Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie rusztowania z poli(glikolu etylenowego) z odwróconego koloidalnego kryształu: trójwymiarowa platforma do hodowli komórek do inżynierii tkankowej wątroby

9.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54331

⸱

27 sierpnia 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 2School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół wytwarzania powstającej trójwymiarowej platformy hodowli hepatocytów, odwróconego koloidalnego kryształowego rusztowania oraz towarzyszących technik oceny zachowania hepatocytów. Kontrolowane pory o kontrolowanej wielkości, wzajemne połączenia i zdolność do koniugacji białek macierzy zewnątrzkomórkowej z rusztowaniem z poli(glikolu etylenowego) (PEG) zwiększają wydajność komórek Huh-7,5.

Streszczenie

Zdolność do utrzymania funkcji hepatocytów in vitro, w celu testowania cytotoksyczności ksenobiotyków, badania infekcji wirusowych i opracowywania leków ukierunkowanych na wątrobę, wymaga platformy, na której komórki otrzymują odpowiednie sygnały biochemiczne i mechaniczne. Najnowsze systemy inżynierii tkankowej wątroby wykorzystują trójwymiarowe (3D) rusztowania składające się z syntetycznych lub naturalnych hydrożeli, ze względu na ich wysoką retencję wody i zdolność do dostarczania bodźców mechanicznych potrzebnych komórkom. Rośnie zainteresowanie rusztowaniem z odwróconym kryształem koloidalnym (ICC), najnowszym osiągnięciem, które umożliwia wysoką organizację przestrzenną, homotypową i heterotypową interakcję komórek, a także interakcję komórka-macierz zewnątrzkomórkowa (ECM). W niniejszym artykule opisano protokół wytwarzania rusztowania ICC przy użyciu diakrylanu poli(glikolu etylenowego) (PEGDA) i metody ługowania cząstek. Krótko mówiąc, z cząstek mikrosfery wytwarza się sieć, po czym dodaje się roztwór prepolimeru, odpowiednio spolimeryzowany, a następnie cząstki są usuwane lub ługowane za pomocą rozpuszczalnika organicznego (np. Tetrahydrofuranu). Rozpuszczenie sieci powoduje powstanie wysoce porowatego rusztowania z kontrolowanymi rozmiarami porów i połączeniami, które umożliwiają mediom łatwiejsze dotarcie do komórek. Ta unikalna struktura pozwala na przyleganie komórek do dużej powierzchni, a także łatwą komunikację między porami, a zdolność do powlekania rusztowania PEGDA ICC białkami również wykazuje wyraźny wpływ na wydajność komórek. Analizujemy morfologię rusztowania, a także zachowanie komórek raka wątroby (Huh-7.5) pod względem żywotności i funkcji, aby zbadać wpływ struktury ICC i powłok ECM. Ogólnie rzecz biorąc, artykuł ten zawiera szczegółowy protokół powstającego rusztowania, które ma szerokie zastosowanie w inżynierii tkankowej, zwłaszcza w inżynierii tkankowej wątroby.

Wprowadzenie

Wątroba jest wysoce unaczynionym organem o wielu funkcjach, w tym detoksykacji krwi, metabolizmie ksenobiotyków i produkcji białek surowicy. Tkanka wątroby ma złożoną trójwymiarową (3D) mikrostrukturę, składającą się z wielu typów komórek, kanalików żółciowych, sinusoid i stref o różnym składzie biomatrycy i różnych stężeniach tlenu. Biorąc pod uwagę tę skomplikowaną strukturę, trudno było stworzyć właściwy model wątroby in vitro1. Istnieje jednak rosnące zapotrzebowanie na funkcjonalne modele in vitro, w których ludzkie hepatocyty służą jako platformy do badania toksycznościleków2 i badań nad chorobami związanymi z wątrobą3.

Obecne platformy inżynierii tkankowej wątroby uprościły złożoność wątroby, izolując jeden lub skupiając się na kilku parametrach wątroby, a mianowicie kokulturze komórek4, składzie biochemicznym mikrośrodowisk strefowych5, dynamice przepływu6,7 i konfiguracji biomatrycy8. Konfigurację biomatrycy można podzielić na takie parametry, jak materiały rusztowań, skład białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), sztywność matrycy, a także konstrukcja i struktura rusztowania. Nastąpił wzrost liczby badań inżynierii tkankowej z wykorzystaniem syntetycznych hydrożeli, zwłaszcza hydrożeli z poli(glikolu etylenowego) (PEG)9, biorąc pod uwagę możliwość dostrajania właściwości mechanicznych, bioaktywności i szybkości degradacji hydrożelu. Jeśli chodzi o badania związane z wątrobą, biokompatybilny hydrożel zastosowano do badania infekcji wirusowych chorób wątroby3. Jako projekt platformy hepatocytów, w licznych badaniach wykorzystano kultury kanapkowe hepatocytów10,11 i enkapsulację komórek w hydrożelu12,13, aby zapewnić środowisko 3D oraz interakcję komórka-ECM i komórka-komórka, które są niezbędne do naśladowania mikrośrodowiska in vivo. Platformy te nie posiadają jednak wysokiego stopnia kontroli i organizacji przestrzennej, co prowadzi do niejednorodnych właściwości przez rusztowanie14.

