Method Article

Przygotowanie i charakterystyka lipofilowych miceli prolekowych doksorubicyny

DOI:

10.3791/54338

⸱

August 2nd, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Hampton University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano protokół przygotowania i charakterystyki lipofilowych miceli 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-[amino(glikol polietylenowy)-2000] (DSPE-PEG).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Micele były z powodzeniem wykorzystywane do dostarczania leków przeciwnowotworowych. Polimery amfifilowe tworzą micele o strukturze rdzeń-powłoka w środowisku wodnym poprzez samoorganizację. Hydrofobowy rdzeń miceli działa jako rezerwuar leków hydrofobowych i zamyka leki hydrofobowe. Otoczka hydrofilowa zapobiega agregacji miceli, a także przedłuża ich krążenie ogólnoustrojowe in vivo. W tym protokole opisujemy metodę syntezy lipofilowego proleku doksorubicyny, kwasu doksorubicynowo-palmitynowego (DOX-PA), który zwiększy ładowanie leku do miceli. Do koniugacji doksorubicyny z lipidem użyto łącznika hydrazonu wrażliwego na pH, który ułatwia uwalnianie wolnej doksorubicyny do komórek nowotworowych. Zsyntetyzowany DOX-PA oczyszczono za pomocą kolumny z żelem krzemionkowym przy użyciu dichlorometanu/metanolu jako eluentu. Oczyszczony DOX-PA analizowano za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) i 1spektroskopii H-jądrowego rezonansu magnetycznego (1H-NMR). Do przygotowania miceli DSPE-PEG obciążonych DOX-PA wykorzystano metodę dyspersji foliowej. Ponadto opisano kilka metod charakteryzowania preparatów micelowych, w tym oznaczanie stężenia DOX-PA i skuteczności enkapsulacji, pomiar wielkości i rozmieszczenia cząstek oraz ocenę aktywności przeciwnowotworowej in vitro. Protokół ten dostarcza użytecznych informacji na temat przygotowania i charakterystyki miceli obciążonych lekiem, a tym samym ułatwi badania i rozwój nowych nanoleków przeciwnowotworowych na bazie micel.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chemioterapia jest powszechnie stosowana w leczeniu różnych form raka. Większość, jeśli nie wszystkie, leki stosowane w chemioterapii mają toksyczne skutki uboczne, które mogą wahać się od łatwych do opanowania drobnych schorzeń, takich jak nudności i biegunka, do stanów bardziej zagrażających życiu. Ponieważ większość leków przeciwnowotworowych jest toksyczna, nieselektywna ekspozycja tych leków na normalne tkanki nieuchronnie powoduje toksyczność. W związku z tym istnieje ogromne zapotrzebowanie na podejście terapeutyczne, które może selektywnie dostarczać leki do komórek nowotworowych. Kolejnym wyzwaniem związanym z podawaniem leków przeciwnowotworowych jest ich sł....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synteza DOX-PA

