Ten manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół wytwarzania powstającej trójwymiarowej platformy hodowli hepatocytów, odwróconego koloidalnego kryształowego rusztowania oraz towarzyszących technik oceny zachowania hepatocytów. Kontrolowane pory o kontrolowanej wielkości, wzajemne połączenia i zdolność do koniugacji białek macierzy zewnątrzkomórkowej z rusztowaniem z poli(glikolu etylenowego) (PEG) zwiększają wydajność komórek Huh-7,5.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wytwarzanie rusztowania z poli(glikolu etylenowego) z odwróconego koloidalnego kryształu: trójwymiarowa platforma do hodowli komórek do inżynierii tkankowej wątroby
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zdolność do utrzymania funkcji hepatocytów in vitro, w celu testowania cytotoksyczności ksenobiotyków, badania infekcji wirusowych i opracowywania leków ukierunkowanych na wątrobę, wymaga platformy, na której komórki otrzymują odpowiednie sygnały biochemiczne i mechaniczne. Najnowsze systemy inżynierii tkankowej wątroby wykorzystują trójwymiarowe (3D) rusztowania składające się z syntetycznych lub naturalnych hydrożeli, ze względu na ich wysoką retencję wody i zdolność do dostarczania bodźców mechanicznych potrzebnych komórkom. Rośnie zainteresowanie rusztowaniem z odwróconym kryształem koloidalnym (ICC), najnowszym osiągnięciem, które umożliwia wysoką organizację przestrzenną, homotypową i heterotypową interakcję komórek, a także interakcję komórka-macierz zewnątrzkomórkowa (ECM). W niniejszym artykule opisano protokół wytwarzania rusztowania ICC przy użyciu diakrylanu poli(glikolu etylenowego) (PEGDA) i metody ługowania cząstek. Krótko mówiąc, z cząstek mikrosfery wytwarza się sieć, po czym dodaje się roztwór prepolimeru, odpowiednio spolimeryzowany, a następnie cząstki są usuwane lub ługowane za pomocą rozpuszczalnika organicznego (np. Tetrahydrofuranu). Rozpuszczenie sieci powoduje powstanie wysoce porowatego rusztowania z kontrolowanymi rozmiarami porów i połączeniami, które umożliwiają mediom łatwiejsze dotarcie do komórek. Ta unikalna struktura pozwala na przyleganie komórek do dużej powierzchni, a także łatwą komunikację między porami, a zdolność do powlekania rusztowania PEGDA ICC białkami również wykazuje wyraźny wpływ na wydajność komórek. Analizujemy morfologię rusztowania, a także zachowanie komórek raka wątroby (Huh-7.5) pod względem żywotności i funkcji, aby zbadać wpływ struktury ICC i powłok ECM. Ogólnie rzecz biorąc, artykuł ten zawiera szczegółowy protokół powstającego rusztowania, które ma szerokie zastosowanie w inżynierii tkankowej, zwłaszcza w inżynierii tkankowej wątroby.
Wprowadzenie
Wątroba jest wysoce unaczynionym organem o wielu funkcjach, w tym detoksykacji krwi, metabolizmie ksenobiotyków i produkcji białek surowicy. Tkanka wątroby ma złożoną trójwymiarową (3D) mikrostrukturę, składającą się z wielu typów komórek, kanalików żółciowych, sinusoid i stref o różnym składzie biomatrycy i różnych stężeniach tlenu. Biorąc pod uwagę tę skomplikowaną strukturę, trudno było stworzyć właściwy model wątroby in vitro1. Istnieje jednak rosnące zapotrzebowanie na funkcjonalne modele in vitro, w których ludzkie hepatocyty służą jako platformy do badania toksycznościleków2 i badań nad chorobami związanymi z wątrobą3
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Wytwarzanie rusztowania ICC (Rysunek 1)
- Przygotowanie sieci polistyrenowych (PS) (średnica = 6 mm; 8-13 warstw kulek).
- Aby przygotować formy, odetnij końcówki probótek do mikrocentryfugi o objętości 0,2 ml (odpornych na gotowanie) na poziomie 40 µl. Przyklej górną część odciętych probótek do szkiełek podstawkowych do mikroskopu o wymiarach 24 x 60 mm2 za pomocą wodoodpornego kleju.