Rusztowanie koloidalne z odwróconym kryształem (ICC)14 to wysoce zorganizowane rusztowanie 3D do hodowli komórek, które zostało po raz pierwszy wprowadzone na początku 2000 roku. Unikalną strukturę rusztowania można przypisać prostemu procesowi wytwarzania przy użyciu kryształu koloidalnego, uporządkowanej sieci cząstek koloidalnych o zmiennej średnicy. Krótko mówiąc, aby podsumować proces, cząstki są starannie układane i wyżarzane za pomocą ciepła, aby utworzyć sieć. Wypłukiwanie tej sieci przez rozpuszczalnik organiczny w spolimeryzowanym hydrożelu powoduje powstanie sześciokątnie upakowanych kulistych wnęk15 o dużej powierzchni. To wysoce uporządkowane rusztowanie zostało wcześniej wykonane zarówno z materiałów syntetycznych, jak i naturalnych, w tym między innymi poli(akrylamidu)16-21, poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego)15,22-30, poli(glikolu etylenowego)31,32, poli(metakrylanu 2-hydroksyetylu)21,33-35 i chitozanu36-39. Rusztowania ICC wykonane z materiałów niepowodujących zanieczyszczeń mają tendencję do promowania sferoid komórkowych w jamach14,23,40. Wykazano, że wiele typów komórek z powodzeniem proliferuje, różnicuje się i funkcjonuje w tej konfiguracji, w tym chondrocyty41, komórki zrębu szpiku kostnego42 i komórki macierzyste43,44. Jeśli chodzi o hepatocyty, przeprowadzono badania z rusztowaniami ICC wykonanymi z Na2SiO3 i poli(akrylamidu), ale nie PEG. Dzięki prostym strategiom biokoniugacji (tj. sprzężeniu amin przez EDC/NHS) można wytwarzać rusztowania na bazie PEG sprzężone z białkami ECM, które mogą udowodnić, że więcej miejsc wiązania komórek jest środowiskiem bardziej podobnym do in vivo i poprawia funkcję wątroby.

W tym manuskrypcie i powiązanym filmie, szczegółowo opisujemy produkcję rusztowania ICC przy użyciu hydrożelu z poli(glikolu etylenowego) diakrylanu (PEGDA) i polistyrenowej siatki mikrosferycznej, zoptymalizowanej pod kątem hodowli raka wątroby (Huh-7.5). Pokazujemy różnice między ogólnie nieprzylepnymi rusztowaniami PEGDA ICC a rusztowaniem PEGDA ICC pokrytym kolagenem pod względem topologii rusztowania i wydajności komórek. Żywotność i funkcja komórek są mierzone jakościowo i ilościowo w celu oceny zachowania komórek Huh-7,5.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wytwarzanie rusztowania ICC (Rysunek 1)

  1. Przygotowanie sieci polistyrenowych (PS) (średnica = 6 mm; 8-13 warstw kulek).
    1. Aby przygotować formy, odetnij końcówki probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,2 ml (odpornych na gotowanie) na poziomie 40 µl. Przymocuj górną część odciętych probówek do szkiełek nakrywkowych o wymiarach 24 x 60 mm2 za pomocą kleju wodoodpornego.
    2. Umieść sfery PS (średnica = 140 µm) zawieszone w wodzie w fiolce o pojemności 20 ml, ostrożnie odpipetuj zawiesinę wodną i dodaj do fiolki 18 ml 70% roztworu etanolu. Umieść roztwór sfer w kąpieli ultradźwiękowej, aby rozluźnić zagregowane sfery. Powtórz ten etap płukania kilka razy, aby całkowicie usunąć wodę i składniki rozpuszczalne w wodzie.
    3. Pipetuj 100 µl etanolu do form.
    4. Odetnij górną część końcówki mikropipety 200 µl o 4 mm. Pipetuj 25 µl sfer do formy dwukrotnie, używając mikropipety 200 µl, aby uzyskać całkowitą objętość 50 µl w każdej formie.
    5. Umieść formy na wytrząsarce kołyszącej przy 120 rpm przez noc.
    6. Sprawdź ułożenie sfer w każdej formie pod mikroskopem optycznym. Jeśli sfery nie są ułożone heksagonalnie, dodaj 50 µl 70% etanolu i potrząśnij ręcznie w osi podłużnej i poprzecznej, aby skorygować ułożenie.
    7. Pozostaw etanol do odparowania w temperaturze pokojowej (RT) przez dwie noce. Umieść kompleks formy i kulek w piecu w temperaturze 130 °C na 6 h, aby przeprowadzić wyżarzanie kulek PS.
  2. Przygotowanie niepowlekanych i powlekanych ECM rusztowań PEGDA.
    1. Zsyntetyzuj makromery PEGDA zgodnie z uznanymi protokołami45,46 dotyczącymi akrylowania liniowych makromerów PEG (Mw = 4,6 kDa).
    2. Przygotuj 50% (w/v) roztwór PEGDA w wodzie dejonizowanej (DI) i pozwól makromerowi odpowiednio się rozpuścić, wirując przy 4 713 x g aż do całkowitego rozpuszczenia.
      1. W przypadku rusztowań ICC sprzężonych z ECM, rozpuść dodatkowo 10% (w/v) Acryloyl-PEG-NHS (Mw=3,4 kDa) w 50% roztworze PEGDA.
    3. Przygotuj 20% (w/v) roztwór zapasowy 2-hydroksy-4'-(2-hydroksyetoksy)-2-metylopropiofenonu (PI) w 70% etanolu.
    4. Dodaj 50 µl 20% (w/v) roztworu zapasowego PI na każdy 1 ml 50% (w/v) PEGDA. Dostosuj wymaganą ilość roztworu zapasowego PI w zależności od masy cząsteczkowej PEGDA.
    5. Mieszaj mieszaninę w probówce do wirowania na wirówce vortex przez 1 min, aby uzyskać jednorodny roztwór.
    6. Oderwij formy od szkiełka (z etapu 1.1.7), usuń klej z form, ostrożnie wypchnij sieci za pomocą szpatułki i umieść każdą z nich w probówce 1,5 ml. Pipetuj 300 µl roztworu PEGDA i wiruj przy 845 x g przez 5 min, aby umożliwić prawidłową infiltrację roztworu PEGDA do sieci.
    7. Wyjmij sieć z probówki za pomocą pęsety i ostrożnie osusz nadmiar roztworu PEGDA na rękawiczkach. Umieść sieć na szkle pokrytym folią parafinową płaską powierzchnią okrągłą skierowaną do góry.
    8. Naświetl rusztowanie zinfiltrowane roztworem PEGDA światłem ultrafioletowym (UV) o długości fali 365 nm (10,84 mW/cm2) przez 5 min za pomocą punktowej lampy UV.
    9. Umieść spolimeryzowane sieci krystaliczne PEGDA w nowych fiolkach (około 10 sieci na fiolkę) i dodaj 20 ml tetrahydrofuranu (THF). Wstrząsaj fiolkami na wytrząsarce orbitalnej przy 300 rpm. Wymień THF co najmniej 3 razy w odstępach 1-2 h.
      Uwaga: Podczas wymiany THF nie usuwaj go całkowicie, aby zapobiec przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do rusztowań, co z kolei może spowodować niepełne usunięcie PS. Pozostaw wystarczającą ilość roztworu, aby przykryć sieci, a następnie dodaj nowy THF.
      Ostrzeżenie: THF jest toksyczny. Należy nosić rękawiczki, fartuch laboratoryjny i gogle. Unikaj wdychania, pracując pod dygestorium.
    10. Sprawdź, czy sfery PS zostały rozpuszczone, dodając wodę do zużytego roztworu THF i obserwując kolor roztworu. Powtórz etap 1.2.9, jeśli sfery PS nie zostały prawidłowo rozpuszczone.
      Uwaga: Kolor roztworu zmieni się na biały, jeśli pozostały jakiekolwiek sfery PS.
  3. Oczyszczanie rusztowań w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC).
    1. Aby wysterylizować rusztowania, przygotuj probówkę do wirowania o pojemności 50 ml z 2 ml 70% etanolu na każde rusztowanie i umieść rusztowania w probówce za pomocą szpatułki. Pozostaw rusztowania do namoczenia w etanolu przez 1 h. Od tego momentu wszystkie procedury należy przeprowadzać w BSC.
    2. Ostrożnie wylej etanol i zastąp go roztworem soli fosforanowej (PBS) (2 ml na rusztowanie), a następnie wiruj przy 524 x g przez 3 min w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Przechowuj w lodówce i wymień PBS kilka razy w odstępach 1-2 h.
      1. W przypadku rusztowań powlekanych kolagenem typu I, przygotuj kolejną probówkę do wirowania o pojemności 50 ml zawierającą roztwór zapasowy kolagenu typu 1 (1 ml na rusztowanie), przenieś wysterylizowane rusztowania do tej probówki za pomocą szpatułki i wiruj przy 524 x g przez 3 min. Wstrząsaj rusztowania przy 400 rpm na wytrząsarce orbitalnej przez 30 min i przechowuj probówkę w lodówce przez noc.
      2. Przed użyciem przemyj rusztowania dwukrotnie PBS, zanurzając rusztowania w świeżym PBS, a następnie odsysając roztwór.
        Uwaga: Zamiast kolagenu typu I można użyć innych białek ECM, ponieważ chemia NHS wymaga grupy aminowej do utworzenia wiązania (Rysunek 2).

