Tutaj prezentujemy łatwy do naśladowania protokół, który pozwala stworzyć udany system hydroponiczny do badań nad odżywianiem roślin. Protokół ten został szeroko przetestowany na Arabidopsis i może być łatwo dostosowany do innych gatunków roślin w celu zbadania określonych wymagań żywieniowych lub wpływu nieistotnych składników na wzrost i rozwój roślin.
Artykuł metodologiczny
Hydroponika: wszechstronny system do badania alokacji składników odżywczych i reakcji roślin na dostępność składników odżywczych i narażenie na pierwiastki toksyczne
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Systemy hydroponiczne były wykorzystywane jako jedna ze standardowych metod badań biologii roślin i są również używane w produkcji komercyjnej dla kilku upraw, w tym sałaty i pomidorów. W społeczności zajmującej się badaniami nad roślinami zaprojektowano liczne systemy hydroponiczne do badania reakcji roślin na stresy biotyczne i abiotyczne. Poniżej przedstawiamy protokół hydroponiczny, który można łatwo wdrożyć w laboratoriach zainteresowanych prowadzeniem badań nad odżywianiem mineralnym roślin.
Ten protokół szczegółowo opisuje system hydroponiczny i przygotowanie materiału roślinnego do udanych eksperymentów. Większość materiałów opisanych w tym protokole można znaleźć poza firmami zajmującymi się zaopatrzeniem naukowym, dzięki czemu przygotowanie do eksperymentów hydroponicznych jest tańsze i wygodniejsze.
Użycie hydroponicznego systemu wzrostu jest najbardziej korzystne w sytuacjach, gdy pożywka musi być dobrze kontrolowana i gdy nienaruszone korzenie muszą być zbierane do dalszych zastosowań. Pokazujemy również, w jaki sposób można modyfikować stężenia składników odżywczych, aby wywołać reakcje roślin zarówno na niezbędne składniki odżywcze, jak i toksyczne pierwiastki nieistotne.
Wprowadzenie
Rośliny są jednymi z niewielu organizmów, które mogą syntetyzować wszystkie wymagane metabolity z jonów nieorganicznych, wody i CO2 za pomocą energii przechwyconej ze słońca1. Hydroponika to metoda uprawy roślin, która wykorzystuje ten fakt, dostarczając wszystkich składników odżywczych w ich nieorganicznej postaci w płynnym roztworze z pożywką stałą lub bez. Systemy hydroponiczne są szeroko stosowane przez naukowców do badania wymagań dotyczących składników odżywczych, a także toksyczności niektórych pierwiastków w Arabidopsis i innych gatunkach roślin 2-5. Na przykład Berezin i wsp.3, Conn i wsp.4 oraz Alatorre-Cobos i wsp.2 Wykorzystano systemy hydroponiczne i kilka gatunków roślin, w tym pomidory i tytoń, w celu wygenerowania wystarczającej ilości biomasy roślinnej do analizy mineralnej2-4. Przemysłowe zastosowania hydroponiki zostały również opracowane dla upraw takich jak pomidory i sałata6. W tym miejscu nakreślamy zastosowanie hydroponiki w kontekście badań, możliwe różnice w dostępnych metodach, a na koniec prezentujemy system, który może być łatwo skalowalny i przydatny dla laboratoriów badawczych zainteresowanych badaniem odżywiania mineralnego roślin.
Systemy hydroponiczne pozwalają na łatwe oddzielanie tkanek korzeniowych i precyzyjną kontrolę dostępności składników odżywczych
Hydroponika oferuje kilka zalet w porównaniu z systemami opartymi na glebie. Po usunięciu z gleby tkanka korzeniowa jest często mechanicznie ścinana, powodując utratę tkanki lub uszkodzenie. Jest to szczególnie ważne w przypadku drobnych struktur korzeniowych, takich jak korzenie boczne i włośniki. Systemy hydroponiczne, które nie wykorzystują obojętnych cząstek stałych, umożliwiają mniej inwazyjne oddzielanie tkanek korzeni i pędów.
W systemach glebowych biodostępność składników odżywczych zmienia się w całej matrycy glebowej, ponieważ składniki odżywcze wiążą się z cząstkami gleby, tworząc mikrośrodowiska w glebie. Ta niejednorodność może zwiększyć poziom złożoności eksperymentów wymagających precyzyjnej kontroli zewnętrznego stężenia składników odżywczych lub innych cząsteczek. Natomiast roztwór hydroponiczny jest jednorodny i można go łatwo wymieniać w trakcie trwania eksperymentu.
