Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Współhodowla żywego mikrobiomu z mikroinżynieryjnymi kosmkami jelitowymi człowieka w urządzeniu mikroprzepływowym typu gut-on-a-chip

22.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54344

⸱

30 sierpnia 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, The University of Texas at Austin, 2Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering at Harvard University, 3Vascular Biology Program, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 4John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokół in vitro do wspólnej hodowli mikrobiomu jelitowego i kosmków jelitowych przez dłuższy okres przy użyciu ludzkiego systemu mikrofizjologicznego typu gut-on-a-chip.

Streszczenie

Tutaj opisujemy protokół długoterminowego współtworzenia wielogatunkowego mikrobiomu jelitowego człowieka z mikroinżynieryjnymi kosmkami jelitowymi w ludzkim urządzeniu mikrofizjologicznym typu gut-on-a-chip. Podsumowujemy granicę światła i tkanki włosowatej jelita w urządzeniu mikroprzepływowym, w którym fizjologiczne deformacje mechaniczne i przepływ płynu przy ścinaniu są stale stosowane w celu naśladowania perystaltyki. W mikrokanale świetlnym hodowane są ludzkie komórki Caco-2 nabłonka jelitowego w celu utworzenia "wolnego od zarazków" nabłonka kosmków i regeneracji kosmków jelita cienkiego. Wstępnie wyhodowane komórki drobnoustrojów są inokulowane po stronie światła w celu stworzenia ekosystemu gospodarz-mikroorganizm. Po tym, jak komórki drobnoustrojów przylegają do wierzchołkowej powierzchni kosmków, przepływ płynu i deformacje mechaniczne są wznawiane w celu wytworzenia mikrośrodowiska w stanie ustalonym, w którym stale dostarczana jest świeża pożywka hodowlana, a niezwiązane bakterie (a także odpady bakteryjne) są stale usuwane. Po przedłużeniu kohodowli z dni na tygodnie okazuje się, że wiele mikrokolonii jest losowo rozmieszczonych między kosmkami, a zarówno komórki drobnoustrojów, jak i nabłonka pozostają żywotne i funkcjonalne przez co najmniej tydzień w hodowli. Nasz protokół współhodowli można dostosować, aby zapewnić wszechstronną platformę dla innych ekosystemów mikrobiomu gospodarza, które można znaleźć w różnych narządach ludzkich, co może ułatwić badania in vitro roli ludzkiego mikrobiomu w organizowaniu zdrowia i choroby.

Wprowadzenie

Jelito ludzkie kryje w sobie zdumiewająco różnorodny wachlarz gatunków drobnoustrojów (<1000 gatunków) oraz ogromną liczbę komórek mikrobiologicznych (10 razy więcej niż ludzkie komórki gospodarza) i genów (100 razy więcej niż ludzki genom)1. Te ludzkie mikrobiomy odgrywają kluczową rolę w metabolizowaniu składników odżywczych i ksenobiotyków, regulowaniu odpowiedzi immunologicznej i utrzymywaniu homeostazy jelitowej2. Nic dziwnego, że biorąc pod uwagę te różnorodne funkcje, komensalny mikrobiom jelitowy w znacznym stopniu moduluje zdrowie i chorobę3. W związku z tym zrozumienie roli mikrobiomu jelitowego i interakcji gospodarz-mikroorganizm ma ogromne znaczenie dla promowania zdrowia przewodu pokarmowego (GI) i badania nowych metod leczenia zaburzeń jelitowych4. Jednak istniejące modele jelitowe in vitro (np. hodowle statyczne) ograniczają kokulturę gospodarza i mikrobiomu do krótkiego czasu (<1 dnia), ponieważ komórki drobnoustrojów przerastają i upośledzają funkcję bariery jelitowej5. Zastępcze modele zwierzęce (np. myszy wolne od zarazków6 lub myszy modyfikowane genetycznie7) również nie są powszechnie stosowane do badania wzajemnych oddziaływań mikrobiomu gospodarz-jelito, ponieważ kolonizacja i stabilne utrzymanie ludzkiego mikrobiomu jelitowego są trudne.