figure-protocol-1
Rysunek 1. Przegląd wytwarzania ICC. Rusztowania ICC oparte na PEG są wytwarzane przy użyciu technik mikrowytwarzania z funkcjonalizacją ECM lub bez niej. Rusztowania ICC powlekane ECM wymagają zastosowania PEG-NHS oraz PEGDA (szczegóły w Rysunku 2). Kratka PS ma średnicę 6 mm i wysokość od 8 do 13 warstw kulek. PS, polistyren; PEGDA, poliakrylan glikolu etylenowego; UV, ultrafiolet; THF, tetrahydrofuran; ECM, macierz zewnątrzkomórkowa. Rysunek został zmodyfikowany i wykorzystany za zgodą wydawnictwa Wiley47. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Charakterystyka struktury ICC

  1. Aby przeanalizować strukturę ICC z białkami sprzężonymi lub bez nich, należy zastosować skaningową mikroskopię elektronową (SEM)47.
    1. Utrwalić rusztowania 4% paraformaldehydem (PFA), poddać je seryjnej dehydratacji w roztworach etanolu o stężeniu 25, 50, 75, 95 i 100%, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C do całkowitego odparowania etanolu.
    2. Suszyć próbki w liofilizatorze przez 48 hr.
    3. Przymocować próbkę do uchwytu za pomocą taśmy węglowej i umieścić w naparce.
    4. Po automatycznym wytworzeniu próżni pokryć próbkę warstwą Pt o grubości 10 nm poprzez napylanie przez 60 sec przy prądzie 20 mA.
    5. Wykonać obrazy rusztowań ICC przy użyciu SEM przy napięciu 5 kV (Rycina 3A, Rycina 4A).
  2. Aby zmierzyć średnicę porów i połączeń między kawernami, należy przeanalizować mikrografie SEM za pomocą oprogramowania do analizy obrazu48 (np. ImageJ; Rycina 3B,C).
  3. Aby zwizualizować kolagen sprzężony z rusztowaniem bez komórek, należy znakować kolagen fluorescencyjnie przy użyciu przeciwciał (1:100) przeciwko kolagenowi typu I i obrazować metodą konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej47 (CLSM; Rycina 4B).

3. Hodowla i wysiew komórek Huh-7.5

  1. Hodować komórki Huh-7.5 z gęstością zasiewu 2-2,5 x 106 komórek/ml w 100-milimetrowych naczyniach hodowlanych w 10 ml podłoża Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) uzupełnionego o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny (pożywka wzrostowa) w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Wymieniać pożywkę co trzy dni w komorze z laminarnym przepływem powietrza (BSC), aż komórki osiągną 75-80% konfluencji.
  2. Przygotować rusztowania do zasiewu komórek w BSC.
    1. Ostrożnie umieścić rusztowania w płytce 24-dołkowej płaską powierzchnią do góry.
    2. Aby przemyć rusztowanie, nanieść pipetą 2 ml PBS do każdego dołka zawierającego rusztowanie. Odessać PBS i nanieść pipetą 2 ml świeżego PBS do każdego dołka.
    3. Odessać PBS i nanieść pipetą 2 ml pożywki wzrostowej (patrz krok 3.1), pozostawiając na 30 min. Odessać pożywkę i pozostawić rusztowanie do wyschnięcia na 1 h.
  3. Odjąć konfluencyjne komórki Huh-7.5 (z kroku 3.1) z płytki hodowlanej w BSC, stosując metodę trawienia trypsyną.
    1. Odessać pożywkę z płytki, dodać 4 ml PBS w celu przemycia komórek adherentnych, a następnie odessać PBS.
    2. Nanieść pipetą 0,75-1 ml 0,25% trypsyny i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 3 min.
    3. Wyjąć płytkę z inkubatora i nanieść pipetą 5 ml pożywki, aby zatrzymać reakcję trypsyny. Przenieść pipetą pożywkę, odjęte komórki i mieszaninę z trypsyną do probówki 15 ml.
    4. Wirować przy 524 x g przez 3 min, usunąć nadsącz i resuspendować osad w 5 ml pożywki.
  4. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru i obliczyć objętość zawiesiny komórkowej zawierającej docelową liczbę komórek, N0, na 25 µl (dla standardowego eksperymentu N0 wynosi 1 x 106 komórek).
    Objętość zawiesiny komórkowej = (docelowa liczba komórek) / (stężenie zawiesiny komórkowej)
  5. Powoli nanieść pipetą 25 µl zawiesiny komórkowej (zawierającej N0 komórek) bezpośrednio na każde rusztowanie (z kroku 3.1.4). Umieścić płytkę 24-dołkową w inkubatorze.
  6. Po 12 h ostrożnie przenieść rusztowania za pomocą szpatułki do nowej płytki 24-dołkowej i nanieść pipetą 2 ml pożywki do każdego dołka. Umieścić płytkę 24-dołkową w inkubatorze.
  7. Wymieniać pożywkę co 3 dni lub w zależności od czasu pobierania pożywki do analizy sekrecji białek (patrz krok 5.1).

