Method Article

Optymalizacja wielkości agregatu w mikrostudzienkach do różnicowania serca ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na podstawie zawiesiny

DOI:

10.3791/54308

⸱

September 25th, 2016

 ,  , 
1Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, 2Department of Comparative Biology and Experimental Medicine, University of Calgary

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konwencjonalne metody inicjowania różnicowania sercowego ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) na podstawie agregatu zawiesinowego są nękane niejednorodnością hodowli pod względem wielkości i kształtu agregatu. W tym miejscu opisujemy solidną metodę różnicowania serca wykorzystującą mikrostudzienki do generowania agregatów hPSC o kontrolowanej wielkości, hodowanych w warunkach sprzyjających pracy serca.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sercowe różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) jest zazwyczaj przeprowadzane w zawiesinowych agregatach komórkowych. Konwencjonalne tworzenie agregatów hPSC polega na dysocjacji kolonii komórkowych na mniejsze grudki, przy czym kontrola wielkości grudek jest z grubsza kontrolowana poprzez pipetowanie zawiesiny komórkowej aż do osiągnięcia pożądanej wielkości grudki. Jednym z głównych wyzwań związanych z konwencjonalnym zagregowanym różnicowaniem komórek hPSC w sercu jest to, że heterogeniczność hodowli i dezorganizacja przestrzenna prowadzą do zmiennej i nieefektywnej wydajności kardiomiocytów. My i inni wcześniej informowaliśmy, że wielkość zagregowanej ludzkiej embrionalnej komórki macierzystej (hESC) może być modulowana w celu optymalizacji wydajności indukcji serca. Sprostaliśmy temu wyzwaniu, stosując skalowalne, oparte na mikrostudzienkach podejście do kontroli parametrów fizycznych tworzenia kruszywa, w szczególności wielkości i kształtu kruszywa. Opisana przez nas metoda polega na wymuszonej agregacji zdefiniowanych liczb hPSC w mikrostudzienkach, a następnie hodowli tych agregatów w warunkach kierujących indukcją serca. Protokół ten można łatwo skalować w zależności od wielkości i liczby użytych odwiertów. Stosując tę metodę, możemy konsekwentnie osiągać wyniki hodowli z częstością występowania kardiomiocytów większą niż 70%.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowla komórkowa in vitro może być przeprowadzana na wiele sposobów, ale zazwyczaj przeprowadzana jest albo w dwuwymiarowych warunkach przylegania, albo w trójwymiarowych warunkach zawiesinowych, które pełniej rekapitulują systemy in vivo. W związku z tym w wielu dziedzinach badań naukowych rośnie tendencja do opracowywania solidnych metod generowania trójwymiarowych konstruktów tkankowych. W scenariuszach, w których typy komórek i procesy wymagają podporowej powierzchni macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i sygnałów adhezji, hodowla trójwymiarowa może być możliwa za pomocą konstruktów rusztowaniowych, w których komórki są hodowane na lub w egzogennej macierzy nośnej1. Komórki i procesy, które nie wymagają adhezji do macierzy podporowej, mogą być przeprowadzane w zawiesinie jako nierusztowane systemy złożone głównie lub wyłącznie z komórek (które mogą następnie przystąpić do wytwarzania własnych matryc endogennych)2,3. W tym artykule przedstawiamy protokół różnicowania serca ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC - komórek macierzystych zdolnych do przekształcenia się w dowolny typ komórek w organizmie, zarówno z embrionalnych, jak i innych źródeł) w kontrolowanych wielkości, jednolitych, nierusztowanych agregatach.

Różnicowanie hPSC jako agregatów zawiesinowych jest nękane przez duże różnice w wielkości agregatów zarówno w trakcie jak i między przebiegami. Ta zmienność jest konsekwencją metody zwykle stosowanej do generowania tych agregatów, która polega na mechanicznej dysocjacji kolonii komórkowych. Aby zmniejszyć tę zmienność, zastosowano szereg podejść do kontrolowania liczby komórek w agregacji, a także średnicy i jednorodności agregatu. Przykłady obejmują tworzenie agregatów w probówkach do mikrowirówek4 lub w postaci wiszących kropli5, mikrowzorcowanie zdefiniowanych dwuwymiarowych kolonii hPSC6, które można następnie przenieść do zawiesiny, lub odwirowanie komórek na wielodołkowe płytki z dnem U lub V7,8,9. Wszystkie te podejścia są jednak ograniczone ze względu na niską przepustowość zagregowanej generacji. Systemy oparte na studniach wykorzystują podobne podejście do systemów płytek z dnem w kształcie litery V, jednak mniejszy rozmiar mikrostudzienek (w tym protokole każda o szerokości 400 μm) umożliwia generowanie większej liczby jednorodnych agregatów z pojedynczej studzienki hodowlanej (standardowa średnica ~ 15,5 mm zawierająca ~ 1200 mikrostudzienek) niż zostałaby wygenerowana z całej płytki z dnem V10. Dobrze oparte tworzenie agregatów stosowano w wielu warunkach, w tym w różnicowaniu hPSC na losy ektodermalne11, endodermalne12, mezodermalne13 i pozaembrionalne14; chondrogeneza z mezenchymalnych komórek macierzystych15; wytwarzanie jednolitych substratów do toksykologicznych badań przesiewowych16; i badania mechanobiologii17.

