Synteza nanoprętów złota oparta na hydrochinonach

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje protokół syntezy nanoprętów złota, oparty na użyciu hydrochinonu jako środka redukującego, a także różne mechanizmy kontroli ich wielkości i proporcji.

Streszczenie

Złote nanopręty są ważnym rodzajem nanocząstek charakteryzujących się szczególnymi właściwościami plazmonicznymi. Pomimo ich powszechnego zastosowania w nanotechnologii, syntetyczne metody otrzymywania nanoprętów złota wciąż nie są w pełni zoptymalizowane. W artykule opisano nowy, wysoce skuteczny, dwuetapowy protokół oparty na zastosowaniu hydrochinonu jako łagodnego środka redukującego. Nasze podejście pozwala na przygotowanie nanoprętów z dobrą kontrolą wielkości i proporcji (AR) po prostu poprzez zmianę ilości bromku heksadecylotrimetyloamoniowego (CTAB) i jonów srebra (Ag⁺) obecnych w "roztworze wzrostowym". Dzięki zastosowaniu tej metody możliwe jest znaczne zmniejszenie ilości CTAB, drogiego i cytotoksycznego odczynnika, niezbędnego do uzyskania wydłużonego kształtu. Złote nanopręty o proporcjach około 3 można uzyskać w obecności zaledwie 50 mM CTAB (w porównaniu do 100 mM stosowanych w standardowym protokole opartym na użyciu kwasu askorbinowego), podczas gdy krótsze nanopręty złota uzyskuje się przy stężeniu już od 10 mM.

Wprowadzenie

Nanocząstki złota (AuNPs) są jednymi z najbardziej rozpowszechnionych i obiecujących nanostruktur do wykorzystania w zastosowaniach biomedycznych. Ich stosowanie ma zasadnicze znaczenie w wielu produktach do diagnostyki in vitro w miejscu opieki nad pacjentem. ¹ Zaproponowano je jako skuteczne narzędzie do wielu innych zastosowań: jako środek kontrastowy w badaniach ^{obrazowych2, jako system dostarczania} leków3 oraz jako leki do termoterapii indukowanej światłem (lub terapii fototermicznej). ⁴ Ogromny potencjał AuNPs skłonił w ciągu ostatnich dwudziestu lat do intensywnych badań nad opracowaniem nowej syntezy, która jest w stanie zwiększyć kontrolę nad uzyskiwanym rozmiarem i kształtem. ⁵ Dzieje się tak dlatego, że różne rodzaje AuNP są w rzeczywistości bardziej odpowiednie niż inne do określonych zastosowań.

Wśród różnych nanostruktur złota, jednym z najciekawszych systemów okazały się złote nanopręty (AuNRs). AuNR charakteryzują się dwoma pikami plazmonicznymi związanymi z oscylacją elektronów odpowiednio wzdłuż osi podłużnej i poprzecznej. ⁶ Szczególnie ważne jest, aby położenie najbardziej intensywnego szczytu podłużnego można było precyzyjnie dostroić w zakresie od 620 do 800 nm, w zależności od proporcji prętów. Region ten pasuje do okna biologicznego,7 w którym ludzkie tkanki prawie nie absorbują światła, co pozwala na rozwój wielu zastosowań fotonicznych in vivo z udziałem AuNPs.

Pomimo ogromnego zainteresowania tego rodzaju nanostrukturami, protokoły syntetyczne do przygotowania AuNR mają kilka ograniczeń. W większości przypadków nanopręty są przygotowywane zgodnie z dwuetapową metodą opracowaną przez Sau i współpracowników. ⁸ W ich protokole nanopręty są syntetyzowane przez redukcję jonów złota za pomocą kwasu askorbinowego w obecności wstępnie uformowanych nasion złota, jonów srebra i dużej ilości bromku heksadecylotrimetyloamoniowego (CTAB), kationowego liniowego środka powierzchniowo czynnego.

Wadą tego protokołu jest to, że wydajność redukcji jonów złota jest stosunkowo niska (około 20%) ⁹ i że potrzebna jest duża ilość CTAB, drogiego odczynnika, który stanowi ponad połowę całkowitego kosztu odczynników w syntezie. Opracowanie nowej i bardziej wydajnej drogi syntezy jest zatem uważane za ważną potrzebę, która pozwoli na rozpowszechnienie podejść biomedycznych opartych na AuNR.

W pierwszej części niniejszego artykułu prezentujemy zoptymalizowany protokół przygotowania AuNR o współczynniku proporcji około trzech. Synteza opiera się na wykorzystaniu hydrochinonu jako łagodnego środka redukującego i pozwala na otrzymanie AuNR z prawie ilościową redukcją jonów złota, z wykorzystaniem zmniejszonej ilości CTAB. ¹⁰ Niniejszy protokół przygotowania AuNR opiera się na dwuetapowym podejściu, w którym nasiona złota są wykorzystywane w "roztworze wzrostowym".

