Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Fuzja pojedynczych proteoliposomów za pośrednictwem SNARE z dwuwarstwami na uwięzi w mikroprzepływowej komórce przepływowej monitorowanej za pomocą spolaryzowanej mikroskopii TIRF

10.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54349

⸱

24 sierpnia 2016

 , 
1Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale University School of Medicine, 2Nanobiology Institute, Yale University, 3Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 4Laboratoire de Neurophotonique, Université Paris Descartes, Faculté des Sciences Fondamentales et Biomédicales, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania pojedynczych, zapośredniczonych przez SNARE zdarzeń fuzji między liposomami a wspieranymi dwuwarstwami w kanałach mikroprzepływowych za pomocą spolaryzowanego TIRFM, z czułością pojedynczej cząsteczki i rozdzielczością czasową ~15 ms. Uwalnianie lipidów i rozpuszczalnego ładunku może być wykrywane jednocześnie. Mierzy się wielkość liposomów, dyfuzyjność lipidów i właściwości porów fuzyjnych.

Streszczenie

W wszechobecnym procesie fuzji membranowej, otwarcie poru fuzyjnego ustanawia pierwsze połączenie między dwoma dawniej oddzielnymi komorami. Podczas uwalniania neuroprzekaźników lub hormonów przez egzocytozę, pory fuzyjne mogą przejściowo wielokrotnie otwierać się i zamykać, regulując kinetykę uwalniania ładunku. Dynamika porów określa również sposób recyklingu pęcherzyków; Nieodwracalne ponowne uszczelnienie powoduje przejściowe zlanie typu "kiss-and-run", podczas gdy dylatacja prowadzi do pełnej fuzji. Aby lepiej zrozumieć, jakie czynniki rządzą dynamiką porów, opracowaliśmy test do monitorowania fuzji błonowej przy użyciu mikroskopii spolaryzowanej całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF) z czułością pojedynczej cząsteczki i rozdzielczością czasową ~15 ms w biochemicznie dobrze zdefiniowanym systemie in vitro. Monitorowane jest połączenie znakowanych fluorescencyjnie małych pęcherzyków jednowarstwowych zawierających białka v-SNARE (v-SUVs) z płaską dwuwarstwą zawierającą t-SNARE, wspartą na miękkiej poduszce polimerowej (t-SBL, dwuwarstwa wspierana przez t). Test wykorzystuje mikroprzepływowe kanały przepływowe, które zapewniają minimalne zużycie próbki przy jednoczesnym dostarczaniu stałej gęstości SUV-ów. Wykorzystując szybkie wzmocnienie sygnału po przeniesieniu znaczników lipidowych z SUV do SBL podczas fuzji, monitorowana jest kinetyka transferu barwnika lipidowego. Czułość mikroskopii TIRF pozwala na śledzenie pojedynczych fluorescencyjnych znaczników lipidowych, z których można wywnioskować dyfuzyjność lipidów i rozmiar SUV dla każdego zdarzenia fuzji. Czas uwalniania barwnika lipidowego może być znacznie dłuższy niż oczekiwano, aby zapewnić niezakłócone przejście przez trwale otwarte pory. Korzystając z modelu, który zakłada, że opóźnienie uwalniania lipidów jest spowodowane migotaniem porów, można oszacować "otwartość" porów, czyli ułamek czasu, w którym pory pozostają otwarte podczas fuzji. Rozpuszczalny marker może być zamknięty w SUV-ach w celu jednoczesnego monitorowania uwalniania lipidów i rozpuszczalnego ładunku. Takie pomiary wskazują, że niektóre pory mogą się ponownie uszczelnić po utracie części rozpuszczalnego ładunku.