Aby sprostać tym wyzwaniom, niedawno opracowaliśmy biomimetyczny system mikrofizjologiczny "Gut-on-a-Chip" (Rysunek 1A, po lewej), aby naśladować interakcje mikrobiomu gospodarz-jelito, które zachodzą w żywym jelicie ludzkim5,8. Mikrourządzenie typu gut-on-a-chip zawiera dwa równoległe kanały mikroprzepływowe oddzielone elastyczną, porowatą, pokrytą macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) błoną wyłożoną ludzkimi komórkami Caco-2 nabłonka jelitowego, naśladując interfejs światła jelita i tkanki włosowatej (ryc. 1A, po prawej)9. Napędzane próżnią cykliczne deformacje rytmiczne wywołują fizjologiczne deformacje mechaniczne, które naśladują zmiany normalnie wywołane przez perystaltykę jelit (ryc. 1A, po prawej). Co ciekawe, gdy komórki Caco-2 są hodowane w jelicie na chipie przez ponad 100 godzin, spontanicznie tworzą trójwymiarowe (3D) kosmki jelitowe ze ścisłymi połączeniami, wierzchołkowymi granicami szczotek, komórkami proliferacyjnymi ograniczonymi do krypt podstawnych, produkcją śluzu, zwiększoną aktywnością metabolizującą leki (np. cytochrom P450 3A4, CYP3A4) i zwiększonym wychwytem zwrotnymglukozy 8. W tym "wolnym od zarazków" mikrośrodowisku możliwe było współhodowanie probiotyku Lactobacillus rhamnosus GG lub terapeutycznego tworzenia probiotycznej mieszanki bakteryjnej z komórkami nabłonka gospodarza przez okres do dwóch tygodni5,10.

W tym badaniu opisujemy szczegółowy protokół przeprowadzania ko-hodowli mikrobiomu gospodarza i jelita w urządzeniu typu gut-on-a-chip przez dłuższy czas. Ponadto omawiamy krytyczne kwestie i potencjalne wyzwania, które należy wziąć pod uwagę w celu szerokiego zastosowania tego protokołu kohodowli gospodarza i mikrobiomu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Mikrofabrykacja urządzenia typu gut-on-a-chip

Uwaga: Gut-on-a-chip to urządzenie mikroprzepływowe wykonane z przezroczystego, przepuszczającego gaz polimeru silikonowego (polidimetylosiloksan, PDMS), zawierającego dwa równoległe mikrokanały (1 mm szerokości x 150 μm wysokości x 1 cm długości) oddzielone elastyczną porowatą membraną PDMS (10 μm w średnicy porów, 25 μm w odstępach od porów do porów) membraną PDMS5,9. Wykonaj urządzenie typu gut-on-a-chip (Rysunek 1A, po lewej), wykonując podane czynności.