Jednym z głównych wyzwań w opracowaniu solidnych protokołów produkcyjnych do produkcji kardiomiocytów pochodzących z hPSC był brak powtarzalności w efektywności różnicowania serca między seriami. Wcześniej wykazaliśmy, że tę zmienność można przypisać niejednorodności w wyjściowej populacji hPSC, która obejmuje zarówno samoodnawiające się hPSC, jak i różnicujące się komórki, które wyrażają geny związane z endodermą i różnicowaniem neuronalnym6,18. Sygnały wydzielane przez te różnicujące się komórki wpływają na indukcję serca. W szczególności endoderma pozaembrionalna wspomaga indukcję serca, podczas gdy progenitorzy neuronalni hamują indukcję serca. Po agregacji hPSC komórki w agregacie różnicują się i organizują w taki sposób, że niezróżnicowane hPSC są otoczone warstwą pozazarodkowych komórek endodermy, które rozwijają się na powierzchni agregatu13. Kontrolując wielkość agregatu, możemy modulować stosunek komórek endodermy indukujących serce do niezróżnicowanych hPSC (stosunek powierzchni do objętości) i zoptymalizować ten stosunek w celu uzyskania maksymalnej indukcji serca13.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie składników medium

  1. Przygotuj podłoże myjące. Na 100 ml DMEM/F12 dodać 1 ml 100x penicyliny/streptomycyny (Pen/Strep), 1 ml 100x L-glutaminy i 5 ml zamiennika surowicy.
  2. Przygotować chemicznie zdefiniowaną pożywkę do indukcji podstawowego krążenia zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Przygotuj następujące odczynniki podstawowe dla pożywek, które będą używane w tym protokole.
    1. Kwas L-askorbinowy: Przygotować roztwór podstawowy 5 mg na ml w 4 °C, sterylną ultraczystą wodę destylowaną w stożkowej probówce.
      1. Pozostaw ten roztwór na lodzie i okresowo obracaj probówkę, aż substancja rozpuszczona całkowicie się rozpuści. Przefiltruj i wysterylizuj roztwór kwasu askorbinowego za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm.
      2. Przygotować 1 ml podwielokrotności roztworu kwasu askorbinowego i przechowywać te podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Za każdym razem, gdy przygotowywana jest pożywka, należy użyć świeżo rozmrożonej podwielokrotności.
    2. W dniu przygotowania pożywki rozcieńczyć 13 μl monotioglicerolu (MTG) w 1 ml podstawowej pożywki do indukcji serca. Wyrzuć niewykorzystany, rozcieńczony MTG.
    3. Przygotować 1 ml porcji transferyny (30 mg/ml) do przechowywania w temperaturze -20 °C. Rozmrożone podwielokrotności przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy.
    4. Przygotować 4 mM kwasu solnego (HCl) zawierającego 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). W dygestorium dodać 30 μl 6,0 N roztworu HCl do 50 ml ultraczystej wody destylowanej. Przefiltruj i wysterylizuj roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm. Dodać 2 ml 25% roztworu BSA do 50 ml roztworu HCl.
    5. Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) zawierającą 0,1% BSA. Dodać 20 μl 25% roztworu BSA na ml PBS.
    6. Przygotować roztwór podstawowy białka morfogenetycznego 4 (BMP-4) dla ludzkiej kości (10 ng/μl). Rozpuścić 10 μg liofilizowanego BMP-4 w 1 ml 4 mM roztworu buforowego HCl zawierającego 0,1% BSA. Przygotować 50 μl porcji do przechowywania w temperaturze -20 °C.
    7. Przygotować roztwór podstawowy ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów 2 (bFGF) (10 ng/μl). Rozpuścić 10 μg liofilizowanego bFGF w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 0,1% BSA. Przygotować 50 μl porcji do przechowywania w temperaturze -20 °C.
    8. Przygotować roztwór podstawowy ludzkiego czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) (5 ng/μl). Rozpuścić 5 μg liofilizowanego VEGF w 1 ml PBS zawierającego 0,1% BSA. Przygotować 50 μl porcji do przechowywania w temperaturze -20 °C.
    9. Przygotować roztwór podstawowy Activin A (10 ng/μl). Rozpuścić 10 μg liofilizowanej aktywiny A w 1 ml PBS zawierającym 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Przygotować 50 μl porcji do przechowywania w temperaturze -20 °C.
    10. Przygotować roztwór podstawowy inhibitora produkcji Wnt-2 (IWP-2) (10 mM). Rozpuścić 2 mg IWP-2 w 429 μl dimetylosulfotlenku (DMSO). Przygotować 10 μl porcji do przechowywania w temperaturze -80 °C.
  4. Przygotować kompletną pożywkę do indukcji pracy serca. Do 100 ml podstawowej pożywki do indukcji serca dodać 1 ml 100x Pen/Strep, 1 ml 100x L-glutamina, 500 μl transferyny, 1 ml świeżo rozmrożonego kwasu askorbinowego i 300 μl MTG. Wyrzuć niewykorzystane podłoże.

