Eksploracja nowych obiektów jako potencjalny test dla powtarzających się zachowań wyższego rzędu u myszy

Podsumowanie

Bardziej ograniczone, powtarzające się zachowania (RRB) zakłócają życie osób dotkniętych tym problemem. Zachowania te są trudne do modelowania u gryzoni, co utrudnia podstawowe badania biomedyczne nad potencjalnymi terapiami lub interwencjami w przypadku RRB. W tym miejscu opisujemy eksplorację nowych obiektów jako potencjalny test dla RRB wyższego rzędu u myszy.

Streszczenie

Ograniczone, powtarzające się zachowania (RRB) są podstawową cechą zaburzeń ze spektrum autyzmu (ASD) i zakłócają życie osób dotkniętych tym problemem. RRB są zwykle dzielone na komponenty niższego i wyższego rzędu, przy czym RRB niższego rzędu składają się ze stereotypii motorycznych, a RRB wyższego rzędu składają się z zachowań perseweracyjnych i sekwencjonowania. RRB wyższego rzędu są trudne do modelowania u myszy. Obecne testy RRB u myszy koncentrują się przede wszystkim na składnikach niższego rzędu, co utrudnia podstawowe badania biomedyczne nad potencjalnymi terapiami lub interwencjami w przypadku RRB wyższego rzędu. Tutaj opisujemy nowy test, eksplorację nowych obiektów. Ten test wykorzystuje podstawową arenę na otwartym polu z czterema nowatorskimi obiektami umieszczonymi na obwodzie. Mysz testowa może swobodnie eksplorować arenę, a kolejność, w jakiej mysz bada nowe obiekty, jest rejestrowana. Na podstawie tych danych można zidentyfikować wzorce sekwencji eksploracji, a także najbardziej preferowany obiekt dla każdej myszy. Reprezentatywne dane udostępnione tutaj i poprzednie wyniki przy użyciu testu eksploracji nowych obiektów ilustrują, że wsobne szczepy myszy wykazują różne zachowanie w tym teście i że szczepy z podwyższonymi RRB niższego rzędu również wykazują podwyższone wzorce zachowania. W związku z tym test eksploracji nowych obiektów wydaje się mieć dobrą trafność dla RRB wyższego rzędu u ludzi i może być cennym testem dla przyszłych badań nad nowymi terapiami ASD.

Wprowadzenie

Zaburzenie ze spektrum autyzmu (ASD) to zaburzenie neurorozwojowe składające się z trzech podstawowych objawów: upośledzenia społecznego, trudności w komunikowaniu się za pomocą języka i powtarzających się zachowań¹. Od 2000 roku liczba osób, u których zdiagnozowano ASD, wzrosła z 1 na 150 do 1 na 68 w ciągu dziesięciu lat ². Chociaż częstość występowania zaburzenia nadal rośnie, przyczyna zaburzenia nie jest jeszcze znana. Nastąpił wzrost wysiłków zmierzających do zidentyfikowania odpowiednich modeli myszy dla rdzenia i powiązanych objawów ASD, ponieważ modele te mogą prowadzić do lepszego zrozumienia podstawowych objawów i przyczyn ASD. Istnieje wiele wsobnych szczepów myszy, które wydają się wykazywać zachowania z trafnością twarzy dla podstawowych objawów ASD, w tym powtarzających się zachowań³.

Ograniczone, powtarzające się zachowania (RRB) są głównym objawem niektórych zaburzeń psychicznych, takich jak ASD. RRB mogą nasilać się wraz z nasileniem zaburzenia⁴ i mogą drastycznie zakłócić styl życia osób dotkniętych chorobą. RRB są zwykle umieszczane w dwóch kategoriach, powtarzających się zachowaniach niższego rzędu, które u ludzi składają się z działań takich jak kołysanie i machanie rękami; oraz powtarzające się zachowania wyższego rzędu, które polegają na ścisłym przestrzeganiu rutyny i oporze przed zmianą^5-8.

