Hydroponika: wszechstronny system do badania alokacji składników odżywczych i reakcji roślin na dostępność składników odżywczych i narażenie na pierwiastki toksyczne

Summary

Tutaj prezentujemy łatwy do naśladowania protokół, który pozwala stworzyć udany system hydroponiczny do badań nad odżywianiem roślin. Protokół ten został szeroko przetestowany na Arabidopsis i może być łatwo dostosowany do innych gatunków roślin w celu zbadania określonych wymagań żywieniowych lub wpływu nieistotnych składników na wzrost i rozwój roślin.

Abstract

Systemy hydroponiczne były wykorzystywane jako jedna ze standardowych metod badań biologii roślin i są również używane w produkcji komercyjnej dla kilku upraw, w tym sałaty i pomidorów. W społeczności zajmującej się badaniami nad roślinami zaprojektowano liczne systemy hydroponiczne do badania reakcji roślin na stresy biotyczne i abiotyczne. Poniżej przedstawiamy protokół hydroponiczny, który można łatwo wdrożyć w laboratoriach zainteresowanych prowadzeniem badań nad odżywianiem mineralnym roślin.

Ten protokół szczegółowo opisuje system hydroponiczny i przygotowanie materiału roślinnego do udanych eksperymentów. Większość materiałów opisanych w tym protokole można znaleźć poza firmami zajmującymi się zaopatrzeniem naukowym, dzięki czemu przygotowanie do eksperymentów hydroponicznych jest tańsze i wygodniejsze.

Użycie hydroponicznego systemu wzrostu jest najbardziej korzystne w sytuacjach, gdy pożywka musi być dobrze kontrolowana i gdy nienaruszone korzenie muszą być zbierane do dalszych zastosowań. Pokazujemy również, w jaki sposób można modyfikować stężenia składników odżywczych, aby wywołać reakcje roślin zarówno na niezbędne składniki odżywcze, jak i toksyczne pierwiastki nieistotne.

Introduction

Rośliny są jednymi z niewielu organizmów, które mogą syntetyzować wszystkie wymagane metabolity z jonów nieorganicznych, wody i CO₂ za pomocą energii przechwyconej ze słońca¹. Hydroponika to metoda uprawy roślin, która wykorzystuje ten fakt, dostarczając wszystkich składników odżywczych w ich nieorganicznej postaci w płynnym roztworze z pożywką stałą lub bez. Systemy hydroponiczne są szeroko stosowane przez naukowców do badania wymagań dotyczących składników odżywczych, a także toksyczności niektórych pierwiastków w Arabidopsis i innych gatunkach roślin ^2-5. Na przykład Berezin i wsp.³, Conn i wsp.⁴ oraz Alatorre-Cobos i wsp.² Wykorzystano systemy hydroponiczne i kilka gatunków roślin, w tym pomidory i tytoń, w celu wygenerowania wystarczającej ilości biomasy roślinnej do analizy mineralnej^2-4. Przemysłowe zastosowania hydroponiki zostały również opracowane dla upraw takich jak pomidory i sałata⁶. W tym miejscu nakreślamy zastosowanie hydroponiki w kontekście badań, możliwe różnice w dostępnych metodach, a na koniec prezentujemy system, który może być łatwo skalowalny i przydatny dla laboratoriów badawczych zainteresowanych badaniem odżywiania mineralnego roślin.

Systemy hydroponiczne pozwalają na łatwe oddzielanie tkanek korzeniowych i precyzyjną kontrolę dostępności składników odżywczych

Hydroponika oferuje kilka zalet w porównaniu z systemami opartymi na glebie. Po usunięciu z gleby tkanka korzeniowa jest często mechanicznie ścinana, powodując utratę tkanki lub uszkodzenie. Jest to szczególnie ważne w przypadku drobnych struktur korzeniowych, takich jak korzenie boczne i włośniki. Systemy hydroponiczne, które nie wykorzystują obojętnych cząstek stałych, umożliwiają mniej inwazyjne oddzielanie tkanek korzeni i pędów.

W systemach glebowych biodostępność składników odżywczych zmienia się w całej matrycy glebowej, ponieważ składniki odżywcze wiążą się z cząstkami gleby, tworząc mikrośrodowiska w glebie. Ta niejednorodność może zwiększyć poziom złożoności eksperymentów wymagających precyzyjnej kontroli zewnętrznego stężenia składników odżywczych lub innych cząsteczek. Natomiast roztwór hydroponiczny jest jednorodny i można go łatwo wymieniać w trakcie trwania eksperymentu.

