Artykuł metodologiczny

Laser tulowy o fali ciągłej do ogrzewania hodowanych komórek w celu zbadania komórkowych efektów termicznych

7.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54326

⸱

30 czerwca 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Optics, University of Luebeck, 2Medical Laser Center Luebeck GmbH, University of Leubeck, 3Department of Ophthalmology, University of Luebeck

W tym artykule

Podsumowanie

Oryginalna eksperymentalna konfiguracja do ogrzewania komórek w naczyniu hodowlanym za pomocą promieniowania laserowego o ciągłej fali 1,94 μm jest tutaj wprowadzona. Za pomocą tej metody można badać reakcje biologiczne komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) po różnych ekspozycjach termicznych.

Streszczenie

Oryginalna metoda ogrzewania hodowanych komórek za pomocą lasera tulowego o ciągłej fali 1,94 μm do oceny biologicznej została tutaj wprowadzona. Promieniowanie lasera tulowego jest silnie absorbowane przez wodę, a komórki na dnie naczynia hodowlanego są podgrzewane poprzez dyfuzję termiczną. Światłowód laserowy o średnicy 365 μm umieszcza się około 12 cm nad naczynią hodowlaną, bez żadnej optyki, tak aby średnica wiązki laserowej była prawie równa wewnętrznej średnicy szalki hodowlanej (30 mm). Utrzymując stałą ilość pożywki hodowlanej w każdym eksperymencie, możliwe jest napromienianie komórek z wysoce powtarzalnym wzrostem temperatury.

Aby skalibrować wzrost temperatury i jej rozkład w jednym naczyniu do hodowli komórkowych dla każdego ustawienia mocy, temperatura była mierzona podczas 10 s naświetlania w różnych pozycjach i na poziomie komórkowym. Rozkład temperatury został odwzorowany za pomocą programu do grafiki matematycznej, a jego wzór na szalce hodowlanej był w formie Gaussa. Po naświetlaniu laserowym można przeprowadzić różne eksperymenty biologiczne w celu oceny reakcji komórek zależnych od temperatury. W tym manuskrypcie wprowadzono barwienie żywotności (tj. rozróżnianie komórek żywych, apoptotycznych i martwych), aby pomóc określić temperatury progowe dla apoptozy i śmierci komórek w różnych punktach w czasie.

Zaletami tej metody są precyzja temperatury i czasu grzania, a także jej wysoka efektywność w podgrzewaniu komórek w całym naczyniu do hodowli komórkowej. Co więcej, pozwala na naukę w szerokim zakresie temperatur i czasu trwania, które mogą być dobrze kontrolowane przez skomputeryzowany system operacyjny.

Wprowadzenie

Zrozumienie zależnych od temperatury reakcji biologicznych komórek ma ogromne znaczenie dla skutecznego leczenia hipertermią. Fotokoagulacja laserowa siatkówki za pomocą lasera termicznego, stosowana w okulistyce, jest jednym z najbardziej uznanych zabiegów laserowych w medycynie. Światło widzialne, głównie o długości fali od zielonej do żółtej, jest wykorzystywane w leczeniu laserowym siatkówki. Światło jest silnie absorbowane przez melaninę w komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), które tworzą najbardziej zewnętrzną monowarstwę komórkową siatkówki. Ostatnio pojawiło się zainteresowanie wśród lekarzy i badaczy bardzo łagodnym promieniowaniem termicznym (fotokoagulacja w świetle widzialnym) jako nową strategią terapeutyczną dla różnych rodzajów zaburzeń siatkówki1,2. Podążając za tym trendem, naszym zainteresowaniem jest subletalne podgrzewanie ogniw RPE pod precyzyjną kontrolą temperatury, techniką zwaną terapią fototermiczną sterowaną temperaturą (TC-PTT).

