Artykuł metodologiczny

Szybkie wykrywanie molekularne i różnicowanie wirusów grypy A i B

15.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54312

⸱

30 stycznia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy szybki, molekularny test na grypę A i B. Test grypy wykrywa każdy cel w ciągu 15 minut, stosując amplifikację izotermiczną za pomocą starterów specyficznych dla grypy, a następnie wykrywanie celu za pomocą molekularnych sond ostrzegawczych. Test na grypę A i B jest przyjazny dla użytkownika i wymaga minimalnego czasu na wykonanie.

Streszczenie

Grypa jest zakaźną chorobą układu oddechowego wywoływaną przez wirusy grypy A i B u ludzi i powoduje znaczną ilość zachorowalności i śmiertelności każdego roku. Test na grypę A i B był pierwszym dostępnym szybkim molekularnym testem na grypę zwolnionym z CLIA. Test grypy A i B polega na zastosowaniu amplifikacji izotermicznej za pomocą starterów specyficznych dla grypy, a następnie wykrywania celu za pomocą molekularnych sond ostrzegawczych. W tym przypadku porównano wyniki testu na grypę A i B na zamrożonych, archiwalnych próbkach wymazu z nosogardzieli (NPS) przechowywanych w pożywce transportowej wirusa (VTM) z testem panelu oddechowego.

Wydajność testu na grypę A i B została oceniona poprzez porównanie wyników z metodą referencyjną panelu oddechowego. Czułość dla całkowitego wirusa grypy A wynosiła 67,5% (95% CI (CI), 56,6-78,5), a swoistość 86,9% (CI, 71,0-100). W przypadku testów na obecność wirusa grypy B czułość i swoistość wynosiły odpowiednio 90,2% (CI, 68,5-100) i 98,8% (CI, 68,5-100).

Ten system ma tę zaletę, że znacznie krótszy czas testu niż jakikolwiek inny obecnie dostępny test molekularny, a prosta, bezpipetowa procedura działa na w pełni zintegrowanym, zamkniętym systemie o niewielkich rozmiarach. Ogólnie rzecz biorąc, test grypy A i B oceniany w tym badaniu może potencjalnie służyć jako szybki test diagnostyczny grypy w miejscu opieki nad pacjentem.

Wprowadzenie

Infekcje wirusem grypy skutkują co roku znaczną liczbą zachorowalności i śmiertelności1,2,3. Niepowikłana grypa charakteryzuje się objawami ogólnoustrojowymi i oddechowymi, takimi jak gorączka, bóle mięśni, ból głowy i nieproduktywny kaszel4,5. Osoby starsze, małe dzieci, pacjenci z obniżoną odpornością i pacjenci z chorobami współistniejącymi są bardziej narażeni na poważne powikłania, takie jak zapalenie płuc, zapalenie mięśnia sercowego, choroba ośrodkowego układu nerwowego lub śmierć6,7.

Zakażenie grypą różni się od innych wirusów układu oddechowego tym, że szybkie podanie terapii przeciwwirusowej w ciągu 48 godzin od wystąpienia objawów może zmniejszyć nasilenie i czas trwania choroby8. Wykazano również, że szybka identyfikacja grypy zmniejsza stosowanie niepotrzebnych antybiotyków9,10. Ponadto hospitalizowani pacjenci z zakażeniami grypą muszą być umieszczani w odizolowanych pomieszczeniach z zachowaniem odpowiednich środków ostrożności w zakresie kontroli zakażeń. Jednak choroby układu oddechowego wywołane przez wirusy inne niż grypa mogą być trudne do klinicznego odróżnienia od grypy. Z tego powodu szybkie i dokładne badania diagnostyczne w kierunku grypy są bardzo ważne w klinicznym leczeniu pacjentów.