Warianty systemów hydroponicznych
Wszystkie uprawy hydroponiczne polegają na pożywce, która dostarcza roślinie niezbędnych składników. Oprócz składników odżywczych korzenie potrzebują również stałego dopływu tlenu. Kiedy korzenie stają się beztlenowe, nie są w stanie pobierać i transportować metabolitów do reszty ciała rośliny7. Systemy hydroponiczne można sklasyfikować na podstawie sposobu, w jaki dostarczają tlen i inne składniki odżywcze do korzeni: dostarczanie tlenu poprzez nasycenie roztworu powietrzem (klasyczna hydroponika), nie zanurzanie korzeni przez cały czas lub pozwalanie, aby korzenie były całkowicie wystawione na działanie powietrza (aeroponika)8. W hydroponice pożywka może być nasycona powietrzem przed użyciem i często zmieniana, lub powietrze może być stale dostarczane do roztworu przez cały cykl życia rośliny9. Alternatywnie, rośliny mogą być również uprawiane na podłożach obojętnych (np. wełnie mineralnej, wermikulitu lub granulkach gliny) i poddawane cyklom mokro-suchym poprzez kapanie roztworu przez podłoże lub okresowe zanurzanie podłoża w pożywce10. W aeroponice korzenie spryskuje się pożywką, aby zapobiec wysuszeniu.
Wady systemów hydroponicznych
Chociaż uprawy hydroponiczne oferują wyraźną przewagę nad systemami opartymi na glebie, istnieją pewne kwestie, które należy wziąć pod uwagę podczas interpretacji danych. Na przykład systemy hydroponiczne narażają rośliny na warunki, które mogą być postrzegane jako niefizjologiczne. Dlatego fenotypy lub reakcje roślin wykryte za pomocą systemów hydroponicznych mogą różnić się wielkością, gdy rośliny są uprawiane w alternatywnych systemach (np. glebie lub podłożach na bazie agaru). Rozważania te nie są unikalne dla systemów hydroponicznych; Zróżnicowane reakcje można również zaobserwować, jeśli rośliny są uprawiane w różnych typach gleb 11,12.
Poniższy protokół zawiera instrukcje krok po kroku, jak skonfigurować system hydroponiczny w laboratorium. Protokół ten został zoptymalizowany dla Arabidopsis thaliana (Arabidopsis); Jednak podobne lub w niektórych przypadkach identyczne kroki można zastosować do uprawy innych gatunków.
Protokół
1. Szkółka sadzonek
- Sterylizacja w fazie gazowej nasion Arabidopsis
- Wlać nasiona (40-50 mg) do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml. (Patrz rysunek 1 dla odpowiedniej objętości nasion, ~ 50 μl). Oznacz każdą tubkę ołówkiem (atrament może wyblaknąć podczas sterylizacji). Umieść każdą opisaną probówkę z otwartą nakrętką w eksykatorze13.
- Umieścić eksykator w aktywnym dygestorium i zamknąć zawór eksykatora.
- Podwielokrotność 100 ml wybielacza (NaClO 6,15%) przelać do zlewki o pojemności 250 ml, a następnie umieścić w eksykatorze.
- Szybko dodaj 3 ml 12 M kwasu solnego do wybielacza za pomocą pipety transferowej. Szybko zamknij pokrywę eksykatora, ponieważ reakcja postępuje szybko. Pozwól, aby sterylizacja postępowała przez 4 godziny (oznaczenie probówki atramentem i zobaczenie, jak atrament zanika, pomaga zwizualizować, że wytworzyła się wystarczająca ilość chloru gazowego).
UWAGA: Chlor gazowy jest toksyczny; Z jego pozostałościami należy obchodzić się z zachowaniem dodatkowych środków ostrożności w funkcjonalnym dygestorium. Skontaktuj się z lokalnymi władzami lub odwiedź stronę internetową Departamentu Bezpieczeństwa i Higieny Pracy - University of Missouri (ESH-MU)14, aby uzyskać informacje na temat bezpieczeństwa chemicznego i wytycznych dotyczących korzystania z dygestoriów: https://ehs.missouri.edu/chem/. - Piętnaście minut przed zakończeniem sterylizacji (3,75 godziny) włącz okap z przepływem laminarnym i wyczyść powierzchnię przy użyciu 70% etanolu.
- Po 4 godzinach sterylizacji otwórz zawór, na krótko zdejmij pokrywę eksykatora z wnętrza dygestoria, usuń wybielacz i zutylizuj go zgodnie z procedurami instytucjonalnymi. Ten krok uwolni dużą część oparów chloru. Uszczelnij komorę sterylizacyjną i przynieś ją do okapu z przepływem laminarnym. Otwórz szeroko pokrywkę i napowietrzaj wysterylizowane nasiona przez około 40 minut. Po tym czasie nasiona należy zużyć natychmiast lub przechowywać w suchym miejscu.
Uwaga: Zalecana jest sterylizacja nasion w fazie gazowej, ale inne metody, takie jak naprzemienne mycie etanolem, wybielaczem i wodą, jak opisano w Alatorre-Cobos i wsp.2 są równie wydajne.
- Pożywki do kiełkowania nasion
Uwaga: Pożywka przygotowana na tym etapie to 1/4 Murashige i Skoog (MS) z witaminami15.- Do szklanej zlewki o pojemności 1 l dodać 450 ml wody dejonizowanej (woda dejonizowana), 0,55 g pożywki MS oraz witaminy, 0,3 g MES (hydrat kwasu 4-morfolinoetanosulfonowego) i mieszadło magnetyczne.