4. Żywotność komórek

  1. Aby jakościowo przeanalizować żywotność komórek, należy użyć zestawów do fluorescencyjnego barwienia żywych/martwych komórek w celu ich zabarwienia, a następnie wykonać obrazowanie przy użyciu konfokalnego mikroskopu skaningowego (CLSM).
    1. Zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu, należy przygotować roztwór zawierający 4 µM calceina AM i 8 µM etydynium homo-dimer-1 w medium (patrz krok 3.1.3).
      Uwaga: Zoptymalizować w zależności od liczby komórek. W przypadku proliferacji i podwojenia liczby komórek (około 2 milionów), należy użyć podwójnej ilości odczynnika.
    2. W BSC odessać medium z każdej studni zawierającej rusztowanie (krok 3.7) za pomocą pipety 500 µl przygotowanego roztworu. Inkubować próbki w 37 °C inkubować przez 1 h.
    3. Przykryć płytki folią, aby chronić próbki przed światłem podczas wyjmowania płytki z inkubatora. Próbki należy zobrazować przy użyciu CLSM49.
  2. Aby ilościowo ocenić żywotność komórek, należy zmierzyć aktywność enzymatyczną (w żywych komórkach) przy użyciu testów kolorymetrycznych.50 (t. j., 2-(2-metoksy-4-nitrofenylo)-3-(4-nitrofenylo)-5-(2,4-disulfofenyl)-2H-tetrazolium (odczynnik w postaci soli jednosodowej)).
    1. Stworzenie krzywej wzorcowej dla platformy ICC (t. j., wykres mierzony jako zależność absorbancji (OD) od podanej liczby komórek).
      Uwaga: Wysiew komórek nie jest w 100% wydajny w porównaniu z innymi platformami, ponieważ komórki mogą przenikać przez otwory w rusztowaniach.
      1. Wyznaczyć liczbę wysiewanych komórek, N0 która zostanie wykorzystana do sporządzenia krzywej wzorcowej.
        Uwaga: Wybierz zakres obejmujący szacowaną w eksperymencie liczbę komórek. Na przykład, jeśli początkowa liczba komórek wynosi 5 x 105 komórki, a szacowany wzrost do ostatniego dnia eksperymentu wynosi około 3-krotności, należy wybrać 2,5 x 105, 5 x 105, 1 x 106, oraz 2 x 106 komórki jako N0.
      2. Przeprowadzić wysiew komórek do rusztowań ICC (jedno N0 na rusztowanie przy objętości zasiewu wynoszącej 25 µl) zgodnie z opisem w krokach 3.1–3.6.
      3. Po 6 godzinach przenieś rusztowania do innego dołka płytki 24-dołkowej. Wybierz czas, który umożliwia adhezję komórek, ale nie ich proliferację.
      4. Przeprowadź zliczenie komórek na przeniesionym rusztowaniu ICC.
        1. W komorze z laminarnym przepływem powietrza (BSC) rozcieńczyć 10-krotny roztwór odczynnika soli jednosodowej (MSR) do stężenia 1x za pomocą pożywki, a następnie pipetować. 500 µl 1x roztwór MSR do każdej studni zawierającej rusztowanie. Inkubować płytkę 24-dołkową w 37 °C przez 1 h.
        2. Z każdego dołka przenieś 100 µl do dołka płytki 96-dołkowej. Jako próbę ślepą pipetować 100 µl świeżego 1x roztworu odczynnika soli jednosodowej do poszczególnych studzienek płytki 96-dołkowej. Ręcznie usuń wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą suchego końcówki do pipety i przykryj płytkę 96-dołkową folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem.
        3. Zmierz OD przy λ = odczyt przy 450 nm za pomocą spektrofotometru. Od wartości pozostałych pomiarów należy odjąć OD próbki ślepej, aby uzyskać dokładną wartość OD51.
      5. Policz liczbę komórek (NL) pozostałe w dołku po przeniesieniu rusztowania (krok 4.2.1.3) za pomocą hematocytometru.
        Uwaga: Stosować 300 µl trypsyny w celu trypsynizacji komórek.
      6. Oblicz rzeczywistą liczbę komórek, NA.
        wartość rzeczywista = wartość początkowa - ilość pozostała w studzience
        NA=N0-NL
      7. Stwórz krzywą wzorcową, nanosząc na wykres wartości OD uzyskane w kroku 4.2.1.4.3 w funkcji rzeczywistej liczby komórek (N).A) i wykorzystać tę wartość do oszacowania liczby komórek w eksperymentach.
        Uwaga: należy sporządzić nową krzywą wzorcową, jeśli jakiekolwiek parametry ICC (t. j. rozmiar porogenu, wymiary rusztowania, białko ECM, itd.) ulegają zmianie.