  1. Odważyć 390 mg doksorubicyny i 243 mg hydrazydu kwasu palmitynowego i przenieść do kolby okrągłodennej.
  2. Dodać 150 ml bezwodnego metanolu do kolby za pomocą szklanej strzykawki. Dodać pipetą 39 μl kwasu trifluorooctowego (TFA). Za pomocą mieszadła magnetycznego mieszać mieszaninę reakcyjną przez 18 godzin w temperaturze pokojowej w ciemności.
    nuta: Ilości materiałów reakcyjnych można skalować w górę lub w dół, aby uzyskać różne ilości DOX-PA. Stosunek reagentów powinien być utrzymany w tych samych proporcjach. Reakcje z użyciem ilości DOX w zakresie od 78 mg do 1 170 mg można przeprowadzić w zwykłym labora....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 pokazuje schemat syntezy DOX-PA. DOX-PA zsyntetyzowano przez koniugację kwasu palmitynowego z doksorubicyną poprzez wiązanie hydrazonowe wrażliwe na pH. Zastosowano niewielki nadmiar hydrazydu kwasu palmitynowego w celu ułatwienia zakończenia reakcji. Ta metoda reakcji ma bardzo wysoką skuteczność i po 18-godzinnej reakcji pozostała tylko niewielka ilość doksorubicyny (ryc. 2). Wydajność wyniosła około 88%. Pod koniec reakcji DOX-PA oczyszczono .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszej pracy opisujemy nieskomplikowaną, szybką metodę dyspersji filmowej do otrzymywania miceli. Metoda ta wykorzystuje właściwości samoorganizacji polimeru amfifilowego (np. DSPE-PEG) do tworzenia miceli o strukturze rdzeń-powłoka w środowisku wodnym. Ta metoda przygotowania miceli ma kilka zalet. 1. Obejmuje prosty proces formulacji, który pozwala uniknąć stosowania skomplikowanych etapów zmniejszania rozmiaru (takich jak wytłaczanie lub homogenizacja) powszechnie stosowanych w przygotowaniu liposomów, .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez następujące granty: grant NIH-SC3, grant NSF-PREM, grant badawczy Hampton University. Chcielibyśmy podziękować Pani Michele A. Cochran z Virginia Institute of Marine Science (VIMS) za korzystanie z analizatora wielkości cząstek. Chcielibyśmy również podziękować Pani Corinne R. Ramaley za zrecenzowanie manuskryptu.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DSPE-PEG2KCordenpharmLP-R4-039>95%
DoxorubicinLC LaboratoriesD-4000>99%
Hydrazyd kwasu palmitynowegoTCI AMERICA   P000425G>98,0%
MetanolACROS Organics610981000Bezwodny
chlorek metylenu RYBACY D151-499,90%
Sultlenek metylu-d6ACROS OrganicsAC320760075Rozpuszczalnik NMR
Kwas trifluorooctowy ACROS OrganicsAC29381100099,50%
żel krzemionkowyFISHER L-7446230-400 siatka
Baker Flex TLCFISHER 
DPBSSigma-AldrichD8537
DU 145  Komórki raka prostatyATCCHTB-81
MTTACROS Organics15899005098%
RPMI 1640 ŚredniMEDIATECH INC 10041CV
Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy TECHNOLOGIE ŻYCIA 15240062100x roztwór podstawowy
Surowica bydlęca płoduTECHNOLOGIE ŻYCIA 
Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowegoVarian, Inc300 NMR 
Bü chi R-3 RotavaporBuchi1103022V1 Parownik obrotowy
Kąpiel ultradźwiękowaBRANSON ULTRASONICS CORPORATION 
Spektrometr UV-VIS Biomate 3Thermo Spectronic
Zetasizer Nano ZS90 Malvern InstrumentsAnalizator wielkości cząstek
Spektrofotometr mikropłytkowy Rio-RadBenchmark Plus 
Inkubator Kultur KomórkowychNapcoCO2 6000
Szafa Bezpieczeństwa BiologicznegoNuaire
SigmaPlot Systat Software, Inc.Oprogramowanie analityczne
96-dołkowa płytka do hodowli komórkowychBecton Dickinson353072
Trypsyna  0,25%Corning Cellgro25-053-CI
NC999012910437077CPX952318R

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hennenfent, K. L., Govindan, R. Novel formulations of taxanes: a review. Old wine in a new bottle? ESMO. 17 (5), 735-749 (2006).
  2. Paliwal, S. R., Paliwal, R., Agrawal, G. P., Vyas, S. P. Liposomal nanomedicine for breast cancer therapy. Nanomedicine. 6 (6), 1085-1100 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Doxorubicin Pro drugMicelle FormulationSilica Gel ColumnThin Layer ChromatographyProton NMR SpectroscopyFilm Dispersion MethodParticle Size AnalysisEncapsulation EfficiencyIn Vitro Anticancer ActivityUltrasonic Bath Dispersion

Related Articles