Dostępnych jest kilka testów do wykrywania i identyfikacji wirusów grypy. Szybkie testy wykrywania antygenu grypy (RIDT) są szeroko stosowane w praktyce klinicznej jako testy przyłóżkowe, ponieważ są proste w użyciu i dostarczają wyniki w ciągu 15 do 30 minut11,12; Jednak ich czułość różni się znacznie (10-80%) w zależności od producenta i badanej populacji oraz typu i podtypu grypy13,14,15. Bezpośrednie testy fluorescencyjne (DFA) zapewniają wyższą czułość niż testy RIDT, ale czas przetwarzania jest dłuższy (~3 godziny) i musi być wykonany przez wykwalifikowanych technologów16,17. Hodowla wirusa stała się złotym standardem w diagnostyce grypy i poprawiła czułość zarówno w przypadku RIDT, jak i DFAs18. Jednak posiew wirusa grypy może trwać od 2 do 14 dni do ukończenia, co zmniejsza jego użyteczność we wspomaganiu leczenia pacjenta19. Wreszcie, testy amplifikacji kwasów nukleinowych (NAAT) zastąpiły techniki hodowli jako nowy złoty standard w diagnostyce grypy. Uważa się, że NAAT mają największą czułość wykrywania grypy w ciągu kilku godzin. Jednak testy NAAT są najdroższymi testami i wymagają specjalistycznego sprzętu i technologów do wykonania5,20,21,22,23,24,25.

Opisany tutaj test na grypę A i B jest pierwszym szybko dostępnym molekularnym testem na grypę bez CLIA. Test ten działa poprzez zastosowanie reakcji amplifikacji endonukleazy Nickinga (NEAR), która wykorzystuje amplifikację izotermiczną za pomocą starterów specyficznych dla grypy, a następnie wykrywanie celu za pomocą molekularnych sond nawigacyjnych. Ten test odróżnia grypę A od B, wymaga 2 minut na ustawienie i przetworzenie jednej próbki, a łącznie 15 minut na wykonanie.

Tutaj prezentujemy protokół testu na grypę A i B. Ponadto udostępniamy przykładowy zestaw danych porównujących wydajność testu grypy A i B na archiwalnych próbkach wymazów z nosogardzieli (NPS) przechowywanych w pożywce transportowej wirusa (VTM) z innym testem panelowym patogenów układu oddechowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

OŚWIADCZENIE ETYCZNE: Wykorzystanie resztek próbek klinicznych jest zatwierdzone i zgodne z wytycznymi Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej Memorial Sloan Kettering Cancer Center.

1. Przed uruchomieniem testu

UWAGA: Test na grypę A i B jest zatwierdzony dla próbek wymazów z nosogardzieli oraz dla wymazów z nosogardzieli przechowywanych w pożywkach transportowych wirusa. Waciki są dołączone do zestawu i powinny być używane w celu uzyskania optymalnej wydajności. Jednak do pobierania próbek wymazów z nosa można również użyć wymazów ze sztucznego jedwabiu, pianki, wymazów flokowanych lub poliestrowych wymazów z nosa.

  1. Aby pobrać próbkę wymazu z nosa, włóż wacik do nozdrza, które ma najbardziej widoczny drenaż lub które jest najbardziej zatłoczone. Delikatnie obracając, wepchnij wacik do nozdrza, aż napotkasz opór i obróć kilka razy o ścianę nosa, a następnie powoli wyjmij go z nozdrza. Przechowywać wymazówki i transportować je w fiolkach zawierających 3 ml pożywki do transportu wirusów (VTM).
    UWAGA: Należy zwrócić szczególną uwagę na odpowiednie pobieranie próbek, ponieważ nieodpowiednie pobieranie próbek może dać błędne wyniki.
    UWAGA: Próbki wymazów należy przetestować jak najszybciej po pobraniu. Mogą być jednak przechowywane w temperaturze pokojowej do 2 godzin lub przechowywane w lodówce w temperaturze 2-8 °C przez maksymalnie 24 godziny, jeśli testy nie są natychmiast dostępne. Świeżo pobrane próbki są idealne dla optymalnej wydajności testu. Niewłaściwe obchodzenie się, przechowywanie i/lub transport próbki może prowadzić do błędnych wyników.
    UWAGA: Jako środek ostrożności osoby wykonujące ten test powinny traktować wszystkie próbki jako potencjalnie zakaźne, przestrzegając uniwersalnych środków ostrożności podczas obchodzenia się z próbkami.
  2. Przed badaniem doprowadzić wszystkie próbki do temperatury pokojowej.
    UWAGA: Wszystkie komponenty testowe są przeznaczone wyłącznie do jednorazowego użytku i nie powinny być używane do wykonywania wielu testów. Nie mieszaj elementów zestawu z różnych numerów partii. Nie należy używać odczynników z zestawu po upływie ich daty ważności.
  3. Przed badaniem doprowadzić odbiornik niebieskiej próbki do temperatury pokojowej. Pomarańczową bazę testową można testować bez konieczności podgrzewania do temperatury pokojowej.
  4. Pozostaw wszystkie próbki do badań w foliowym opakowaniu do momentu bezpośrednio przed użyciem. Włącz instrument, naciskając przycisk zasilania z boku instrumentu. Wprowadź identyfikator użytkownika i naciśnij "OK".