Wprowadzenie

Fuzja błon jest uniwersalnym procesem biologicznym niezbędnym do wewnątrzkomórkowego transportu lipidów i białek, sekrecji, zapłodnienia, rozwoju oraz wnikania wirusów otoczkowych do organizmów gospodarzy1-3. W większości wewnątrzkomórkowych reakcji fuzji, w tym podczas uwalniania hormonów i neuroprzekaźników drogą egzocytozy, energia niezbędna do połączenia dwóch dwuwarstw lipidowych jest dostarczana poprzez tworzenie wiązki czterech helis między pokrewnymi rozpuszczalnymi białkami receptorowymi czynnika N-etylomaleimidu-wrażliwego (SNARE), zakotwiczonymi odpowiednio w pęcherzyku (v-SNARE) i błonie docelowej (t-SNARE)4. Egzocytoza pęcherzyków synaptycznych jest najściślej regulowaną reakcją fuzji i zachodzi w ciągu milisekundy po dotarciu potencjału czynnościowego1,4,5. Por fuzyjny, będący początkowym połączeniem między dwiema fuzującymi komorami, może wielokrotnie otwierać się i zamykać przed ponownym uszczelnieniem lub nieodwracalnym rozszerzeniem5-7. Ten pierwszy przypadek skutkuje przejściową fuzją typu „kiss & run”, podczas gdy ten drugi prowadzi do pełnej fuzji. Czynniki sterujące równowagą między tymi dwoma trybami fuzji oraz mechanizmy regulujące migotanie poru nie są jeszcze dobrze poznane5,8.

Białka SNARE są niezbędne do egzocytozy; fuzja pęcherzyków synaptycznych zostaje zniesiona po rozszczepieniu białek SNARE przez neurotoksyny9. Eksperymenty z fuzją masową z użyciem małych pęcherzyków jednowarstwowych (SUVs) wykazały, że białka SNARE są nie tylko niezbędne, ale również wystarczające do indukowania fuzji błon10. W tym teście masowym pęcherzyki SUVs zrekonstytuowane z białkami v-SNARE (v-SUV) zostały domieszkowane fluorescencyjnymi fosfolipidami (N-(7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-yl)-fosfoetanolaminą (NBD-PE) oraz (N-(lissamina rodamina B sulfonyl)-fosfoetanolaminą (LR-PE) i zmieszane z nieznakowanymi pęcherzykami zawierającymi białka t-SNARE (t-SUV). Początkowo fluorescencja NBD-PE w v-SUV jest wygaszana poprzez Försterowski rezonansowy transfer energii (FRET) do LR-PE. W miarę jak znakowane v-SUV łączą się z nieznakowanymi t-SUV, gęstość powierzchniowa fluoroforu w nowo połączonej błonie zmniejsza się, a wynikający z tego wzrost fluorescencji NBD-PE informuje o stopniu mieszania lipidów10. Ponieważ test masowy jest łatwy do przygotowania i analizy, był on powszechnie stosowany do badania mechanizmów fuzji pośredniczonej przez białka SNARE10-14. Wykazuje on jednak kilka ograniczeń, takich jak niska czułość i słaba rozdzielczość czasowa. Co najważniejsze, jako pomiar zespołowy, uśrednia on wyniki ze wszystkich zdarzeń, co utrudnia rozróżnienie między dokowaniem a fuzją, a także detekcję stanów pośrednich hemifuzji.

W ciągu ostatniej dekady kilka grup, w tym nasza, opracowało nowe testy do monitorowania zdarzeń fuzji na poziomie pojedynczych pęcherzyków15-27. Ha i współpracownicy wykorzystali v-SUV-y przytwierdzone do powierzchni i monitorowali ich fuzję z wolnymi t-SUV-ami18,19. Mieszanie lipidów monitorowano za pomocą FRET pomiędzy parą fluoroforów związanych z lipidami, wbudowanych odpowiednio w v- i t-SUV-y, wykorzystując mikroskopię TIRF (całkowitego wewnętrznego odbicia)18. Później laboratorium Brungera zastosowało pojedynczy gatunek znacznika lipidowego wraz ze znacznikiem zawartości do jednoczesnego wykrywania mieszania się lipidów i zawartości20,28. Zarówno markery lipidowe, jak i markery zawartości wprowadzono w wysokich, samogaszących stężeniach; fuzja z nieznakowanymi SUV-ami skutkowała odgaszeniem fluorescencji20,28.

Inni łączyli v-SUV z płaskimi dwuwarstwami zrekonstytuowanymi z t-SNARE15-17,21-27,29. Płaska geometria docelowej dwuwarstwy (zawierającej t-SNARE) lepiej naśladuje fizjologiczny proces fuzji małych, silnie zakrzywionych pęcherzyków z płaską błoną plazmatyczną. Grupa Steinema wykorzystała membrany spinające pory, zrekonstytuowane z t-SNARE i zawieszone nad porowatym podłożem z azotku krzemu, a fuzję z pojedynczymi v-SUV wykryto za pomocą konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej23. Inni przeprowadzali fuzję v-SUV z płaskimi dwuwarstwami zrekonstytuowanymi z t-SNARE, osadzonymi na szklanym podłożu15-17,21,22,24-27,29. Ogromną zaletą stosowania dwuwarstw osadzonych (SBL) jest możliwość wykorzystania mikroskopii TIRF do wykrywania zdarzeń dokowania i fuzji z doskonałym stosunkiem sygnału do szumu i bez zakłóceń ze strony wolnych v-SUV, choć zastosowanie mikroprzepływów pozwala również na rozdzielczość pojedynczych zdarzeń przy użyciu standardowej mikroskopii epifluorescencyjnej w polu dalekim24.