2. Przygotowanie płytki Microwell

UWAGA: Wszystkie czynności należy wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Dodaj 0,5 ml roztworu płuczącego (składnik zestawu) do każdej studzienki, która zostanie użyta na płytce. Aby upewnić się, że roztwór styka się z całą powierzchnią wewnątrz każdej mikrostudzienki, odwiruj płytkę przy 840 x g przez 2 minuty.
  2. Inkubować płytkę przez 30 do 60 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Odessać roztwór płuczący ze studzienek. Umyć każdą studzienkę dwukrotnie w następujący sposób: Dodać 1 ml PBS do każdej studzienki, odwirować płytkę o sile 840 x g przez 2 minuty, a następnie odessać PBS.

3. Tworzenie agregatów hPSC w płytce mikrodołkowej

UWAGA: Wszystkie czynności należy wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Umieść medium myjące w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Wymagana objętość = 1 ml x liczba studzienek hPSC, które zostaną zdysocjowane.
  2. Dysocjacja hPSC na pojedyncze komórki
    UWAGA: Te kroki opisują dysocjację komórek hodowanych na płytkach 6-dołkowych — objętości odczynników można skalować proporcjonalnie dla różnych formatów hodowli.
    1. Dobrze odessać pożywkę hodowlaną z każdej kultury hPSC w celu dysocjacji. Przepłukać każdą studzienkę 1 ml enzymu dysocjacyjnego, a następnie natychmiast odessać enzym dysocjacyjny z każdej studzienki.
      UWAGA: Resztkowy enzym dysocjacyjny powinien być wystarczający do dysocjacji komórek.
    2. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.
    3. Dodać 1 ml pożywki płuczącej do każdej studzienki i mechanicznie oddzielić komórki od powierzchni hodowli tkankowej, pipetując pożywkę płuczącą za pomocą mikropipetora P1000 na powierzchnię kultury tkankowej. Jeśli dysocjacja wydaje się być niepełna i pozostają grudki komórek, w tym momencie przepuść zawiesinę przez sitko.
    4. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i przechowywać probówkę w inkubatorze do czasu zliczania komórek w następnym etapie.
    5. Wykonaj zliczanie komórek:
      1. Pobrać 10 μl próbki zawiesiny komórek pobranej w poprzednim kroku. Dodać 30 μl błękitu trypanowego i dobrze wymieszać zawiesinę za pomocą pipetowania.
      2. Przenieś 10 μl komórek barwionych błękitem trypanowym do każdej komory hemocytometru i zwizualizuj pod odwróconym mikroskopem za pomocą obiektywu 10X. Policz komórki.
    6. Na podstawie wyników zliczania komórek oblicz, ile dołków można wysiać przy 1,2 x 106 komórek na dołek płytki mikrodołkowej. Obliczać Pożywka agregacyjna wymagana do wysiewu komórek w ilości 1 ml na studzienkę.
    7. Przygotuj pożywkę agregacyjną. Na 10 ml kompletnej pożywki do indukcji serca dodać 0,5 μl roztworu podstawowego BMP4 (stężenie końcowe = 0,5 ng/ml) i inhibitora Y-27632 ROCK (stężenie końcowe = 10 μM).
    8. Wyjąć stożkową probówkę zawierającą hPSC z inkubatora i odwirować probówkę o stężeniu 200 x g przez 5 minut. Odessać pożywkę płuczącą i ponownie zawiesić komórki w pożywce agregującej o gęstości 1,2 x10,6 komórek na ml.
    9. Zassać roztwór płuczący PBS z każdej studzienki płytki mikrodołkowej. Za pomocą mikropipetora P1000 równomiernie rozprowadzić i rozsiać 1 ml zawiesiny komórek do każdego dołka na płytce mikrodołkowej. Aby zasiać dużą liczbę dołków, okresowo wiruj zawiesinę komórek, aby zapobiec osiadaniu.
    10. Odwirować płytkę o masie 200 x g przez 5 minut. Obserwuj płytkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki odwirowały na dnie każdej mikrostudzienki.
    11. Inkubować płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2, 5 % O2 (hipoksji).