- Rozpuść i dostosuj pH do 5,7 za pomocą NaOH, a następnie dodaj 3,5 g fitoagara. Mieszaj roztwór jeszcze przez 5 minut.
- Wlej cały roztwór do cylindra miarowego i dodaj wodę DI do 500 ml. Roztwór o objętości 500 ml należy przelać w autoklawie z mieszadłem magnetycznym w środku, używając butelki o pojemności 1 litra do sterylizacji w autoklawie.
- Po autoklawowaniu roztworu mieszać roztwór przez 7-10 minut za pomocą mieszadła magnetycznego w butelce.
- Po schłodzeniu podłoża do temperatury 50-60 °C, przelać je do płytek w sterylnych warunkach i pozostawić do zestalenia. Talerze można przechowywać do późniejszego wykorzystania w chłodni.
- Posiewanie nasion
- Włącz okap z przepływem laminarnym 15 minut przed użyciem i oczyść powierzchnię 70% etanolem. Wymagane są następujące elementy: sterylne nasiona, bibuła filtracyjna, wykałaczki, taśma do mikroporów i płytki 1/4 MS.
- Umieść sterylne nasiona na sterylnej bibule filtracyjnej. Lekko zwilż jeden koniec sterylnej wykałaczki (sterylną wodą lub szturchając podłoże 1/4 MS). Użyj tego nawilżonego końca, aby zebrać nasiona z bibuły filtracyjnej, a następnie połóż je na powierzchni podłoża.
- Rozłóż nasiona na talerzu w gęstości około 1 ziarna nacm2 (Rysunek 2). Następnie użyj taśmy z mikroporami, aby przytrzymać pokrywę płytki przymocowaną do korpusu płytki. Ten rodzaj taśmy pomaga zapobiegać zanieczyszczeniom, jednocześnie umożliwiając wymianę gazową między powietrzem a mikroklimatem wewnątrz płyty.
- Przed wykiełkowaniem rozwarstwić nasiona, trzymając płytki przez dwa dni w chłodni przykrytej przed światłem.
- Po rozwarstwieniu umieść nasiona w komorze wzrostowej lub w miejscu o optymalnych warunkach wzrostu (23 °C, 16 godzin światła/8 godzin ciemności i 60% wilgotności względnej dla Arabidopsis). Sadzonki będą gotowe do hydroponiki 10-12 dni po wykiełkowaniu.
Uwaga: Podczas kiełkowania może dojść do znacznej kondensacji pod pokrywką płytki, aby zapobiec utonięciu, nadmiar wody należy wyrzucić w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym.
2. Konfiguracja hydroponiczna i proces przeszczepu
- Roztwór hydroponiczny
Uwaga: Jak wspomniano we wstępie, rośliny mogą mieć określone wymagania żywieniowe. Arabidopsis został z powodzeniem wyhodowany z pożywką pokazaną w tabeli 116. W zależności od dostawców, wymienione tutaj sole mogą mieć różną zawartość wody (uwodnioną) i stosowanie takich alternatyw nie wpływa na właściwości pożywki, o ile molowość jest utrzymywana na stałym poziomie.- Przygotować roztwory podstawowe każdego makroskładnika odżywczego w różnych butelkach (Tabela 1), a wszystkie mikroelementy z wyjątkiem Fe-EDTA w sterylnej butelce (sterylizować przez filtrację przy użyciu membran 0,22 μm). Zawsze dodawaj Fe-EDTA na końcu podczas mieszania roztworu. Przygotuj 10x pożywkę przed eksperymentem, ale w autoklawie i przechowuj w temperaturze 4 °C. Używaj lub zmieniaj składniki odżywcze tylko wtedy, gdy pożywka osiągnie temperaturę pokojową.
- Przesadzanie
- Przygotuj uchwyt na rośliny i pojemniki hydroponiczne
- Wykonaj nacięcie w piance, biegnąc wzdłuż jej długości za pomocą żyletki (patrz rysunek 3). Przygotuj jedną wtyczkę na roślinę.
- Zatyczki rurkowe z pianki do autoklawu nasączone wodą DI.
- Pokrój panel piankowy na mniejsze deski, upewniając się, że szerokość i długość płyt piankowych jest o 0,5-1,0 cm mniejsza niż rozmiar pojemnika (patrz rysunek 4).
- Użyj świdra korkowego, aby zrobić otwory w płycie piankowej. Gęstość roślin powinna być równomiernie rozłożona, najlepiej 1 roślina na 10 cm2. Ta gęstość sprawi, że rośliny będą starannie oddzielone od siebie; Możliwe są jednak większe gęstości, które nie wykluczają powodzenia eksperymentów. Upewnij się, że rozmiar otworów jest zgodny z rozmiarem zaślepek (patrz Rysunek 4).
- Napełnij pojemniki pożywką. Upewnij się, że głębokość roztworu jest wystarczająca do rozwoju korzeni (co najmniej 5 cm). Następnie ostrożnie umieść płyty piankowe na powierzchni roztworu.