Powtarzające się zachowania niższego rzędu były szeroko badane u gryzoni, gdzie objawiają się jako stereotypy motoryczne, które można łatwo zaobserwować w warunkach laboratoryjnych⁹. Wydaje się, że te zachowania mają dobrą trafność dla RRB u ludzi, a także potencjalnie silną trafność konstruktu¹⁰. Testy na obecność RRB niższego rzędu można przeprowadzić poprzez wideomonitoring aktywności myszy w celu zbadania napadów i czasu trwania tych stereotypów motorycznych¹¹. Powtarzające się zachowania wyższego rzędu stanowią wyzwanie dla podstawowych badań biomedycznych z wykorzystaniem gryzoni, ponieważ te RRB nie są tak łatwe do zidentyfikowania za pomocą prostej obserwacji. Ze względu na trudności w identyfikacji tych zachowań, istnieje mniej ustalonych testów dla powtarzających się zachowań wyższego rzędu. Tradycyjnie, RRB wyższego rzędu mierzono u gryzoni przy użyciu paradygmatu labiryntu, w którym badane zwierzę jest szkolone, aby osiągnąć kompetencję w ucieczce. Miejsce ucieczki jest następnie zamieniane, a liczba prób wymaganych do ponownego nauczenia się miejsca ucieczki jest rejestrowana^{jako 12}. Testy te nie są idealne, ponieważ wymagają długiego okresu szkolenia, często wywołują niepokój i mogą skutkować bardzo zmiennymi wynikami. Eksploracja tablic otworów została również wykorzystana do ilościowego określenia RRB wyższego rzędu^13,14. Takie podejście nie wymaga długich sesji treningowych, ale opiera się na motywacji żywieniowej i/lub dyskryminacji węchowej. Testy dla RRB wyższego rzędu, które nie są przeciwlękowe lub wymagają szkolenia, byłyby miłym uzupełnieniem istniejącego repertuaru eksploracji otworów i testów opartych na labiryntach, które są obecnie stosowane.

Szczep myszy wsobnych C58/J (C58) silnie ilustruje wysoki poziom stereotypowych zachowań związanych z ASD, a mianowicie powtarzające się, bezcelowe stereotypy motoryczne i podwyższony poziom samouwodzenia^3,11. Dodatkowo, myszy C58 wykazują RRB poprzez wysoki poziom odchowywania, przewracania do tyłu i scrabblingu^11,14,16. Szczep ten zaczyna wykazywać te zachowania we wczesnym okresie noworodkowym i kontynuuje je przez całe dorosłe życie. Idealnie byłoby móc przetestować obecność podwyższonych RRB wyższego rzędu, aby uzupełnić dobrze udokumentowane RRB niższego rzędu obecne w tym szczepie, a także w innych szczepach myszy. Opisany tutaj nowatorski test eksploracji obiektów daje naukowcom możliwość jednoczesnej obserwacji RRB niższego i wyższego rzędu, ponieważ daje możliwość mierzenia wzorcowych zachowań, a także powtarzających się stereotypów motorycznych.

Wykorzystanie eksploracji nowych obiektów jako testu dla powtarzających się zachowań wyższego rzędu zostało opracowane przez Pearsona i wsp.¹⁷. Ta nowa ocena jest rozszerzeniem dobrze znanego testu na otwartym polu^18-21 z dodaniem czterech nowych obiektów do areny. Myszom pozwolono swobodnie badać te nieznane obiekty, a liczba i kolejność badań obiektów była śledzona. Badania obiektów zostały następnie przeanalizowane pod kątem obecności wzorców, przy czym myszy BTBR wykazywały podwyższoną liczbę badań wzorców wśród obiektów. Korzystając z tego testu, myszy mogą wykazywać powtarzające się i wzorcowe zachowania wyższego rzędu, eliminując potrzebę uczenia się zachowań, a także usuwając niepotrzebne bodźce. Eksploracja nowych obiektów indukuje RRB wyższego rzędu, ponieważ pozwala myszom tworzyć wzorce i sekwencje poprzez ich naturalną eksplorację. Użycie tego testu pozwala badaczowi na ilościowe określenie obecności tych RRB wyższego rzędu.