Najnowsza technologia optoakustyczna z naszego instytutu pozwoliła na pomiar wzrostu temperatury w czasie rzeczywistym w napromieniowanych miejscach siatkówki. Umożliwia to kontrolę nad wzrostem temperatury podczas napromieniowania3. Ponieważ jednak subletalna hipertermia siatkówki, spowodowana subletalnym ogrzewaniem komórek RPE, nie była wcześniej brana pod uwagę ze względu na niemożność pomiaru i kontrolowania temperatury, zależne od temperatury reakcje komórek RPE na termiczne promieniowanie laserowe były do tej pory bardzo mało badane. Co więcej, nie tylko różnica temperatur nie została szczegółowo omówiona, ale także różnica w zachowaniu komórek, które przeżyły po subletalnym i śmiertelnym napromieniowaniu. Dlatego, aby zebrać dowody naukowe na temat leczenia opartego na TC-PTT, staramy się wyjaśnić zależne od temperatury reakcje biologiczne komórek RPE i ich mechanizmy za pomocą konfiguracji eksperymentalnych in vitro.

W tym celu konieczne jest stworzenie konfiguracji ogrzewania komórek, która spełnia następujące warunki: 1) możliwość szybkiego wzrostu temperatury, 2) precyzyjnie kontrolowany czas i temperatura, oraz 3) stosunkowo duża liczba badanych komórek do eksperymentów biologicznych. Jeśli chodzi o metodę ogrzewania, laser kliniczny, taki jak laser Nd.YAG o podwójnej częstotliwości (532 nm), niestety nie nadaje się do ogrzewania kultur komórkowych. Wynika to ze znacznie zmniejszonej liczby melanosomów w hodowanych komórkach RPE. Absorpcja światła laserowego może być niejednorodna, a wzrost temperatury na poziomie komórkowym jest zmienny między eksperymentami, nawet gdy jest naświetlany tą samą mocą promieniowania. Kilka wcześniejszych badań donosiło o użyciu czarnego papieru pod dnem naczynia podczas napromieniania4 lub użyciu dodatkowych melanosomów, które są fagocytowane przez komórki hodowlane przed eksperymentami5,6. Wiele badań biologicznych in vitro mających na celu ocenę odpowiedzi komórek wywołanych hipertermią przeprowadzono przy użyciu gorącej płyty, łaźni wodnej lub inkubatora CO2 z ustawieniem temperatury7. Metody te wymagają długiego okresu nagrzewania, ponieważ osiągnięcie pożądanej temperatury zajmuje trochę czasu (tj. kilka minut). Co więcej, przy użyciu tych metod trudno jest uzyskać szczegółową historię termiczną (tj. temperaturę pomnożoną przez czas) na poziomie komórkowym. Co więcej, temperatura między komórkami w różnych pozycjach w jednym naczyniu hodowlanym może się różnić ze względu na zmienną dyfuzję temperatury. W większości przypadków te czasowe i przestrzenne informacje o temperaturze podczas hipertermii nie były brane pod uwagę w analizach biologicznych, mimo że na biologiczną odpowiedź komórki może mieć krytyczny wpływ temperatura i czas trwania podwyższonej temperatury.

Aby przezwyciężyć te problemy, zastosowano tutaj laser tulowy o ciągłej fali do ogrzewania komórek. Promieniowanie lasera tulowego (λ = 1,94 μm) jest silnie absorbowane przez wodę8, a komórki na dnie szalki hodowlanej są stymulowane termicznie wyłącznie przez dyfuzję termiczną. Światłowód laserowy o średnicy 365 μm jest umieszczony około 12 cm nad naczynią hodowlaną, bez żadnej optyki pomiędzy nimi. Średnica wiązki laserowej różni się w taki sposób, że jest prawie równa wewnętrznej średnicy naczynia hodowlanego (30 mm) na powierzchni pożywki hodowlanej. Przy stałej ilości pożywki hodowlanej możliwe jest napromienianie komórek przy wzroście temperatury o wysokiej powtarzalności. Zmienne ustawienia mocy umożliwiają naświetlanie promieniowaniem do 20 W, a temperatura medium na poziomie komórkowym może wzrosnąć do ΔT ≈ 26 °C w ciągu 10 s.

Poprzez modyfikację warunków napromieniowania, możliwa jest również zmiana profilu wiązki laserowej, aby zmienić rozkład temperatury w naczyniu hodowlanym. Na przykład możliwe jest badanie z rozkładem temperatury podobnym do Gaussa, jak w obecnym badaniu, lub z jednorodnym rozkładem temperatury. To ostatnie może być korzystne dla badania wpływu zależnych od temperatury reakcji komórek w szczególności na subletalny wzrost temperatury, ale nie na stres związany ze śmiercią komórki lub reakcje gojenia się ran.