- Ustawić system pompy powietrznej tak, aby dostarczał tlen do roztworu (patrz rysunek 5).
Uwaga: Napełnij pojemnik hydroponiczny pożywką tego samego dnia, w którym przesadzane są sadzonki. Zakrycie boków pojemnika przed światłem pomoże zapobiec rozwojowi glonów.
- Przenoszenie sadzonek z płytek do systemu hydroponicznego
- Użyj małej pęsety, aby delikatnie wyciągnąć każdą sadzonkę z pośredniej płytki i połóż korzeń wzdłuż nacięcia korka z rurki piankowej. Ostrożnie włóż rurkę piankową przytrzymującą sadzonkę do płyty piankowej, a następnie umieść deskę z powrotem w pojemniku hydroponicznym. Patrz rysunek 6, aby zapoznać się z odpowiednią manipulacją.
- Przygotuj uchwyt na rośliny i pojemniki hydroponiczne
3. Eksperymenty hydroponiczne
- Wymiana pożywki i manipulacja nią
- Wymiana pożywki
- Aby zastąpić pożywkę, przygotuj świeży roztwór hydroponiczny zgodnie z opisem w kroku 2.1. Wyjmij płytę piankową zawierającą rośliny z pojemnika hydroponicznego i umieść ją w tymczasowym pojemniku wypełnionym wodą lub roztworem hydroponicznym.
- Wyrzuć stary roztwór, krótko przepłucz pojemnik trzy razy wodą DI. Dodaj świeżo przygotowany roztwór hydroponiczny do tego pojemnika i delikatnie umieść płytę piankową z roślinami z powrotem w pojemniku hydroponicznym. Wymieniaj roztwór hydroponiczny dwa razy w tygodniu.
- Zmiana składu odżywczego roztworu hydroponicznego
- Dostosuj skład roztworu hydroponicznego pokazanego w tabeli 1, aby zmodyfikować końcowe stężenie pierwiastka będącego przedmiotem zainteresowania. Na przykład, aby wywołać niedobór żelaza (Fe), zmodyfikuj roztwór hydroponiczny, aby zmniejszyć stężenie Fe-EDTA. Dla porównania dołącz zestaw roślin kontrolnych uprawianych na pełnym (lub pełnym) roztworze hydroponicznym, bez żadnych modyfikacji.
- Aby manipulować pożywką z toksycznym pierwiastkiem, najpierw przygotuj niezależny roztwór podstawowy pożądanego pierwiastka toksycznego, najlepiej 1000 razy skoncentrowanego. Użyj pipety, aby napełnić roztwór hydroponiczny pierwiastkiem toksycznym do pożądanego stężenia końcowego przy użyciu 1,000 stężonego bulionu.
- Na przykład, aby przygotować 3 l roztworu hydroponicznego zawierającego 20 μM kadmu, należy przygotować 0,5 M CdCl2 i dodać 120 μl 0,5 M CdCl2 do 3 l roztworu hydroponicznego. Dla porównania dołącz zestaw kontrolny roślin uprawianych na hydroponice bez CdCl2.
UWAGA: Pierwiastki toksyczne, takie jak kadm, arsen i ołów, są bardzo niebezpieczne dla zdrowia ludzkiego i środowiska. Przed przeprowadzeniem eksperymentów należy skontaktować się z lokalnymi władzami lub odwiedzić stronę internetową EHS-MU (https://ehs.missouri.edu/train/chemical.html)14 w celu uzyskania wytycznych dotyczących bezpieczeństwa środowiskowego i zdrowotnego.
- Wymiana pożywki
- Sterylizacja narzędzi do kolejnych eksperymentów
- Ponieważ prawie cały materiał użyty do przygotowania zestawu hydroponicznego może być ponownie użyty, wyczyść różne części rozcieńczonym wybielaczem (NaClO 0,6%).
- Po spłukaniu wybielaczem dokładnie spłucz wszystkie materiały wodą DI. Przechowuj pojemniki, płyty piankowe i kamienie bąbelkowe w suchym miejscu do wykorzystania w przyszłości. Zatyczki piankowe są gotowe do ponownego użycia po usunięciu korzeni i sterylizacji w autoklawie.
Wyniki
W tej sekcji przedstawiono wyniki dwóch rodzajów eksperymentów przeprowadzonych z wykorzystaniem opisanego tutaj systemu hydroponicznego. W pierwszym eksperymencie zmodyfikowano roztwór odżywczy w celu uzyskania różnych stężeń cynku. Zmodyfikowano również roztwór odżywczy poprzez dodanie niesmiertelnych stężeń toksycznego pierwiastka – kadmu (Rycina 7). W drugim eksperymencie wykorzystano spektrometrię emisyjną z wzbudzeniem plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-OES) 1 do pomiaru składu pierwiastkowego korzeni i liści roślin hodowanych w roztworze hydroponicznym zawierającym kadm (Rycina 8). Eksperyment ten ilustruje zalety oddzielnego pozyskiwania korzeni i liści.