4. Etap indukcji serca 1

  1. Jednego dnia po agregacji (dzień 1) należy przygotować wymaganą objętość pożywki indukcyjnej etapu 1 (dla płytki 24-dołkowej objętość = 1 ml x liczba dołków). Na 1 ml kompletnej pożywki do indukcji serca dodać 1 μl roztworu podstawowego BMP4 (stężenie końcowe = 10 ng/ml), 0,5 μl roztworu podstawowego bFGF (stężenie końcowe = 5 ng/ml) i 0,6 μl aktywiny A (stężenie końcowe = 6 ng/ml). Umieścić pożywkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na co najmniej 15 minut.
  2. Wyjąć płytkę mikrodołkową z inkubatora. Sprawdź kruszywa pod mikroskopem. W porównaniu z agregacją bezpośrednio po wirówce powinny wydawać się nienaruszone z gładkimi krawędziami (bardziej okrągłe i mniej kwadratowe niż poprzedniego dnia).
  3. Usunąć supernatant bez naruszania agregatów wewnątrz mikrostudzienek:
    1. Trzymaj płytkę mikrodołkową poziomo poziomo (tj. nie przechylaj jej). Dla każdego dołka na płytce mikrodołkowej umieścić końcówkę mikropipetora P1000 na powierzchni pożywki hodowlanej i przy krawędzi studzienki.
    2. Powoli usuwaj pożywkę, uważając, aby nie naruszyć agregatów na dnie mikrostudzienek. Po zmniejszeniu poziomu medium do około 1 do 2 mm od teksturowanej powierzchni mikrostudzienki, powoli przechyl płytkę, aby zebrać medium po jednej stronie studzienki (gdy objętość jest wystarczająco niska, ruch płynu jest znacznie zmniejszony i łatwiej jest uniknąć podnoszenia agregatów z ich indywidualnych mikrostudzienek). Powoli odpipetować pozostałą pożywkę w studzience.
  4. Aby dodać świeżą pożywkę indukcyjną etapu 1, upewniając się, że agregaty pozostają w swoich indywidualnych mikrostudzienkach: Pobrać 1 ml pożywki indukcyjnej etapu 1 za pomocą mikropipetora P1000. Przytrzymać końcówkę pipety przy wewnętrznej krawędzi studzienki i bardzo powoli dozować pożywkę do wewnętrznej ścianki studzienki. Powtórz dla pozostałych dołków.
  5. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze w warunkach niedotlenienia na 3 dni.

5. Etap indukcji serca 2

  1. W dniu 4 umieścić pożywkę do płukania (objętość = liczba studzienek x 2 ml) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na co najmniej 15 minut.
  2. Przygotować niezbędną objętość pożywki indukcyjnej etapu 2 (objętość = liczba studzienek x 1 ml): Na ml kompletnej pożywki do indukcji serca dodać 2 μl roztworu podstawowego VEGF (stężenie końcowe = 10 ng/ml) i 0,5 μl roztworu podstawowego IWP-2 (stężenie końcowe = 5 μM). Umieść przygotowane medium indukcyjne Stage 2 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na co najmniej 15 minut.
  3. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml zebrać agregaty z każdej studzienki płytki mikrodołkowej i zawiesinę kruszywy zebrać do stożkowej probówki o pojemności 15 ml (zebrać do 10 studzienek na probówkę o pojemności 15 ml).
  4. Pozostawić agregaty na 15 minut do osadzenia się w inkubatorze do hipoksyji.
    UWAGA: Ten krok jest ważny, aby oddzielić pojedyncze komórki i szczątki komórkowe od nienaruszonych agregatów.
  5. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić agregaty w 10 ml wstępnie podgrzanego medium do płukania w celu usunięcia pozostałości cytokin indukcyjnych (np. aktywina A jest silną cząsteczką sygnałową nawet w bardzo niskich stężeniach).
  6. Odwirować agregaty przy 50 x g przez 2 minuty. Odessać supernatant. Ponownie zawiesić granulowane agregaty we wstępnie podgrzanym medium Induction 2.
  7. Przenieść zawiesinę kruszywa na 24-dołkową płytkę o bardzo niskim stopniu mocowania (ULA) w ilości 1 ml na studzienkę. Obserwuj agregaty pod mikroskopem jako jednolite, ciasne skupiska komórek. Inkubować w warunkach niedotlenienia do 6 dnia.

6. Etap indukcji serca 3

  1. W dniu 6 przygotuj niezbędną objętość pożywki indukcyjnej etapu 3 (objętość = liczba studzienek x 1 ml). Na 1 ml kompletnej pożywki do indukcji serca dodać 2 μl roztworu podstawowego VEGF (stężenie końcowe = 10 ng/ml) i 0,5 μl roztworu podstawowego bFGF (stężenie końcowe = 5 ng/ml). Przygotować pożywkę indukcyjną Stage 3 umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na co najmniej 15 minut.
  2. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml przenieść osady do stożkowych probówek o pojemności 15 ml, uzyskując do 10 ml kruszywa na probówkę.
  3. Odczekaj 10 minut, aż agregaty się uspokoją. Odessać supernatant i ponownie zawiesić agregaty we wstępnie podgrzanym pożywce indukcyjnej etapu 3. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml rozprowadzić agregaty na 24-dołkowej płytce ULA w ilości 1 ml na studzienkę.
  4. W dniu 10 przygotuj niezbędną objętość pożywki indukcyjnej etapu 3 (objętość = liczba studzienek x 1 ml) zgodnie z krokiem 6.1.
  5. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml przenieść osady do stożkowych probówek o pojemności 15 ml, uzyskując do 10 ml kruszywa na probówkę.
  6. Odczekaj 10 minut, aż agregaty się uspokoją. Odessać supernatant i ponownie zawiesić agregaty w pożywce indukcyjnej etapu 3. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml rozprowadzić agregaty na 24-dołkowej płytce ULA w ilości 1 ml na studzienkę.
  7. Inkubować w warunkach niedotlenienia przez dwa dni. W dniu 12 rozpocząć inkubację komórek przy normoksyjnym poziomie tlenu przez pozostałą część okresu hodowli (37 °C, 20% O2, 5 % CO2 ).
    UWAGA: Po upływie tego czasu komórki nie są już hodowane w warunkach niedotlenienia.
  8. Powtarzaj tę pełną wymianę pożywki (kroki 6.2 i 6.3) co 4 dni, począwszy od 14 dnia aż do pobrania komórek (zazwyczaj maksymalne stężenie kardiomiocytów obserwuje się po 14 dniu różnicowania).

