie hormonu somatostatyny. Jądra wyglądały jak ciemne z minimalnym wykrywalnym niespecyficznym oznakowaniem (ryc. 1). Przy małych powiększeniach zaobserwowano z.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to wykazało potencjalną użyteczność QD jako uniwersalnych sond do badań CLEM. Zastosowane nanocząstki QD o długości fali 585 nm wykazywały jasną i stabilną fluorescencję podczas obserwacji za pomocą mikroskopii światła szerokokątnego i były łatwo obserwowane przez TEM. Poprzednie badania przeprowadzone przez jednego z obecnych autorów wykazały, że QD są również odpowiednie dla superrozdzielczej mikroskopii świetlnej7. Ich fotostabilność była szczególnie przydatna przy długich okresach oglądania i długi.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować za wsparcie Xiao Juan Wu (Laboratorium Immunohistochemii) oraz Departamentowi Patologii Anatomicznej, Sydney South West Pathology Service (SSWPS), NSW Health Pathology, Liverpool, Nowa Południowa Walia, Australia.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kakodylan soduProscitechC0205Szkodliwa substancja chemiczna
Tetratlenek osmuProscitechC010Stosować tylko w dygestorii
Octan uranyluUnivar-Ajax569Niebezpieczna substancja chemiczna
Etanol 100%FroninaJJ008
Aceton 100%FroninaJJ006
ERL 4221ProscitechC056
DER 732ProscitechC047
NSAProscitechC059
DMAEProscitechC050
Metaperiodynian soduAnalar BDH10259
przeciwciało anty-somatostatynoweDakoA0566
Rozcieńczalnik przeciwciałDakoS3022
Qdot 585 Koniugat streptawidyny InvitrogenQ10113MP
Biotynylowane kozie przeciwciało anty-królicze IgGSigmaB7389-1ML
Aldehyd glutarowy 50%EMS16320
Normalna surowica koziaInvitrogenPCN5000
PBS "Dulbecco A"Oxoid 
BSAc (10%)Aurion900.022
ParafilmPechiney PPM
(pH 2,0 - 9,0)Merck1.09584.0001
MikroformyProscitechRL063
Nóż diamentowyDiatomeUltra 45
Transmisyjny mikroskop elektronowyFEIMorgagni 268D
ZeissAxioscope A1
Siatki 300 mesh nikiel (cienki pręt)Agar ScientificG2740N
UltramikrotomRMCPowertome
TEM oprogramowanie sterujące kamerąSoft Imaging SystemAnalySISw wersji 3.0
Oprogramowanie do przetwarzania obrazuAdobe Systems Dołączonyprogram Photoshop CS2
BR0014G Paski wskaźnikowe pH Mikroskop fluorescencyjny Carl

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
  2. Introduction to correlative light and electron micr....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Correlative Light Electron MicroscopyQuantum Dot NanoparticlesImmunocytochemical StudiesTransmission Electron MicroscopyWidefield Fluorescence MicroscopySomatostatinoma Tumor TissueStreptavidin Conjugated QDsNickel Grid PreparationAntibody Labeling ProtocolFluorescence TEM Overlay

Related Articles