Obrazowanie wapnia u Drosophila podczas aktywacji jaj

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje adaptowalny protokół ex vivo do wizualizacji Ca²⁺ podczas aktywacji jaj u Drosophila.

Streszczenie

Aktywacja jaj to uniwersalny proces, który obejmuje serię zdarzeń, które pozwalają zapłodnionemu jaju zakończyć mejozę i zainicjować rozwój embrionalny. Jednym z aspektów aktywacji jaj, zachowanym we wszystkich badanych organizmach, jest zmiana wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia (Ca²⁺) często nazywana "falą Ca²⁺". Podczas gdy prędkość i liczba oscylacji fali Ca²⁺ różni się w zależności od gatunku, zmiana wewnątrzkomórkowego Ca^{2 +} ma kluczowe znaczenie dla wywołania wydarzeń niezbędnych dla rozwoju embrionalnego. Zmiany te obejmują wznowienie cyklu komórkowego, regulację mRNA, egzocytozę ziarnistości korowej i rearanżację cytoszkieletu.

W dojrzałym jaju Drosophila, aktywacja następuje w jajowodzie samicy przed zapłodnieniem, inicjując serię zdarzeń zależnych od^Ca2+. W tym miejscu przedstawiamy protokół obrazowania fali Ca²⁺ u Drosophila. Podejście to zapewnia manipulowalny system modelowy do badania mechanizmu fali Ca²⁺ i związanych z nią dalszych zmian.

Wprowadzenie

Zmiana wewnątrzkomórkowego stężenia Ca²⁺ przy aktywacji jaja (oocytu) jest zachowanym składnikiem wszystkich badanych organizmów ^1,2. Zdarzenie to inicjuje szeroki zakres procesów zależnych od^Ca2+, w tym wznowienie cyklu komórkowego i translację przechowywanych mRNA. Ze względu na to zapotrzebowanie na Ca²⁺, wizualizacja przejściowych zmian w wewnątrzkomórkowych stężeniach Ca²⁺ była kluczowa dla celu.

Historycznie, organizmy modelowe były wybierane do badań nad aktywacją jaj na podstawie wielkości i dostępności ich jaj. Zastosowano różne podejścia do wizualizacji w celu śledzenia i ilościowego określania zmian w wewnątrzkomórkowych stężeniach Ca^{2 +} w tych systemach, w tym: fotoproteiny aequorin w rybach medaka ³; Ca²⁺ wrażliwe barwniki fluorescencyjne, takie jak Fura-2 w jeżowcu i chomiku ^4,5; i zieleń wapniowa-1-dekstran w Xenopus ⁶.

Generowanie i ulepszanie genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (GECI) zmieniło zdolność do wizualizacji dynamiki Ca²⁺ in vivo ⁷. Te konstrukty genetyczne ulegają ekspresji w określonych tkankach i ograniczają potrzebę stosowania inwazyjnych preparatów tkankowych ⁸.

GCaMPs to klasa GECI oparta na zielonym białku fluorescencyjnym (GFP), która okazała się bardzo skuteczna ze względu na ich wysokie powinowactwo do Ca²⁺, stosunek sygnału do szumu i możliwość dostosowania do ^9-11. W obecności^Ca2+ kompleks GCaMP ulega szeregowi zmian konformacyjnych, począwszy od wiązania Ca²⁺ z kalmoduliną, co skutkuje zwiększoną intensywnością fluorescencji składnika GFP ⁹.

GCaMPs były szeroko wykorzystywane w badaniach nad neuronami Drosophila do wizualizacji zmian w wewnątrzkomórkowym wapniu¹². Niedawne zastosowanie technologii GCaMP do wizualizacji Ca²⁺ w dojrzałych jajach Drosophila ujawniło pojedynczą przejściową falę Ca²⁺ przy aktywacji jaj ^13,14. Falę Ca²⁺ można uwidocznić w małym powiększeniu podczas owulacji in vivo ¹³ lub w większym powiększeniu za pomocą testu aktywacji ex vivo ^13,14. W teście ex vivo poszczególne dojrzałe oocyty są izolowane z jajników i aktywowane za pomocą roztworu hipotonicznego, określanego jako bufor aktywacyjny, który, jak wykazano, podsumowuje zdarzenia aktywacji in vivo ^15-17.

