Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Modele in vitro i in vivo do badania przejścia śródbłonka rogówki i mezenchymów

7.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54329

⸱

20 sierpnia 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Far Eastern Memorial Hospital, 2Institute of Clinical Medicine, National Taiwan University, 3Department of Ophthalmology, National Taiwan University Hospital, 4College of Medicine, National Taiwan University

W tym artykule

Podsumowanie

Pierwotna hodowla bydlęcych komórek śródbłonka rogówki została wykorzystana do zbadania mechanizmu przejścia śródbłonka rogówki na mezenchym. Ponadto wykorzystano model kriouszkodzenia śródbłonka rogówki szczura, aby zademonstrować przejście śródbłonka rogówki i mezenchymów in vivo.

Streszczenie

Komórki śródbłonka rogówki (CEC) odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu czystości rogówki poprzez aktywne pompowanie. Zmniejszona liczba CEC może prowadzić do obrzęku rogówki i pogorszenia ostrości wzroku. Jednak ludzkie CEC są podatne na upośledzony potencjał proliferacyjny. Ponadto stymulacja wzrostu komórek jest często komplikowana przez stopniowe przejście śródbłonkowo-mezenchymalne (EnMT). W związku z tym zrozumienie mechanizmu EnMT jest niezbędne do ułatwienia regeneracji CEC o kompetentnej funkcji. W tym badaniu przygotowaliśmy pierwotną hodowlę CEC bydła poprzez obieranie CEC za pomocą błony Descemeta z guzika rogówki i wykazaliśmy, że CEC bydła wykazywały proces EnMT, w tym zmianę fenotypową, translokację jądrową β-kateniny oraz regulatory EMT ślimaka i ślimaka, w hodowli in vitro. Ponadto wykorzystaliśmy model kriouszkodzenia śródbłonka rogówki szczura, aby zademonstrować proces EnMT in vivo. Reasumując, hodowla pierwotna in vitro bydła CEC i modele kriouszkodzeń śródbłonka rogówki szczurów in vivo stanowią użyteczne platformy do badania mechanizmu EnMT.

Wprowadzenie

Komórki śródbłonka rogówki (CEC) odgrywają istotną rolę w utrzymaniu czystości rogówki, a tym samym ostrości widzenia, regulując stan nawodnienia zrębu rogówki poprzez aktywne pompowanie1. Ze względu na ograniczony potencjał proliferacyjny ludzkich CEC, liczba komórek zmniejsza się wraz z wiekiem, a naprawa ran śródbłonka rogówki po urazie odbywa się zwykle poprzez powiększenie i migrację komórek, a nie mitozę komórek2. Gdy liczba CEC spada poniżej progu około 500 komórek/mm2, stan odwodnienia zrębu rogówki nie może być utrzymany, co prowadzi do keratopatii pęcherzowej i upośledzenia wzroku3,4.

Ograniczony potencjał proliferacyjny ludzkich CEC został przypisany kilku czynnikom, w tym zmniejszonej ekspresji naskórkowego czynnika wzrostu i jego receptora w starzejących się komórkach5, antyproliferacyjnemu TGFβ2 w cieczy wodnistej6 i hamowaniu kontaktu2,7. Chociaż niektóre czynniki wzrostu, takie jak podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF), mogą zwiększać proliferację w hodowanym ludzkim śródbłonku rogówki, wydajność hodowli pozostaje ograniczona8,9. Ponadto CEC mogą ulegać zmianie fenotypowej podczas ekspansji ex vivo, przypominającej przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT)10-13. Przejście śródbłonkowo-mezenchymalne (EnMT) charakteryzuje się destabilizacją połączeń komórkowych, utratą polaryzacji wierzchołkowo-podstawnej, rearanżacją cytoszkieletu, ekspresją aktyny mięśni gładkich alfa i wydzielaniem kolagenu typu I14. Wszystkie te cechy mogą zakłócić normalne funkcjonowanie CEC, utrudniając stosowanie CEC hodowanych ex vivo w inżynierii tkankowej. Ponadto EnMT jest związany z patogenezą kilku chorób śródbłonka rogówki, w tym dystrofii śródbłonka rogówki Fuchsa i tworzenia błony zarogówkowej15,16. W związku z tym zrozumienie mechanizmu EnMT może pomóc w manipulowaniu procesem EnMT i ułatwić regenerację CEC w celu umożliwienia kompetentnego funkcjonowania.