Pearson et al. opracowali ten test i użyli go do sprawdzenia obecności potencjalnych powtarzających się zachowań wyższego rzędu w szczepie myszy wsobnej BTBR, uzyskując intrygujące wyniki¹⁷. Niedawno opublikowaliśmy badanie uzupełniające dotyczące zachowań szczepów C58, C57BL/6J (C57) i FVB/NJ (FVB), a także bardziej szczegółowe badanie potencjalnych zmiennych zakłócających obecnych w tym teście oraz możliwe podejścia statystyczne do analizy wygenerowanych danych²².

Protokół

Opisany tutaj protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie Redlands. Myszy C58, C57 i FVB użyte w tych badaniach zostały wyhodowane w wiwarium University of Redlands z materiału pierwotnie uzyskanego z Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Wartownicy z tego wiwarium byli badani przesiewowo co sześć miesięcy i stwierdzono, że są wolne od patogenów.

1. Wyposażenie i ustawienie pomieszczenia

Uwaga: Użyliśmy dwóch różnych aren do testowania nowatorskich obiektów: przezroczystej plastikowej prostokątnej klatki (45 cm x 24 cm x 20 cm) lub nieprzezroczystej okrągłej klatki o średnicy podstawy 41 cm; jednak można użyć dowolnej klatki. Pearson i wsp. użyli w swoim teście mniejszej prostokątnej klatki (20 cm x 30 cm x 20 cm). Szczegóły dotyczące tego konkretnego projektu eksperymentalnego znajdują się poniżej, ale biorąc pod uwagę nowatorstwo tego testu, nie ma przyjętych standardów w dziedzinie fenotypowania behawioralnego dla żadnej z opisanych zmiennych.

1. Wypełnij arenę testową około 1/2 cala ściółki z kolb kukurydzy.
2. Zaznacz cztery różne nowe obiekty. Wybierz cztery przedmioty, które są w przybliżeniu tego samego rozmiaru, wykonane z tworzywa sztucznego o dużej gęstości, aby ułatwić czyszczenie i jest odporne na żucie, a także różnią się od siebie kształtem i kolorem. Co ważne, upewnij się, że myszy testowe nie są narażone na działanie tych obiektów, dopóki nie zostaną uruchomione w teście.
   Uwaga: Na przykład użyto tutaj różowego klocka-zabawki, czerwonej małpki, białej płytki z niebieskim napisem i standardowej białej kostki.
3. Na prostokątnej arenie umieść te przedmioty w odległości około 3 cm od rogów. Na okrągłej arenie umieść przedmioty tak, aby znajdowały się w równych odległościach od siebie i około 10 cm od boków. Zapisz położenie każdego obiektu jako inną liczbę, od 1 do 4 (Rysunek 1). Upewnij się, że obiekty są ułożone w kolejności losowej lub przeciwwagi podczas testowania.
4. Ustaw kamerę bezpośrednio nad areną testową, aby nagrywać całą arenę podczas okresu aklimatyzacji i testów.
   Uwaga: Przebywanie badaczy w tym samym pomieszczeniu co myszy może potencjalnie wpłynąć na poziom aktywności i eksplorację podczas testów.

2. Test Eksploracji Nowych Obiektów

1. Badanie przeprowadzić na początku cyklu świetlnego w pomieszczeniu oświetlonym światłem fluorescencyjnym o natężeniu około 100 luksów. Upewnij się, że oświetlenie jest jednolite na całej arenie testowej, aby ustandaryzować wygląd podczas nagrywania wideo.
2. Umieść karteczkę ze znanymi wymiarami na dnie areny testowej i rozpocznij nagrywanie wideo.
3. Przenieś mysz testową na pustą arenę testową na 10 minut, aby służyła jako okres aklimatyzacji. Nagranie wideo okresu aklimatyzacji.
4. Po okresie aklimatyzacji zostaw mysz na arenie, szybko dodaj cztery nowe obiekty do areny testowej i nagrywaj zachowanie myszy przez dodatkowe 10 minut.
5. Po upływie pełnego 20-minutowego okresu aklimatyzacji/testowania włóż mysz testową z powrotem do jej klatki domowej i dokładnie wyczyść i osusz nowe obiekty i arenę testową bezzapachowym płynem do naczyń i wodą.