Warianty systemów hydroponicznych

Wszystkie uprawy hydroponiczne polegają na pożywce, która dostarcza roślinie niezbędnych składników. Oprócz składników odżywczych korzenie potrzebują również stałego dopływu tlenu. Kiedy korzenie stają się beztlenowe, nie są w stanie pobierać i transportować metabolitów do reszty ciała rośliny⁷. Systemy hydroponiczne można sklasyfikować na podstawie sposobu, w jaki dostarczają tlen i inne składniki odżywcze do korzeni: dostarczanie tlenu poprzez nasycenie roztworu powietrzem (klasyczna hydroponika), nie zanurzanie korzeni przez cały czas lub pozwalanie, aby korzenie były całkowicie wystawione na działanie powietrza (aeroponika)⁸. W hydroponice pożywka może być nasycona powietrzem przed użyciem i często zmieniana, lub powietrze może być stale dostarczane do roztworu przez cały cykl życia rośliny⁹. Alternatywnie, rośliny mogą być również uprawiane na podłożach obojętnych (np. wełnie mineralnej, wermikulitu lub granulkach gliny) i poddawane cyklom mokro-suchym poprzez kapanie roztworu przez podłoże lub okresowe zanurzanie podłoża w pożywce¹⁰. W aeroponice korzenie spryskuje się pożywką, aby zapobiec wysuszeniu.

Wady systemów hydroponicznych

Chociaż uprawy hydroponiczne oferują wyraźną przewagę nad systemami opartymi na glebie, istnieją pewne kwestie, które należy wziąć pod uwagę podczas interpretacji danych. Na przykład systemy hydroponiczne narażają rośliny na warunki, które mogą być postrzegane jako niefizjologiczne. Dlatego fenotypy lub reakcje roślin wykryte za pomocą systemów hydroponicznych mogą różnić się wielkością, gdy rośliny są uprawiane w alternatywnych systemach (np. glebie lub podłożach na bazie agaru). Rozważania te nie są unikalne dla systemów hydroponicznych; Zróżnicowane reakcje można również zaobserwować, jeśli rośliny są uprawiane w różnych typach gleb ^11,12.

Poniższy protokół zawiera instrukcje krok po kroku, jak skonfigurować system hydroponiczny w laboratorium. Protokół ten został zoptymalizowany dla Arabidopsis thaliana (Arabidopsis); Jednak podobne lub w niektórych przypadkach identyczne kroki można zastosować do uprawy innych gatunków.