7. Analiza cytometrii przepływowej częstotliwości ekspresji troponiny sercowej T (cTnT) w wyniku hodowli mikrostudzienki

  1. Oddziel agregacje w następujący sposób:
    1. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml przenieść 1 studzienkę kruszywa do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować agregaty o masie 50 x g przez 2 minuty i ostrożnie zassać supernatant.
    2. Dodać 1 ml świeżo rozpuszczonego 1 mg/ml roztworu kolagenazy typu II do kruszyw. Przenieść zawiesinę zbiorczą do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Inkubować agregaty w kolagenazie typu II przez noc w temperaturze pokojowej.
    3. Następnego dnia użyj mikropipetora P1000, aby delikatnie zdysocjować agregaty w jednorodną zawiesinę jednokomórkową. Jeżeli agregaty nie ulegają łatwej dysocjacji, należy je osadzić, odessać supernatant i inkubować agregaty w 700 μl enzymu dysocjacyjnego przez 1 do 2 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie odpipetować agregaty 1 do 2 razy mikropipetorem P1000 w celu dysocjacji.
    4. Rozcieńczyć enzym dysocjacyjny: Dodać 700 μl pożywki płuczącej zawierającej 14 μl roztworu podstawowego DNAzy o stężeniu 1 mg/ml. Pobrać próbkę o objętości 10 μl w celu zliczenia komórek i odwirować pozostałą zawiesinę za pomocą mikrowirówki laboratoryjnej o stężeniu 300 x g przez 2 minuty.
  2. Przeprowadzić zliczanie komórek: Wybarwić próbkę liczącą 10 μl równą objętością błękitu trypanowego i policzyć za pomocą hemocytometru.
  3. Wyjąć z mikrowirówki probówkę do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającą pozostałe komórki. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w stężeniu od 200 000 do 500 000 komórek na 100 μl, w zrównoważonym roztworze soli Hanksa zawierającym 2% płodową surowicę bydlęcą (HF).
  4. Dla każdego warunku przenieś 100 μl zawiesiny komórek na studzienkę do 2 dołków 96-dołkowej płytki (jedna studzienka zostanie wybarwiona przeciwciałem cTnT, a druga będzie drugorzędową kontrolą przeciwciała).
  5. Odwirować płytkę o masie 300 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant za pomocą mikropipetora wielokanałowego.
  6. Utrwalenie komórek: Dodać 200 μl roztworu utrwalającego (składnik zestawu) do dołka i inkubować płytkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Odwirować płytkę o sile 300 x g przez 2 minuty. Za pomocą mikropipetora wielokanałowego ostrożnie pobrać supernatant z dołków. Supernatant należy wyrzucić do pojemnika na odpady paraformaldehydu.
  8. Umyj utrwalone komórki dwukrotnie: Dodaj 200 μl HF do każdej studzienki. Odwirować płytkę o masie 300 x g przez 2 min. Odessać supernatant i powtórzyć etap płukania jeszcze raz. Stałe ogniwa mogą być przechowywane przez okres do jednego tygodnia w wysokiej temperaturze w temperaturze 4 °C.
  9. Przepuszczalność komórek:
    1. Odwirować płytkę o masie 300 x g przez 2 min.
    2. Dodać 100 μl roztworu przepuszczalnego (składnik zestawu) do każdej studzienki i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    3. Odwirować płytkę o masie 300 x g przez 2 minuty i odessać supernatant.
  10. Przygotować główną mieszaninę anty-cTnT w HF w optymalnym stężeniu dla danego numeru partii (optymalne rozcieńczenie musi być określone przez miareczkowanie i zwykle mieści się w zakresie od 1:500 do 1:2 000).
  11. Dla każdego warunku (2 studzienki na warunek) dodać 100 μl mieszanki wzorcowej do jednego dołka (wybarwiona próbka) i 100 μl zwykłego HF do drugiego dołka (kontrola przeciwciał wtórnych). Inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
  12. Odwirować komórki przy 300 x g przez 2 minuty. Odessać supernatant i dodać 200 μl HF do dołka. Powtórz ten krok prania jeszcze raz.
  13. Przygotować mieszaninę wzorcową przeciwciała drugorzędowego. Przenieść objętość HF odpowiadającą 100 μl dla każdego studzienki (drugorzędowa kontrola przeciwciał i barwione cTnT) poddawanej obróbce. Dodać 1 μl koziego przeciwciała drugorzędowego anty-mysiego APC na 200 μl HF (rozcieńczenie 1:200).
  14. Zabarwić próbki. Dodać 100 μl roztworu barwiącego do każdej studzienki (zarówno drugorzędowej kontroli przeciwciał, jak i studzienek barwionych anty-cTnT). Inkubować komórki w ciemności w temperaturze 4 °C przez 30 minut (po dodaniu fluorescencyjnego przeciwciała drugorzędowego przechowywać płytkę pod przykryciem lub w ciemności, aby uniknąć fotowybielania).
  15. Odwirować komórki przy 300 x g przez 2 minuty. Odessać supernatant i dodać 200 μl HF do dołka. Powtórz ten krok prania jeszcze raz.
  16. Przenieść próbki do probówek do analizy cytometru z przepływem okrągłym o pojemności 5 ml i wykonać cytometrię przepływową w celu uzyskania sygnału w kanale APC, korzystając ze standardowych protokołów dla przyrządu19.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kontrolowane rozmiary agregaty hPSC mogą być efektywnie formowane za pomocą systemu mikrostudzienek, zależnych tylko od koncentracji komórek i powierzchni mikrostudzienki. Po krótkim odwirowaniu odpowiednia liczba komórek (1000 w tym protokole) jest łączona w każdej mikrostudzience (rysunek 1A). Co ważne, komórki te odbudowują połączenia wewnątrzkomórkowe w ciągu 24 godzin i nie powinny już wypełniać studzienki, ale wyglądać jak zwarte agregaty o gładkich krawędziach (ryc. 1B). Agregaty te stanowią materiał wyjściowy do dalszego różnicowania w kierunku losu serca. Jeśli komórki nie tworzą ciasnych klastrów, sugeruje to możliwą śmierć komórki w wyniku dysocjacji i ponownej agregacji, a także należy zbadać przydatność stężeń pasażowania pojedynczych komórek i inhibitorów ROCK dla określonej linii komórkowej. Kolejne trzy dni w mikrostudzienkach wykazują niewielkie zmiany w morfologii agregatów, chociaż widoczny jest pewien wzrost. Po usunięciu z mikrostudzienek kruszywa powinny zachować swoją okrągłą, ciasno upakowaną morfologię i mieć podobną wielkość do siebie (rysunek 1C). Hodowla na 24-dołkowych płytkach ULA pozwoli na dalszą ekspansję i wzrost komórek.