2. Przeprowadzanie testu

  1. Aby rozpocząć proces testowania, dotknij opcji "Uruchom test" na ekranie instrumentu. Wprowadź identyfikator pacjenta za pomocą klawiatury ekranowej lub skanera kodów kreskowych i naciśnij "OK". Otwórz pokrywę i włóż pomarańczową bazę testową do pomarańczowego uchwytu bazy testowej.
  2. Upewnij się, że na ekranie wyświetlany jest prawidłowy test i naciśnij "OK". Włóż niebieski odbiornik próbki do uchwytu niebieskiego odbiornika próbki.
    UWAGA: Nie otwieraj sample odbiornik przed umieszczeniem go w urządzeniu, ponieważ uniemożliwi to osiągnięcie przez bufor elucyjny prawidłowej temperatury roboczej i może wpłynąć na wydajność testu.
  3. Poczekaj, aż sample odbiornik się rozgrzeje. Po wyświetleniu monitu przez przyrząd zdejmij foliową uszczelkę i umieść wacik pacjenta, który ma być przetestowany, w ampodbiorniku próbki.
    UWAGA: Podczas zdejmowania folii połóż dwa palce na krawędzi Sample Odbiornik, aby upewnić się, że pozostaje na swoim miejscu.
  4. Energicznie mieszaj wacik z płynem przez 10 sekund, dociskając główkę wacika do boku sample odbiornika podczas mieszania, aby pomóc usunąć próbkę z wacika. Naciśnij "OK", aby kontynuować. W przypadku testowania wymazów przechowywanych w pożywce transportowej wirusa, należy wirować VTM przez 10 sekund, a następnie dodać 200 μl do odbiornika próbki.
  5. Wciśnij białą kasetę transferową do niebieskiego sample odbiornik. Kontynuuj naciskanie ampodbiornik próbki, aż pomarańczowy wskaźnik się podniesie.
  6. Podnieś, a następnie podłącz wkład transferowy do podstawy testowej. Obserwuj, jak pomarańczowy wskaźnik opada po prawidłowym zamocowaniu transferu wkładu. Zamknij pokrywę i nie otwieraj, dopóki na ekranie nie pojawi się komunikat "Test zakończony".

3. Kontrola jakości

  1. Dotknij opcji "Uruchom test kontroli jakości" na ekranie głównym. Wybierz test kontroli jakości, który ma zostać uruchomiony. Potwierdź, że typ testu pasuje do próbki kontroli jakości przeznaczonej do testowania, dotykając "OK" i postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby zakończyć testowanie.

4. Interpretacja wyników

  1. Po zakończeniu badania należy obserwować wyniki testu wyświetlane na ekranie wraz z interpretacją na obecność grypy A, B, nieznanych podtypów. W przypadku nieprawidłowych wyników powtórz test.