Protocol

1. Szkółka sadzonek

1. Sterylizacja w fazie gazowej nasion Arabidopsis
   1. Wlać nasiona (40-50 mg) do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml. (Patrz rysunek 1 dla odpowiedniej objętości nasion, ~ 50 μl). Oznacz każdą tubkę ołówkiem (atrament może wyblaknąć podczas sterylizacji). Umieść każdą opisaną probówkę z otwartą nakrętką w eksykatorze¹³.
   2. Umieścić eksykator w aktywnym dygestorium i zamknąć zawór eksykatora.
   3. Podwielokrotność 100 ml wybielacza (NaClO 6,15%) przelać do zlewki o pojemności 250 ml, a następnie umieścić w eksykatorze.
   4. Szybko dodaj 3 ml 12 M kwasu solnego do wybielacza za pomocą pipety transferowej. Szybko zamknij pokrywę eksykatora, ponieważ reakcja postępuje szybko. Pozwól, aby sterylizacja postępowała przez 4 godziny (oznaczenie probówki atramentem i zobaczenie, jak atrament zanika, pomaga zwizualizować, że wytworzyła się wystarczająca ilość chloru gazowego).
      UWAGA: Chlor gazowy jest toksyczny; Z jego pozostałościami należy obchodzić się z zachowaniem dodatkowych środków ostrożności w funkcjonalnym dygestorium. Skontaktuj się z lokalnymi władzami lub odwiedź stronę internetową Departamentu Bezpieczeństwa i Higieny Pracy - University of Missouri (ESH-MU)¹⁴, aby uzyskać informacje na temat bezpieczeństwa chemicznego i wytycznych dotyczących korzystania z dygestoriów: https://ehs.missouri.edu/chem/.
   5. Piętnaście minut przed zakończeniem sterylizacji (3,75 godziny) włącz okap z przepływem laminarnym i wyczyść powierzchnię przy użyciu 70% etanolu.
   6. Po 4 godzinach sterylizacji otwórz zawór, na krótko zdejmij pokrywę eksykatora z wnętrza dygestoria, usuń wybielacz i zutylizuj go zgodnie z procedurami instytucjonalnymi. Ten krok uwolni dużą część oparów chloru. Uszczelnij komorę sterylizacyjną i przynieś ją do okapu z przepływem laminarnym. Otwórz szeroko pokrywkę i napowietrzaj wysterylizowane nasiona przez około 40 minut. Po tym czasie nasiona należy zużyć natychmiast lub przechowywać w suchym miejscu.
      Uwaga: Zalecana jest sterylizacja nasion w fazie gazowej, ale inne metody, takie jak naprzemienne mycie etanolem, wybielaczem i wodą, jak opisano w Alatorre-Cobos i wsp.² są równie wydajne.
2. Pożywki do kiełkowania nasion
   Uwaga: Pożywka przygotowana na tym etapie to 1/4 Murashige i Skoog (MS) z witaminami¹⁵.
   1. Do szklanej zlewki o pojemności 1 l dodać 450 ml wody dejonizowanej (woda dejonizowana), 0,55 g pożywki MS oraz witaminy, 0,3 g MES (hydrat kwasu 4-morfolinoetanosulfonowego) i mieszadło magnetyczne.
   2. Rozpuść i dostosuj pH do 5,7 za pomocą NaOH, a następnie dodaj 3,5 g fitoagara. Mieszaj roztwór jeszcze przez 5 minut.
   3. Wlej cały roztwór do cylindra miarowego i dodaj wodę DI do 500 ml. Roztwór o objętości 500 ml należy przelać w autoklawie z mieszadłem magnetycznym w środku, używając butelki o pojemności 1 litra do sterylizacji w autoklawie.
   4. Po autoklawowaniu roztworu mieszać roztwór przez 7-10 minut za pomocą mieszadła magnetycznego w butelce.
   5. Po schłodzeniu podłoża do temperatury 50-60 °C, przelać je do płytek w sterylnych warunkach i pozostawić do zestalenia. Talerze można przechowywać do późniejszego wykorzystania w chłodni.
3. Posiewanie nasion
   1. Włącz okap z przepływem laminarnym 15 minut przed użyciem i oczyść powierzchnię 70% etanolem. Wymagane są następujące elementy: sterylne nasiona, bibuła filtracyjna, wykałaczki, taśma do mikroporów i płytki 1/4 MS.
   2. Umieść sterylne nasiona na sterylnej bibule filtracyjnej. Lekko zwilż jeden koniec sterylnej wykałaczki (sterylną wodą lub szturchając podłoże 1/4 MS). Użyj tego nawilżonego końca, aby zebrać nasiona z bibuły filtracyjnej, a następnie połóż je na powierzchni podłoża.
   3. Rozłóż nasiona na talerzu w gęstości około 1 ziarna na^cm2 (Rysunek 2). Następnie użyj taśmy z mikroporami, aby przytrzymać pokrywę płytki przymocowaną do korpusu płytki. Ten rodzaj taśmy pomaga zapobiegać zanieczyszczeniom, jednocześnie umożliwiając wymianę gazową między powietrzem a mikroklimatem wewnątrz płyty.
   4. Przed wykiełkowaniem rozwarstwić nasiona, trzymając płytki przez dwa dni w chłodni przykrytej przed światłem.
   5. Po rozwarstwieniu umieść nasiona w komorze wzrostowej lub w miejscu o optymalnych warunkach wzrostu (23 °C, 16 godzin światła/8 godzin ciemności i 60% wilgotności względnej dla Arabidopsis). Sadzonki będą gotowe do hydroponiki 10-12 dni po wykiełkowaniu.
      Uwaga: Podczas kiełkowania może dojść do znacznej kondensacji pod pokrywką płytki, aby zapobiec utonięciu, nadmiar wody należy wyrzucić w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym.