W tym badaniu opisaliśmy metodę izolowania bydlęcych CEC od guzika rogówki. W hodowli pierwotnej in vitro zaobserwowano proces EnMT, w tym zmianę fenotypową, translokację jądrową β-kateniny oraz regulatory EMT ślimaka i ślimaka. Dalej opisaliśmy metodę demonstrowania EnMT in vivo przy użyciu modelu kriouszkodzenia śródbłonka rogówki szczura. Korzystając z tych 2 modeli, wykazaliśmy, że marimastat, inhibitor metaloproteinazy macierzowej (MMP) o szerokim spektrum działania, może hamować proces EnMT. Opisane protokoły ułatwiają szczegółową analizę mechanizmu EnMT oraz opracowanie strategii manipulowania procesem EnMT w celu dalszego zastosowania klinicznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zastosowane w tym badaniu były zgodne z oświadczeniem Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką dotyczącą wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Narodowego Szpitala Uniwersyteckiego na Tajwanie.

1. Izolacja, przygotowanie hodowli pierwotnej i barwienie immunologiczne bydła CEC

  1. Zdobądź świeże oczy bydlęce z lokalnej rzeźni.
  2. Zdezynfekuj oczy w 10% w/v roztworze jodu powidonu przez 3 minuty. Przemyj je roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).
  3. Zbierz guzik rogówki skalpelem i nożyczkami w sterylnych warunkach. Oderwij błonę Descemeta kleszczami pod mikroskopem preparacyjnym (zauważ, że w tym badaniu oczy bydła zostały wyłuszczone przez lokalną rzeźnię; dlatego pierwszą procedurą badawczą była dezynfekcja oczu preenucleated w laboratorium).
  4. Inkubować błonę Descemeta w 1 ml trypsyny w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Zebrać bydlęce CEC przez odwirowanie przy 112 x g przez 5 minut. Zawiesić komórki w 1 ml uzupełnionego hormonalnego podłoża nabłonkowego (SHEM) zawierającego równe objętości zmodyfikowanej pożywki Dulbecco Eagle z buforem HEPES i pożywki F12 Ham's, uzupełnione 5% płodową surowicą bydlęcą, 0,5% dimetylosulfotlenku, 2 ng/ml ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu, 5 mg/ml insuliny, 5 mg/ml transferyny, 5 ng/ml selenu, 1 nmol/l toksyny, 50 mg/ml gentamycyny i 1,25 mg/ml amfoterycyny B.
  5. Zasiaj komórki (około 1 x 10,5 komórek na oko) w naczyniu o średnicy 6 cm. Hoduj je w SHEM. Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 w powietrzu. Zmieniaj pożywkę co 3 dni.
  6. Gdy komórki osiągną zbieżność, umyć je w PBS i inkubować w 1 ml trypsyny w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Zebrać je przez odwirowanie w stężeniu 112 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml SHEM.
    1. Policz komórki w hemocytometrze. Zasiać komórki na szkiełkach przykrywkowych o gęstości 1 x 104 na dołek na płytce 24-dołkowej i wyhodować komórki w SHEM. W celu zbadania wpływu marimastatu na tłumienie EnMT, należy inkubować komórki w SHEM z 10 μM marimastatu dodanymi do pożywki hodowlanej i zmieniać pożywkę co 3 dni.
  7. Utrwal komórki we wskazanym punkcie czasowym za pomocą 250 μl 4% paraformaldehydu o pH 7,4 przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przepuszczać 250 μl 0,5% Triton X-100 przez 5 min. Blok z 10% albuminą surowicy bydlęcej przez 30 min.
  8. Inkubować komórki z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko aktywnej beta-kateninie (ABC), ślimakowi i ślimakowi przez noc w temperaturze 4 °C. Rozcieńczenie zastosowanych przeciwciał pierwszorzędowych wynosi 1:200. Przeciwciała rozcieńcza się w rozcieńczalniku przeciwciał składającym się z 10 mM PBS, 1% w/v albuminy surowicy bydlęcej i 0,09% w/v azydku sodu.
  9. Umyj komórki dwukrotnie PBS przez 15 minut i inkubuj je z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluorem Alexa (1:100 w rozcieńczalniku przeciwciała) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  10. Przeciwbarwić jądro komórkowe, pokrywając komórki 2 μg / ml 4',6-diamidino-2-fenyloindolu, umyć komórki dwukrotnie PBS przez 15 minut i zamontować je roztworem montażowym zapobiegającym blaknięciu.
  11. Uzyskanie obrazów immunofluorescencyjnych przy długościach fal wzbudzenia 405 i 488 nm za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego z 20-krotnym powiększeniem obiektywu.