5. Funkcje komórki

  1. Analizę sekrecji białek przez komórki Huh-7.5 (np. albuminy, mocznika) z zebranych pośrodków (z kroku 3.7) należy przeprowadzić za pomocą enzymatycznego testu immunoabsorpcyjnego (ELISA)52.
    Uwaga: Należy rozcieńczyć pośrodki w zależności od liczby wysianych komórek i ilości zebranego medium. Dla 5 x 105 komórek wysianych w ICC należy zastosować stosunek ok. 1:25 przed naniesieniem na studzienki pokryte przeciwciałami.
  2. W celu jakościowej analizy funkcji komórek należy przeprowadzić immunostaining specyficznych białek wewnątrzkomórkowych (np. albuminy), enzymów (np. CYP450), zbarwić komponenty strukturalne (np. aktynę komórkową) oraz jądra komórkowe, a następnie wykonać obrazowanie za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego (CLSM)49.
    1. Odssać pośrodki (z kroku 3.7) i nalać 2 ml PBS w celu przemycia rusztowań ICC zawierających komórki.
    2. Nalać 1 ml 4% PFA i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej w celu utrwalenia.
    3. Przemyć 3x 2 ml PBS.
    4. Przeprowadzić permeabilizację błon poprzez inkubację rusztowań w 1 ml 0,1% 4-(1,1,3,3-tetrametylobutylo)fenylopolietylenoglikolu (surfaktantu) przez 30 min.
    5. Przemyć 3x 2 ml PBS, aby usunąć wszelkie wyciekające białka.
    6. Nalać 500 µl 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h w celu zablokowania niespecyficznego wiązania.
    7. Przygotować roztwór rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego (np. przeciwko albuminie, CYP450).
      1. Nalać 500 µl roztworu 1% BSA do probówki 15 ml i dodać 4,5 ml roztworu 0,1% surfaktantu, aby przygotować łącznie 5 ml roztworu 0,1% BSA.
      2. Nalać 98 µl roztworu 0,1% BSA do probówki mikrotwórczej 200 µl oraz 2 µl przeciwciała pierwszorzędowego, aby uzyskać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego w rozcieńczeniu 1:50 (przeciwciało pierwszorzędowe: 0,1% BSA).
    8. Nalać 40 µl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na rusztowanie i przykryć podłoże folią parafinową. Owinąć płytkę 24-dołkową folią aluminiową i przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C przez noc.
    9. Przemyć 3x 2 ml PBS, delikatnie wstrząsając płytką pomiędzy płukaniami.
    10. Przygotować roztwór zapasowy rozcieńczonego biotynylowanego przeciwciała wtórnego (np. przeciwciała anty-mysie).
      1. Nalać 198 µl roztworu 0,1% BSA i 2 µl przeciwciała wtórnego, aby uzyskać roztwór przeciwciała wtórnego w rozcieńczeniu 1:100 (przeciwciało wtórne: 0,1% BSA).
      2. Przygotować 0,1% roztwór zapasowy faloidyny znakowanej rhodaminą lub fluoresceiną (do barwienia filamentów aktynowych komórki) w roztworze 0,1% BSA.
      3. Nalać 25 µl każdego roztworu do probówki i dobrze wymieszać.
    11. Nalać 50 µl roztworu zapasowego przeciwciała wtórnego na rusztowanie. Przykryć rusztowanie folią parafinową, owinąć płytkę folią aluminiową i przechowywać w temperaturze pokojowej przez 2 h.
    12. Przemyć 3x 2 ml PBS.
    13. Nalać 200 µl roztworu 0,2% 4'-6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI; barwnik do jąder komórkowych) na rusztowanie i pozostawić w temperaturze pokojowej przez 2-3 min. Przykryć płytkę folią aluminiową.
    14. Przemyć 2x 2 ml PBS.
    15. Za pomocą zakraplacza nanieść kroplę medium montażowego na podłoże.
    16. Ostrożnie położyć rusztowanie na szkiełku przedmiotowym i wykonać obrazowanie za pomocą CLSM47.
  3. Ocenić ekspresję genów za pomocą reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR). Użyć standardowych zestawów do RT-PCR53 i qPCR54 zgodnie z instrukcjami producenta. Wyekstrahować RNA z komórek zgodnie z poniższym opisem.
    1. Umieścić rusztowanie (z kroku 3.7) w probówce mikrotwórczej 1,5 ml.
    2. Nalać 1 ml roztworu do ekstrakcji RNA do probówki i inkubować w sonikatorze przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    3. Nalać 200 µl chloroformu do każdej probówki mikrotwórczej i energicznie potrząsać probówką w dłoni przez 15-20 s. Przechowywać probówki w temperaturze pokojowej przez ok. 3 min, aż fazy się rozdzielą.
    4. Odwirować próbkę przy 13 000 x g, 4 °C przez 15 min i ostrożnie wyjąć probówki, aby nie zmieszać faz.
    5. Ostrożnie nalać 500-600 µl górnej fazy wodnej z pierwszej probówki do drugiej probówki mikrotwórczej.
    6. Dodać równą objętość (500-600 µl) izopropanolu do tej drugiej probówki.
    7. Odwrócić probówkę 3-5 razy i pozostawić w temperaturze pokojowej na 10 min.
    8. Odwirować próbkę przy 13 000 x g, 4 °C przez 15 min.
      1. Jeśli osad nie jest widoczny na dnie probówki, wirować ponownie przez 5 min.
        Uwaga: Jeśli osad nadal nie jest widoczny, ilość RNA może być niewystarczająca.
    9. Odwrócić probówki z otwartym korkiem, aby usunąć nadsącz, a następnie nalać do probówki 1 ml 70% etanolu rozcieńczonego w wodzie z DEPC.
    10. Lekko zawirować probówkę w vortexie, aby osad oddzielił się od ścianki probówki, a następnie pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.