2. Konfiguracja hydroponiczna i proces przeszczepu

1. Roztwór hydroponiczny
   Uwaga: Jak wspomniano we wstępie, rośliny mogą mieć określone wymagania żywieniowe. Arabidopsis został z powodzeniem wyhodowany z pożywką pokazaną w tabeli 1¹⁶. W zależności od dostawców, wymienione tutaj sole mogą mieć różną zawartość wody (uwodnioną) i stosowanie takich alternatyw nie wpływa na właściwości pożywki, o ile molowość jest utrzymywana na stałym poziomie.
   1. Przygotować roztwory podstawowe każdego makroskładnika odżywczego w różnych butelkach (Tabela 1), a wszystkie mikroelementy z wyjątkiem Fe-EDTA w sterylnej butelce (sterylizować przez filtrację przy użyciu membran 0,22 μm). Zawsze dodawaj Fe-EDTA na końcu podczas mieszania roztworu. Przygotuj 10x pożywkę przed eksperymentem, ale w autoklawie i przechowuj w temperaturze 4 °C. Używaj lub zmieniaj składniki odżywcze tylko wtedy, gdy pożywka osiągnie temperaturę pokojową.
2. Przesadzanie
   1. Przygotuj uchwyt na rośliny i pojemniki hydroponiczne
      1. Wykonaj nacięcie w piance, biegnąc wzdłuż jej długości za pomocą żyletki (patrz rysunek 3). Przygotuj jedną wtyczkę na roślinę.
      2. Zatyczki rurkowe z pianki do autoklawu nasączone wodą DI.
      3. Pokrój panel piankowy na mniejsze deski, upewniając się, że szerokość i długość płyt piankowych jest o 0,5-1,0 cm mniejsza niż rozmiar pojemnika (patrz rysunek 4).
      4. Użyj świdra korkowego, aby zrobić otwory w płycie piankowej. Gęstość roślin powinna być równomiernie rozłożona, najlepiej 1 roślina na 10 cm². Ta gęstość sprawi, że rośliny będą starannie oddzielone od siebie; Możliwe są jednak większe gęstości, które nie wykluczają powodzenia eksperymentów. Upewnij się, że rozmiar otworów jest zgodny z rozmiarem zaślepek (patrz Rysunek 4).
      5. Napełnij pojemniki pożywką. Upewnij się, że głębokość roztworu jest wystarczająca do rozwoju korzeni (co najmniej 5 cm). Następnie ostrożnie umieść płyty piankowe na powierzchni roztworu.
      6. Ustawić system pompy powietrznej tak, aby dostarczał tlen do roztworu (patrz rysunek 5).
         Uwaga: Napełnij pojemnik hydroponiczny pożywką tego samego dnia, w którym przesadzane są sadzonki. Zakrycie boków pojemnika przed światłem pomoże zapobiec rozwojowi glonów.
   2. Przenoszenie sadzonek z płytek do systemu hydroponicznego
      1. Użyj małej pęsety, aby delikatnie wyciągnąć każdą sadzonkę z pośredniej płytki i połóż korzeń wzdłuż nacięcia korka z rurki piankowej. Ostrożnie włóż rurkę piankową przytrzymującą sadzonkę do płyty piankowej, a następnie umieść deskę z powrotem w pojemniku hydroponicznym. Patrz rysunek 6, aby zapoznać się z odpowiednią manipulacją.

3. Eksperymenty hydroponiczne

1. Wymiana pożywki i manipulacja nią
   1. Wymiana pożywki
      1. Aby zastąpić pożywkę, przygotuj świeży roztwór hydroponiczny zgodnie z opisem w kroku 2.1. Wyjmij płytę piankową zawierającą rośliny z pojemnika hydroponicznego i umieść ją w tymczasowym pojemniku wypełnionym wodą lub roztworem hydroponicznym.
      2. Wyrzuć stary roztwór, krótko przepłucz pojemnik trzy razy wodą DI. Dodaj świeżo przygotowany roztwór hydroponiczny do tego pojemnika i delikatnie umieść płytę piankową z roślinami z powrotem w pojemniku hydroponicznym. Wymieniaj roztwór hydroponiczny dwa razy w tygodniu.
   2. Zmiana składu odżywczego roztworu hydroponicznego
      1. Dostosuj skład roztworu hydroponicznego pokazanego w tabeli 1, aby zmodyfikować końcowe stężenie pierwiastka będącego przedmiotem zainteresowania. Na przykład, aby wywołać niedobór żelaza (Fe), zmodyfikuj roztwór hydroponiczny, aby zmniejszyć stężenie Fe-EDTA. Dla porównania dołącz zestaw roślin kontrolnych uprawianych na pełnym (lub pełnym) roztworze hydroponicznym, bez żadnych modyfikacji.
      2. Aby manipulować pożywką z toksycznym pierwiastkiem, najpierw przygotuj niezależny roztwór podstawowy pożądanego pierwiastka toksycznego, najlepiej 1000 razy skoncentrowanego. Użyj pipety, aby napełnić roztwór hydroponiczny pierwiastkiem toksycznym do pożądanego stężenia końcowego przy użyciu 1,000 stężonego bulionu.
      3. Na przykład, aby przygotować 3 l roztworu hydroponicznego zawierającego 20 μM kadmu, należy przygotować 0,5 M CdCl₂ i dodać 120 μl 0,5 M CdCl₂ do 3 l roztworu hydroponicznego. Dla porównania dołącz zestaw kontrolny roślin uprawianych na hydroponice bez CdCl₂.
         UWAGA: Pierwiastki toksyczne, takie jak kadm, arsen i ołów, są bardzo niebezpieczne dla zdrowia ludzkiego i środowiska. Przed przeprowadzeniem eksperymentów należy skontaktować się z lokalnymi władzami lub odwiedzić stronę internetową EHS-MU (https://ehs.missouri.edu/train/chemical.html)¹⁴ w celu uzyskania wytycznych dotyczących bezpieczeństwa środowiskowego i zdrowotnego.
2. Sterylizacja narzędzi do kolejnych eksperymentów
   1. Ponieważ prawie cały materiał użyty do przygotowania zestawu hydroponicznego może być ponownie użyty, wyczyść różne części rozcieńczonym wybielaczem (NaClO 0,6%).
   2. Po spłukaniu wybielaczem dokładnie spłucz wszystkie materiały wodą DI. Przechowuj pojemniki, płyty piankowe i kamienie bąbelkowe w suchym miejscu do wykorzystania w przyszłości. Zatyczki piankowe są gotowe do ponownego użycia po usunięciu korzeni i sterylizacji w autoklawie.