2. Model kriouszkodzenia śródbłonka rogówki szczura i wstrzyknięcie dokomorowe

  1. Znieczulenie 12-tygodniowych samców szczurów Sprague-Dawley za pomocą domięśniowych wstrzyknięć 2% ksylazyny (5,6 mg/kg) i tiletaminy oraz zolazepamu (18 mg/kg). Delikatnie uszczypnij skórę zwierząt, aby potwierdzić prawidłowe znieczulenie w przypadku braku drgania skóry.
  2. Wkropl jedną kroplę 0,5% chlorowodorku proparakainy do prawego oka każdego szczura, aby zminimalizować ból oczu i odruch mrugania. Wkraplać maść tetracyklinową do lewego oka, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
  3. Schłodzić sondę ze stali nierdzewnej (średnica = 3 mm) w ciekłym azocie. Przyłóż sondę ze stali nierdzewnej do środkowej rogówki prawego oka na 30 sekund. Często wkraplaj PBS do prawego oka podczas zabiegu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
  4. Wkraplać 0,1% atropiny i 0,3% siarczanu gentamycyny natychmiast po kriourazie i raz dziennie, aby złagodzić ból oka wynikający ze skurczu rzęsek i zapobiec infekcji.
    1. Po zabiegu utrzymuj szczury w cieple za pomocą lampy grzewczej i obserwuj ich regenerację co 15 minut po znieczuleniu, aż odzyskają kontrolę motoryczną. Dodatkowo nałóż maść tetracyklinową na prawe oko, aby zapobiec wysuszeniu rogówki w okresie rekonwalescencji.
  5. Powtarzaj kriouraz rogówki przez 3 kolejne dni.
  6. W celu dostarczenia marimastatu lub bFGF do przedniej komory oczu szczura, należy znieczulić szczury zgodnie z wcześniejszym opisem. Wkraplan jedną kroplę 0,5% chlorowodorku proparakainy do prawego oka, aby zminimalizować ból oczu i odruch mrugania.
  7. Przepłukać powierzchnię oka sterylnym PBS. Wykonać paracentezę komory przedniej pod mikroskopem operacyjnym, wprowadzając igłę 30 G przymocowaną do strzykawki o pojemności 1 ml w przezroczystej rogówce przylimbowej w płaszczyźnie powyżej i równolegle do tęczówki.
  8. Obróć igłę do góry i lekko wciśnij ranę rogówki, aby odsączyć trochę cieczy wodnistej i zmniejszyć ciśnienie wewnątrzgałkowe. Wstrzyknąć 0,02 ml leku domiejscowo. Podczas wyjmowania igły delikatnie ścisnąć przewód igły bawełnianą końcówką.
  9. Sfotografuj oko zewnętrzne we wskazanym punkcie czasowym pod mikroskopem operacyjnym.

3. Zbieranie guzika rogówki szczura i barwienie immunologiczne

  1. Aby poddać szczury eutanazji, umieść je w komorze eutanazyjnej i wlej 100% CO2 z szybkością napełniania 10-30% objętości komory na minutę. Utrzymuj wlew CO2 przez dodatkową minutę po braku oddychania i wyblakłym kolorze oczu.
  2. Przebij oko szczura na rąbku ostrym ostrzem. Przetnij rogówki nożyczkami rogówkowymi wzdłuż rąbka. Spłaszcz rogówki na szkiełku. Wykonaj dodatkowe promieniste nacięcia, jeśli rogówka zwija się.
  3. Utrwalić rogówki za pomocą 250 μl 4% paraformaldehydu o pH 7,4 przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przepuszczać 250 μl 0,5% Triton X-100 przez 5 min, a blokować 10% albuminą surowicy bydlęcej przez 30 min.
  4. Inkubować rogówki z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko ABC przez noc w temperaturze 4 °C w rozcieńczalniku 1:200 w rozcieńczalniku przeciwciał. Przemyć rogówki dwukrotnie PBS przez 15 minut i inkubować je z przeciwciałem drugorzędowym (1:100 w rozcieńczalniku przeciwciała) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Przeciwbarwić jądro komórkowe, pokrywając komórki 2 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenyloindolu i dwukrotnie przemywać komórki PBS przez 15 minut.
  5. Zamontuj rogówki w roztworze montażowym zapobiegającym blaknięciu. Uzyskaj obrazy immunofluorescencyjne przy długościach fal wzbudzenia 405 i 561 nm za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego przy 20-krotnym powiększeniu obiektywu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po izolacji bydlęcych CEC, komórki hodowano in vitro. Rycina 1 przedstawia obrazy w kontraście fazowym bydlęcych CEC. Sześciokątny kształt komórek w fazie konfluencji wskazywał, że podczas izolacji komórki nie zostały zanieczyszczone fibroblastami z zrazu rogówki. Rycina 2 przedstawia immunobarwienie wykonane z użyciem przeciwciał przeciwko ABC, snail oraz slug w wskazanym punkcie czasowym. Poza zmianami fenotypowymi w hodowli in vitro, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