    11. Dodać 50 µl wody z DEPC, aby resuspendować osad.
    12. Kontynuować pipetowanie aż do rozpuszczenia osadu.
    13. Inkubować przez 10 min w temperaturze 55 °C w celu denaturacji dwuniciowego RNA do RNA jednoniciowego.
    14. Lekko opukać palcami dno probówki, a następnie krótko odwirować probówki (7 500 x g, 4 min, 4 °C).
    15. Przechowywać probówki w lodzie do momentu przeprowadzenia transkrypcji odwrotnej55 i PCR w czasie rzeczywistym zgodnie z opisem w 56.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Poniżej przedstawiono i omówiono reprezentatywne wyniki charakterystyki strukturalnej rusztowania ICC oraz porównanie skuteczności każdego z wariantów rusztowania ICC w hodowli hepatocytów. Warunki rusztowań ICC zastosowane w tych wynikach obejmują powłoki kolagenowe o stężeniach 0 µg/ml (Bare), 20 µg/ml (Collagen 20), 200 µg/ml (Collagen 200) i 400 µg/ml (Collagen 400), a początkowa liczba wysianych komórek Huh-7.5 wynosi 1x106.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Rusztowania inżynierii tkankowej szybko ewoluują, aby zapewnić wszystkie fizyczne i biochemiczne wskazówki niezbędne do regeneracji, utrzymania lub naprawy tkanek w celu zastosowania wymiany narządów, badania chorób, opracowywania leków iwielu innych. W inżynierii tkankowej wątroby pierwotne ludzkie hepatocyty szybko tracą swoje funkcje metaboliczne po odizolowaniu od organizmu, co stwarza ogromne zapotrzebowanie na rusztowania inżynieryjne i opracowywanie platform do utrzymania funkcji wątroby. Obecne platfor...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony National Research Foundation Fellowship (NRF -NRFF2011-01) oraz Competitive Research Programme (NRF-CRP10-2012-07).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka do PCR 0,2 mlAxygen ScientificPCR-02D-COdporny na gotowanie
klej Gorilla GlueGorilla Glue, Inc.Zależy od dostawcy. Został on zakupiony w lokalnym sklepie.
Prowadnice szklaneVWR631-1575Wymiary: 24 razy; 60 mm2
Kulki polistyrenoweFisher ScientificTSS#4314AŚrednica = 140 &mikro; m; 3x104 cząstki na mililitr i 1,4% rozkład wielkości
EtanolMerck1.00983.1011bezwzględny do analizy EMSURE; Rozcieńczyć do 70% wodą Milli-Q
Kąpiel ultradźwiękowa PiecwyposażeniowyElmaS10H
NaberthermN7/HSprzęt
200 µ l końcówka do pipetAxygen ScientificT-210-Y-R-S
Wytrząsarka wahadłowaVWR444-0142
Glikol polietylenowy (PEG)Merck1.09727.0100Mw= 4 kDa; arylacja monomerów PEG i oczyszczanie powstałego osadu wytwarza makromer PEGDA o Mw = 4,6  kDa
WirówkaBeckman Coulter392932Sprzęt
Akrylan - Poli(Glikol etylenowy) - Walerianian sukcynimidyluLaysan BioACRL-PEG-SVA-3400-1gMw = 3,4 kDa
2-hydroksy-4'-(2-hydroksyetoksy)-2-metylopropiofenonSigma Aldrich410896
VortexVWR58816-123Sprzęt
MikrowirówkaEppendorf5404 000.413
folii parafinowejM #PM996Utrzymywany na poziomie 9" z intensywnością 10,84  mW/cm2
Reflektor UV Bluewave 200Blaze Technology 120008, 122300
Tetrahydrofuran (THF)Merck107025
Wytrząsarka orbitalnaHeidolph543-123120-00-5
Kolagen typu ISigma AldrichC3867-1VLOd szczura 1x, bez CaCl2 & MgCl2; pH = 7,2
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco20012-02716% w/v AQ. 10 x 10  ml
ParaformaldehydVWR43368.9MSprzęt
Freezone 4.5 liofilizatorLabconco7750020Equipment
Powlekarka do natryskiwaniaJeol Ltd.JFC-1600
Sprzęt Skaningowy mikroskop elektronowyJeol Ltd.JSM 5310
Przeciwciała pierwszorzędowe przeciwko kolagenowi typu IAbcamab6308
Przeciwciało wtórne przeciw myszy sprzężone z Alexa Fluor 488Life TechnologiesA21121
Płytka, kultura tkankowa 24 dołki, płaskie dno (Nunclon) Bio-Rev PTE LTD3820-024
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)
2,5 g / L glukozy z L-Gln		Lonza12-604F
Płodowa surowica bydlęca (FBS)GibcoA15-151
Penicylina-Streptomycyna (P/S)Life Tchnologies15140-122 E
100 mm Corning niepoddane obróbce naczynia hodowlaneSigma AldrichCLS430591
0,25% Trypsyna-EDTAGibco25200-056Sprzęt; 37  ° C, 5% wilgotności
Forma Steri-Cycle CO2 InkubatoryThermofisher Scientific371
Hemacytometr Hausser Bright-Line PhaseThermofisher Scientific02-671-6
Zestaw do żywej/martwej żywotności/cytotoksyczności dla komórek ssakówLife TechnologiesL3224 
Test CCK-8Dojindo LaboratoriesCK04-11Odczynnik soli monosodowej (MSR)
Czytnik mikropłytek Infinite 200 PRO tekanu
dla ludziAbcam abcamab108788
Triton X-100Bio-Rad#1610407
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA2153-50G
Przeciwciała pierwotne przeciwko myszom (przeciwko CYP3A4, albuminie)Santa Cruz Biotechnologysc-53850; sc-271605
DAPILife TechnologiesD3571
Alexa Fluor 555 z oznaczeniem PhalloidinLife TechnologiesA34055
TrizolLife Technologies15596-026
ChloroformVWR22706.326
IzopropanolFisher Scientific67-63-0
DPEC wodaThermofisher ScientificAM9916
Nanodrop Spektrofotometr 2000cThermofisher ScientificND-2000
iScript Odwrotna transkrypcja Supermix Bio-Rad Laboratories1708840
SYBR select Master Mix for CFXLife Technology4472937
Primery (do wyboru)
CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal CyclerBio Rad LaboratoriesSOFT-CFX-31-PATCH 
Parafilm zZestaw ELISA albuminy