Głównym problemem jest to, czy i w jaki sposób oddziaływania między podłożem a dwuwarstwą wpływają na jakość dwuwarstwy wspieranej oraz na proces fuzji. We wczesnych pracach wykorzystywano planarne SBL, które były bezpośrednio wspierane na podłożu szklanym lub kwarcowym15-17. SBL te tworzono poprzez adsorpcję, pękanie, rozprzestrzenianie i fuzję membran t-SUV na podłożu. Wkrótce jednak zauważono, że pominięcie kluczowego komponentu t-SNARE, białka SNAP25, w SBL przygotowanych w ten sposób, prowadziło do kinetyki dokowania i fuzji v-SUV nieodróżnialnej od tej uzyskanej przy użyciu kompletnych białek t-SNARE17. Ponieważ SNAP25 jest absolutnie niezbędne do fuzji in vivo30,31, podważono fizjologiczną istotność tych wczesnych prób. Grupa Tamma pokonała to wyzwanie, stosując lepiej kontrolowany sposób formowania dwuwarstwy wspieranej21. Wykorzystano w nim nanoszenie metodą Langmuira-Blodgetta dla pierwszej, wolnej od białek warstwy SBL, a następnie fuzję tej monowarstwy z t-SUV21. Doprowadziło to do fuzji zależnej od SNAP25.

Aby uniknąć potencjalnych artefaktów związanych z dwuwarstwą bezpośrednio osadzoną na szklanym podłożu, bez konieczności stosowania metod Langmuira-Blodgetta, Karatekin et al. wprowadzili miękką, uwodnioną poduszkę z poli(glikolu etylenowego) (PEG) pomiędzy dwuwarstwę a podłoże24. Modyfikacja ta doprowadziła również do fuzji zależnej od SNAP2524. Znane jest, że dwuwarstwy osadzone na miękkiej warstwie polimerowej lepiej zachowują mobilność i funkcję białek transbłonowych32, co wykorzystywano w badaniach fuzji z wirusami33. Ponadto dwuwarstwy PEGylowane wydają się zachowywać pewną zdolność do samonaprawy i są bardzo stabilne34,35. Najpierw do membrany t-SUV włącza się frakcję dostępnych komercyjnie, sprzężonych z lipidami łańcuchów PEG. Gdy t-SUV pękają i tworzą płaską dwuwarstwę na szklanym podłożu, szczotka PEG pokrywa obie warstwy płaskiej dwuwarstwy. Ponieważ tworzenie płaskiej dwuwarstwy jest napędzane adhezją łańcuchów PEG otaczających t-SUV do hydrofilowej powierzchni szkła, pękanie liposomów i formowanie płaskiej dwuwarstwy są stosunkowo niewrażliwe na zastosowany skład lipidowy. Jednakże w przypadku włączenia dużych ilości cholesterolu, co zwiększa właściwości spójne SUV, mogą one nie pękać samoistnie. W takim przypadku w celu wspomagania formowania płaskiej dwuwarstwy można zastosować szok osmotyczny lub jony dwuwartościowe25.