CEC są znane ze swojej skłonności do ulegania EnMT podczas proliferacji komórek. Aby opracować strategie tłumienia procesu EnMT w celach terapeutycznych, konieczne jest dokładne zrozumienie mechanizmu EnMT. Opisaliśmy 2 modele do badania EnMT, a mianowicie model hodowli bydła CEC in vitro i model kriouszkodzenia śródbłonka rogówki szczura. Nasze wyniki pokazały proces EnMT w obu modelach. Co więcej, efekt tłumienia EnMT marimastatu został odtworzony w obu modelach, co sugeruje, że te 2 modele mają ten sam mechan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych, które mogliby zadeklarować.

Podziękowania

Dziękujemy personelowi Drugiego Laboratorium Podstawowego, Departamentu Badań Medycznych, Narodowego Tajwańskiego Szpitala Uniwersyteckiego za ich wsparcie techniczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
trypsynaThermoFisher Scientific12604-013
Dulbecco' s zmodyfikowana pożywka Eagle i pożywka Ham's F12ThermoFisher Scientific11330
płodowa surowica bydlęcaThermoFisher Scientific26140-079
dimetylosulfotlenekSigmaD2650
ludzki naskórkowy czynnik wzrostuThermoFisher ScientificPHG0311
insulina, transferyna, selen ThermoFisher Scientific41400-045
toksynaSigmaC8052-1MG
gentamycynaThermoFisher Scientific15750-060
amfoterycyna BThermoFisher Scientific15290-026
paraformaldehydmikroskopia elektronowa 111219
Triton X-100SigmaT8787 
albumina surowicy bydlęcejSigmaA7906
marimastatSigmaM2699-25MG
antyaktywne przeciwciało beta-kateninyMillpore05-665
przeciwciało przeciw ślimakomSanta cruzsc28199
przeciwciało przeciw ślimakomSanta cruzsc15391
kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) wtórne przeciwciałoThermoFisher ScientificA-11001do barwienia ABC bydlęcych CEC
kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) drugorzędoweThermoFisher ScientificA-11003do barwienia ABC śródbłonka rogówki szczura
kozła przeciwciało anty-królicze IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-11008do barwienia ślimaków i ślimaków bydlęcych CEC
rozcieńczalnik przeciwciałGenemed Biotechnologies10-0001
4',6-diamidino-2-fenyloindolThermoFisher ScientificD1306
podłoże montażoweVector LaboratoriesH-1000
laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyZEISSLSM510
ksylazyna BayerN/A
Tiletamine plus zolazepamVirbacN/A lekweterynaryjny
chlorowodorek proparakainy roztwór okulistycznyAlconN/A lekweterynaryjny
0,1% atropinyWu-Fu Laboratories Co., LtdNie dotyczyleku klinicznego 
0,3% siarczan gentamycynySinphar GroupN/Alek kliniczny 
podstawowy czynnik wzrostu fibroblastówThermoFisher ScientificPHG0024lek kliniczny 