  1. Procedura mikrowytwarzania jelita na chipie5,9.
    1. Przygotować nieutwardzony, odgazowany PDMS poprzez zmieszanie prepolimeru PDMS i utwardzacza (15:1 w/w) i umieścić go w eksykatorze próżniowym na 30 minut.
    2. Wlej 30 g i 3 g nieutwardzonego, odgazowanego PDMS na każdą formę silikonową, która ma mikrowzorce oparte na SU-8 odpowiednio górnych i dolnych mikrokanałów jelita na chipie. Następnie utwardzać w temperaturze 60 °C w suchym piecu przez co najmniej 4 godziny.
    3. Wyjmij górną i dolną warstwę PDMS z każdej formy silikonowej, przecinając krawędź za pomocą skalpela chirurgicznego. Przebij 6 otworów (dwa wloty, dwa wyloty i dwie komory próżniowe) za pomocą dziurkacza do biopsji (średnica otworu 2.0 mm).
    4. Przygotować porowatą membranę, wylewając 10 g nieutwardzonego i odgazowanego PDMS na silanizowaną płytkę krzemową zawierającą tablice słupków z okrągłymi filarami (o średnicy 10 μm, wysokości 25 μm) pokrytą płaską, silanizowaną warstwą nośną PDMS (15:1, w/w; grubość 1 cm). Umieść na zestawie odważnik o wadze 3 kg i utwardź polimer w temperaturze 60 °C przez 12 godzin lub dłużej.
    5. Zdeformuj konfigurację porowatej membrany PDMS przyklejonej do płyty nośnej PDMS z płytki krzemowej, ostrożnie podnosząc róg płyty z płytki i odklejając, aż porowata membrana PDMS zostanie całkowicie oderwana od płytki.
    6. Wystaw stronę kanału górnej warstwy (PDMS, 15:1, w/w) i porowatą stronę membrany na działanie plazmy generowanej przez ręczną obróbkę koronową odpowiednio przez 1 minutę i 3 sekundy.
    7. Umieść plazmowo poddane działaniu plazmy powierzchnie porowatej membrany PDMS i górnej warstwy mikrokanalików w konforemnym konkontakcie, umieszczając każdy element równolegle bez pęcherzyków powietrza.
    8. Inkubować cały zestaw w temperaturze 80 °C O/N w celu nieodwracalnego związania dwóch warstw PDMS.
    9. Oderwij warstwę nośną PDMS od montażu górnej warstwy z porowatą membraną, ostrożnie podnosząc róg warstwy nośnej i odklejając, aż warstwa nośna zostanie całkowicie oderwana od górnej warstwy z membraną.
    10. Oderwij części tej membrany znajdujące się nad komorami próżniowymi (dwie komory znajdujące się po obu stronach głównego kanału) za pomocą pęsety z cienką końcówką, aby utworzyć puste komory próżniowe.
    11. Stronę z membraną przymocowaną do górnej części i stronę z kanałami wygrawerowanymi na dolnej części należy wystawić na działanie plazmy w taki sam sposób, jak opisano w kroku 1.1.6 przez 1 minutę.
    12. Wyrównaj górną warstwę mikrokanalików z porowatą membraną, a dolną warstwę z konforemnym kontaktem, umieszczając każdy element równolegle bez pęcherzyków powietrza pod stereoskopem.
    13. Utwardź cały zestaw w suchym piecu w temperaturze 80 °C O/N, aby wytworzyć kompletne urządzenie mikroprzepływowe typu gut-on-a-chip, zawierające dwie puste komory próżniowe obok kanału komórki mikroprzepływowej.
  2. Podłącz rurkę do wlotu i wylotu każdego portu połączonego z górnymi lub dolnymi mikrokanałami w chipie jelitowym za pomocą igły ze stali nierdzewnej wygiętej pod kątem 90°.
  3. Podłącz rurkę do otworów połączonych z komorami próżniowymi za pomocą igły ze stali nierdzewnej wygiętej pod kątem 90° z końcem.
  4. Wysterylizuj mikrokanaliki i rurki, przepływając 70% (v/v) etanol za pomocą wysterylizowanej jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml.
  5. Wysuszyć mikrokanaliki i rurki w suszarce o temperaturze 60 °C O/N.