Results

W tej sekcji przedstawiono wyniki dwóch rodzajów eksperymentów z wykorzystaniem opisanego tutaj systemu hydroponicznego. W pierwszym eksperymencie pożywka została zmodyfikowana w celu uzyskania różnych stężeń. Zmodyfikowaliśmy również pożywkę, dodając nieśmiertelne stężenia toksycznego pierwiastka kadmu (ryc. 7). W drugim eksperymencie użyliśmy optycznej spektrometrii emisyjnej ze wzbudzeniem w plazmie indukcyjnie sprzężonej (ICP-OES) ¹ do pomiaru składu pierwiastkowego korzeni i liści roślin uprawianych w roztworze hydroponicznym zawierającym kadm (ryc. 8). Ten eksperyment ilustruje zalety osobnego pozyskiwania korzeni i liści.

Eksperyment 1

Siewki rzodkiewnika (Col-0) były uprawiane w systemie hydroponicznym opisanym w krokach protokołu 1 i 2. Roślinom pozwolono rosnąć w sumie przez 3 tygodnie, zanim zostały potraktowane różnymi stężeniami (ryc. 7A-B) lub nieśmiertelnym stężeniem kadmu (ryc. 7C). Sześć dni po zabiegu rośliny uprawiane przy wysokich stężeniach (> 42 μM) wykazywały opóźniony wzrost z powodu toksyczności Zn, podczas gdy rośliny bez dodatku również wykazują opóźniony wzrost w porównaniu z roślinami uprawianymi z 7 μM Zn²⁺. Rysunek 7 pokazuje również zmniejszenie wzrostu pędów, wzrostu korzeni i chlorotycznych objawów liści typowych dla roślin narażonych na działanie kadmu (Rysunek 7C).

Eksperyment 2

Rośliny Col-0 były uprawiane zgodnie z opisem w krokach 1 i 2. Po dwóch tygodniach niemodyfikowany (pełny) roztwór zastąpiono 80 ml roztworu hydroponicznego zawierającego 20 μM Cd. Po 72 godzinach tkanki korzeniowe przemyto poprzez przeniesienie całej płyty piankowej z roślinami do nowego naczynia zawierającego 80 ml Tris 20 mM (pH 8,0) i 5 mM EDTA. To rozwiązanie usunie metale ciężkie związane z powierzchnią korzenia. Rośliny inkubowano w roztworze zawierającym EDTA na wytrząsarce obrotowej przez 5 minut. Roztwór EDTA zastąpiono następnie 80 ml wody demineralizowanej, a rośliny inkubowano na wytrząsarce obrotowej przez dodatkowe 5 minut. Ten etap płukania wodą demineralizowaną powtórzono dwukrotnie. Po spłukaniu roślin wodą DI, tkanki liści i korzeni zostały zebrane niezależnie i przetworzone na ICP-OES¹. Rysunek 8 pokazuje, że skład pierwiastkowy liści różni się od korzeni, gdzie makroelementy (Ca, K i Mg) w tkance liścia są obecne w wyższym stężeniu niż w korzeniach. Z drugiej strony mikroelementy, takie jak Zn i Fe, są preferencyjnie gromadzone w korzeniach. Stwierdzono, że stężenie pierwiastka nieistotnego kadmu jest wyższe w korzeniach niż w pędach.