5. Konserwacja i czyszczenie

  1. Codziennie czyść instrument i otaczającą go ławkę 70% etanolem lub 10% roztworem wybielacza. Rozpyl roztwór czyszczący na wilgotną, niestrzępiącą się szmatkę do czyszczenia. Nie wylewaj roztworów bezpośrednio na instrument.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym badaniu zarchiwizowane próbki NPS pobrano od pacjentów hospitalizowanych z objawami grypopodobnymi w Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC) podczas epidemii grypy pomiędzy 15 grudnia 2012 r. a 1 marca 2013 r. Próbki NPS dostarczono w 3 ml VTM i przebadano w ramach rutynowej praktyki klinicznej za pomocą testu molekularnego wykrywającego panel wirusów oddechowych (RP), w tym grypy A, A-1, A-3 oraz B. W okresie badania do laboratorium klinicznego MSKCC w celu przeprowad...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wirusy grypy są istotną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Szybka i dokładna diagnoza grypy jest jednym z głównych kluczy do opanowania epidemii grypy w sezonie oddechowym. Inne testy oparte na antygenach są szybkie i łatwe do wykonania; Mają jednak niską czułość13. Z drugiej strony, tradycyjne testy molekularne mają lepszą czułość, ale wymagają bardziej doświadczonych technologów laboratoryjnych do wykonania i są droższe. Test na grypę A i B opisany w tym badaniu i protok...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy pracownikom Clinical Microbiology Service z Memorial Sloan-Kettering Cancer Center za pomoc w zbieraniu próbek klinicznych. Badanie to było częściowo wspierane przez umowę badawczą między MSKCC a Alere Scarborough (SK2013-0262).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alere i InstrumentAlereNAT-000 (Global), NAT-024 (US)
Alere i Influenza A & Zestaw testowy B 24 Alere425-000 (globalny), 425-024 (US)
Alere i skaner kodów kreskowychAlereEQ001001
Uniwersalna drukarkaAlere55115 (globalna), alereiprinter ( USA)
200 i mikro; l pipeta
200 i mikro; l jednorazowe końcówki
Podłoże do transportu wirusówRemelM4-RT
precyzyjnado pipet