2. Wzrost mikroinżynieryjnych kosmków jelitowych w urządzeniu typu gut-on-a-chip

  1. Nasiona komórek nabłonka jelitowego (np. Caco-2BBE) na mikrourządzeniu typu gut-on-a-chip5,9.
    1. Wysterylizuj urządzenie 70% (v/v) etanolem (patrz krok 1.4) za pomocą wysterylizowanej jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml, a następnie wysusz w suchym piecu o temperaturze 60 °C (patrz krok 1.5) przed aktywacją powierzchni.
    2. Wystaw całą konfigurację mikrosystemu jelita na chipie (tj. korpus jelita na chipie podłączony do rurki) na działanie światła UV (253,7 nm) i ozonu jednocześnie przez 40 minut.
    3. Schłodzić urządzenie w temperaturze pokojowej przez 15 minut w świetle UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC).
    4. Wprowadzić 100 μl roztworu powlekającego ECM - mieszaniny 50 μg/ml kolagenu typu I i 300 μg/ml mieszaniny macierzy zewnątrzkomórkowej rozcieńczonej w niezawierającym surowicy zmodyfikowanym podłożu Dulbecco Eagle Medium (DMEM) - do zarówno górnych, jak i dolnych mikrokanalików za pomocą jednorazowej, sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml.
    5. Inkubować cały zestaw w inkubatorze o temperaturze 37 °C i wilgotności 5% CO2 przez 1 godzinę.
    6. Odgazować 50 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) kompletnej pożywki hodowlanej (DMEM, 20%, v/v, płodowa surowica bydlęca (FBS), 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny; podawane w jednorazowej strzykawce o pojemności 3 ml) za pomocą systemu filtracji o pojemności 50 ml (wielkość porów 0,45 μm) w BSC przez 1 min.
      1. Przepuść wstępnie podgrzane medium przez system filtracji i delikatnie postukaj w przefiltrowane medium przez 1 minutę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki lub rozpuszczony gaz z medium.
    7. Umieścić podwielokrotność odgazowanej kompletnej pożywki w jednorazowej strzykawce o pojemności 3 ml i inkubować w nawilżanym inkubatorze o temperaturze 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    8. Podłączyć dwie jednorazowe strzykawki o pojemności 3 ml zawierające odgazowaną, wstępnie podgrzaną kompletną pożywkę hodowlaną do górnego i dolnego mikrokanalika.
    9. Odgazowaną kompletną pożywkę do hodowli komórkowych należy wprowadzić do górnego mikrokanału za pomocą pompy strzykawkowej o objętościowym natężeniu przepływu 30 μl/h (co odpowiada naprężeniu ścinającemu przy 0,02 dyn/cm2) w nawilżanym inkubatorze O/N o temperaturze 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  2. Tworzenie mikroinżynieryjnych kosmków Caco-2 w jelitach na chipie.
    1. Użyj komórek Caco-2BBE o numerze przejścia od 50 do 65.
    2. Hodować komórki Caco-2 w kolbie T75 zawierającej kompletną pożywkę hodowlaną w inkubatorze o temperaturze 37 °C nawilżonym 5% CO2 przez 4-5 dni, aby uzyskać w pełni zlewające się komórki.
    3. Dodać 10 ml PBS wolnego od Ca2+ i Mg2+ do w pełni zlewających się komórek Caco-2 wyhodowanych w kolbie T75, przepłukać komórki, a następnie odessać PBS. Powtórz ten krok dwukrotnie.
    4. Dodać 1 ml 0,05% roztworu trypsyny/EDTA i inkubować w nawilżanym inkubatorze 5% CO2 o temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    5. Zawiesić zdysocjowane komórki za pomocą 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych (z FBS), pipetując w górę i w dół trzy do pięciu razy.
    6. Odwirować zawiesinę komórkową przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant.
    7. Ponownie zawiesić z 1 ml wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki, aby dostosować gęstość komórek na poziomie ~1,5 x 105 komórek/cm2 w urządzeniu. Użyj hemocytometru, aby oszacować gęstość komórek.