Łącznie, naświetlanie laserem tulowym może umożliwić badanie różnych rodzajów czynników biologicznych, takich jak ekspresja genów/białek, kinetyka śmierci komórki, proliferacja komórek i rozwój funkcjonalności komórek, po różnych ekspozycjach termicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórek RPE

  1. Izolacja komórek RPE z oczu świni
    1. Pozyskać świeżo wyłupane oczy świni z lokalnej rzeźni. Przechowywać je w niskiej temperaturze (4 °C) i w ciemności.
    2. Usunąć tkanki pozakomórkowe za pomocą nożyczek i namoczyć oczy w roztworze antyseptycznym przez 5 min.
    3. Umieścić oczy w sterylnym roztworze soli fizjologicznej w buforze fosforanowym bez jonów wapnia i magnezu (PBS (-)) do czasu użycia.
    4. Za pomocą skalpela przebić twardówkę około 5 mm za limbusm rogówki. Wyciąć całą przednią część oka, przecinając nożyczkami całkowicie równolegle do limbusa rogówki.
    5. Usunąć przednią część oka (t.j. rogówkę i soczewkę) oraz ciało szkliste. Dodać 1 mL PBS (-) i delikatnie usunąć siatkówkę neuronalną.
      UWAGA: Tak przygotowana „miseczka oka”, składająca się z twardówki, naczyniówki i RPE, jest teraz gotowa.
    6. Dodać do miseczki oka uprzednio ogrzaną (37 °C) 0,25% trypsynę w PBS (-). Dostosować objętość tak, aby roztwór trypsyny wypełniał około 80% miseczki oka.
    7. Inkubować miseczkę oka z roztworem trypsyny w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 10 min.
    8. Wyjąć miseczkę oka z inkubatora i zastąpić 0,25% roztwór trypsyny roztworem PBS (-) z 0,05% trypsyną + 0,2% solą tetrasodową kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA·4N). Inkubować miseczkę oka w inkubatorze przez 45 min.
      UWAGA: Po 45 min komórki RPE będą albo lekko przytwierdzone do błony Brucha, albo już oddzielone i zawieszone w roztworze trypsyny-EDTA.
    9. Zebrać komórki RPE poprzez delikatne pipetowanie. Przenieść komórki wraz z roztworem do probówki stożkowej wypełnionej 10 mL pożywki hodowlanej (DMEM high glucose z L-glutaminą), zawierającej 10% surowicy wieprzowej, antybiotyk/antybiotyk przeciwgrzybiczy oraz pirogronian sodu (1 mM).
      UWAGA: Surowica może zneutralizować działanie trypsyny.
    10. Odwirować zawiesinę komórkową przy 400 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    11. Usunąć supernatant i dodać 10 mL świeżej pożywki. Odwirować ponownie w tych samych warunkach przez 5 min.
    12. Usunąć supernatant i dodać nową pożywkę tak, aby stężenie komórek wyniosło 5 x 105 komórek/mL (oznaczone poprzez policzenie komórek za pomocą komory hemocytometrycznej). Wymieszać dobrze poprzez delikatne pipetowanie.
    13. Rozdzielić zawiesinę komórkową do naczyń hodowlanych. Użyć 3 mL na naczynie hodowlane o średnicy 60 mm.
      UWAGA: Hodowlę tę nazywa się pasażem zero (P0).
    14. Utrzymywać komórki w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Co drugi dzień wymieniać połowę pożywki kondycjonowanej na świeżą pożywkę.
    15. Przeprowadzić pasaż (krok 1.2), gdy warstwa komórek stanie się zbieżna.
  2. Pasaż hodowli komórek RPE
    1. Usunąć pożywkę hodowlaną i dwukrotnie wypłukać komórki roztworem PBS (-).
    2. Inkubować komórki w roztworze PBS (-) z 0,05% trypsyną + 0,2% EDTA w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 5 min.
    3. Oddzielić komórki RPE poprzez delikatne pipetowanie i zebrać zawiesinę komórkową do probówki stożkowej wypełnionej 10 mL pożywki hodowlanej z dodatkiem 10% surowicy wieprzowej.
    4. Odwirować zawiesinę komórkową przy 400 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    5. Usunąć supernatant i dodać nową pożywkę hodowlaną, tak aby stężenie komórek wyniosło 5 x 105 komórek/mL (oznaczone poprzez policzenie liczby komórek za pomocą komory hemocytometrycznej). Rozdzielić komórki do nowych naczyń hodowlanych o średnicy 60 mm, zgodnie z opisem w kroku 1.1.13.
      UWAGA: Hodowla komórkowa stanowi teraz pasaż 1 (P1).
    6. Po osiągnięciu zbieżności, przeprowadzić pasaż z hodowli P1 do P2, stosując tę samą procedurę opisaną w krokach 1.2.1-1.2.5. Z hodowli P2 wysiać komórki na mniejsze naczynia hodowlane (średnica wewnętrzna 30 mm) zamiast naczyń o średnicy 60 mm.
    7. Do eksperymentów należy wykorzystać hodowle P2 lub P3.