Bibliografia

  1. Prevention control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices--United States, 2013-2014. , Report No. 1057-5987 1-43 (2013).
  2. Poehling, K. A., et al. The Underrecognized Burden of Influenza in Young Children. New England Journal of Medicine. 355 (1), 31-40 (2006).
  3. Estimates of Deaths Associated with Seasonal Influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. 59 (33), 1057-1089 (2010).
  4. Agrawal, A. S., et al. Comparative evaluation of real-time PCR and conventional RT-PCR during a 2 year surveillance for influenza and respiratory syncytial virus among children with acute respiratory infections in Kolkata, India, reveals a distinct seasonality of infection. Journal of Medical Microbiology. 58 (12), 1616-1622 (2009).
  5. Ginocchio, C. C. Strengths and Weaknesses of FDA-Approved/Cleared Diagnostic Devices for the Molecular Detection of Respiratory Pathogens. Clinical Infectious Diseases. 52, suppl 4 312-325 (2011).
  6. Grohskopf, L. A., et al. Prevention and control of seasonal influenza with vaccines: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices-United States, 2013-2014. MMWR Recomm Rep. 62 (07), 1-43 (2013).
  7. Molinari, N. -A. M., et al. The annual impact of seasonal influenza in the US: measuring disease burden and costs. Vaccine. 25 (27), 5086-5096 (2007).
  8. Aoki, F. Y., et al. Early administration of oral oseltamivir increases the benefits of influenza treatment. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 51 (1), 123-129 (2003).
  9. Noyola, D. E., Demmler, G. J. Effect of rapid diagnosis on management of influenza A infections. The Pediatric infectious disease journal. 19 (4), 303-307 (2000).
  10. Sharma, V., Dowd, M., Slaughter, A. J., Simon, S. D. EFfect of rapid diagnosis of influenza virus type a on the emergency department management of febrile infants and toddlers. Archives of Pediatrics & Adolescent Medicine. 156 (1), 41-43 (2002).
  11. Dale, S. E., Mayer, C., Mayer, M. C., Menegus, M. A. Analytical and clinical sensitivity of the 3M rapid detection influenza A+B assay. J Clin Microbiol. 46 (11), 3804-3807 (2008).
  12. van Doorn, H. R., et al. Clinical validation of a point-of-care multiplexed in vitro immunoassay using monoclonal antibodies (the MSD influenza test) in four hospitals in Vietnam. J Clin Microbiol. 50 (5), 1621-1625 (2012).
  13. Hurt, A. C., Alexander, R., Hibbert, J., Deed, N., Barr, I. G. Performance of six influenza rapid tests in detecting human influenza in clinical specimens. Journal of Clinical Virology. 39 (2), 132-135 (2007).
  14. Fiore, A. E., et al. Antiviral agents for the treatment and chemoprophylaxis of influenza --- recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP). MMWR Recomm Rep. 60 (1), 1-24 (2011).
  15. Harper, S. A., et al. Seasonal influenza in adults and children--diagnosis, treatment, chemoprophylaxis, and institutional outbreak management: clinical practice guidelines of the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis. 48 (8), 1003-1032 (2009).
  16. Hannoun, C., Tumova, B. Survey on influenza laboratory diagnostic and surveillance methods in Europe. European Journal of Epidemiology. 16 (3), 217-222 (2000).
  17. Leonardi, G. P. Rapid identification of 2009 H1N1 influenza A virus using fluorescent antibody methods. Am J Clin Pathol. 134 (6), 910-914 (2010).
  18. Chartrand, C., Leeflang, M. M. G., Minion, J., Brewer, T., Pai, M. Accuracy of Rapid Influenza Diagnostic TestsA Meta-analysis. Annals of Internal Medicine. 156 (7), 500-511 (2012).
  19. Lee, G. C., et al. Evaluation of a rapid diagnostic test, NanoSign(R) Influenza A/B Antigen, for detection of the 2009 pandemic influenza A/H1N1 viruses. Virol J. 7, 244(2010).
  20. Tang, Y. W., et al. Clinical accuracy of a PLEX-ID flu device for simultaneous detection and identification of influenza viruses A and B. J Clin Microbiol. 51 (1), 40-45 (2013).
  21. Bandt, D., et al. Economic high-throughput-identification of influenza A subtypes from clinical specimens with a DNA-oligonucleotide microarray in an outbreak situation. Molecular and Cellular Probes. 26 (1), 6-10 (2012).
  22. Pierce, V. M., Elkan, M., Leet, M., McGowan, K. L., Hodinka, R. L. Comparison of the Idaho Technology FilmArray system to real-time PCR for detection of respiratory pathogens in children. J Clin Microbiol. 50 (2), 364-371 (2012).
  23. Teo, J., et al. VereFlu™: an integrated multiplex RT-PCR and microarray assay for rapid detection and identification of human influenza A and B viruses using lab-on-chip technology. Archives of Virology. 156 (8), 1371-1378 (2011).
  24. Babady, N. E., et al. Comparison of the Luminex xTAG RVP Fast assay and the Idaho Technology FilmArray RP assay for detection of respiratory viruses in pediatric patients at a cancer hospital. J Clin Microbiol. 50 (7), 2282-2288 (2012).
  25. Chidlow, G., et al. Duplex real-time reverse transcriptase PCR assays for rapid detection and identification of pandemic (H1N1) 2009 and seasonal influenza A/H1, A/H3, and B viruses. J Clin Microbiol. 48 (3), 862-866 (2010).
  26. Bell, J. J., Selvarangan, R. Evaluation of the Alere I influenza A&B nucleic acid amplification test by use of respiratory specimens collected in viral transport medium. J Clin Microbiol. 52 (11), 3992-3995 (2014).
  27. Nie, S., et al. Evaluation of Alere i Influenza A&B for Rapid Detection of Influenza Viruses A and B. Journal of Clinical Microbiology. 52 (9), 3339-3344 (2014).
  28. Chapin, K. C., Flores-Cortez, E. J. Performance of the Molecular Alere i Influenza A&B Test Compared to That of the Xpert Flu A/B Assay. Journal of Clinical Microbiology. 53 (2), 706-709 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Grypa A i Bamplifikacja izotermicznasondy typu molecular beaconwymaz z nosogardzielimedium transportowe do wirus wtest panelu oddechowegotest w punkcie opieki POCTszybka diagnostyka grypydiagnostyka kliniczna

Powiązane artykuły