W drugiej części pokazujemy, jak precyzyjnie dostosować rozmiar i proporcje uzyskanego AuNR na dwa sposoby. Pierwszym sposobem, podobnym do standardowego protokołu opartego na kwasie askorbinowym, jest zmiana ilości jonów srebra obecnych w "roztworze wzrostowym". Drugi sposób opiera się na zmienności ilości CCAB, którą można zmniejszyć do stężenia 10 mM (zbliżonego do krytycznego stężenia micelarnego podawanego przez dostawcę) w celu uzyskania dobrze zdefiniowanych krótkich nanoprętów.

Protokół

1. Synteza nanoprętów złota

Uwaga: Przez cały czas używaj wysoce oczyszczonej wody.

1. Przygotowanie ziaren złota
   1. Rozpuścić 364,4 mg bromku heksadecylotrimetyloamoniowego (CTAB) w 5 ml wody, pod wpływem ultradźwięków w temperaturze 40 °C, aż roztwór stanie się klarowny. Poczekaj, aż roztwór CTAB ostygnie do temperatury pokojowej.
   2. Oddzielnie przygotować 5 ml kwasu tetrachloroaurowego (HAuCl₄) w wodzie (0,5 mM).
   3. Dodać roztwór HAuCl₄ do roztworu CTAB pod energicznym mieszaniem magnetycznym, utrzymując stałą temperaturę na poziomie 27 °C.
   4. Przygotować 600 μl roztworu borowodorku sodu (NaBH₄) w wodzie (10 mM) o temperaturze 4 °C. Dodać ten roztwór do mieszaniny energicznie mieszając. Sprawdź, czy kolor roztworu natychmiast zmieni się z żółtego na brązowawy.
   5. Mieszać zawiesinę przez 20 minut przed użyciem. Zawiesinę nasion należy przechowywać nie dłużej niż 24 godziny w temperaturze pokojowej.
   6. Sprawdź wymiary nasion za pomocą spektrofotometru UV-Vis. Upewnij się, że nasiona są wystarczająco małe (około 2 nm), aby można je było wykorzystać do przygotowania nanoprętów złota metodą spektroskopii w świetle UV.
      Uwaga: Widmo musi być podobne do tego, które przedstawiono na rysunku 1. Nie wolno stosować większych zarodków identyfikowanych przez obecność piku plazmonicznego o długości fali około 505-520 nm, ponieważ mogą one wytwarzać kuliste nanocząstki.
2. Przygotowanie "roztworu wzrostowego" nanoprętów złota.
   1. Rozpuścić 182,2 mg CTAB razem z 22 mg hydrochinonu w 5 ml wody o temperaturze 40 °C za pomocą ultradźwięków. Schłodzić roztwór do temperatury 27 °C.
   2. Przygotować 200 μl 4 mM roztworu azotanu srebra (AgNO₃).
   3. Oddzielnie przygotować 5 ml 1 mM roztworu kwasu tetrachloroaurowego (HAuCl₄).
   4. Najpierw dodaj roztwór azotanu srebra przygotowany w kroku 1.2.2. Następnie dodać roztwór HAuCl₄ przygotowany w kroku 1.2.3 do roztworu CTAB i hydrochinonu przygotowanego w kroku 1.2.1 mieszając magnetycznie.
   5. Natychmiast po tym, pod mieszaniem magnetycznym dodać 12 μl zawiesiny nasion uprzednio przygotowanej zgodnie z protokołem przedstawionym w kroku 1.1 i pozostawić reakcję do rozpoczęcia. Sprawdź, czy zawieszenie zmieni kolor w ciągu około 30 minut.
   6. Kontroluj tworzenie się nanoprętów, sprawdzając widmo widzialne UV zawiesiny, jak opisano w sekcji 4, co 5 minut. Kontynuuj, aż widmo się ustabilizuje. Aby umożliwić pełne uformowanie nanoprętów, należy pozostawić zawiesinę pod mieszaniem przez kolejne 30 minut (rysunek 2).
   7. Podzielić zawiesinę na probówki (1 ml zawiesiny na każdą probówkę) i odwirować przy 10 000 x g przez 10 minut. Złote nanopręty tworzą ciemny osad na dnie probówki.
   8. Zawiesić osad z każdej probówki w 1 ml wody. Wymieszaj ze sobą zawartość probówek i przechowuj zawiesinę złotych nanoprętów w temperaturze pokojowej.
   9. Scharakteryzować otrzymane nanopręty za pomocą spektroskopii UV-widzialnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej, jak opisano w sekcji 4 (Rysunek 3).

2. Dostrajanie proporcji nanoprętów poprzez zmianę stężenia jonów Ag⁺

1. Przygotować roztwór azotanu srebra o stężeniu 4 mM, rozpuszczając 3,4 mg_AgNO3 w 5 ml wody.
2. Przygotować w trzech różnych fiolkach roztwór z CTAB i hydrochinonem, jak opisano w sekcji 1.2.1 i dodać odpowiednio 100 μl, 150 μl lub 200 μl roztworu azotanu srebra.
3. Dodać roztwór HAuCl₄ przygotowany zgodnie z krokiem 1.2.3 i przystąpić do przygotowania nanoprętów złota, jak opisano w ppkt 1.2.5.
4. Scharakteryzować otrzymane nanopręty za pomocą spektroskopii UV-widzialnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Fiolki z mniejszą ilością Ag⁺ spowodują krótsze nanopręty (proporcje odpowiednio 2 i 2,2) (ryc. 4).