Bibliografia

  1. Yamada, M., et al. Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions. Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).
  2. Abboud, G., Kaplowitz, N. Drug-induced liver injury. Drug Safety. 30 (4), 277-294 (2007).
  3. Cho, N. J., et al. Viral infection of human progenitor and liver-derived cells encapsulated in three-dimensional PEG-based hydrogel. Biomed Mater. 4 (1), (2009).
  4. Revzin, A., et al. Designing a hepatocellular microenvironment with protein microarraying and poly (ethylene glycol) photolithography. Langmuir. 20 (8), 2999-3005 (2004).
  5. Sato, A., Kadokura, K., Uchida, H., Tsukada, K. An in vitro hepatic zonation model with a continuous oxygen gradient in a microdevice. Biochem Bioph Res Com. 453 (4), 767-771 (2014).
  6. Domansky, K., et al. Perfused multiwell plate for 3D liver tissue engineering. Lab Chip. 10 (1), 51-58 (2010).
  7. Hegde, M., et al. Dynamic interplay of flow and collagen stabilizes primary hepatocytes culture in a microfluidic platform. Lab Chip. 14 (12), 2033-2039 (2014).
  8. Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat methods. 2 (2), 119-125 (2005).
  9. Underhill, G. H., Chen, A. A., Albrecht, D. R., Bhatia, S. N. Assessment of hepatocellular function within PEG hydrogels. Biomaterials. 28 (2), 256-270 (2007).
  10. Dunn, J., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Hepatocytes in collagen sandwich: evidence for transcriptional and translational regulation. J cell biol. 116 (4), 1043-1053 (1992).
  11. Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Long-term in vitro function of adult hepatocytes in a collagen sandwich configuration. Biotechnol progr. 7 (3), 237-245 (1991).
  12. Ling, Y., et al. A cell-laden microfluidic hydrogel. Lab Chip. 7 (6), 756-762 (2007).
  13. Kim, M., Lee, J. Y., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31 (13), 3596-3603 (2010).
  14. Kotov, N. A., et al. Inverted Colloidal Crystals as Three-Dimensional Cell Scaffolds. Langmuir. 20 (19), 7887-7892 (2004).
  15. Shanbhag, S., Woo Lee, J., Kotov, N. Diffusion in three-dimensionally ordered scaffolds with inverted colloidal crystal geometry. Biomaterials. 26 (27), 5581-5585 (2005).
  16. Lee, Y. H., Huang, J. R., Wang, Y. K., Lin, K. H. Three-dimensional fibroblast morphology on compliant substrates of controlled negative curvature. Integr Biol. 5, 1447-1455 (2013).
  17. da Silva, J., Lautenschlager, F., Kuo, C. H. R., Guck, J., Sivaniah, E. 3D inverted colloidal crystals in realistic cell migration assays for drug screening applications. Integr Biol. 3, 1202-1206 (2011).
  18. da Silva, J., Lautenschlager, F., Sivaniah, E., Guck, J. R. The cavity-to-cavity migration of leukaemic cells through 3D honey-combed hydrogels with adjustable internal dimension and stiffness. Biomaterials. 31, 2201-2208 (2010).
  19. Lee, J., Lilly, G. D., Doty, R. C., Podsiadlo, P., Kotov, N. A. In vitro toxicity testing of nanoparticles in 3D cell culture. Small. 5, 1213-1221 (2009).
  20. Lee, J., Kotov, N. A. Notch ligand presenting acellular 3D microenvironments for ex vivo human hematopoietic stem-cell culture made by layer-by-layer assembly. Small. 5, 1008-1013 (2009).
  21. Liu, Y., et al. Rapid aqueous photo-polymerization route to polymer and polymer-composite hydrogel 3D inverted colloidal crystal scaffolds. J Biomed Mater Res. Part A. 83, 1-9 (2007).
  22. Ma, P. X., Choi, J. W. Biodegradable polymer scaffolds with well-defined interconnected spherical pore network. Tissue Eng. 7, 23-33 (2001).
  23. Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Poly (lactic-co-glycolic acid) bone scaffolds with inverted colloidal crystal geometry. Tissue Eng Part A. 14, 1639-1649 (2008).
  24. Choi, S. W., Zhang, Y., Xia, Y. Three-dimensional scaffolds for tissue engineering: the importance of uniformity in pore size and structure. Langmuir. 26, 19001-19006 (2010).
  25. Choi, S. W., Zhang, Y., Thomopoulos, S., Xia, Y. In vitro mineralization by preosteoblasts in poly(DL-lactide-co-glycolide) inverse opal scaffolds reinforced with hydroxyapatite nanoparticles. Langmuir. 26, 12126-12131 (2010).
  26. Choi, S. W., Zhang, Y., Macewan, M. R., Xia, Y. Neovascularization in biodegradable inverse opal scaffolds with uniform and precisely controlled pore sizes. Adv Healthc Mater. 2, 145-154 (2013).
  27. Zhang, Y., Choi, S. W., Xia, Y. Modifying the Pores of an Inverse Opal Scaffold With Chitosan Microstructures for Truly Three-Dimensional Cell Culture. Macromol Rapid Commun. 33, 296-301 (2012).
  28. Cai, X., et al. Investigation of neovascularization in three-dimensional porous scaffolds in vivo by a combination of multiscale photoacoustic microscopy and optical coherence tomography. Tissue Eng. Part C, Meth. 19, 196-204 (2013).
  29. Zhang, Y. S., Yao, J., Wang, L. V., Xia, Y. Fabrication of Cell Patches Using Biodegradable Scaffolds with a Hexagonal Array of Interconnected Pores (SHAIPs). Polymer. 55, 445-452 (2014).
  30. Zhang, Y. S., Regan, K. P., Xia, Y. Controlling the Pore Sizes and Related Properties of Inverse Opal Scaffolds for Tissue Engineering Applications. Macromol Rapid Commun. 34, 485-491 (2013).
  31. Stachowiak, A. N., Bershteyn, A., Tzatzalos, E., Irvine, D. J. Bioactive Hydrogels with an Ordered Cellular Structure Combine Interconnected Macroporosity and Robust Mechanical Properties. Adv Mater. 17, 399-403 (2005).
  32. Stachowiak, A. N., Irvine, D. J. Inverse opal hydrogel-collagen composite scaffolds as a supportive microenvironment for immune cell migration. J Biomed Mater Res. Part A. 85, 815-828 (2008).