Do 8 dnia, po pierwszym narażeniu na sygnalizację Activin i hamowanie Wnt, agregaty zaczną pojawiać się jako większe i jaśniejsze agregaty (Rysunek 1D). W tym okresie na dnie każdej studzienki widoczne będą znaczne szczątki komórkowe, które należy usunąć, pozwalając kruszywu osiąść przed usunięciem pożywki. Od czasu do czasu wiele skupisk łączy się ze sobą. Nie zahamuje to różnicowania się innych agregatów w studni, chociaż te "super agregaty" zwykle nie wykazują zmian morfologicznych obserwowanych w przypadku mniejszych agregatów i jest mniej prawdopodobne, że ulegną całkowitemu zróżnicowaniu.

Ciągłe różnicowanie skutkuje zauważalnymi zmianami morfologicznymi w agregatach ze zwiększonym rozmiarem i pojawieniem się zorganizowanych obszarów włóknistych. Do 12 dnia można zaobserwować kurczenie się agregatów. Będą one zawsze składać się z dużych, przezroczystych komórek i często zawierają rozległą macierz zewnątrzkomórkową na zewnątrz agregatu (ryc. 2). Podczas gdy skurcze w całym skupisku wskazują na udane różnicowanie, ekspresję markerów sercowych można również zaobserwować w agregatach, które nie wydają się kurczyć. Po dysocjacji agregatów i znakowaniu immunologicznym większość komórek będzie dodatnia dla markera kardiomiocytów cTnT za pomocą cytometrii przepływowej (ryc. 3). Ekspresja tego markera jest stabilna w komórkach i można ją zaobserwować w agregatach aż do 19 dnia różnicowania.

figure-results-1
Rycina 1: Oś czasu hPSC zróżnicowana w kierunku losu serca. Natychmiast po agregacji komórki prawie wypełniają każdą mikrostudzienkę (A). Dzień później agregaty wydają się skondensowane i gładkie (B). Ta morfologia utrzymuje się nawet wtedy, gdy agregaty są usuwane z mikrostudzienek i powlekane płytkami studzienek (C). W 8 dniu agregaty zaczynają się rozszerzać i wydają się jaśniejsze w kolorze (D). Podziałka skali: 250 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Agregaty zaczynają się kurczyć w 12 dniu różnicowania. Po sześciu dniach w średnim stadium indukcji serca 3 zaobserwowano silne skurcze łączące (górny panel: rozluźnienie, środkowy panel: skurcz). Dolny panel pochodzi z odjęcia górnego i środkowego panelu, przy czym najbardziej znaczące różnice pojawiają się jako czarne lub białe (groty strzałek). Podziałka skali: 250 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Znakowanie immunologiczne troponiny sercowej T w zróżnicowanych hPSC. W dniu 17 większość komórek jest dodatnia na obecność troponiny T w sercu za pomocą cytometrii przepływowej (wypełniony histogram). Pokazano również komórki wybarwione samym przeciwciałem drugorzędowym (histogram niewypełniony). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaobserwowano, że efektywne różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych w sercu jest procesem bardzo zmiennym. Chociaż nie jest zaskakujące, że różne linie komórkowe wykazują różne skłonności do różnicowania się do określonych typów komórek, zaobserwowano, że skuteczność różnicowania serca waha się dramatycznie między seriami replikacji przy użyciu tej samej linii komórkowej6. Opisany tutaj protokół odnosi się do jednego z głównych źródeł tej zmienności poprzez bezpośrednie kontrolowanie liczby komórek wejściowych na agregację. Aby jeszcze bardziej zmniejszyć zmienność między seriami, zaleca się stosowanie linii hPSC przystosowanych do pasażowania pojedynczych komórek, ponieważ ta forma ekspansji i utrzymania hPSC skutkuje bardziej spójnymi populacjami pluripotencjalnymi w odniesieniu do częstości ekspresji markerów pluripotencji (np. Oct4, Nanog, Tra-1-60 itp.).