Rysunek 1. Sterylizacja w fazie gazowej nasion Arabidopsis. (A) Ilość nasion Arabidopsis w 1,5 ml probówek wirówkowych. (B) Probówki zawierające nasiona z otwartymi nakrętkami w uchwycie stojaka na probówki, gotowe do sterylizacji, w zestawie jedna probówka z tuszem zaznaczonym na nakrętce. (C) Sterylizacja ustawiona wewnątrz eksykatora, zamknięta pokrywa i zawór. (D) Ślad atramentu na wieczku probówki włączonej do procesu sterylizacji nasion z silnym kolorem śladu atramentu przed i po sterylizacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Etap posiewu nasion. (A) Nasiona umieszcza się na wysterylizowanym papierze przed posiewem. Do tego kroku wymagana jest również wysterylizowana wykałaczka. (B) Lekko zwilż koniec wykałaczki pożywką lub wodą z boku płytki średniej. (C) Nasiona przenosi się na płytki o objętości 1/4 MS. (D) Idealna gęstość nasion wynosi ≈1 ziarno/cm². Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Korek piankowy służący do utrzymywania sadzonek w pożywce. Nacięcie na połowie korka rurki piankowej pomaga utrzymać sadzonkę podczas przesadzania z płytek do hydroponiki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Przygotowanie płyty piankowej. (A) Sprawdź rozmiar szablonowej płyty piankowej z rozmiarem pojemnika przed przygotowaniem płyt piankowych w dużych ilościach. Dwie małe perforacje wykonane pośrodku płyty piankowej ułatwiają trzymanie i przenoszenie pianki za pomocą pęsety. (B-C) Świdr korkowy służy do tworzenia otworów w płycie piankowej. (D) Sprawdź prawidłowe dopasowanie między zatyczką rurki piankowej a otworami utworzonymi w płycie piankowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Ustawienie pompy powietrza do eksperymentu hydroponicznego z góry view (A) i widok z boku (B). Liczby wskazują: 1 - pompa dostarczająca powietrze; 2 - plastikowa rurka łącząca pompę powietrza z systemem zaworów w celu sterowania przepływem powietrza; 3 - system zaworów; 4 i 5 - plastikowa rurka łącząca system zaworów z kamieniami bąbelkowymi do napowietrzania; 6 i 7 - kamienie bąbelkowe (sprzedawane do akwariów). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Przenoszenie sadzonek do systemu hydroponicznego. (A) Użyj pęsety, aby wyjąć sadzonkę z pośredniej płytki. (B) Umieść korzeń sadzonki wzdłuż nacięcia na korku rurki piankowej. (C) Włóż zatyczkę rurki piankowej do płyty piankowej. (D) Gotowe ustawienie płyty piankowej z sadzonkami gotowymi do umieszczenia na pożywce. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7. Pożywki mogą być modyfikowane w celu zbadania niedoboru lub toksycznego działania pierwiastków. 4-tygodniowy hydroponicznie uprawiany rzodkiewnik 6 dni po zabiegu: (A-B) rośliny uprawiane z 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42 i 50 μM Zn. Rośliny uprawiane przy wysokich stężeniach Zn (> 42 μM) wykazują opóźniony wzrost (toksyczność), podczas gdy rośliny bez dodatku Zn również wykazują opóźniony wzrost (niedobór składników odżywczych) w porównaniu z roślinami uprawianymi z 7 μM Zn²⁺. (C) Rośliny uprawiane przy braku (po lewej) lub obecności 20 μM Cd w pożywce (zdjęcie wykonano po 6 dniach ekspozycji na Cd). Narażenie na kadm indukuje chlorozę i ogranicza wzrost. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8. Skład pierwiastkowy korzeni i pędów roślin uprawianych hydroponicznie. Pędy zawierają więcej makroelementów (Ca, K, Mg) w porównaniu z korzeniami, podczas gdy niezbędne mikroelementy i żelazo są bardziej skoncentrowane w korzeniach. Podobnie nieistotny pierwiastek kadm jest preferencyjnie gromadzony w korzeniach. Słupki błędów reprezentują 95% przedziały ufności (n = 14, pędy i n= 9, korzenie). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt. TGLI Pokój pkt. Szt. Rozdział