3. Punktacja wideo

1. Ukończ wszystkie oceny zachowań za pomocą wideo, aby zwiększyć niezawodność.
   Uwaga: Oprogramowanie do rejestrowania zachowań Noldus The Observer zostało użyte do wykonania kroków²² zgodnie z opisem tutaj, ale specjalistyczny program nie jest konieczny:
   1. Przed nagraniem pierwszego filmu skonfiguruj schemat kodowania projektu w oprogramowaniu do rejestrowania zachowań, tworząc nowy projekt lub edytując istniejący, podobny projekt.
      1. W polu Project Setup (Ustawienia projektu) ustaw opcję Pobieranie danych na "Offline Observation" (Obserwacja w trybie offline). W polu Behavior Coding (Kodowanie zachowań) zaprogramuj "Scrabble", "Digging", "Rearing", "Grooming" (Uwodzenie) i "Sniff Object 1, 2, 3 and 4" (Wykrywanie obiektów 1, 2, 3 i 4) jako "Zdarzenia stanu". Zaprogramuj "skakanie" jako "zdarzenie punktowe". Uwaga: Definicje tych zachowań są szczegółowo opisane w innym miejscu¹¹.
         Uwaga: Zdarzenia stanu mają czas rozpoczęcia i zakończenia, podczas gdy zdarzenia punktowe po prostu zbierają dane zliczania. Naciśnięcia dla każdego dyskretnego zachowania są generowane przez oprogramowanie, a odpowiadające im naciśnięcia są programowane w dodatkowej klawiaturze (krok 3.1.2).
      2. Aby zaprogramować klawiaturę dodatkową, otwórz oprogramowanie klawiatury, kliknij odpowiedni przycisk klawiatury pomocniczej wyświetlany na ekranie, wpisz odpowiednią kombinację i kliknij OK. Po zaprogramowaniu dodatkowej klawiatury zamknij oprogramowanie, ponieważ program będzie działał w tle komputera.
   2. Po zakończeniu projektu i jego skonfigurowaniu użyj oprogramowania do rejestrowania zachowań, aby ocenić liczbę i czas trwania tylnych (zdefiniowanych jako obie przednie łapy umieszczone na ścianie areny), wykopów (zdefiniowanych jako dwie przednie łapy myszy zakopujące się w pościeli areny), samooczyszczania (zdefiniowanych jako mysz liżąca dowolny obszar własnego ciała i/lub mysz dotykająca przedniej części twarzy dowolnej części twarzy łapy) i skoki (definiowane jako mysz podnosząca się, a następnie skacząca tak, że wszystkie cztery stopy są jednocześnie nad ziemią).
      1. Aby skomponować muzykę do filmu, przejdź do pozycji Plik > Otwórz projekt, a następnie Obserwuj > Obserwacja > Nowy. Program poprosi o nazwę pliku. Po nazwaniu wybierz odpowiedni plik multimediów wideo.
      2. Rozpocznij punktację, klikając przycisk Rozpocznij obserwację.
         Uwaga: Podczas oceniania powtarzającego się zachowania myszy wszystkie zdarzenia stanu wymagają dwóch naciśnięć, z których pierwsze odpowiada zainicjowaniu zachowania, a drugie końcowi zachowania. Zdarzenia punktowe wymagają tylko jednego naciśnięcia.