Jak wspomniano powyżej, w tym podejściu szczoteczka z PEG pokrywa obie strony płaskiej, podpartej dwuwarstwy. Szczoteczka skierowana w stronę kanału przepływu mikrofluidycznego pomaga zapobiegać niespecyficznej adhezji nadchodzących v-SUV, które zazwyczaj są również pokryte warstwą PEG. Tworzenie kompleksów v- i t-SNARE rozpoczyna się od dystalnych względem błony końców N i postępuje etapami w kierunku domen proksymalnych względem błony36. Aby v-SUV mogły wejść w interakcję z t-SBL, końce N v- i t-SNARE muszą wystawać ponad szczoteczki z PEG, co wydaje się mieć miejsce w warunkach przeprowadzanego testu. Wysokość szczoteczki można dostosować do badania białek innych niż SNARE poprzez zmianę gęstości lipidów pegylowanych oraz długości łańcucha PEG37,38. Kolejną zaletą szczoteczek z PEG pokrywających proksymalne powierzchnie fuzujących dwuwarstw jest to, że naśladują one zatłoczone środowisko błon biologicznych, które są wypełnione 30 000–40 000 integralnych białek błonowych na mikrometr kwadratowy39. Podobnie jak łańcuchy PEG w tym teście, odpychająca warstwa białkowa pokrywająca błony biologiczne musi zostać odsunięta, aby umożliwić kontakt między dwiema fosfolipidowymi dwuwarstwami w celu zajścia fuzji.

W tym teście wykorzystuje się mikrofluidyczne kanały przepływowe, ponieważ oferują one wyjątkowe zalety. Po pierwsze, przepływ mikrofluidyczny umożliwia bardziej jednorodne osadzanie t-SUV, które rozprzestrzeniają się i fuzują, tworząc t-SBL. Po drugie, mała objętość kanału (< 1 µl) minimalizuje zużycie próbki. Po trzecie, wymagane niewielkie objętości pozwalają na przeprowadzenie całego eksperymentu w warunkach stałego przepływu. Przepływ usuwa słabo, prawdopodobnie niespecyficznie, przyłączone v-SUV z SBL16. Utrzymuje on również stałą gęstość v-SUV nad t-SBL, co upraszcza analizę kinetyczną17. Wreszcie, pęcherzyki zadokowane są łatwo odróżnialne od pęcherzyków wolnych, niesionych przez przepływ25. Po czwarte, na tej samej lamelle można zastosować kilka kanałów mikrofluidycznych, z których każdy bada inny warunek. Pozwala to na porównanie warunków podczas jednego cyklu eksperymentalnego. Podobnego podejścia użyła grupa van Oijena do badania fuzji między wirusem grypy a amortyzowanymi SBL33.

W mikroskopii TIRF wykładniczy zanik pola ewanescentnego (ze stałą zaniku ~100 nm) ogranicza wzbudzenie fluorescencji do cząsteczek znajdujących się w bardzo bliskim sąsiedztwie granicy fazy szkło-bufor. Minimalizuje to wkład cząsteczek fluorescencyjnych znajdujących się dalej, zwiększa stosunek sygnału do szumu i pozwala na czułość na poziomie pojedynczych cząsteczek przy czasie naświetlania klatek wynoszącym 10-40 msec. Pole ewanescentne prowadzi również do wzrostu sygnału podczas fuzji: w miarę jak znakowane lipidy przenoszą się z SUV do SBL, znajdują się one średnio w silniejszym polu wzbudzenia. Ten wzrost fluorescencji jest bardziej wyraźny w przypadku większych liposomów.

Jeśli do wytworzenia pola ewanescentnego wykorzystuje się światło spolaryzowane, dodatkowe efekty wpływają na zmiany fluorescencji podczas przenoszenia znaczników z SUV do SBL. Niektóre barwniki lipidowe posiadają dipol przejścia zorientowany pod preferowanym średnim kątem względem dwuwarstwy, w której są osadzone. Tworzy to różnicę w ilości fluorescencji emitowanej przez fluorofory, gdy znajdują się one w SUV w stosunku do SBL, ponieważ spolaryzowana wiązka będzie wzbudzać barwniki w obu membranach w różny sposób. W pierwszym przypadku wiązka wzbudzająca będzie oddziaływać z dipolami przejścia zorientowanymi wokół sferycznego SUV, natomiast w drugim przypadku orientacje dipoli będą ograniczone przez płaską geometrię SBL. Na przykład, gdy stosowane jest padające światło spolaryzowane s (spolaryzowane prostopadle do płaszczyzny padania), wzbudzenie jest bardziej efektywne, gdy barwnik znajduje się w SBL niż w SUV w przypadku dipola przejścia barwnika lipidowego zorientowanego równolegle do membrany29,40 (takiego jak w przypadku DiI lub DiD41-43). SUV domieszkowany takim fluoroforem wydaje się ciemny podczas dokowania do SBL (Rycina 7, Reprezentatywne wyniki). W momencie otwarcia się poru fuzyjnego i połączenia membran SUV i SBL, sondy fluorescencyjne dyfundują do SBL i stają się bardziej podatne na wzbudzenie przez spolaryzowane s pole ewanescentne25,27,29. W konsekwencji sygnał fluorescencji zintegrowany wokół miejsca fuzji gwałtownie wzrasta podczas przenoszenia barwnika z SUV do SBL27 (Rycina 3 i Rycina 7). Dodatkowym czynnikiem wpływającym na zmiany sygnału towarzyszące fuzji jest zniesienie wygaszania (dequenching) znaczników fluorescencyjnych w miarę ich rozcieńczania podczas przenoszenia do SBL. Wkład zniesienia wygaszania jest zazwyczaj niewielki w porównaniu z zanikiem pola ewanescentnego i efektami polaryzacji w opisanym tutaj teście, ponieważ znakowana jest tylko niewielka frakcja (Symbol przybliżenia i procent mniejszy niż 1% w notacji matematycznej.) lipidów.