Ten test ex vivo umożliwia łatwą wizualizację fali Ca²⁺ w wysokiej rozdzielczości w różnych warunkach eksperymentalnych, w tym przy zakłóceniach farmakologicznych, manipulacjach fizycznych i genetycznych mutantach. W artykule przedstawiono przygotowanie dojrzałych jaj Drosophila do aktywacji ex vivo i późniejszą mikroskopię wykorzystywaną do wizualizacji fali Ca²⁺ za pomocą GCaMP. Podejście to można wykorzystać do przetestowania inicjacji i kontroli fali Ca²⁺ oraz do zbadania dalszych wyników.

Protokół

Uwaga: Wykonuj wszystkie kroki w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Przygotowanie do sekcji

Uwaga: Opisane tutaj kroki są zgodne z E. Gavis, Princeton University & Weil et. al. ¹⁸. Wykonaj następujące czynności na dwa dni przed obrazowaniem.

1. Weź fiolkę na muchy zawierającą około 10 ml stałego pokarmu i dodaj niewielką ilość suszonych drożdży do jednego rogu, wystarczy mniej niż 1 g.
   Uwaga: Aby uzyskać informacje na temat fiolek na muchy lub pokarmu, patrz "Konserwacja Drosophila" ¹⁹.
2. Dodaj 1-3 krople wody, aby uwodnić drożdże.
3. Odstawić fiolkę pod kątem 45° i odczekać 3 - 5 minut, aż drożdże wchłoną wodę.
4. Podczas gdy drożdże wchłaniają wodę, wybierz butelkę much wyrażających UASt-myr GCaMP5 ²⁰ napędzanych przez wannę-VP16GAL4 (określane jako GCaMP5), które niedawno się pojawiły (wybrano mirystoylowaną formę GCaMP5, aby zapewnić wysoki stosunek sygnału do szumu poprzez przywiązanie GECI do błony w jaju).
5. Znieczulić muchy w butelce gazem CO₂ . Pamiętaj, aby trzymać butelkę odwróconą, aby nie zgubić much w mokrej karmie.
6. Przerzuć znieczulone muchy na podkładkę CO₂ i posortuj 10 - 15 samic i 5 samców za pomocą pędzla pod mikroskopem preparacyjnym. Uwaga: Standardem jest włączenie samców, aby zapewnić zdrowe samice do sekcji.
7. Gdy fiolka z kroku 1.3 będzie gotowa, dodaj do niej wybrane muchy. Należy uważać, aby fiolka była ustawiona poziomo, aż muchy staną się aktywne.
8. Umieścić fiolkę w temperaturze 25 °C na około 36 godzin.
9. Pozostałe muchy z wkładki CO₂ należy umieścić z powrotem w butelce lub wyrzucić.

2. Wycinanie jajników Drosophila

Uwaga: Opisane tutaj kroki są zgodne z Weil et al. ^{Rozdział 18}.