3. Dostrajanie proporcji nanoprętów poprzez zmianę stężenia CTAB

1. Przygotować różne partie nanoprętów złota o różnych stężeniach CTAB w "roztworze wzrostowym". Użyj stężeń od 10 mM do 100 mM do produkcji złotych nanoprętów o różnych rozmiarach i proporcjach. Stężenia CTAB stosowane w każdym doświadczeniu są podsumowane w Tabeli 1 z odpowiednią ilością użytych miligramów. Rozpuścić różne ilości CTAB zawsze z 22 mg hydrochinonu w 5 ml wody.
2. Dodać 200 μl roztworu azotanu srebra (przygotowanego zgodnie z krokiem 1.2.2) i 5 ml roztworu HAuCl₄ (przygotowanego zgodnie z opisem w kroku 1.2.3) do każdej fiolki mieszając magnetycznie.
3. Dodać 12 μl zawiesiny nasion i obserwować zmianę koloru końcowej mieszanki.
4. Przerwij mieszanie, gdy kolor zawiesiny i widmo widzialne UV są ustabilizowane; czas reakcji zależy od stężenia CTAB w roztworze wzrostowym.
5. Wirować przy 10 000 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić w wodzie.
6. Scharakteryzować otrzymane nanopręty za pomocą spektroskopii UV-widzialnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Niższe stężenie CTAB spowoduje krótsze nanopręty, podczas gdy wyższe stężenie da dłuższe, ale większe nanopręty. Wręcz przeciwnie, współczynnik kształtu nanoprętów będzie wyższy w zakresie około 40-50 mM i zmniejszy się zarówno przy niższych, jak i wyższych stężeniach (ryc. 5 i ryc. 6).

4. Charakterystyka złotych nanoprętów

1. Spektroskopia w zakresie widzialnym UV
   1. Rozcieńczyć 100 μl roztworu nanoprętów z 400 μl wody w plastikowej mikrokuwecie i uzyskać widmo absorpcyjne UV (zakres długości fali od 400 do 840 nm) zgodnie z protokołem producenta.
   2. Zbieraj widma widzialne w promieniowaniu UV (zakres długości fal od 400 do 840 nm) roztworu wzrostowego co 5 minut w celu zbadania kinetyki reakcji.
2. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)
   1. Zbierz obrazy TEM każdej próbki nanoprętów w celu zmierzenia rozmiaru i proporcji otrzymanych nanoprętów. Przygotować próbki, umieszczając kroplę zawiesiny (4 μl) na ultracienkiej siatce miedzianej o siatkach 200 pokrytych formvarem i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze 4 °C. Przeprowadzić analizę próbki w TEM przy użyciu napięcia przyspieszającego 200 kV zgodnie z protokołem producenta.

Wyniki

Widma UV-vis zarodników złota przedstawiono na Rysunku 1. Widma UV-vis zarejestrowane w różnych odstępach czasu po wstrzyknięciu zarodników złota przedstawiono na Rysunku 2. Widma UV-vis oraz obrazy z transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) otrzymanych nanoprętów złota pokazano na Rysunku 3. Widma UV-vis oraz obrazy TEM nanoprętów złota o różnym stosunku wymiarów, otrzymane poprzez zmianę ilości jonów srebra, przedstawiono na

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje hydrochinon, cząsteczkę aromatyczną charakteryzującą się słabym potencjałem redukcyjnym, do produkcji nanoprętów złota. Istnieją dwie główne zalety obecnego protokołu w stosunku do najczęściej stosowanej metody syntezy opartej na użyciu kwasu askorbinowego: pierwszą jest to, że hydrochinon jest w stanie prawie ilościowo zredukować jony złota, umożliwiając produkcję większej ilości nanoprętów złota. ¹¹ To ostatnie wynika z faktu, że wymaga ona niższej kwoty CTAB i wynik...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Trójwodny chlorek złota(III)	Sigma Aldrich	520918
Hydrochinon	Sigma Aldrich	H17902
Azotan srebra	Sigma Aldrich	209139	toksyczny
borowodorek sodu	Sigma Aldrich	480886
Bromek heksadecylotrimetyloamoniowy (CTAB)	Sigma Aldrich	H5882	Ostra toksyna. (ustnie). W tym badaniu przetestowaliśmy trzy różne partie CTAB (H5882) firmy Sigma Aldrich. Dwa z nich zostały oznaczone jako wyprodukowane w Chinach, a jeden jako wyprodukowany w Indiach. Z naszego doświadczenia wynika, że tylko partie oznaczone jako wyprodukowane w Chinach były skuteczne w przygotowaniu AuNR.
Spektrofotometr	Thermo scientific	Nanodrop 2000C
TEM	JEOL	2100