Wzrost sygnału podczas fuzji może zostać wykorzystany do wywnioskowania właściwości poru fuzyjnego poprzez porównanie czasu, Równanie równowagi statycznej, ΣFx=0, symbol wzoru dla analizy równowagi sił w mechanice., wymaganego do wydostania się lipidu przez por swobodnie przepuszczalny dla lipidów, z rzeczywistym czasem uwalniania, Symbol τ<sub>release</sub>, koncepcja kinetyki, równanie, analiza reakcji chemicznej.. Jeśli te dwie skale czasowe są porównywalne, można wywnioskować, że por stawia niewielki opór przepływowi lipidów. Jednakże, jeśli rzeczywisty czas uwalniania jest znacznie dłuższy niż czas uwalniania ograniczonego dyfuzją, wskazywałoby to na proces, taki jak migotanie poru (pore flickering), który opóźnia uwalnianie lipidów. Czas uwalniania ograniczonego dyfuzją, Równanie równowagi statycznej, ΣFx=0, symbol wzoru dla analizy równowagi sił w mechanice., zależy od rozmiaru fundującego liposomu oraz dyfuzyjności lipidów; jego oszacowanie wymaga ilościowego określenia tych dwóch parametrów. Czułość testu na poziomie pojedynczych cząsteczek pozwala na pomiar dyfuzyjności lipidów poprzez śledzenie kilku pojedynczych fluoroforów lipidowych po ich uwolnieniu do SBL dla każdego zdarzenia fuzji26. Rozmiar każdego fundującego pęcherzyka można oszacować27, łącząc (i) intensywność pojedynczego barwnika lipidowego, (ii) zmianę całkowitej fluorescencji wokół miejsca dokowania po przeniesieniu wszystkich fluoroforów do SBL podczas fuzji, (iii) znaną gęstość znakowania lipidów SUV oraz (iv) powierzchnię przypadającą na jeden lipid. Dla wielu zdarzeń fuzji stwierdzono, że rzeczywiste czasy uwalniania lipidów były znacznie dłuższe niż oczekiwano w przypadku uwalniania kontrolowanego dyfuzyjnie27, co odnotowano wcześniej przy założeniu jednorodnego rozmiaru SUV44. Przyjmując, że opóźnienie uwalniania lipidów wynika z migotania poru, model ilościowy pozwala na oszacowanie „otwartości poru”, czyli ułamka czasu, w którym por pozostaje otwarty podczas fuzji27.

W miarę możliwości ważne jest testowanie mechanizmów fuzji przy użyciu zarówno markerów lipidowych, jak i markerów zawartości rozpuszczalnej. Na przykład uwalnianie lipidów mogłoby być opóźnione przez procesy inne niż migotanie porów, takie jak ograniczenie dyfuzji lipidów przez białka SNARE otaczające por. Gdyby tak było, uwalnianie zawartości poprzedzałoby uwalnianie markerów lipidowych, pod warunkiem, że por jest wystarczająco duży, aby umożliwić przejście sond rozpuszczalnych. Bardziej fundamentalna wada tego podejścia mogłaby wynikać z założenia, że przenoszenie znakowanych lipidów do SBL odbywa się poprzez wąski por fuzyjny łączący SBL z pęcherzykiem, który w dużej mierze zachował swój kształt sprzed fuzji. Przenoszenie lipidów do SBL mogłoby również wynikać z szybkiego rozszerzenia poru fuzyjnego z jednoczesnym, niezwykle szybkim zapadnięciem się SUV w membranę SBL, jak wcześniej sugerowano na podstawie samych danych dotyczących uwalniania lipidów29. Jednoczesne monitorowanie uwalniania lipidów i zawartości wykazało, że wiele porów zamknęło się po uwolnieniu wszystkich markerów lipidowych, ale zatrzymało część swojego rozpuszczalnego ładunku27. Wskazuje to, że co najmniej niektóre liposomy nie zapadają się w SBL po fuzji i że transfer barwnika lipidowego do SBL odbywa się przez por fuzyjny. Ponadto uwalnianie lipidów i zawartości następowało jednocześnie27, co sprawia, że mało prawdopodobne jest, aby opóźnienie uwalniania lipidów było spowodowane utrudnieniem dyfuzji lipidów przez białka SNARE otaczające por45.