   3. Oceń, ile razy mysz obwąchała każdy obiekt. Wąchanie definiuje się jako każde zbliżenie nosa myszy na odległość mniejszą niż 0,5 cm od obiektu. Zmierz czas trwania sniffu za pomocą oprogramowania do rejestrowania behawioralnego w taki sam sposób, w jaki mierzono czas trwania powtarzających się zachowań (krok 3.1.2).
      1. Za każdym razem, gdy mysz obwąchuje obiekt, zapisz odpowiedni numer pozycji, który doprowadzi do ciągu liczb pod koniec 10-minutowego okresu testowania (np. 1243421...). Ręcznie zapisz te dane.
         Uwaga: Aby zwiększyć wydajność i spójność podczas oceniania filmów, liczby zawsze odpowiadają danej pozycji, a nie obiektowi.
      2. Jeśli mysz obwąchuje obiekt, odwraca wzrok, a następnie ponownie obwąchuje obiekt, policz tę liczbę dwa razy.
      3. Po zdobyciu pełnej 10-minutowej oceny wideo zwizualizuj dane, klikając Analizuj > Analiza zachowania > Nowy. Gdy dane pojawią się na ekranie, wyeksportuj je lub skopiuj i wklej do osobnego arkusza kalkulacyjnego.
   4. Zapisz całkowitą odległość, jaką mysz przebyła na arenie podczas testowania.
      Uwaga: Do wykonania tego kroku użyto oprogramowania do śledzenia wideo, skalibrowanego do śledzenia myszy testowej i rejestrowania całkowitej odległości przebytej w centymetrach. Wszystkie filmy nagrane przez oprogramowanie do śledzenia wideo miały notatkę ze znanymi wymiarami umieszczoną na arenie na początku filmu.
      1. Użyj karty notatki, aby skalibrować każdy film w oprogramowaniu, ustawiając linię kalibracji wzdłuż każdego końca karty notatki i wprowadzając odpowiednią długość na ekranie kalibracji oprogramowania. Po narysowaniu linii wprowadź znaną długość i szerokość karty notatki, które odpowiadają każdej linii.
      2. W ustawieniach areny wybierz całą arenę.
         Uwaga: Poszczególne obszary areny można rozróżnić w oprogramowaniu, jeśli na przykład interesujący był ruch myszy wzdłuż ścian w porównaniu z ruchem myszy.
      3. W ustawieniach kontroli próbnej wybierz dziesięciominutowy czas trwania. W Ustawieniach wykrywania wybierz ciemny obiekt na jasnym tle.
         Uwaga: Musiałoby to zostać zmienione, gdyby używane były myszy albinosy lub gdyby tło miało ciemniejszy odcień.
      4. Po zaprogramowaniu ustawień nascore filmy. Kliknij przycisk Pozyskiwanie> otwórz opcję Pobieranie. W polu Kontrola pozyskiwania kliknij pozycję Nowa wersja próbna, a następnie pozycję Rozpocznij wersję próbną. Po upływie dziesięciu minut program zatrzymuje się, a dane można wizualizować.
      5. Kliknij przycisk Analizuj > Oblicz statystyki. Gdy dane pojawią się na ekranie, wyeksportuj je lub skopiuj i wklej do osobnego arkusza kalkulacyjnego.