Bibliografia

  1. Maurice, D. M. The location of the fluid pump in the cornea. J Physiol. 221 (1), 43-54 (1972).
  2. Joyce, N. Proliferative capacity of the corneal endothelium. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (3), 359-389 (2003).
  3. Morishige, N., Sonoda, K. H. Bullous keratopathy as a progressive disease: evidence from clinical and laboratory imaging studies. Cornea. 32, Suppl 1 77-83 (2013).
  4. Bates, A. K., Cheng, H., Hiorns, R. W. Pseudophakic bullous keratopathy: relationship with endothelial cell density and use of a predictive cell loss model. A preliminary report. Curr Eye Res. 5 (5), 363-366 (1986).
  5. Wilson, S. E., Lloyd, S. A. Epidermal growth factor and its receptor, basic fibroblast growth factor, transforming growth factor beta-1, and interleukin-1 alpha messenger RNA production in human corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 32 (10), 2747-2756 (1991).
  6. Chen, K. H., Harris, D. L., Joyce, N. C. TGF-beta2 in aqueous humor suppresses S-phase entry in cultured corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40 (11), 2513-2519 (1999).
  7. Senoo, T., Obara, Y., Joyce, N. C. EDTA: a promoter of proliferation in human corneal endothelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (10), 2930-2935 (2000).
  8. Yue, B. Y., Sugar, J., Gilboy, J. E., Elvart, J. L. Growth of human corneal endothelial cells in culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (2), 248-253 (1989).
  9. Peh, G. S., Beuerman, R. W., Colman, A., Tan, D. T., Mehta, J. S. Human corneal endothelial cell expansion for corneal endothelium transplantation: an overview. Transplantation. 91 (8), 811-819 (2011).
  10. Zhu, C., Rawe, I., Joyce, N. C. Differential protein expression in human corneal endothelial cells cultured from young and older donors. Mol Vis. 14, 1805-1814 (2008).
  11. Ko, M. K., Kay, E. P. Regulatory role of FGF-2 on type I collagen expression during endothelial mesenchymal transformation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4495-4503 (2005).
  12. Lee, H. T., Kay, E. P. FGF-2 induced reorganization and disruption of actin cytoskeleton through PI 3-kinase, Rho, and Cdc42 in corneal endothelial cells. Mol Vis. 9, 624-634 (2003).
  13. Pipparelli, A., et al. ROCK Inhibitor Enhances Adhesion and Wound Healing of Human Corneal Endothelial Cells. PloS one. 8 (4), e62095(2013).
  14. Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Theriault, M., Proulx, S. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1228-1237 (2015).
  15. Jakobiec, F. A., Bhat, P. Retrocorneal membranes: a comparative immunohistochemical analysis of keratocytic, endothelial, and epithelial origins. Am J Ophthalmol. 150 (2), 230-242 (2010).
  16. Okumura, N., et al. Involvement of ZEB1 and Snail1 in excessive production of extracellular matrix in Fuchs endothelial corneal dystrophy. Lab Invest. 95 (11), 1291-1304 (2015).
  17. Okumura, N., et al. Enhancement on primate corneal endothelial cell survival in vitro by a ROCK inhibitor. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3680-3687 (2009).
  18. Zhu, Y. T., Chen, H. C., Chen, S. Y., Tseng, S. C. G. Nuclear p120 catenin unlocks mitotic block of contact-inhibited human corneal endothelial monolayers without disrupting adherent junctions. J Cell Sci. 125 (15), 3636-3648 (2012).
  19. Ho, W. T., et al. Inhibition of Matrix Metalloproteinase Activity Reverses Corneal Endothelial-Mesenchymal Transition. Am J Pathol. 185 (8), 2158-2167 (2015).
  20. Kay, E. D., Cheung, C. C., Jester, J. V., Nimni, M. E., Smith, R. E. Type I collagen and fibronectin synthesis by retrocorneal fibrous membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 22 (2), 200-212 (1982).
  21. Li, C., et al. Notch Signal Regulates Corneal Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Am J Pathol. 183 (3), 786-795 (2013).
  22. Okumura, N., et al. The ROCK Inhibitor Eye Drop Accelerates Corneal Endothelium Wound Healing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (4), 2493-2502 (2013).
  23. Mannermaa, E., Vellonen, K. S., Urtti, A. Drug transport in corneal epithelium and blood-retina barrier: emerging role of transporters in ocular pharmacokinetics. Adv Drug Deliv Rev. 58 (11), 1136-1163 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Bydlece kom rki nab onka rog wkikrioobezw adnienie nab onka rog wki szczurahodowla in vitromodel in vivoprocedura izolacji kom rekbarwienie immunofluorescencyjneanaliza translokacji j drowejleczenie maramastateminiekcja podstawowego FGF
Modele in vitro i in vivo do badania przejścia śródbłonka rogówki i mezenchymów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.