    8. Wlać 100 μl zawieszonych komórek Caco-2 do górnego mikrokanału (po stronie światła), umieszczając jednorazową strzykawkę o pojemności 1 ml przymocowaną do igły 25 G5/8 na wylocie rurki podłączonej do górnego mikrokanału.
    9. Zacisnąć wszystkie wloty i wyloty rurek podłączonych do górnych i dolnych mikrokanałów za pomocą klipsów do segregatorów.
    10. Inkubuj cały zestaw w 37 °C, nawilżonym inkubatorze 5% CO2 przez 1 godzinę, aby umożliwić zdysocjowanym komórkom Caco-2 przyleganie do powierzchni porowatej membrany.
    11. Usunąć zaciski i wznowić przepływ pożywki hodowlanej tylko do górnego mikrokanału z prędkością 30 μl/h za pomocą pompy strzykawkowej, aż komórki utworzą nienaruszoną monowarstwę przez 24-36 godzin. Użyj mikroskopii kontrastu fazowego lub mikroskopii kontrastu interferencji różnicowej (DIC), aby potwierdzić połączenia komórka-komórka w monowarstwie komórki.
    12. Gdy komórki tworzą monowarstwę, należy przelać pożywkę hodowlaną zarówno do górnych (lumenów), jak i dolnych (kapilarycznych) mikrokanalików przy tym samym natężeniu przepływu 30 μl/h.
    13. Zastosowanie odkształceń mechanicznych naśladujących ruchy podobne do perystaltykijelit 5,9.
      1. Włącz pompę próżniową wyposażoną w osprzęt napinający.
      2. Podłącz komory próżniowe do sterownika podciśnienia za pomocą rurki ze złączem ze stali nierdzewnej.
      3. Ustaw ruch rozciągający 10% średniego odkształcenia komórki z częstotliwością 0.15 Hz w trybie cyklicznej funkcji sinusoidalnej w oprogramowaniu do sterowania próżnią, a następnie kliknij "Start".
    14. Utrzymuj stały przepływ pożywki hodowlanej (30 μl/h) zarówno w górnym, jak i dolnym mikrokanale do zlewającej się monowarstwy Caco-2 pod odkształceniami mechanicznymi (10%, 0,15 Hz) przez ~100 godz.
      Uwaga: Komórki Caco-2 spontanicznie ulegają morfogenezie kosmków z pofałdowanymi projekcjami 3D rozciągniętymi w kierunku światła mikrokanału nabłonka5,8-10.
  3. Aby naśladować funkcje na poziomie narządów żywego jelita ludzkiego z interfejsem światło-tkanka kapilarna w jelitie na chipie10, postępuj zgodnie z opisem.
    1. Hoduj mikroinżynieryjne kosmki Caco-2, powtarzając kroki od 2,1 do 2,2.
    2. Przelać wstępnie ogrzaną pożywkę do kohodowli (mieszaninę kompletnej pożywki do hodowli komórkowych Caco-2 i kompletnej pożywki hodowlanej HMVEC, 1:1 v/v) do górnych i dolnych mikrokanalików z prędkością 30 μl/h.
    3. Wprowadzić 100 μl zdysocjowanych normalnych ludzkich komórek śródbłonka naczyń włosowatych naczyń włosowatych (HMVEC; końcowa gęstość komórek, ~5,0 x 105 komórek/cm2) do dolnego mikrokanału identyczną metodą opisaną w krokach od 2.2.3 do 2.2.9.
    4. Umieść utwardzony prostokątny kawałek PDMS (0,5 cm x 1 cm x 1 cm; szerokość x długość x wysokość; 15:1, bez elastomeru: utwardzacz) na górze urządzenia typu gut-on-a-chip, a następnie odwróć całą konfigurację urządzenia do góry nogami (tj. górny mikrokanał jest skierowany w dół, a dolny mikrokanał w górę).
    5. Inkubować zestaw w inkubatorze o temperaturze 37 °C, nawilżonym 5% CO2 przez 1 godzinę, aby umożliwić zdysocjowanym HMVEC przyleganie do powierzchni porowatej membrany w dolnym mikrokanale.
    6. Wyjmij cały zestaw z inkubatora CO2 i odwróć go ponownie.
    7. Przepływać wstępnie ogrzaną pożywkę do kohodowli (mieszanina kompletnej pożywki do hodowli komórkowych Caco-2 i kompletnej pożywki hodowlanej HMVEC, 1:1 v/v) do górnych i dolnych mikrokanałów z prędkością 30 μl/h z mechanicznymi ruchami rozciągającymi (10%, 0,15 Hz) przez co najmniej trzy dni w celu utworzenia połączeń komórka-komórka monowarstwy śródbłonka.