1. Po 36 godzinach znieczulić muchy z fiolki drożdżowej CO₂ .
2. Gdy muchy wewnątrz fiolki zostaną znieczulone, przerzuć je na podkładkę CO₂ w celu posortowania pędzlem pod mikroskopem preparacyjnym.
3. Wybierz kobietę.
4. Odizoluj dwa jajniki od samicy. Pełny szczegółowy protokół znajduje się w Weil et. al. ¹⁸. Podsumowując:
   1. Umieść małą kroplę utlenionego oleju halowęglowego (seria 95) na szkiełku nakrywkowym nr 1.5 o wymiarach 22 x 40 mm.
   2. Chwyć samicę kleszczami w przedniej części brzucha.
   3. Trzymając samicę pod mikroskopem preparacyjnym, użyj drugiego zestawu kleszczy, aby delikatnie usunąć tylną część samicy.
   4. Zetrzyj tkankę tylną z drugich kleszczy.
   5. Ściśnij jamę brzuszną drugimi kleszczami od przodu do tylnej części brzucha. Dwa nieprzezroczyste jajniki powinny przylegać do kleszczy, gdy znajdują się na zewnątrz samicy.
   6. Dotknij jajników olejem.
   7. Usuń wszelkie tkanki z kleszczy, wycierając kleszcze.
   8. Powtórzyć te kroki (2.4.1-2.4.7), aby uzyskać trzy szkiełka nakrywkowe, z których każde zawiera jajniki jednej muchy.

3. Izolowanie poszczególnych dojrzałych jaj

1. Pod standardowym mikroskopem preparacyjnym z powiększeniem ustawionym na 4X, na pierwszym szkiełku nakrywkowym z kroku 2.4, oddziel dwa jajniki, rozrywając jajowód.
2. Wprowadź parę zamkniętych kleszczy do środka pojedynczego jajnika, uważając, aby nie przebić żadnych komór jajowych.
3. Włóż standardową sondę preparacyjną do środka jajnika obok zamkniętych kleszczy.
4. Delikatnie przeciągnij sondę preparacyjną przez jajnik w kierunku tylnego bieguna, gdzie znajdują się dojrzałe jaja (komory jajowe stadium 14).
5. Powtórz kroki 3.1 - 3.4 2 - 5 razy w zależności od wielkości jajnika i liczby jaj.
   Uwaga: Dodanie CO₂ zazwyczaj powoduje złożenie pojedynczego jaja, które będzie wydawać się większe z podniesionymi wyrostkami grzbietowymi niż jaja wstępnie złożone. To jajo należy wyrzucić do obrazowania, ponieważ zostało już aktywowane wewnątrz samicy.
   Uwaga: Dojrzałe komórki jajowe prawdopodobnie łatwo oddzielają się od tkanki łącznej jajnika.
6. Jeśli na zewnątrz jajnika nie są widoczne żadne dojrzałe jaja, kontynuuj delikatne drażnienie sondą preparacyjną.
7. Gdy dojrzałe jaja będą widoczne na szkiełku nakrywkowym na zewnątrz jajnika, manewruj 3 - 5 w linii pośrodku szkiełka nakrywkowego.
   Uwaga: Aby uzyskać najlepsze wyniki, delikatnie przesuń sondę wzdłuż boku jaj.
   Uwaga: Unikaj ciągnięcia za przydatki grzbietowe, ponieważ może to uszkodzić jajo.
   Uwaga: W zależności od przyszłej konfiguracji obrazowania, ustaw jaja w odległości około 200 μm od siebie prostopadle do szkiełka nakrywkowego, aby uzyskać maksymalną powierzchnię obrazowania.
8. Po wyrównaniu usuń resztę tkanki jajnika, odciągając ją od wyrównanych komórek jajowych za pomocą kleszczy.
9. Usuń nadmiar oleju, wklepując go rogiem chusteczki medycznej. Uważaj, aby nie dotykać dojrzałych jaj chusteczką medyczną, ponieważ dojrzałe jaja, z którymi się zetkniesz, zostaną utracone.
10. Narysuj krzyżyk na szkiełku nakrywkowym za pomocą markera, aby uprościć zlokalizowanie próbki pod mikroskopem.
11. Ustaw szkiełko nakrytkowe w bezpiecznym miejscu i pozostaw przygotowane komory na jajka na szkiełku nakrywkowym na odpoczynek na 5 - 10 minut. Dzięki temu jajko może osiąść w oleju. Próbki można wykorzystać do 1 godziny po sekcji.
12. Powtórz kroki 3.1 - 3.11 dla pozostałych szkiełek nakrywkowych z jajnikami.