Protokół, jak napisano tutaj, określa łączną wielkość 1000 komórek dla optymalnej indukcji serca z linii embrionalnych komórek macierzystych HES-2. Aby zastosować ten protokół do różnych linii komórkowych, konieczne jest przeprowadzenie wstępnego badania przesiewowego wielkości agregatu w celu określenia optymalnego rozmiaru agregatu specyficznego dla linii komórkowej. Chociaż nie ma to bezpośredniego wpływu na procedury, których należy tutaj przestrzegać, przypominamy czytelnikowi, że oczekuje się, że zmiany w zagregowanej wielkości i ogólnej gęstości komórek wpłyną na dostarczanie tlenu. Może to stać się istotnym czynnikiem branym pod uwagę w dalszych zastosowaniach. Ponadto apoptoza śmierci komórek jest problemem podczas dysocjacji hPSC do pojedynczych komórek. Dlatego bardzo ważne jest, aby upewnić się, że inhibitor ROCK jest obecny podczas wymuszonej agregacji komórek w mikrostudzienkach. Wreszcie, bardzo ważne jest, aby w 4 dniu różnicowania agregaty zostały dobrze umyte w celu usunięcia śladowych ilości aktywiny A, obecnej w pożywce indukcyjnej 1, przed ponownym zawieszeniem w pożywce indukcyjnej 2. Po 4 dniu różnicowania Activina A wspomaga różnicowanie endodermy kosztem indukcji mezodermy20.

Głównym zastosowaniem tej techniki jest badanie przesiewowe wielkości agregatów, które sprzyjają efektywnemu różnicowaniu serca. Jednak jednym z ograniczeń obecnej techniki jest to, że trudno jest skalować produkcję serca do klinicznie istotnych poziomów przy użyciu płytek mikrodołkowych. Zwiększenie skali różnicowania serca jest zwykle przeprowadzane w warunkach hodowli masowej w bioreaktorach zawiesinowych z mieszadłem21. W związku z tym, gdy system mikrostudzienki zostanie wykorzystany do określenia dopuszczalnych zakresów wielkości agregatu w celu efektywnej indukcji serca, następnym krokiem w celu zwiększenia skali jest określenie prędkości wirnika bioreaktora, które mogą wygenerować pożądany rozmiar agregatu komórkowego.