Rodzaj składnika odżywczego	Sól/odczynnik	Stężenie w roztworze hydroponicznym	jednostka
Makroskładnik odżywczy	Zobaczmateriał KNO 3	1,250	Mm
Makroskładnik odżywczy	KH2PO4	0,625	Mm
Makroskładnik odżywczy	MgSO4	0,500	Mm
Makroskładnik odżywczy	Ca(NO3)2	0,500	Mm
Mikroelement	H3BO3	17.500	μM
Mikroelement	MnCl2	5.500	μM
Mikroelement	ZnSO4	0,500	μM
Mikroelement	Na2MoO4	0,062	μM
Mikroelement	NaCl2	2.500	μM
Mikroelement	Klon2	0,004	μM
Mikroelement	FeEDTA	12.500	μM

Tabela 1. Efektywne stężenie składników odżywczych w roztworze hydroponicznym

.

Discussion

Zdrowie sadzonek używanych do hydroponiki jest jednym z głównych czynników przyczyniających się do sukcesu eksperymentu hydroponicznego. Sterylizacja narzędzi, nasion i pożywek hodowlanych również odgrywa ważną rolę w zmniejszaniu ryzyka zanieczyszczenia i zapewnia dobry start roślinom przed przesadzeniem do systemu hydroponicznego. Środowisko pracy z urządzeniami takimi jak autoklaw, dygestorium, chłodnia (4 °C) i przestrzeń do wzrostu z kontrolowanymi warunkami (natężenie światła i temperatura) jest niezbędne do dobrego przygotowania do eksperymentu.

Świeżość pożywki decyduje również o zdrowiu roślin, a to z kolei decyduje o powodzeniu eksperymentu hydroponicznego. Ponieważ woda paruje szybciej pod bezpośrednim oświetleniem, stężenie soli zmieni się z powodu zmniejszenia całkowitej objętości roztworu; Dlatego najlepiej jest zmieniać roztwór hydroponiczny co najmniej dwa razy w tygodniu. Jeśli jednak używane są duże, głębokie pojemniki wyposażone w system pomp powietrza, wymiana pożywki w przypadku eksperymentów, które są krótkotrwałe, może nie być konieczna. Zwróć uwagę, że w przypadku Arabidopsis użyliśmy naczyń Magenta (77 mm szerokości x 77 mm długości x 97 mm wysokości), ale inne, większe pojemniki mogą być również używane do przechowywania większych roślin.

Dla badaczy zainteresowanych składnikami odżywczymi roślin, eksperymenty hydroponiczne stanowią wyjątkowe warunki do testowania fenotypów roślin i reakcji na różną dostępność składników odżywczych¹⁷. Manipulując stężeniami pierwiastków będących przedmiotem zainteresowania, naukowcy mogą przeprowadzać różne eksperymenty, aby przetestować wpływ wystarczalności, niedoboru lub toksycznych stężeń niezbędnych i nieistotnych składników odżywczych. W porównaniu z systemem opartym na glebie, system hydroponiczny zapewnia roślinom bardziej jednorodne podłoże odżywcze przy mniejszym ryzyku chorób przenoszonych przez glebę. Ponadto zarówno tkanki korzeni, jak i pędów mogą być łatwo zbierane i oddzielane w celu dalszych analiz na określonych tkankach roślinnych.

W części reprezentatywnej przedstawiliśmy dwa przykłady, w których do bardziej szczegółowych badań nad odżywianiem roślin wykorzystano prosty system hydroponiczny. W pierwszym przykładzie, uprawiając rośliny na gradiencie stężenia, byliśmy w stanie zilustrować poziom kontroli, jaki można osiągnąć w zakresie składu odżywczego za pomocą tego systemu hydroponicznego. Rośliny uprawiane z 7 μM Zn rosły znacznie energiczniej w porównaniu z roślinami uprawianymi w 50 μM Zn, podczas gdy rośliny uprawiane bez dodatku Zn były karłowate w porównaniu z roślinami uprawianymi z 7 μM Zn. Wynikało to częściowo z czasu, przez jaki rośliny mogły rosnąć w wystarczających warunkach; wcześniejsze usunięcie Zn z pożywki może wywołać silniejsze objawy niedoboru. Stosując tę samą zasadę, byliśmy w stanie wywołać toksyczność za pomocą nieistotnego metalu, kadmu, o którym wiadomo, że upośledza wzrost roślin.