  33. Liu, Y., Wang, S. 3D inverted opal hydrogel scaffolds with oxygen sensing capability. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 58, 8-13 (2007).
  34. Bryant, S. J., Cuy, J. L., Hauch, K. D., Ratner, B. D. Photo-patterning of porous hydrogels for tissue engineering. Biomaterials. 28, 2978-2986 (2007).
  35. Bhrany, A. D., Irvin, C. A., Fujitani, K., Liu, Z., Ratner, B. D. Evaluation of a sphere-templated polymeric scaffold as a subcutaneous implant. JAMA facial plastic surgery. 15, 29-33 (2013).
  36. Kuo, Y. C., Chiu, K. H. Inverted colloidal crystal scaffolds with laminin-derived peptides for neuronal differentiation of bone marrow stromal cells. Biomaterials. 32 (3), 819-831 (2011).
  37. Yang, J. T., Kuo, Y. C., Chiu, K. H. Peptide-modified inverted colloidal crystal scaffolds with bone marrow stromal cells in the treatment for spinal cord injury. Colloids Surf. B, Biointerfaces. 84, 198-205 (2011).
  38. Kuo, Y. C., Tsai, Y. T. Inverted colloidal crystal scaffolds for uniform cartilage regeneration. Biomacromolecules. 11, 731-739 (2010).
  39. Choi, S. W., Xie, J., Xia, Y. Chitosan-Based Inverse Opals: Three-Dimensional Scaffolds with Uniform Pore Structures for Cell Culture. Adv Mater. 21, 2997-3001 (2009).
  40. Long, T. J., Sprenger, C. C., Plymate, S. R., Ratner, B. D. Prostate cancer xenografts engineered from 3D precision-porous poly(2-hydroxyethyl methacrylate) hydrogels as models for tumorigenesis and dormancy escape. Biomaterials. 35, 8164-8174 (2014).
  41. Kuo, Y. C., Tsai, Y. T. Inverted colloidal crystal scaffolds for uniform cartilage regeneration. Biomacromolecules. 11, 731-739 (2010).
  42. Kuo, Y. C., Chiu, K. H. Inverted colloidal crystal scaffolds with laminin-derived peptides for neuronal differentiation of bone marrow stromal cells. Biomaterials. 32, 819-831 (2011).
  43. Lee, J., Cuddihy, M. J., Cater, G. M., Kotov, N. A. Engineering liver tissue spheroids with inverted colloidal crystal scaffolds. Biomaterials. 30 (27), 4687-4694 (2009).
  44. Galperin, A., et al. Integrated bi-layered scaffold for osteochondral tissue engineering. Adv Healthc Mater. 2, 872-883 (2013).
  45. Waters, D. J., et al. Morphology of Photopolymerized End-linked Poly(ethylene glycol) Hydrogels by Small Angle X-ray Scattering. Macromolecules. 43 (16), 6861-6870 (2010).
  46. Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Conjugate addition reactions combined with free-radical cross-linking for the design of materials for tissue engineering. Biomacromolecules. 2 (2), 430-441 (2001).
  47. Kim, M. H., et al. Biofunctionalized Hydrogel Microscaffolds Promote Three-Dimensional Hepatic Sheet Morphology. Macromol Biosci. , (2015).
  48. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. , http://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html#toc-Subsection-30.1 (2012).
  49. JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Introduction to Fluorescence Microscopy. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
  50. Tominaga, H., et al. A water-soluble tetrazolium salt useful for colorimetric cell viability assay. Anal Commun. 36 (2), 47-50 (1999).
  51. JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Introduction to the Microplate Reader. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
  52. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The ELISA Method. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
  53. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1, 1559-1582 (2006).
  54. JoVE Science Education Database. Essentials of Environmental Microbiology. RNA Analysis of Environmental Samples Using RT-PCR. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
  55. JoVE Science Education. Essentials of Environmental Microbiology. , JoVE. (2015).
  56. Jeong, S., et al. The evolution of gene regulation underlies a morphological difference between two Drosophila sister species. Cell. 132 (5), 783-793 (2008).
  57. Griffith, L. G., Naughton, G. Tissue engineering--current challenges and expanding opportunities. Science. 295 (5557), 1009-1014 (2002).
  58. Hegde, M., et al. Dynamic Interplay of Flow and Collagen Stabilizes Primary Hepatocytes Culture in a Microfluidic Platform. Lab Chip. 14, 2033-2039 (2014).
  59. Kim, Y., Lasher, C. D., Milford, L. M., Murali, T., Rajagopalan, P. A comparative study of genome-wide transcriptional profiles of primary hepatocytes in collagen sandwich and monolayer cultures. Tissue Eng Pt C. 16 (6), 1449-1460 (2010).
  60. Baimakhanov, Z., et al. Efficacy of multi-layered hepatocyte sheet transplantation for radiation-induced liver damage and partial hepatectomy in a rat model. Cell Transplant. , (2015).
  61. Li, C. Y., et al. Micropatterned Cell-Cell Interactions Enable Functional Encapsulation of Primary Hepatocytes in Hydrogel Microtissues. Tissue Eng Pt A. 20 (15-16), 2200-2212 (2014).
  62. Shlomai, A., et al. Modeling host interactions with hepatitis B virus using primary and induced pluripotent stem cell-derived hepatocellular systems. P Natl A Sci USA. 111 (33), 12193-12198 (2014).
  63. Curcio, E., et al. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).
  64. Martinez-Hernandez, A., Amenta, P. The hepatic extracellular matrix. Vichows Archiv A Pathol Anat. 423, 1-11 (1993).
  65. Liu, Y., Wang, S., Lee, J. W., Kotov, N. A. A Floating Self-Assembly Route to Colloidal Crystal Templates for 3D Cell Scaffolds. Chem Mater. 17 (20), 4918-4924 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rusztowanie z glikolu polietylenowegometoda wyp ukiwania cz stekfunkcja hepatocyt wwytwarzanie rusztowapowlekanie macierz zewn trzkom rkowskaningowa mikroskopia elektronowakom rki Huh 7 5wyp ukiwanie tetrahydrofuranem

Powiązane artykuły