Jedną z istotnych różnic tej techniki w stosunku do innych metod różnicowania serca na podstawie agregatów jest to, że umożliwia ona bezpośrednie badania nad modulacją efektów endogennej sygnalizacji w agregatach, a także kohodowlą indukcyjnych/hamujących typów tkanek z hPSC w sumie13. Tego typu badania mogą dostarczyć informacji na temat rozwoju procesu produkcji serca na dużą skalę.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.U. ma interes finansowy w leżącej u podstaw technologii mikrostudzienek.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Peterowi Zandstra, w którego laboratorium ten protokół został opracowany, oraz dr Markowi Gagliardiemu i Gordonowi Kellerowi, którzy udzielili pomocy w ustaleniu początkowych metod, na których opierał się ten proces. Opracowanie protokołu było wspierane przez stypendium Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology dla C.B. oraz grant z Heart and Stroke Foundation of Ontario dla Petera Zandstra.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
bezpieczeństwa biologicznego
Pomoc do
Pipety serologiczne (od 5 do 25 ml) 
Aspirator
Aspirator lub pipety Pasteura
15 i 50 ml rurki stożkowe Wyciąg
0,22 i mikro; m filtr
5% CO2, 5% O2, i inkubator do hodowli komórkowych z kontrolowaną wilgotnością Inkubator hipoksyjny (o niskiej zawartości tlenu)
5% CO2, 20% O2, i inkubator do hodowli komórkowych z kontrolowaną wilgotnością 
Wirówka wolnoobrotowa z wahliwym wirnikiem kubełkowym wyposażonym w uchwyt na płytki 
Mikropipety P2, P20, P200 i P1000 oraz związane z nimi końcówki 
Mikroskop odwrócony z obiektywami fazowymi 4X, 10X i 20X 
Płytki 24-dołkowe Ultra-Low Attachment (ULA) Corning/Costar3473
do mikrowirówek 1,5 ml
Mikrowirówka
Kwas L-askorbinowySigma-AldrichA4403
Sterylna Ultraczysta woda destylowanaSigma-AldrichW3500
Vortex
Ice
-20 &stopni; C zamrażarka
MonotioglicerolSigma-AldrichM6145Toksyczny; Zdecydowanie zaleca się podawanie MTG w celu zminimalizowania utleniania spowodowanego wielokrotnym otwieraniem. Podwielokrotności mogą być przechowywane w temperaturze 4 & stopni; C do 3 miesięcy, -20 ° C jest zalecany do długotrwałego przechowywania.
StemPro-34 MediumThermo Fisher Scientific10639-011Podstawowa pożywka do indukcji serca; Suplement jest przechowywany w temperaturze -20 stopni Celsjusza; C i podłoże podstawowe w temperaturze 4 & st. C.
TransferynaRoche10652202001
BMP-4R& D Technologies314-BP
bFGFR& D Technologies233-FB
VEGFR& D Technologies293-VE
Activin A R& D Technologies338-AC
IWP-2Odczynniki Direct57-G89
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher Scientific14190
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Thermo Fisher Scientific15561
Kwas solny Sigma-Aldrich258148
dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD2650
DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12660
100x Penicylina/StreptomycynaThermo Fisher Scientific15140
100x L-glutaminaThermo Fisher Scientific25030
Zamiennik serum nokautującegoThermo Fisher Scientific10828010
TrypLE SelectThermo Fisher Scientific12563
Hemocytometr
Trypan Blue
Aggrewell 400 płytekStemCell Technologies27845Płytki Microwell
Roztwór do płukania AggrewellStemCell Technologies7010Roztwór do płukania Microwell
Y-27632 Inhibitor ROCKTocris1254
Kolagenaza typu IISigma-AldrichC6885 
Hank's Balanced Salt SolutionThermo Fisher Scientific14025092
Surowica bydlęcapłodu Thermo Fisher Scientific12483
96-dołkowa płytka (do barwienia FACS)
Odczynnik do permeabilizacji IntraprepBeckman CoulterIM2389Zestaw z 2 częściami: roztwór utrwalający i roztwór przepuszczalny; Toksyczne
przeciwciała cTnTNeomarkery MS-295
kozie przeciwciało anty-mysie-IgG APCSondymolekularneA865
5 ml probówki do cytometrii z przepływem okrągłym dnem zależneod
Szafa pipetstrzykawkowyProbówki stołowa enzymu dysocjacyjnego ThermoFisher maszyny FACS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wintermantel, E., et al. Tissue engineering scaffolds using superstructures. Biomaterials. 17, 83-91 (1996).
  2. Lazar, A., et al. Formation of porcine hepatocyte spheroids for use in a bioartificial liver. Cell Transplant. 4, 259-268 (1995).
  3. Sachlos, E., Auguste, D. T. Embryoid body morphology influences diffusive transport of inductive biochemicals: a strategy for stem cell differentiation. Biomaterials. 29, 4471-4480 (2008).
  4. Johnstone, B., Hering, T. M., Caplan, A. I., Goldberg, V. M., Yoo, J. U. In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. Exp. Cell Res. 238, 265-272 (1998).
  5. Steinberg, M. S. Does differential adhesion govern self-assembly processes in histogenesis? Equilibrium configurations and the emergence of a hierarchy among populations of embryonic cells. J. Exp. Zool. 173, 395-433 (1970).
  6. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells Dayt. Ohio. 26, 2300-2310 (2008).
  7. Koike, M., Kurosawa, H., Amano, Y. A Round-bottom 96-well Polystyrene Plate Coated with 2-methacryloyloxyethyl Phosphorylcholine as an Effective Tool for Embryoid Body Formation. Cytotechnology. 47, 3-10 (2005).
  8. Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106, 1601-1603 (2005).
  9. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells Dayt. Ohio. 25, 929-938 (2007).
  10. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PloS One. 3, e1565(2008).
  11. Kozhich, O. A., Hamilton, R. S., Mallon, B. S. Standardized generation and differentiation of neural precursor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 9, 531-536 (2013).
  12. Ungrin, M. D., et al. Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics. Biotechnol. Bioeng. 109, 853-866 (2012).
  13. Bauwens, C. L., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 17, 1901-1909 (2011).
  14. Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reprod. Camb. Engl. 140, 3-9 (2010).
  15. Markway, B. D., et al. Enhanced chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in low oxygen environment micropellet cultures. Cell Transplant. 19, 29-42 (2010).
  16. Fey, S. J., Wrzesinski, K. Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell. Toxicol. Sci. Off. J. Soc. Toxicol. 127, 403-411 (2012).
  17. Wallace, L., Reichelt, J. Using 3D culture to investigate the role of mechanical signaling in keratinocyte stem cells. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 989, 153-164 (2013).
  18. Ungrin, M., O'Connor, M., Eaves, C., Zandstra, P. W. Phenotypic analysis of human embryonic stem cells. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. , (2007).
  19. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. JoVE. , e52010(2014).
  20. Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFβ family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Dev. Camb. Engl. 138, 861-871 (2011).
  21. Niebruegge, S., et al. Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor. Biotechnol. Bioeng. 102, 493-507 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cardiac DifferentiationHuman Pluripotent Stem CellsMicrowell AggregationAggregate Size ControlHypoxic IncubationFlow CytometryCardiac Troponin TStage Induction MediumUltra Low Attachment PlateParacrine Signaling

Related Articles