3. Kokultura mikrobiomu gospodarza i jelita w mikrourządzeniu typu gut-on-a-chip

  1. Wykonaj wstępną hodowlę komórek bakteryjnych w następujący sposób, aby wspólnie wyhodować komensalny mikrobiom jelitowy na mikroinżynieryjnych kosmkach jelitowych.
    1. Zawiesić liofilizowaną sproszkowaną mieszaninę bakterii probiotycznych w 10 ml mieszaniny (1:1, v/v) autoklawowanego bulionu Lactobacilli MRS i wzmocnionej pożywki Clostridium.
    2. Dostosuj końcową gęstość komórek do około 0,2 jednostki gęstości optycznej (przy 600 nm), dodając odpowiednią ilość pożywki, a następnie podwielokrotność 3 ml zawiesiny komórek drobnoustrojów w jednorazowej sterylnej probówce o pojemności 10 ml.
    3. Umieścić probówki zawierające zawieszone komórki drobnoustrojów w pojemniku beztlenowym. Dodać do pojemnika dwie saszetki z beztlenowym wytwarzaniem gazu. Zamknij szczelnie pokrywę pojemnika i inkubuj zestaw pojemnika bez wstrząsania w inkubatorze O/N o temperaturze 37 °C nawilżanym 5%CO2
      4. .
  2. Inokulacja mikrobiomu i kokultura komórkami nabłonka jelitowego5,10.
    1. Przygotować jednorazowe strzykawki o pojemności 3 ml zawierające odgazowaną, wolną od antybiotyków pożywkę do hodowli komórkowych (tj. DMEM z 20% FBS). Patrz ppkt 2.1.6 w celu zapoznania się z procedurą odgazowywania pożywki hodowlanej.
    2. Wyjmij z inkubatora CO2 cały zestaw urządzenia typu gut-on-a-chip zawierającego mikroinżynieryjne kosmki, a następnie przejdź do szafy bezpieczeństwa biologicznego.
    3. Wyjąć strzykawki podłączone do rurki połączonej z górnymi i dolnymi mikrokanałami. Podłączyć strzykawki przygotowane w ppkt 3.2.1 do urządzenia, umieścić z powrotem w inkubatorze CO2 , a następnie przepuszczać tę wolną od antybiotyków pożywkę hodowlaną przez 12 godzin przed wysiewem mikrobiomu.
    4. Odwiruj wstępnie wyhodowane komórki mieszaniny bakterii probiotycznych (patrz kroki w 3.1) w temperaturze 10 000 x g przez 5 minut. Odessać supernatant za pomocą próżni, a następnie ponownie zawiesić w pożywce DMEM bez antybiotyków (końcowa gęstość komórek, ~1,0 x 107 CFU/ml).
    5. Wlać zawiesinę komórkową do strony światła mikrokanalika zawierającego "wolne od zarazków" kosmki jelitowe za pomocą jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml dołączonej do igły 25 G5/8. Pozwól na przyleganie komórek drobnoustrojów do wierzchołkowej powierzchni kosmków jelitowych przez ~ 1,5 godziny bez przepływu, zaciskając się na wszystkich końcach rurek.
    6. Perfuzjować wstępnie podgrzaną, wolną od antybiotyków pożywkę hodowlaną do górnych i dolnych mikrokanałów z prędkością 40 μl/h z cyklicznymi deformacjami rytmicznymi (10%, 0,15 Hz).
    7. Do kohodowli E. coli znakowanej białkiem zielonej fluorescencji (GFP) (GFP E. coli; Niepatogenne komórki DH5-alfa E. coli gospodarza)10,11 z mikroinżynieryjnymi kosmkami, wstępnie hodować komórki E. coli GFP w autoklawizowanym podłożu LB w temperaturze 37 °C w stanie wstrząsania (200 obr./min) przez 12 godzin. Powtórzyć procedurę od 3.2.5 do 3.2.6 w celu przeprowadzenia jednoczesnej hodowli komórek E. coli GFP z mikroinżynieryjnymi kosmkami.
  3. Komórki obrazu5,8-10
    1. Wykonaj DIC, epifluorescencję lub laserową skaningową mikroskopię konfokalną w celu zarejestrowania morfologii drobnoustrojów i nabłonków5,8,10.
      1. W przypadku obrazowania DIC należy wyjąć zestaw mikrosystemu jelita na chipie z inkubatora CO2 , umieścić zestaw urządzenia na stoliku mikroskopu, a następnie zarejestrować morfologię komórki.
      2. Do obrazowania fluorescencyjnego nabłonka kosmków, przepływ PBS do przemywania komórek w tempie 100 μl/h przez 10 min.
        1. Utrwalić kosmki za pomocą 4% (w/v) paraformaldehydu przez 15 min. Następnie przepływowy PBS do mycia komórek z prędkością 100 μl/h przez 10 min.
        2. Przepuszczalność kosmków za pomocą 0,3% (v/v) Triton X-100 rozcieńczonego w PBS zawierającym 2% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przez 10 minut. Następnie przepływowy PBS do mycia komórek z prędkością 100 μl/h przez 10 min.
        3. Blokuj komórki z 2% (w/v) roztworem BSA w PBS przez 1 godzinę. Następnie przepływowy PBS do mycia komórek z prędkością 100 μl/h przez 10 min.
        4. Dodać 300 nM roztworu dichlorowodorku 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) rozcieńczonego w PBS do barwienia jądrowego pod ochroną przed światłem.
        5. Dodać 25 jednostek/ml fluorescencyjnej falloidyny (koniugat falloidyny-CF647) rozpuszczonej w PBS do barwienia F-aktyną pod ochroną przed światłem.
        6. Rejestruj obrazy fluorescencyjnie wybarwionych komórek za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego.