2. Naświetlanie laserem tulowym

  1. Budowa stacji naświetlającej
    1. Podłączyć urządzenie laserowe z tulenem (1,94 µm, zakres mocy: 0-20 W) do włókna o aperturze numerycznej 0,22-NA i średnicy rdzenia 365 µm.
    2. Mechanicznie przymocować końcówkę włókna do metalnego ramienia, które jest zamocowane poziomo do pionowego metalowego słupka stacji naświetlaćcej. Ustawić pionowy słupek tak, aby końcówka włókna laserowego znajdowała się nad płytą grzewczą, na której podczas naświetlania zostanie umieszczona naczynie z hodowlą komórkową.
    3. Położyć białą kartkę papieru na płycie grzewczej i włączyć wiązkę celowniczą (λ = 635 nm, max = 1 mW, średnica na poziomie papieru ≈ 30 mm). Zaznaczyć obwód wiązki celowniczej na białym papierze, aby określić miejsce, w którym naczynie z hodowlą ma być umieszczone podczas naświetlania.
      UWAGA: Płaszczyzna z końcówką włókna w osi z może być regulowana. Bez dodatkowej optyki obrazującej średnica plamki laserowej w płaszczyźnie hodowli komórkowej, umieszczonej 12 cm poniżej końcówki włókna, wynosi około 30 mm, co jest prawie równoważne średnicy wewnętrznej naczynia do hodowli komórkowej. Schematyczny rysunek układu przedstawiono na Rysunku 1.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schemat stacji naświetlania laserem tulowym.Naczynie hodowlane umieszczono na płycie grzejnej. Komórki znajdują się 12 cm poniżej końcówki włókna lasera tulowego, tak aby rozmiar wiązki był niemal identyczny z średnicą wewnętrzną naczynia hodowlanego (około 30 mm). Procedura naświetlania laserem jest kontrolowana przez rutynę czasową autorskiej platformy projektowej systemu. Przed uruchomieniem programu naświetlania należy określić ustawienia mocy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