Protokół fuzji SUV-SBL, w którym nie monitorowano uwalniania zawartości rozpuszczalnej, został wcześniej opublikowany przez Karatekina i Rothmana25W niniejszej pracy uwzględniono nowsze osiągnięcia, a mianowicie jednoczesny monitoring uwalniania lipidów i zawartości oraz szacowanie właściwości SUV, lipidów i porów fuzyjnych.27Protokół rozpoczyna się od instrukcji przygotowania komórek mikrofluidycznych, wykonanych poprzez połączenie bloku elastomeru poli(dimetylosiloksanu) (PDMS) zawierającego rowki z szkiełkiem podstawowym.25Następnie wyjaśniono sposób przygotowania v-SUV z markerami lipidowymi oraz markerami zawartości. W rozdziałach 4 i 5 zamieszczono instrukcje dotyczące montażu komórek mikrofluidycznych oraz tworzenia SBL. in situ oraz sprawdzanie pod kątem defektów i płynności, wprowadzanie v-SUV do cel przepływowych oraz detekcja zdarzeń fuzji. Sekcja 6 zawiera instrukcje dotyczące analizy danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie bloku PDMS do uformowania kanału mikrofluidycznego

Schemat procesu mikrowytwarzania; układ montażu włókna; mikroskopia optyczna; użycie precyzyjnych narzędzi.
Rycina 1. Mikrowytwarzanie szablonu celi przepływowej i przygotowanie bloku PDMS. (A) Projekt czterokanałowej celi przepływowej dopasowanej do szkiełka przedmiotowego o wymiarach 24 x 60 mm (dół). Sześć identycznych projektów rozmieszczonych tak, aby zmieściły się na 10 cm waflu krzemowym (góra). (B) Wycięty blok PDMS o grubości około 5-8 mm za pomocą dziurkacza. (C) Wprowadzenie rurki do wycięcia za pomocą pęsety. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Należy pozyskać szablon komory przepływowej, taki jak przedstawiono na Rysunku 1A. Typowe kanały mają szerokość 0,3-1 mm, wysokość 70-100 µm i długość 1-2 cm. Szablon można wykonać za pomocą standardowych technik fotolitografii w zapleczu cleanroom25 lub zamówić, jeśli dostęp do cleanroomu jest niemożliwy. Alternatywnie można obrobić mechanicznie szablon o większych wymiarach z odpowiedniego materiału.
    Uwaga: Personel cleanroomu może przeszkolić i poprowadzić niedoświadczonych użytkowników (dostęp do zaplecza cleanroom jest zawsze ograniczony do osób z odpowiednim przeszkoleniem) w zakresie projektowania i zamawiania masek, czyszczenia wafli oraz fotolitografii. Po uzyskaniu szablonu można go wielokrotnie wykorzystywać poza cleanroomem, pod warunkiem przechowywania w zamkniętym naczyniu i dbałości o wykluczenie zanieczyszczeń pyłem.
  2. W jednorazowym plastikowym kubku należy przygotować mieszaninę ok. 100 ml PDMS (baza elastomeru silikonowego) i ok. 10 ml sieciowania (środka utwardzającego). Aby łatwiej operować lepkim PDMS, należy odciąć końcówkę jednorazowej pipety. PDMS należy odważyć do plastikowego kubka, ponieważ pipetowanie nie jest dokładne.
  3. Mieszaninę należy dobrze wymieszać. Liczne pęcherzyki powietrza należy usunąć poprzez odgazowanie w desykatorze próżniowym (około 20 min). W momencie poddania kubka próżni pęcherzyki początkowo zwiększą swoją objętość, co znacznie zwiększy objętość mieszaniny. Należy kontrolować przyłożoną próżnię i upewnić się, że kubek jest wystarczająco głęboki, aby zapobiec rozlaniu zawartości.