          Uwaga: Podczas mikroskopii konfokalnej zastosowano obiektyw 25X z odpowiednim zoomem optycznym. Na rysunku 3B zastosowano powiększenie około 525x.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby naśladować ekosystem gospodarz-mikrobiom jelita ludzkiego in vitrojest to konieczne jest opracowanie protokołu eksperymentalnego w celu odtworzenia stabilnej, długoterminowej kokultury bakterii jelitowych i ludzkich komórek nabłonkowych jelit w warunkach fizjologicznych, takich jak mechanika przypominająca perystaltykę oraz przepływ płynu. W niniejszej pracy wykorzystujemy biomimetyczne mikro urządzenie gut-on-a-chip (Rycina 1A) w celu kokul...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zrozumienie interakcji między gospodarzem a mikrobiomem ma kluczowe znaczenie dla postępu medycyny; Jednak tradycyjne modele hodowli komórkowych wykonywane w plastikowym naczyniu lub statycznej płytce studzienkowej nie wspierają stabilnej kohodowli ludzkich komórek jelitowych z żywymi drobnoustrojami jelitowymi przez więcej niż 1-2 dni, ponieważ komórki drobnoustrojów w większości przerastają komórki ssaków in vitro. Rosnąca populacja drobnoustrojów szybko zużywa tlen i składniki odżywcze, a następnie wytwarza n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Donald E. Ingber jest założycielem Emulate Inc., posiada udziały w firmie i przewodniczy jej Naukowej Radzie Doradczej. Pozostali autorzy nie ujawniają żadnych informacji finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Sri Kosuri (Wyss Institute na Uniwersytecie Harvarda) za dostarczenie szczepu E. coli znakowanego GFP. Prace te były wspierane przez Agencję Zaawansowanych Projektów Badawczych w Obszarze Obronności (Defense Advanced Research Projects Agency) na mocy umowy o współpracy nr W911NF-12-2-0036, Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) na podstawie umowy #HHSF223201310079C oraz Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering na Uniwersytecie Harvarda. Poglądy i wnioski zawarte w tym dokumencie są poglądami i wnioskami autorów i nie powinny być interpretowane jako reprezentujące oficjalną politykę, wyrażoną lub dorozumianą, Wojskowego Biura Badawczego, Wojskowego Laboratorium Badawczego, Agencji ds. Żywności i Leków lub rządu USA. Rząd Stanów Zjednoczonych jest upoważniony do powielania i rozpowszechniania przedruków do celów rządowych, niezależnie od wszelkich informacji o prawach autorskich zawartych w niniejszym dokumencie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) zawierające 25 mM glukozy i 25 mM HEPESGibco10564-011Rozgrzej go w temperaturze 37 stopni; C w łaźni wodnej.
Difco Lactobacilli MRS bulionBD288120Uruchom autoklaw przy 121 stopniach; C przez 15 min.
Poli(dimetylosiloksan)Dow Corning3097358-100415:1 (w/w), PDMS : środek utwardzający
Caco-2BBE ludzki rak jelita grubego liniaDigestive Disease CenterLudzki gruczolakorak jelita grubego 
Inaktywowany termicznie FBSGibco10082-14720% (v/v) w DMEM
Penicylina-streptomycyna-glutaminaGibco10378-0161/100 rozcieńczenie w DMEM
4′,6-dimidyno-2-fenyloindoluSondy molekularneD1306Barwienie jąder
Koniugat falloidyny-CF647 (25 jednostek/ml)Barwienie biotium00041F-aktyna
System napinania Flexcell FX-5000Flexcell International CorporationFX5KRuch stretcingowy podobny do perystaltyki (10% odkształcenia komórek, częstotliwość 0,15 Hz)
Odwrócony mikroskop epifluorescencyjnyObrazowanie ZeissAxio Observer Z1,
skaningowy mikroskop konfokalnyLeicaDMI6000Obrazowanie, Fluorescencyjny
środek czyszczący UVOJelight Company Inc342Aktywacja powierzchniowa kolagenu
typu I typu chip jelitowego GibcoA10483-01Składnik macierzy zewnątrzkomórkowej do hodowli komórkowej do chipa
MatrigelBD354234Składnik macierzy zewnątrzkomórkowej do hodowli komórkowej do chipa
1 ml jednorazowa strzykawkaBD309628Materiał do wstrzykiwań komórek i pożywek
25 G Igła 5/8BD329651Materiały do wstrzykiwania komórek i pożywek
Pompa strzykawkowaBraintree Scientific Inc.BS-8000Sprzęt do wstrzykiwania do chipa
VSL#3Sigma-Tau Pharmaceuticals7-45749-01782-6Preparat 8 różnych komensalnych mikroorganizmów jelitowych
Wzmocnione podłoże ClostridiumBD218081Pożywka do hodowli bakterii beztlenowych
System pojemników beztlenowych GasPak EZ ze wskaźnikiemBD260001Saszetka do wytwarzania gazu beztlenowego 
4% paraformaldehydMikroskopia elektronowa Nauka157-4-100Utrwalanie komórek do barwienia
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Przepuszczalność komórek
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA7030Środek blokujący do barwienia komórek
Obróbka koronowaElectro-Technic ProductsBD-20ACGenerator plazmy do produkcji chipa
Steriflip MilliporeSE1M003M00Odgazowanie kompletnej pożywki hodowlanej
Jednorazowy hemocytometriNCYTODHC-N01Do ręcznego liczenia komórek
Harvard , DIC