4. Analizy statystyczne, sekwencjonowanie

1. W ciągu liczb odpowiadających badaniom obiektów wygenerowanym przez każdą mysz zidentyfikuj łączną liczbę wszystkich możliwych kombinacji 3 cyfr bez powtarzających się liczb (np. 121, 123, 124, ale nie 112 lub 122).
   Uwaga: Program napisany w języku programowania Python został użyty do określenia, ile razy każda możliwa sekwencja pojawia się w ciągu liczb. Nie jest konieczne korzystanie z zewnętrznego programu, a krok ten można wykonać na wiele różnych sposobów (np. za pomocą funkcji Znajdź w programie Microsoft Word lub Excel).
2. Zapisz liczbę wystąpień każdej sekwencji i zidentyfikuj trzy najczęściej powtarzane sekwencje dla każdej myszy.
   Uwaga: Poszczególne sekwencje będą się różnić w zależności od myszy, a rzeczywista sekwencja jest mniej interesująca niż liczba powtórzeń sekwencji (tj. przestrzeganie wzorca jest ważniejsze niż sam wzorzec).
3. Ponieważ całkowita liczba sekwencji powtarzanych przez mysz będzie dodatnio skorelowana z poziomem aktywności, skoryguj te wartości, dzieląc liczbę najczęstszych wzorców przez całkowitą liczbę wzorców dla każdej pojedynczej myszy. Spowoduje to uzyskanie indeksu powtórzeń sekwencji, który jest niezależny od ogólnej aktywności.
4. Porównaj, ile razy każda mysz powtarza swoje najczęstsze sekwencje (skorygowane o poziom aktywności) między grupami, korzystając z odpowiedniej analizy ANOVA, procedury wielokrotnego porównania (np. test Dunnetta) i testów post-hoc.

5. Analizy statystyczne, preferencje obiektów

1. Używając tego samego ciągu liczb wygenerowanego powyżej (krok 3.1.3.1), zidentyfikuj preferencje nowego obiektu każdej myszy, zliczając całkowitą liczbę razy każdy obiekt był badany, lub innymi słowy, licząc całkowitą liczbę 1 sekundy, 2 sekundy, 3 sekundy i 4 sekundy w ciągu danych. Popraw poziom aktywności i porównaj za pomocą ANOVA, jak opisano powyżej (kroki 4.3-4.4).
   Uwaga: Te metody opublikowane przez nasze laboratorium²² i opisane tutaj są w dużej mierze oparte na Pearson et al.¹⁷

Wyniki

Dane^{reprezentatywne 22} pokazują, że samice myszy C58/J wykazywały większą liczbę sekwencjonowanych wzorców niż inne szczepy na arenie okrągłej (Rysunek 2, panel A), ale nie na arenie prostokątnej (Rysunek 2, panel C). Żaden z trzech męskich szczepów nie różnił się od siebie (ryc. 2, panele B i D). Reprezentatywne dane pokazują, że zarówno samce, jak i samice myszy C58 / J wykazują silniejszą preferencję dla najczęściej odwiedza...

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy niedawno opracowany test, który może być przydatny do ilościowego określania zachowań myszy z trafnością twarzy dla powtarzających się zachowań wyższego rzędu u ludzi. W przeciwieństwie do bardziej uznanych testów, takich jak Barnes lub T-maze, ten nowatorski test eksploracji obiektów nie wymaga żadnego szkolenia myszy ani nie wywołuje szczególnego niepokoju. Ponadto eksploracja nowych obiektów nie wymaga żadnych bodźców żywieniowych ani społecznych, co pozwala na większe skupienie się na zach...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Standardowa klatka dla gryzoni z poliwęglanu (45 cm x 24 cm x 20 cm)			Pożądane jest wiele klatek, aby ułatwić testowanie wielu myszy
Plastikowa nieprzezroczysta okrągła arena testowa (średnica podstawy 41 cm)	United States Plastic Corp.	13931	Wiele aren jest pożądanych w celu ułatwienia testowania wielu myszy
			dla gryzoni z kolby kukurydzy
Novel Object - czerwona małpa	Hasbro, Pawtucket RI		z Barrel of Monkeys
Novel Object - prostokątny 2 x 4 LEGO
Novel Object - płytka	Thinkfun Inc., Alexandria VA		od Toot i Otto
Novel Object - standardowa biała matryca
Kamera wideo
Oprogramowanie do rejestrowania zachowań - The Observer	Noldus, Wageningen, Holandia	używać
Oprogramowanie do śledzenia wideo - EthoVision	Noldus, Wageningen, Holandia	można używać
Klawiatura wejściowa X-Keys	P.I. Engineering, Williamstown MI	829484
MacroWorks II	P.I. Engineering, Williamstown, Michigan