4. Przygotowanie do obrazowania

1. Doprowadzić przygotowany bufor aktywacyjny ¹⁵ do temperatury pokojowej.
   Uwaga: Bufor aktywacyjny jest buforem hipotonicznym: 3,3 mM NaH₂PO₄, 16,6 mM KH₂PO₄, 10 mM NaCl, 50 mM KCl, 5% glikolu polietylenowego 8 000, 2 mM CaCl₂, doprowadzony do pH 6,4 ze stosunkiem 1:5 NaOH:KOH. Więcej informacji można znaleźć w: Mahowald, 1983 ¹⁵. Podwielokrotności buforu aktywacyjnego mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez miesiące i w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
2. Starannie przetransportować przygotowane szkiełka nakrywkowe, bufor aktywacyjny i szklane pipety do zakładu obrazowania.
   Uwaga: Można użyć mikroskopu szerokokątnego, konfokalnego, z wirującym dyskiem lub mikroskopem z blachą świetlną. Zalecamy użycie mikroskopu odwróconego. Nasze reprezentatywne wyniki uzyskano przy użyciu mikroskopu konfokalnego.
3. Należy wybrać obiektyw odpowiedni do obrazowania całej dojrzałej komórki jajowej (tutaj: 20X 0,7 NA).
4. Zamontuj pierwsze przygotowane szkiełko nakrywkowe na stoliku mikroskopowym. Uważaj, aby nie złamać szkiełek nakrywkowych na scenie.
5. Jakościowo wybierz pole widzenia z dojrzałą komorą jajową do aktywacji. Nie wyobrażaj sobie przebitych komór jajowych ani tych z pęcherzykami w błonie.
   Uwaga: W przypadku kroków 4.6 - 4.7 polecenia oprogramowania będą się różnić w zależności od mikroskopu i producenta.
6. Ustawić parametry obrazowania dla standardowego wzbudzenia GFP (488 nm) i emisji (500 - 580 nm). Ustaw również widok jasnego pola, aby zwizualizować i zorientować dojrzałe jajo i przemieszczony olej.
7. Wybierz najniższą płaszczyznę Z, na której widoczne są dojrzałe jaja i ustaw pełny stos Z, który ma być pobrany dla 40 μm przy około 2 μm na krok. Ustaw parametry tak, aby nie było opóźnień między akwizycją stosu Z. Ustaw szereg czasowy do przechwytywania przez około 30 minut.

5. Obrazowanie Ex Vivo Aktywacja komórek jajowych

1. Rozpocznij przechwytywanie obrazu.
2. Poczekaj na zdobycie 1-2 pełnych stosów Z. Pokazuje dojrzałe jajo przed aktywacją.
3. Pobrać około 300 μl buforu aktywacyjnego do szklanej pipety.
4. Umieszczając końcówkę szklanej pipety zawierającej bufor aktywacyjny pod kątem 45° nad szkiełkiem nakrywkowym, powoli przesuwać pipetę na ścieżkę wiązki, aż znajdzie się bezpośrednio nad obrazowaną dojrzałą komórką jajową. Szklana pipeta powinna znajdować się 1-2 cm nad olejem.
5. Dodać 1-2 krople buforu aktywacyjnego w czasie krótszym niż 5 sekund ze szklanej pipety. To powinno wyprzeć olej. Należy unikać dodawania nadmiaru buforu aktywacyjnego lub dotykania jaja szklaną pipetą, ponieważ może to spowodować przemieszczenie dojrzałej komórki jajowej. Należy uważać, aby nie dotknąć szkiełka nakrywkowego pipetą, ponieważ może to spowodować zmianę płaszczyzny ogniskowej lub tworzenie się pęcherzyków powietrza w olejku immersyjnym między obiektywem a szkiełkiem nakrywkowym.
6. Podczas dodawania bufora aktywacyjnego podczas akwizycji obrazu, sprawdź kanał jasnego pola, aby upewnić się, że olej został przemieszczony przez bufor aktywacji.
   Uwaga: Najpierw pojawi się jako cień, ponieważ pipeta przerywa ścieżkę wiązki, ale spowoduje to również pojawienie się małych kropelek oleju. Niektóre kropelki oleju mogą pozostać związane z dojrzałą komórką jajową, co wpłynie na wyniki eksperymentów i jakość obrazu.
7. Jeżeli olej nie zostanie wyparty z początkowego dodania buforu aktywacyjnego, należy powtórzyć kroki 5.4-5.6.
8. Po pomyślnym przemieszczeniu oleju pozwól szeregom czasowym działać aż do zakończenia.
   Uwaga: Ze względu na pęcznienie oocytów podczas aktywacji, niektóre komory jajowe drastycznie przesuną się poza płaszczyznę ogniskową lub pole widzenia po dodaniu bufora aktywacyjnego. W takiej sytuacji należy przerwać akwizycję i zamontować następny szkiełko nakrywkowe.
9. Po zakończeniu akwizycji sekwencji obrazów zapisz dane.