W drugim przykładzie skład pierwiastkowy korzeni i pędów Col-0 traktowanych 20 μM Cd przez 72 godziny został określony za pomocą ICP-OES. Znaleźliśmy różnice we wszystkich wykrytych metalach między korzeniami a pędami. Makroelementy stwierdzono w wyższych stężeniach w pędach w stosunku do korzeni, natomiast w korzeniach częściej występowały żelazo i. Kadm miał wzór podobny do żelaza i, był bardziej skoncentrowany w korzeniach niż w pędach. Dane te wzmacniają ideę, że liście i korzenie dostarczają różnych informacji o statusie jonomu rośliny, a zatem obie tkanki muszą być analizowane oddzielnie, aby zrozumieć odżywianie i skład mineralny na poziomie całej rośliny. Oprócz ICP-OES do pomiaru składu pierwiastkowego (jonomu) tkanek roślinnych można również zastosować kilka metod spektroskopowych, takich jak atomowa spektroskopia absorpcyjna (AAS) lub spektrometria mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS).

W eksperymencie hydroponicznym objawy i fenotypy roślin reagujących na różne warunki odżywcze stanowią początek tego, co można rozszerzyć na bardziej szczegółowe analizy, takie jak ekspresja genów (transkryptomika) i obfitość białek (proteomika). Te techniki -omiczne są kluczem do integracji metabolizmu roślin poprzez uwzględnianie procesów w sposób specyficzny dla tkanki.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Do sterylizacji nasion
Bleach	The Clorox Company	NA	Zwykły wybielacz www.cloroxprofessional.com
Kwas solny	Fisher Scientific	A144-500
Korpus eksykatora	Nalgene	D2797 SIGMA	Sprzedawany przez Sigma-Aldrich
Płytka eksykatora	Nalgene	5312-0230	Sprzedawany przez Thermo Scientific
Na jedną ćwiartkę MS preparat średni
MES	Acros Organics	172591000	Hydrat kwasu 4-morpholineetanosulfonowego
Murashige and Skoog (MS)	Sigma-Aldrich	M0404-10L
KOH	Fisher Scientific	P250-500
Fitoagar	Duchefa Biochemie	P1003.1000
Talerz kwadratowy	Fisher Scientific	0875711A	Jednorazowa szalka Petriego z siatką
Do posiewu nasion
Bibuła filtracyjna	Whatman	1004090
Wykałaczka	Jarden Strona główna Marki	NA
Folia aluminiowa	Reynolds Wrap	NA	Standardowa folia aluminiowa
Taśma mikroporowa	3M Health Care	19-898-074	Taśma chirurgiczna; Sprzedawane przez Fisher Scientific
Do przygotowania roztworu hydroponicznego
KNO3	Fisher Scientific	BP368-500
KH2PO4Fisher	Scientific	P386-500
MgSO4	Fisher Scientific	M63-500
Ca(NO3)2	Acros Organics	A0314209
H3BO3	Sigma	B9645-500G
MnCl2	Sigma-Aldrich	M7634-100G
ZnSO4	Sigma	Z0251-100G
Na2MoO4	Aldrich	737-860-5G
NaCl2	Fisher Scientific	S271-1
CoCl	Sigma-Aldrich	232696-5G
FeEDTA	Sigma	E6760-100G
" Stericup & Steritop" butelka	Milipore Corporation	SCGVU02RE	Pojemnik na mikroelementy www.milipore.com
Do przygotowania buforu do płukania korzeni
EDTA	Acros Organics	A0305456
Tris	Fisher Scientific	BP154-1
Do konfiguracji hydroponicznej
Autoklawowalnej rurki piankowej	Jaece Industries Inc.	L800-A	Identi-Plugs pasują do otworów z 2R = 6-13 mm
Płyta piankowa	Styropian Marka  Dow	ESR-2142	Grubość: 1/2 cala
Świdr korkowy	Humboldt	H-9662	Zestawy świdrów korkowych z uchwytami, , Platerowany mosiądz Zestaw 6, 3/16 "do 1/2" Rozmiar OD
Pompa powietrza	Aqua Culture	MK-1504
Sprzedawana	przez Wal-mart Stores, Inc.
Rurki lotnicze i kamienie bąbelkowe do akwarium	Rurki do hodowli wodnej	: 928/25-S
Rurki lotnicze i kamienie bąbelkowe akwariowe	Sprzedawane przez Wal-mart Stores, Inc.	Kamień: ASC-1
Inne
Etanol	Fisher Scientific	A995-4	Odczynnik Alkoholowy
Chlorek Kadmu (CdCl2)	Sigma-Aldrich	10108-64-2