Eksperyment 1
Arabidopsis siewki (Col-0) hodowano w systemie hydroponicznym opisanym w krokach 1 i 2 protokołu. Rośliny wzrosty przez łącznie 3 tygodnie przed poddaniem ich działaniu różnych stężeń cynku (Rysunek 7A-B) lub nieletalnさego stężenia kadmu (Rysunek 7C). Sześć dni po potraktowaniu rośliny hodowane przy wysokich stężeniach cynku (> 42 µM) wykazały zahamowany wzrost z powodu toksyczności Zn, natomiast rośliny, którym nie dodano dodatkowego cynku, również wykazały spowolniony wzrost w porównaniu z roślinami hodowanymi przy 7 µM Zn2+. Rysunek 7 przedstawia również ograniczenie wzrostu pędów i korzeni oraz objawy chlorozy liści typowe dla roślin eksponowanych na kadm (Rysunek 7C).
Eksperyment 2
Rośliny Col-0 były hodowane zgodnie z opisem w krokach 1 i 2. Po dwóch tygodniach roztwór niemodyfikowany (pełny) zastąpiono 80 ml roztworu hydroponicznego zawierającego 20 µM Cd. Po 72 godzinach tkanki korzeniowe przemyto, przenosząc całą płytę piankową z roślinami do nowego naczynia zawierającego 80 ml Tris 20 mM (pH 8.0) i 5 mM EDTA. Roztwór ten usunie metale ciężkie związane z powierzchnią korzenia. Rośliny inkubowano w roztworze zawierającym EDTA na wytrząsarku rotacyjnej przez 5 minut. Następnie roztwór EDTA zastąpiono 80 ml wody DI, a rośliny inkubowano na wytrząsarce rotacyjnej przez kolejne 5 minut. Ten etap płukania wodą DI powtórzono dwukrotnie. Po wypłukaniu roślin wodą DI tkanki liści i korzeni zebrano oddzielnie i poddano analizie ICP-OES1. Rysunek 8 pokazuje, że skład pierwiastkowy liści różni się od składu korzeni, gdzie makroskładniki (Ca, K i Mg) w tkance liściowej występują w wyższym stężeniu w porównaniu do korzeni. Z drugiej strony, mikroelementy takie jak Zn i Fe kumulują się preferencyjnie w korzeniach. Stwierdzono, że stężenie nieessentialnego pierwiastka, kadmu, było wyższe w korzeniach w porównaniu do pędów.
Rysunek 1. Sterylizacja w fazie gazowej Arabidopsis nasiona (A) Ilość Arabidopsis nasion na probówki wiriórkowe o pojemności 1,5 ml. (B) Probówki zawierające nasiona z otwartymi zakrętkami w statywie, przygotowane do sterylizacji; dołączono jedną probówkę z zaznaczoną markerem zakrętką. (C) Układ do sterylizacji umieszczony wewnątrz eksykatora, pokrywa i zawór zamknięte. (D) Znak z tuszu na zakrętce probówki wykorzystanej w procesie sterylizacji nasion, z wyraźnym kolorem znaku przed i po sterylizacji. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rysunek 2. Etap wysiewania nasion. (A) Przed wysiewaniem nasiona umieszcza się na wysterylizowanym papierze. Do tego etapu niezbędny jest również wysterylizowany wykałaczka. (B) Lekko zwilżyć koniec wykałaczką w pożywce lub wodzie na brzegu płytki z pożywką. (C) Nasiona przenosi się na płytki z pożywką ¼ MS. (D) Idealna gęstość wysiewu nasion wynosi ≈1 nasionko/cm2. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rysunek 3. Korek piankowy służący do utrzymania sadzonek w roztworze odżywczymNacięcie połowy korka z rurki piankowej ułatwia przytrzymanie siewki podczas przesadzania z płytek do układu hydroponicznego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4. Przygotowanie płyty piankowej. (A) Przed przygotowaniem płyt piankowych w dużych ilościach należy sprawdzić rozmiar płyty szablonowej w odniesieniu do rozmiaru pojemnika. Dwie małe perforacje wykonane na środku płyty piankowej ułatwiają trzymanie i manipulowanie pianką za pomocą pęsety. (B-C) Do wykonania otworów w płycie piankowej użyto wycinaka do korka. (D) Sprawdzić, czy korek z rurki piankowej pasuje odpowiednio do otworów wykonanych w płycie piankowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 5. Ustawienie pompy powietrznej dla eksperymentu hydroponicznego w widoku z góry (A) i z boku (B). Numery oznaczają: 1 – pompa doprowadzająca powietrze; 2 – plastikowy przewód łączący pompę powietrzną z systemem zaworów do kontroli przepływu powietrza; 3 – system zaworów; 4 i 5 – plastikowe przewody łączące system zaworów z kamieniami napowietrzającymi; 6 i 7 – kamienie napowietrzające (sprzedawane do akwariów). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 6. Przenoszenie siewek do systemu hydroponicznego. (A) Za pomocą pęsety wyjmij siewkę z płytki z pożywką. (B) Umieść korzeń siewki wzdłuż nacięcia w korku z piankowej rurki. (C) Włóż piankowy korek do rurki w płytę piankową. (D) Gotowe ustawienie na płycie piankowej z sadzonkami przygotowanymi do umieszczenia w roztworze odżywczym. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 7. Roztwory odżywcze można modyfikować w celu badania efektów niedoboru lub toksyczności poszczególnych pierwiastków. 4-tygodniowe, hodowane hydroponicznie Arabidopsis 6 dni po leczeniu: (A-B) rośliny hodowane z 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42 i 50 µM cynku (Zn). Rośliny hodowane przy wysokich stężeniach Zn (> 42 µM) wykazują opóźniony wzrost (toksyczność), podczas gdy rośliny bez dodatku Zn również wykazują opóźniony wzrost (niedobór składników odżywczych) w porównaniu do roślin hodowanych z 7 µM Zn2+. (C) Rośliny hodowane wobec braku (po lewej) lub w obecności 20 µM Cd w roztworze odżywczym (zdjęcie wykonano po 6 dniach ekspozycji na Cd). Ekspozycja na kadm wywołuje chlorozę i hamuje wzrost. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 8. Skład pierwiastkowy korzeni i pędów roślin hodowanych hydroponicznie. Pędy zawierają więcej makroskładników (Ca, K, Mg) w porównaniu z korzeniami, natomiast niezbędne mikroelementy, takie jak cynk i żelazo, są bardziej skoncentrowane w korzeniachach. Podobnie niebędący niezbędnym do życia pierwiastek, kadm, akumuluje się preferencyjnie w korzeniach. Słupki błędu reprezentują 95% przedziały ufności (n = 14 dla pędów i n = 9 dla korzeni). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Rodzaj składnika odżywczego | Sól/Odczynnik | Stężenie w roztworze hydroponicznym | Jednostka |
| Makroskładnik | KNO3 | 1.250 | mM |
| Makroskładnik | KH2PO4 | 0.625 | mM |
| Makroskładnik | MgSO44 | 0.500 | mM |
| Makroskładnik | Ca(NO3)23)2 | 0.500 | mM |
| Mikroskładnik odżywczy | H3BO3 | 17.500 | µM |
| Mikroskładnik odżywczy | MnCl22 | 5.500 | µM |
| Mikroelement | ZnSO₄4 | 0.500 | µM |
| Mikroskładnik odżywczy | Na2MoO4 | 0.062 | µM |
| Mikroskładnik odżywczy | NaCl2 | 2.500 | µM |
| Mikroskładnik odżywczy | CoCl22 | 0.004 | µM |
| Mikroskładnik odżywczy | FeEDTA | 12.500 | µM |
Tabela 1. Efektywne stężenie składników odżywczych w roztworze hydroponicznym.
Dyskusja
Zdrowie sadzonek używanych do hydroponiki jest jednym z głównych czynników przyczyniających się do sukcesu eksperymentu hydroponicznego. Sterylizacja narzędzi, nasion i pożywek hodowlanych również odgrywa ważną rolę w zmniejszaniu ryzyka zanieczyszczenia i zapewnia dobry start roślinom przed przesadzeniem do systemu hydroponicznego. Środowisko pracy z urządzeniami takimi jak autoklaw, dygestorium, chłodnia (4 °C) i przestrzeń do wzrostu z kontrolowanymi warunkami (natężenie światła i temperatura) jest niezbędne do dobrego przygotowania do eksperymentu.
Świeżość pożywki decyduje również o zdrowiu roślin, a to z kolei decyduje o powodzeniu eksperymentu hydroponicznego. Ponieważ woda paruje szybciej pod bezpośrednim oświetleniem, stężenie soli zmieni się z powodu zmniejszenia całkowitej objętości roztworu; Dlatego najlepiej jest zmieniać roztwór hydroponiczny co najmniej dwa razy w tygodniu. Jeśli jednak używane są duże, głębokie pojemniki wyposażone w system pomp powietrza, wymiana pożywki w przypadku eksperymentów, które są krótkotrwałe, może nie być konieczna. Zwróć uwagę, że w przypadku Arabidopsis użyliśmy naczyń Magenta (77 mm szerokości x 77 mm długości x 97 mm wysokości), ale inne, większe pojemniki mogą być również używane do przechowywania większych roślin.
Dla badaczy zainteresowanych składnikami odżywczymi roślin, eksperymenty hydroponiczne stanowią wyjątkowe warunki do testowania fenotypów roślin i reakcji na różną dostępność składników odżywczych17. Manipulując stężeniami pierwiastków będących przedmiotem zainteresowania, naukowcy mogą przeprowadzać różne eksperymenty, aby przetestować wpływ wystarczalności, niedoboru lub toksycznych stężeń niezbędnych i nieistotnych składników odżywczych. W porównaniu z systemem opartym na glebie, system hydroponiczny zapewnia roślinom bardziej jednorodne podłoże odżywcze przy mniejszym ryzyku chorób przenoszonych przez glebę. Ponadto zarówno tkanki korzeni, jak i pędów mogą być łatwo zbierane i oddzielane w celu dalszych analiz na określonych tkankach roślinnych.