6. Przetwarzanie obrazu po akwizycji

1. Otwórz zestaw danych za pomocą oprogramowania Fiji (http://fiji.sc/Downloads#Fiji) lub równoważnego oprogramowania do przetwarzania obrazu i wybierz odpowiednie pliki do analizy.
2. Aby zbudować projekcję pozyskanych danych wybierz: Image > Stacks > Z-project.
3. Wybierz początkowy plasterek Z i końcowy plasterek Z, zazwyczaj całą sekcję. Wybierz typ projekcji, zwykle ustawiony na "Maksymalna intensywność". Zaznacz pole wyboru "Wszystkie ramy czasowe", aby zastosować wybrane ustawienia do całej serii.
4. Jeśli zobrazowano więcej niż jeden kanał fluorescencyjny, użyj narzędzia Kanały, aby umożliwić przesuwanie między kolorami, tworzenie kompozycji lub zmianę skali szarości obrazu. Wybierz narzędzie Obraz > Kolory > Kanały.
5. Aby dostosować jasność i kontrast obrazu, wybierz Obraz > Dostosuj > Jasność/Kontrast.
6. Aby wyeksportować pojedynczy obraz, przesuń suwak skali czasu do odpowiedniej klatki i wybierz Plik > Zapisz jako > JPEG lub dowolny preferowany format.
7. Wybierz lokalizację i tytuł eksportowanego pliku, a następnie zapisz.
   Uwaga Liczba klatek na sekundę z oprogramowania do przetwarzania obrazu będzie wymagana do nadania znacznika czasu na obrazie.
8. Aby wyeksportować szereg czasowy jako film, wybierz: Plik > Zapisz jako > AVI, a następnie wybierz liczbę klatek na sekundę (~ 7 klatek na sekundę).
9. Wybierz lokalizację i tytuł eksportowanego pliku, a następnie zapisz.
10. Aby zapisać skorygowany plik w formacie Fidżi, wybierz opcję Plik > Zapisz.

Wyniki

W niniejszej pracy zademonstrowaliśmy sposób przygotowania dojrzałych jaj Drosophila do aktywacji ex vivo. Jaja wykazujące ekspresję GECI umożliwiają obrazowanie dynamiki Ca²⁺ podczas aktywacji jaja oraz na początku rozwoju embrionalnego (Rycina 1). Należy zauważyć, że w zależności od zastosowanego GCaMP, a w szczególności od obecności grupy mirystoilowej, wyniki mogą wykazywać niewielkie różnice jakościowe^{13 14}. Zademonstrowaliśmy również rolę funkcjonalnej aktyny podczas aktywacji jaja poprzez dodanie do buforu aktywacyjnego cytochalazyny D, inhibitora polimeryzacji aktyny (Rycina 2) ¹⁴.
 