Bibliografia

  1. Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
  2. Tremaroli, V., Backhed, F. Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism. Nature. 489, 242-249 (2012).
  3. Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C. M., Brett Finlay, B. Gut Microbiota in Health and Disease. Physiol. Rev. 90, 859-904 (2010).
  4. Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
  5. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
  6. Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 313-323 (2009).
  7. Garrett, W. S., et al. Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system. Cell. 131, 33-45 (2007).
  8. Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol. 5, 1130-1140 (2013).
  9. Huh, D., Kim, H. J., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nat Protoc. 8, 2135-2157 (2013).
  10. Kim, H. J., Li, H., Collin, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, E7-E15 (2016).
  11. Miller, W. G., Lindow, S. E. An improved GFP cloning cassette designed for prokaryotic transcriptional fusions. Gene. 191, 149-153 (1997).
  12. Odijk, M., et al. Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems. Lab Chip. 15, 745-752 (2015).
  13. Lentle, R. G., Janssen, P. W. Physical characteristics of digesta and their influence on flow and mixing in the mammalian intestine: a review. J Comp Physiol B. 178, 673-690 (2008).
  14. Granato, D., et al. Cell surface-associated lipoteichoic acid acts as an adhesion factor for attachment of Lactobacillus johnsonii La1 to human enterocyte-like Caco-2 cells. Appl Environ Microbiol. 65, 1071-1077 (1999).
  15. Dewhirst, F. E., et al. The human oral microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
  16. Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat Rev Microbiol. 9, 244-253 (2011).
  17. Hay, P. E., et al. Abnormal bacterial colonisation of the genital tract and subsequent preterm delivery and late miscarriage. Br Med J. 308, 295-298 (1994).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wsp hodowla mikrobiomuruch przypominaj cy perystaltykprzep yw cinaj cy cieczykom rki Caco 2kolonizacja mikrobiologicznainterfejs gospodarz mikrobsystem mikrofizjologiczny
Współhodowla żywego mikrobiomu z mikroinżynieryjnymi kosmkami jelitowymi człowieka w urządzeniu mikroprzepływowym typu gut-on-a-chip
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.