W części reprezentatywnej przedstawiliśmy dwa przykłady, w których do bardziej szczegółowych badań nad odżywianiem roślin wykorzystano prosty system hydroponiczny. W pierwszym przykładzie, uprawiając rośliny na gradiencie stężenia, byliśmy w stanie zilustrować poziom kontroli, jaki można osiągnąć w zakresie składu odżywczego za pomocą tego systemu hydroponicznego. Rośliny uprawiane z 7 μM Zn rosły znacznie energiczniej w porównaniu z roślinami uprawianymi w 50 μM Zn, podczas gdy rośliny uprawiane bez dodatku Zn były karłowate w porównaniu z roślinami uprawianymi z 7 μM Zn. Wynikało to częściowo z czasu, przez jaki rośliny mogły rosnąć w wystarczających warunkach; wcześniejsze usunięcie Zn z pożywki może wywołać silniejsze objawy niedoboru. Stosując tę samą zasadę, byliśmy w stanie wywołać toksyczność za pomocą nieistotnego metalu, kadmu, o którym wiadomo, że upośledza wzrost roślin.
W drugim przykładzie skład pierwiastkowy korzeni i pędów Col-0 traktowanych 20 μM Cd przez 72 godziny został określony za pomocą ICP-OES. Znaleźliśmy różnice we wszystkich wykrytych metalach między korzeniami a pędami. Makroelementy stwierdzono w wyższych stężeniach w pędach w stosunku do korzeni, natomiast w korzeniach częściej występowały żelazo i. Kadm miał wzór podobny do żelaza i, był bardziej skoncentrowany w korzeniach niż w pędach. Dane te wzmacniają ideę, że liście i korzenie dostarczają różnych informacji o statusie jonomu rośliny, a zatem obie tkanki muszą być analizowane oddzielnie, aby zrozumieć odżywianie i skład mineralny na poziomie całej rośliny. Oprócz ICP-OES do pomiaru składu pierwiastkowego (jonomu) tkanek roślinnych można również zastosować kilka metod spektroskopowych, takich jak atomowa spektroskopia absorpcyjna (AAS) lub spektrometria mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS).
W eksperymencie hydroponicznym objawy i fenotypy roślin reagujących na różne warunki odżywcze stanowią początek tego, co można rozszerzyć na bardziej szczegółowe analizy, takie jak ekspresja genów (transkryptomika) i obfitość białek (proteomika). Te techniki -omiczne są kluczem do integracji metabolizmu roślin poprzez uwzględnianie procesów w sposób specyficzny dla tkanki.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez Radę Badawczą Uniwersytetu Missouri (Projekt CB000519) oraz Amerykańską Narodową Fundację Nauki (IIA-1430428 do DMC). Nga T. Nguyen był wspierany przez Program Szkoleniowy Wietnamskiej Fundacji Edukacji (program wymiany gości nr G-3-10180). Dziękujemy również Rogerowi Meissenowi (MU Bond Life Sciences Center) za jego pomoc i wiedzę podczas sesji nagrywania i montażu wideo.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Do sterylizacji nasion | |||
| Bleach | The Clorox Company | NA | Zwykły wybielacz www.cloroxprofessional.com |
| Kwas solny | Fisher Scientific | A144-500 | |
| Korpus eksykatora | Nalgene | D2797 SIGMA | Sprzedawany przez Sigma-Aldrich |
| Płytka eksykatora | Nalgene | 5312-0230 | Sprzedawany przez Thermo Scientific |
| Na jedną ćwiartkę MS preparat średni | |||
| MES | Acros Organics | 172591000 | Hydrat kwasu 4-morpholineetanosulfonowego |
| Murashige and Skoog (MS) | Sigma-Aldrich | M0404-10L | |
| KOH | Fisher Scientific | P250-500 | |
| Fitoagar | Duchefa Biochemie | P1003.1000 | |
| Talerz kwadratowy | Fisher Scientific | 0875711A | Jednorazowa szalka Petriego z siatką |
| Do posiewu nasion | |||
| Bibuła filtracyjna | Whatman | 1004090 | |
| Wykałaczka | Jarden Strona główna Marki | NA | |
| Folia aluminiowa | Reynolds Wrap | NA | Standardowa folia aluminiowa |
| Taśma mikroporowa | 3M Health Care | 19-898-074 | Taśma chirurgiczna; Sprzedawane przez Fisher Scientific |
| Do przygotowania roztworu hydroponicznego | |||
| KNO3 | Fisher Scientific | BP368-500 | |
| KH2PO4Fisher | Scientific | P386-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Ca(NO3)2 | Acros Organics | A0314209 | |
| H3BO3 | Sigma | B9645-500G | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | M7634-100G | |
| ZnSO4 | Sigma | Z0251-100G | |
| Na2MoO4 | Aldrich | 737-860-5G | |
| NaCl2 | Fisher Scientific | S271-1 | |
| CoCl | Sigma-Aldrich | 232696-5G | |