  1. Naświetlanie laserem hodowli komórkowej
    1. 1 h przed naświetlaniem całkowicie wymienić pożywkę hodowlaną na 1,2 mL świeżej pożywki.
      UWAGA: Jest to KROK KRYTYCZNY i musi być ściśle przestrzegany.
    2. Umieścić stację naświetlania (tj. płytkę grzewczą i uchwyt do mocowania włókna laserowego) w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
    3. Wyjąć naczynie z hodowlą komórkową z inkubatora i umieścić je w wyznaczonym miejscu na płytce grzewczej (krok 2.1.3).
    4. Założyć okulary ochronne. Włączyć laser tulowy. Ustawić żądaną moc na urządzeniu laserowym (regulowana w zakresie 0–20 W). Włączyć emisję.
    5. Uruchomić platformę projektową systemu sterującego naświetlaniem laserowym i protokołem czasowym (plik uzupełniający).
    6. Natychmiast po umieszczeniu naczynia z hodowlą na płytce grzewczej kliknąć „pre-heating time”, aby uruchomić timer na 140 s („pre-heating time 1”); pozwoli to utrzymać temperaturę pożywki hodowlanej na poziomie 37 °C przed naświetlaniem.
      UWAGA: Po 140 s rozlegnie się sygnał dźwiękowy i automatycznie uruchomi się kolejny timer („pre-heating time 2”), odliczający 8 s. W ciągu tych 8 s badacz może otworzyć naczynie z hodowlą. Po 148 s podgrzewania wstępnego automatycznie przeprowadzona zostanie 10 s irradiation laserowa hodowli komórkowej. W razie sytuacji awaryjnej należy wyposażyć urządzenie laserowe w przycisk wymuszonego zatrzymania, aby natychmiast wyłączyć laser. Jest to KROK KRYTY CNY i musi być ściśle przestrzegany. Szczególną ostrożność należy zachować przy otwieraniu pokrywki naczynia tuż przed naświetlaniem, na początku 8 s podgrzewania wstępnego. Otwarcie pokrywki może spowodować bardzo szybkie ochłodzenie powierzchni pożywki.
    7. Po naświetlaniu natychmiast założyć pokrywkę z powrotem na naczynie z hodowlą, pozostawić naczynie na płytce grzewczej przez dodatkowe 7 s, a następnie umieścić je z powrotem w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  2. Pomiar rozkładu temperatury na poziomie komórkowym (kalibracja temperatury)
    1. Wykonaj małe otwory (o średnicy około 300 µm) blisko dna na czterech stronach (co 90°) naczynia hodowlanego o średnicy 30 mm (bez komórek); użyj końcówki igły (20G) podgrzanej palnikiem Bunsena. Uszczelnij otwory od zewnątrz taśmą izolacyjną i wykonaj mały otwór cienką igłą tak, aby przez ten otwór można było wstawić cienką termoparę (o średnicy 200 µm) w warunkach wodoszczelnych.
    2. Na zewnętrznej stronie dna naczynia hodowlanego narysuj 2 prostopadłe średnice i wyznacz punkt przecięcia (tj. środek strony spodniej) jako punkt zero współrzędnych (0). Zaznacz co 3 mm promieniowo na zewnątrz naczynia (tj. 0, 3, 6, 9, 12 i 15 mm) w każdym kierunku wzdłuż linii (Rysunek 2, niebieskie kropki); łączna liczba punktów powinna wynosić 21.
    3. Napełnij naczynie hodowlane 1,2 mL nowej pożywki hodowlanej. Umieść naczynie na płytce grzewczej o temperaturze 37 °C, wprowadź cienką termoparę (o średnicy 200 µm) przez boczny otwór i umieść jej czujnik w zaznaczonym punkcie pomiarowym.
    4. Założyć okulary ochronne. Włączyć laser tulowy i ręcznie ustawić moc urządzenia laserowego (między 0 a 20 W, w przyrostach 0,1 W).
      UWAGA: Do kalibracji temperatury wystarczające powinny być pomiary przy mocy w przyrostach 3 W.
    5. Uruchomić platformę projektową systemu i kliknąć przycisk „Start Temp. Acquisition” (plik uzupełniający), aby rozpocząć pomiar temperatury.
    6. Przeprowadzić taką samą procedurę jak w kroku 2.2.6.
      UWAGA: Program sterujący mierzy temperaturę wstawionej termopary co 100 ms i wyświetla przebieg temperatury podczas naświetlania w interfejsie użytkownika (GUI).
    7. Przeprowadzić te procedury dla wszystkich 21 punktów pomiarowych i dla różnych ustawień mocy. Powtórzyć całą procedurę trzy razy dla wszystkich punktów i wszystkich ustawień mocy, aby uzyskać wiarygodne dane.
    8. Wyeksportować dane temperaturowe jako pliki csv, które można następnie przekonwertować na arkusz kalkulacyjny. Obliczyć średnią maksymalną temperaturę na koniec naświetlania dla pomiarów potrójnych w każdym punkcie. Wyciągnąć średnią z wartości punktów znajdujących się na tym samym okręgu (łącznie 4 punkty, z wyjątkiem punktu centralnego).
    9. Nanieść uzyskaną uśrednioną maksymalną temperaturę na wykres, przyjmując odległość od środka naczynia (mm) jako oś x oraz wzrost temperatury (ΔT, °C) jako oś y. Użyć funkcji dopasowania w programie matematycznym, aby dopasować model Gaussa do surowych danych. Stworzyć rozkład temperatury z dopasowaniem gaussowskim.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Punkty kalibracji temperatury w jednej naczyniu do hodowli komórkowej. Dane dotyczące temperatury mierzono w centrum oraz w 5 punktach promieniowych pod 4 różnymi kątami (niebieskie kropki). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