Konieczność udziału cytoszkieletu podczas aktywacji jaja jest cechą konserwatywną. U C. elegans po zapłodnieniu składniki cytoszkieletu ulegają reorganizacji, aby przygotować jednokomórkowy embrion do pierwszego podziału asymetrycznego ^21,22. Wykazano, że u jeżowca zaburzenie reorganizacji cytoszkieletu po aktywacji wpływa na cykl komórkowy poprzez zapobieganie tworzeniu się pierścienia kurczliwego ²³. Rola aktyny w pośredniczeniu fali Ca²⁺ oraz jej późniejsza funkcja podczas aktywacji jaja u Drosophila nie została jeszcze w pełni wyjaśniona.
 
U Drosophila współwizualizacja fali Ca²⁺ i cytoszkieletu aktynowego jest możliwa dzięki zastosowaniu tego testu aktywacji ex vivo. Można pozyskiwać serie czasowe z wielu kanałów, a dynamikę wewnątrzkomórkowego Ca²⁺ dopasować do zmian w organizacji aktyny w oocycie (Rycina 3).

Rysunek 1: Pojedynczy jon Ca2+²⁺ Fala w Muszka owocówka Aktywacja komórki jajowej. Szereg czasowy ex vivo dojrzały Muszka owocówka jajo wykazujące ekspresję UASt-myrGCaMP5 po dodaniu buforu aktywującego (A-H)Wzrost stężenia Ca2+ w cytoplazmie²⁺ rozpoczyna się na biegunie tylnym (B) i namnaża (B-F) z przeciętną prędkością wynoszącą około 1.5 µm/secRozpoczęcie fali jest zazwyczaj obserwowane w ciągu 3 min od dodania buforu aktywacyjnego. Po aktywacji wewnątrzkomórkowe poziomy wapnia w dojrzałym oocyte powracają do wartości sprzed aktywacji. (G,H)Patrz film uzupełniający 1 (czas całkowity 33 min). Paski skali = 50 µmMaksymalna projekcja = 40 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.

Rysunek 2: Dodanie cytochalazyny D do buforu aktywacyjnego zaburza poziom Ca2+²⁺ Propagacja fal. Szeregi czasowe ex vivo dojrzały Muszka owocówka jajo wykazujące ekspresję UASt-myrGCaMP5 po dodaniu buforu aktywacyjnego zawierającego 10 µg/ml stężenie końcowe cytochalazyny D (A-H)Podczas gdy Ca²⁺ fala rozpoczyna się w biegunie tylnym (A)jest on upośledzony i nie dociera do przedniej części jaja (F) (białe groty strzałek wskazują czoło fali). Brak dalszego Ca²⁺ obserwowano zmiany w ciągu 30 min). Patrz: dodatkowy film 2 (całkowity czas 30 min). Paski skali = 50 µmMaksymalna projekcja = 40 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Współwizualizacja aktyny i Ca²⁺ podczas aktywacji oocytu w Muszka owocówka. Szeregi czasowe ex vivo dojrzały Muszka owocówka jajo wykazujące ekspresję UASt-myrGCaMP5 (Cyjan) oraz UASp-F-Tractin.tdTomato (Magenta) po dodaniu buforu aktywującego (A-H). Ca²⁺ fala rozpoczyna się od bieguna tylnego i powraca w sposób analogiczny do Rycina 1Aktyna wydaje się zmieniać w czasie, białe groty strzałek (A kontra H) Brak Ca²⁺ wykrycie sygnału w centrum dojrzałej komórki jajowej wynika z przemieszczania się próbki podczas przechwytywania obrazu. Paski skali = 50 µmMaksymalna projekcja = 40 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Pierwszym krytycznym krokiem w tym protokole jest odizolowanie dojrzałych jaj bez uszkodzenia. Można to osiągnąć poprzez delikatne manewrowanie jajami za pomocą sondy preparucyjnej. Praktyka umożliwi wykonanie tej manipulacji bez uszkodzenia jaj. Drugim kluczowym krokiem jest uniknięcie utraty próbki po nałożeniu buforu aktywacyjnego na dojrzałą komórkę jajową w oleju. Nakładanie buforu aktywacyjnego powinno odbywać się powoli i bez kontaktu ze szkiełkiem nakrywkowym. Ten etap może być trudny, jeśli konfiguracja mikroskopu nie pozwala na łatwy dostęp do próbki. Wskazane jest poruszanie pachowych części mikroskopu, takich jak inkubator temperatury.