| FeEDTA | Sigma | E6760-100G | |
| " Stericup & Steritop" butelka | Milipore Corporation | SCGVU02RE | Pojemnik na mikroelementy www.milipore.com |
| Do przygotowania buforu do płukania korzeni | |||
| EDTA | Acros Organics | A0305456 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP154-1 | |
| Do konfiguracji hydroponicznej | |||
| Autoklawowalnej rurki piankowej | Jaece Industries Inc. | L800-A | Identi-Plugs pasują do otworów z 2R = 6-13 mm |
| Płyta piankowa | Styropian Marka Dow | ESR-2142 | Grubość: 1/2 cala |
| Świdr korkowy | Humboldt | H-9662 | Zestawy świdrów korkowych z uchwytami, , Platerowany mosiądz Zestaw 6, 3/16 "do 1/2" Rozmiar OD |
| Pompa powietrza | Aqua Culture | MK-1504 | |
| Sprzedawana | przez Wal-mart Stores, Inc. | ||
| Rurki lotnicze i kamienie bąbelkowe do akwarium | Rurki do hodowli wodnej | : 928/25-S | |
| Rurki lotnicze i kamienie bąbelkowe akwariowe | Sprzedawane przez Wal-mart Stores, Inc. | Kamień: ASC-1 | |
| Inne | |||
| Etanol | Fisher Scientific | A995-4 | Odczynnik Alkoholowy |
| Chlorek Kadmu (CdCl2) | Sigma-Aldrich | 10108-64-2 |
Bibliografia
- McDowell, S. C., et al. Elemental Concentrations in the Seed of Mutants and Natural Variants of Arabidopsis thaliana Grown under Varying Soil Conditions. PLoS ONE. 8, 1-11 (2013).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biol. 14, 69-69 (2014).
- Berezin, I., Elazar, M., Gaash, R., Avramov-Mor, M., Shaul, O. The Use of Hydroponic Growth Systems to Study the Root and Shoot Ionome of Arabidopsis thaliana. Hydroponics - A Standard Methodology for Plant Biological Researches. Asao, T. , InTech. ISBN: 978-953-51-0386-8 (2012).
- Conn, S. J., et al. Protocol: optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9, 4-4 (2013).
- Kopittke, P. M., Blamey, F. P. C., Asher, C. J., Menzies, N. W. Trace metal phytotoxicity in solution culture: a review. J. Exp. Bot. 61, 945-954 (2009).
- Gent, M. P. N. Composition of hydroponic lettuce: effect of time of day, plant size, and season. J. Sci. Food Agric. 92, 542-550 (2012).
- Gibbs, J., Turner, D. W., Armstrong, W., Darwent, M. J., Greenway, H. Response to oxygen deficiency in primary maize roots. I. Development of oxygen deficiency in the stele reduces radial solute transport to the xylem. Funct. Plant Biol. 25, 745-758 (1998).
- Zobel, R. W., Del Tredici, P., Torrey, J. G. Method for Growing Plants Aeroponically. Plant Physiol. 57, 344-346 (1976).
- Chang, D. C., Park, C. S., Kim, S. Y., Lee, Y. B. Growth and Tuberization of Hydroponically Grown Potatoes. Potato Research. 55, 69-81 (2012).
- Resh, H. M. Hydroponic Food Production : A Definitive Guidebook for the Advanced Home Gardener and the Commercial Hydroponic Grower, Seventh Edition. , CRC Press. 199-292 (2012).
- Sharma, H. K., Chawan, D. D., Daiya, K. S. Effect of different soil types on plant growth, leaf pigments and sennoside content in Cassia species. Pharmaceutisch weekblad. 2, 65-67 (1980).
- Strojny, Z., Nowak, J. S. Effect of different growing media on the growth of some bedding plants. Acta horticulturae. 19, 157-162 (2004).
- Bent, A. Arabidopsis thaliana floral dip transformation method. Methods Mol Biol. 2, 87-103 (2006).
- Chemical Safety Environmental Health and Safety - University of Missouri. , University of Missouri. Available from: https://ehs.missouri.edu/ (2013).
- Murashige, T., Skoog, F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962).
- Lee, D. A., Chen, A., Schroeder, J. I. ars1, an Arabidopsis mutant exhibiting increased tolerance to arsenate and increased phosphate uptake. Plant J. 35, 637-646 (2003).
- Pii, Y., Cesco, S., Mimmo, T. Shoot ionome to predict the synergism and antagonism between nutrients as affected by substrate and physiological status. Plant Physiol. Biochem. 94, 48-56 (2015).
- Baxter, I. Ionomics: studying the social network of mineral nutrients. Curr. Opin. Plant Biol. 12, 381-386 (2009).
- Baxter, I. Ionomics: The functional genomics of elements. Brief Funct Genomics. 9, 149-156 (2010).
- Salt, D. E. Update on plant ionomics. Plant Physiol. 136, 2451-2456 (2004).
Przedruki i uprawnienia