3. Oceny biologiczne odpowiedzi komórkowych po różnych irradiacjach termicznych

  1. Ocena żywotności komórek ( t.j. żywe, apoptotyczne i martwe) po zastosowaniu różnych ustawień mocy oraz wyznaczenie progu śmierci komórkowej
    1. W wskazanych punktach czasowych (t.j. 3, 24 i 48 h po napromieniowaniu), przemyć komórki buforem PBS (-) i użyć dostępnego komercyjnie zestawu do oceny żywotności komórek (t. j. żywe, apoptotyczne, martwe) zgodnie z protokołem producenta.
    2. Przygotować roztwór barwiący, dodając 5 µL z aneksyny V znakowanej izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC), 5 µL etydyniومu homodimeru III oraz 5 µL Hoechst 33342 do 100 µL 1x buforu wiążącego (wszystkie są komponentami zestawu). Przygotować odpowiednią ilość roztworu barwiącego, aby pokryć komórki. Inkubować komórki przez 15 min.
    3. Przemyć hodowlę komórkową dwukrotnie buforem wiążącym, zastąpić bufor wiążący buforem PBS (-) i umieścić hodowlę na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego.
    4. Przełącz drogę światła na okular, wybierz filtr DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol), włącz oświetlenie i znajdź płaszczyznę ostrości przy użyciu obiektywu 4x.
    5. Przełącz tor światła na kamerę, odszukaj obraz na ekranie komputera w oprogramowaniu do obrazowania mikroskopowego i ustaw ostrość.
    6. Użyj funkcji stitch (t. j. funkcję oprogramowania dedykowanego dla mikroskopu (pozwalającą na rejestrację wielu obrazów z różnych obszarów szalki, a następnie stworzenie z nich jednego, dużego obrazu), aby uzyskać obraz fluorescencyjny całej szalki z hodowlą komórkową. Należy użyć trzech różnych zestawów filtrów — DAPI, FITC oraz tetrametylorhodaminy (TRITC) — aby odpowiednio zobrazować komórki wykazujące pozytywny wynik dla Hoechst 33342 (wszystkie jądra komórkowe), FITC-anneksyny V (komórki apoptotyczne) oraz etydium homodimeru III (komórki martwe).
    7. Zmierz promień (mm) obszaru martwego (dodatniego pod kątem etydyny homodimeru III) oraz promień zewnętrzny i wewnętrzny obszaru w formie obręcza z komórkami apoptotycznymi (dodatnich pod kątem anneksyny V) w barwionych kulturach komórkowych. Podstaw wartości tych promieni do dopasowanej funkcji Gaussa rozkładu temperatury dla odpowiadającego ustawienia mocy. Oblicz dokładną temperaturę na brzegu obszaru martwego lub apoptotycznego, aby określić temperatury progowe dla śmierci komórkowej i zmian apoptotycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rozkład temperatury przy różnych ustawieniach mocy