Modyfikacje tego protokołu mogą być wprowadzone w celu wizualizacji innych czynników znakowanych fluorescencyjnie, zamiast Ca²⁺ podczas aktywacji jaja. Mówiąc bardziej ogólnie, za pomocą tego protokołu można analizować różne etapy rozwoju Drosophila lub wyniki dodania innego bufora.

Rozwiązywanie problemów może być wymagane, jeśli ustawienia mikroskopu nie są optymalne do wizualizacji sygnału z próbki. Można to osiągnąć poprzez zwiększanie lub zmniejszanie mocy lasera, zmianę zasięgu przechwytywania i dostosowanie parametrów stosu Z. Innym problemem może być konsekwentne przemieszczanie się jaj poza pole widzenia po dodaniu bufora aktywacyjnego. Jeśli zdarza się to regularnie, pozwól dojrzałym jajom osiąść na szkiełkach nakrywkowych przez dłuższy czas, od 15 do 20 minut. Należy pamiętać, że użycie oleju o wyższej lepkości zmieni wyporność oleju przez bufor aktywacyjny.

Ta przedstawiona tutaj technika jest ograniczona odległością roboczą obiektywu, odwodnieniem dojrzałych jaj i zdolnością do rozwarstwienia dojrzałych jaj bez uszkodzenia. Jednak w porównaniu z metodami obrazowania in vivo , w których dojrzały oocyt przechodzi przez dorosłą samicę i zostaje zdeponowany ¹³, nasza metoda umożliwia większą rozdzielczość przestrzenną, możliwość fizycznej manipulacji dojrzałą komórką jajową przed aktywacją oraz możliwość przetestowania roli aktywacji komórki jajowej bez zapłodnienia.

Istnieje wiele potencjalnych przyszłych zastosowań tej techniki, w tym testowanie konstruktów reporterowych dla komponentów komórkowych podczas aktywacji jaj i wizualizacja fali Ca²⁺ w zmutowanym tle ^14,24. Wraz z narzędziami eksperymentalnymi i genetycznymi, przedstawiony tutaj test aktywacji jaj ex vivo umożliwia badanie wyzwalania, propagacji i dalszych skutków uniwersalnie konserwatywnej fali Ca²⁺ .

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Drożdże czynne suche	Fleischman' s	#2192
Mikroskop preparacyjny	Leica	MZ6	Różne będą działać
Lampa	Mircotec Światłowód	MF0-90	Różne będą działać
Chusteczki medyczne	Kimberly-Clark Corporation	KLEW3020
Marker	Stabilo	841/46	OHPen uniwersalny, - dostępny w większości sklepów stacjonarnych. Bardzo drobna szerokość 0,4 mm
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114 (789060 Dutscher)
Szkiełko nakrywkowe nr 1.5, 22 x 50 mm	międzynarodowe- Nr 1-VWR Kat=631-0137-22-50mm	Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T
Olej halowęglowy, seria 95	Halocarbon Products Corp.	Dystrybutor w Europie:
Solvadis (GMBH)
Oil 10 S	VWR Chemicals	24627.188	Może być stosowany zamiast oleju halowęglowego, seria 95
Kleszcze	Fine Science Tools	11252-00	Chociaż narzędzia te powinny być czyste, użycie autoklawu nie jest konieczne, etanol byłby wystarczający.
Sonda	Fine Science Tools	10140-01
Pipeta szklana	Fisherbrand,FB50251		Pasteur Pipety, szklane, bez zasilania, 150 mm długości
Fiolka	Regina Industries	P1014	GPPS  80 mm x 25 mm