- Umieść sfery PS (średnica = 140 µm) zawieszone w wodzie w fiolce o pojemności 20 ml, ostrożnie odpipetuj zawiesinę wodną i dodaj do fiolki 18 ml 70% roztworu etanolu. Umieść roztwór sfer w kąpieli ultradźwiękowej, aby rozluźnić zagregowane sf....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Reprezentatywne wyniki charakterystyki strukturalnej rusztowania ICC oraz porównanie skuteczności każdego wariantu rusztowania ICC w hodowli hepatocytów zostały przedstawione i omówione poniżej. Warianty rusztowania ICC zastosowane w tych wynikach obejmowały powłoki kolagenowe o stężeniach 0 µg/ml (Bare), 20 µg/ml (Collagen 20), 200 µg/ml (Collagen 200) i 400 µg/ml (Collagen 400), a początkowa liczba wysianych komórek Huh-7.5 wynosiła 1x106.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Rusztowania inżynierii tkankowej szybko ewoluują, aby zapewnić wszystkie fizyczne i biochemiczne wskazówki niezbędne do regeneracji, utrzymania lub naprawy tkanek w celu zastosowania wymiany narządów, badania chorób, opracowywania leków iwielu innych. W inżynierii tkankowej wątroby pierwotne ludzkie hepatocyty szybko tracą swoje funkcje metaboliczne po odizolowaniu od organizmu, co stwarza ogromne zapotrzebowanie na rusztowania inżynieryjne i opracowywanie platform do utrzymania funkcji wątroby. Obecne platfor.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony National Research Foundation Fellowship (NRF -NRFF2011-01) oraz Competitive Research Programme (NRF-CRP10-2012-07).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówka do PCR 0,2 ml | Axygen Scientific | PCR-02D-C | Odporny na gotowanie |
| klej Gorilla Glue | Gorilla Glue, Inc. | Zależy od dostawcy. Został on zakupiony w lokalnym sklepie. | |
| Prowadnice szklane | VWR | 631-1575 | Wymiary: 24 razy; 60 mm2 |
| Kulki polistyrenowe | Fisher Scientific | TSS#4314A | Średnica = 140 &mikro; m; 3x104 cząstki na mililitr i 1,4% rozkład wielkości |
| Etanol | Merck | 1.00983.1011 | bezwzględny do analizy EMSURE; Rozcieńczyć do 70% wodą Milli-Q |
| Kąpiel ultradźwiękowa Piec | wyposażeniowy | Elma | S10H |
| Nabertherm | N7/H | Sprzęt | |
| 200 µ l końcówka do pipet | Axygen Scientific | T-210-Y-R-S | |
| Wytrząsarka wahadłowa | VWR | 444-0142 | |
| Glikol polietylenowy (PEG) | Merck | 1.09727.0100 | Mw= 4 kDa; arylacja monomerów PEG i oczyszczanie powstałego osadu wytwarza makromer PEGDA o Mw = 4,6 kDa |
| Wirówka | Beckman Coulter | 392932 | Sprzęt |
| Akrylan - Poli(Glikol etylenowy) - Walerianian sukcynimidylu | Laysan Bio | ACRL-PEG-SVA-3400-1g | Mw = 3,4 kDa |
| 2-hydroksy-4'-(2-hydroksyetoksy)-2-metylopropiofenon | Sigma Aldrich | 410896 | |
| Vortex | VWR | 58816-123 | Sprzęt |
| Mikrowirówka | Eppendorf | 5404 000.413 | |
| folii parafinowej | M | #PM996 | Utrzymywany na poziomie 9" z intensywnością 10,84 mW/cm2 |
| Reflektor UV Bluewave 200 | Blaze Technology | 120008, 122300 | |
| Tetrahydrofuran (THF) | Merck | 107025 | |
| Wytrząsarka orbitalna | Heidolph | 543-123120-00-5 | |
| Kolagen typu I | Sigma Aldrich | C3867-1VL | Od szczura 1x, bez CaCl2 & MgCl2; pH = 7,2 |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Gibco | 20012-027 | 16% w/v AQ. 10 x 10 ml |
| Paraformaldehyd | VWR | 43368.9M | Sprzęt |
| Freezone 4.5 liofilizator | Labconco | 7750020 | Equipment |
| Powlekarka do natryskiwania | Jeol Ltd. | JFC-1600 | |
| Sprzęt Skaningowy mikroskop elektronowy | Jeol Ltd. | JSM 5310 | |
| Przeciwciała pierwszorzędowe przeciwko kolagenowi typu I | Abcam | ab6308 | |
| Przeciwciało wtórne przeciw myszy sprzężone z Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21121 | |
| Płytka, kultura tkankowa 24 dołki, płaskie dno (Nunclon) | Bio-Rev PTE LTD | 3820-024 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 2,5 g / L glukozy z L-Gln | Lonza | 12-604F | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Gibco | A15-151 | |
| Penicylina-Streptomycyna (P/S) | Life Tchnologies | 15140-122 E | |
| 100 mm Corning niepoddane obróbce naczynia hodowlane | Sigma Aldrich | CLS430591 | |
| 0,25% Trypsyna-EDTA | Gibco | 25200-056 | Sprzęt; 37 ° C, 5% wilgotności |
| Forma Steri-Cycle CO2 Inkubatory | Thermofisher Scientific | 371 | |
| Hemacytometr Hausser Bright-Line Phase | Thermofisher Scientific | 02-671-6 | |
| Zestaw do żywej/martwej żywotności/cytotoksyczności dla komórek ssaków | Life Technologies | L3224 | |
| Test CCK-8 | Dojindo Laboratories | CK04-11 | Odczynnik soli monosodowej (MSR) |
| Czytnik mikropłytek Infinite 200 PRO | tekanu | ||
| dla ludzi | Abcam abcam | ab108788 | |
| Triton X-100 | Bio-Rad | #1610407 | |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Przeciwciała pierwotne przeciwko myszom (przeciwko CYP3A4, albuminie) | Santa Cruz Biotechnology | sc-53850; sc-271605 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| Alexa Fluor 555 z oznaczeniem Phalloidin | Life Technologies | A34055 | |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | |
| Chloroform | VWR | 22706.326 | |
| Izopropanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | |
| DPEC woda | Thermofisher Scientific | AM9916 | |
| Nanodrop Spektrofotometr 2000c | Thermofisher Scientific | ND-2000 | |
| iScript Odwrotna transkrypcja Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1708840 | |
| SYBR select Master Mix for CFX | Life Technology | 4472937 | |
| Primery (do wyboru) | |||
| CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler | Bio Rad Laboratories | SOFT-CFX-31-PATCH |
Bibliografia
- Yamada, M., et al. Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions. Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).
- Abboud, G., Kaplowitz, N.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