Wszystkie zmiany temperatury dla każdego pojedynczego naświetlania były monitorowane podczas kalibracji temperatury. Na podstawie tych danych wyznaczono maksymalną temperaturę w punkcie pomiarowym, zdefiniowaną jako Tmax (°C). Jak pokazano na Rysunku 3A, program został uruchomiony w momencie umieszczenia naczynia hodowlanego na płycie grzejn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Omawiając biologiczne reakcje komórkowe związane z temperaturą, znaczenie ma nie tylko temperatura, ale także czas trwania podwyższonej temperatury, ponieważ większość procesów biochemicznych jest zależna od czasu. Szczególnie w dziedzinie hipertermii indukowanej laserem w okulistyce, ze względu na krótki zakres czasu - od milisekund do sekund - trudno jest zbadać efekty termiczne komórek przy precyzyjnej kontroli temperatury. Dlatego pożądana jest konfiguracja naświetlania laserowego odpowiednia dla modelu hodowli komór...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant badawczy z niemieckiego Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań (BMBF) (grant #13GW0043C) oraz Europejskiego Biura Badań i Rozwoju Lotniczego (EOARD, grant # FA9550-15-1-0443)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium - wysoki poziom glukozySigma-AldrichD5796-500MLDodaj (2)-(4) przed użyciem. Ciepło w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem.
Antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy (100 & razy;)Sigma-AldrichA5955-100MLZawiera 10 000 jednostek penicyliny, 10 mg streptomycyny i 25 μ g Amfoterycyna B w 1 ml. Przed użyciem dodać 5,5 ml do średniej butelki o pojemności 500 ml (1).
Pirogronian sodu (100 mM)Sigma-AldrichS8636-100MLPrzed użyciem dodać 5,5 ml do 500 ml średniej butelki (1) (stężenie końcowe: 1 mM)
SurowicaSigma-Aldrich12736C-500MLPrzed użyciem dodać 50 ml do 500 ml pożywki (1) (ostatecznie: 10%)
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sigma-AldrichD8537-500ML
Trypsyna z trzustki świniSigma-AldrichT4799-25G
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma-AldrichED-100G
Ludzki zestaw VEGF Quantikine ELISAR& D SystemDVE00
Oxiselect Zestaw do oznaczania całkowitego glutationuCell Biolabs, IncSTA-312
Zestaw do wykrywania apoptotycznego/nekrottycznego/zdrowych komórekPromoKinePK-CA707-30018
NazwaCompanyNumer katalogowyKomentarze
Equipments
Thulium laserStarmedtec GmbHPrototyp0-20 W
365 mm średnica rdzenia fiberKOMPONENTY LASEROWE NiemcyCF01493-52
TermoparaOmega Engineering IncHYP-0-33-1-T-G-60-SMPW-M
Płyta grzewczaMEDAX
Czytnik mikropłytek ( spektrofluorometr)Urządzenie molekularneSpectramax M4
QIAGENTissueLyser LT
Mikroskop fluorescencyjnyNikonECLIPSE Ti
matematyczny program komputerowyThe Mathworks. IncMATLAB Release 2015b
projektowania systemuNational InstrumentLabviewLaboratory Virtual Instrument Engineering Workbench
świńska Homogenizator komórkowy platforma

Bibliografia

  1. Inagaki, K., et al. Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema. Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).
  2. Roider, J., et al. Selective retina therapy (SRT) for clinically significant diabetic macular edema. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (9), 1263-1272 (2010).
  3. Brinkmann, R., et al. Real-time temperature determination during retinal photocoagulation on patients. J Biomed Opt. 17 (6), 061219(2012).
  4. Yoshimura, N., et al. Photocoagulated human retinal pigment epithelial cells produce an inhibitor of vascular endothelial cell proliferation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (8), 1686-1691 (1995).
  5. Denton, M. L., et al. Damage Thresholds for Exposure to NIR and Blue Lasers in an In Vitro RPE Cell System. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (7), 3065-3073 (2006).
  6. Shrestha, R., Choi, T. Y., Chang, W., Kim, D. A high-precision micropipette sensor for cellular-level real-time thermal characterization. Sensors (Basel). 11 (9), 8826-8835 (2011).
  7. Gao, F., Ye, Y., Zhang, Y., Yang, J. Water bath hyperthermia reduces stemness of colon cancer cells. Clin Biochem. 46 (16-17), 1747-1750 (2013).
  8. Jansen, E. D., van Leeuwen, T. G., Motamedi, M., Borst, C., Welch, A. J. Temperature dependence of the absorption coefficient of water for midinfrared laser radiation. Lasers Surg Med. 14 (3), 258-268 (1994).
  9. Iwami, H., Pruessner, J., Shiraki, K., Brinkmann, R., Miura, Y. Protective effect of a laser-induced sub-lethal temperature rise on RPE cells from oxidative stress. Exp Eye Res. 124, 37-47 (2014).
  10. Denton, M. L., et al. Spatially correlated microthermography maps threshold temperature in laser-induced damage. J Biomed Optics. 16 (3), (2011).
  11. Morgan, C. M., Schatz, H. Atrophic creep of the retinal pigment epithelium after focal macular photocoagulation. Ophthalmology. 96 (1), 96-103 (1989).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Podgrzewanie kultur kom rkowychkalibracja termicznarozk ad temperaturybarwienie ywotno cipr g apoptozypr g mierci kom rkowejmikroskopia fluorescencyjnapomiar termoparfunkcja Gaussa

Powiązane artykuły