  4. Dużą kroplę odgazowanej mieszaniny PDMS należy wlać do szklanej szalki Petriego (150 mm x 20 mm), a następnie docisnąć wafel do PDMS szablonem skierowanym do góry. Pozwala to uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza pod waflem. Uwięzione pęcherzyki mogą się rozszerzyć i spowodować przechylenie wafla po umieszczeniu szalki w piekarniku. Następnie należy wlać odgazowany PDMS na szablon na górze wafla, aż zostanie on pokryty warstwą PDMS o grubości ok. 5-8 mm. Jeśli pojawi się pęcherzyk powietrza, należy go delikatnie usunąć końcówką pipety.
  5. PDMS należy wypiekać w piekarniku w temperaturze 60 °C przez 3 h. Należy upewnić się, że szalka stoi poziomo.
  6. Używając nowego ostrza skalpela, należy wyciąć blok PDMS zawierający uformowane struktury kanałów. Wycięty blok musi pasować do szkiełka nakrywkowego (patrz krok 4.1.9).
  7. Wycięty blok należy odczepić z szalki i położyć na czystym kawałku folii aluminiowej.
    Uwaga: Zsieciowane bloki PDMS można przechowywać przez kilka miesięcy. Na jednym waflu znajduje się 6 zestawów kanałów przepływowych (Rysunek 1A), zatem w jednym procesie formowania można uzyskać 6 bloków PDMS. Po wycięciu wszystkich 6 bloków PDMS należy usunąć luźne fragmenty materiału, ale poza tym nie usuwać pozostałego PDMS przed wylaniem i zsieciowaniem kolejnej partii, która będzie wymagać jedynie około połowy ilości PDMS zużytej przy pierwszej partii. Dobry szablon może służyć przez kilka lat.
  8. Używając dziurkacza, należy przebić blok PDMS jednym prostym ruchem (Rysunek 1B). Należy zacząć od strony rowków kanałów. Koniecznie należy usunąć wyciętą część PDMS. Czynność tę należy powtórzyć dla wszystkich ośmiu otworów w projekcie z czterema kanałami.
  9. Blok PDMS należy położyć stroną kanałów do dołu na nowym, gładkim kawałku folii aluminiowej. Blok można przechowywać do kilku miesięcy w suchym pojemniku, najlepiej w desykatorze.
  10. Za pomocą pęsety należy wsunąć rurkę (ID 0,25 mm, OD 0,76 mm) w przebity otwór na głębokość około jednej trzeciej jej długości (Rysunek 1C). Rurkę należy uciąć pod skosem, aby ułatwić wsuwanie. Rurki powinny pozostać wystarczająco długie, aby sięgały odpowiednio do zbiornika SUV i pompy strzykawkowej. Po umieszczeniu zmontowanego chipa na mikroskopie, rurki można ponownie przyciąć, jeśli są zbyt długie.
  11. Aby połączyć rurki ze strzykawkami pompy, należy odciąć krótki fragment grubszej rurki silikonowej (ID 0,51 mm, OD 2,1 mm) i wsunąć w nią cieńszą rurkę z jednej strony. Tak przygotowany blok PDMS można przechowywać przez kilka miesięcy.

2. Czyszczenie szkiełek nakrywkowych

  1. Oczyść szkiełka nakrywkowe zgodnie z protokołem opisanym przez Karatekin i Rothmana25, stosując silnie utleniającą mieszaninę kwasu siarkowego (H2SO4) i nadtlenku wodoru (H2O2). Procedurę tę należy przeprowadzić w pomieszczeniu czystym (cleanroom), przestrzegając odpowiednich zasad bezpieczeństwa. Alternatywnie można użyć dostępnych w handlu szkiełek nakrywkowych oczyszczonych w warunkach cleanroom (patrz Lista materiałów).

3. Przygotowanie v-SUV-ów zawierających znaczniki lipidowe i treściowe

Schemat procesu oczyszczania wirusów przy użyciu zestawu do wirowania w gradiencie jodiksanolu.
Rycina 2. Schemat przygotowania SUV. Lipidy są mieszane w probówce szklanej (1), a rozpuszczalnik jest odparowywany w celu utworzenia filmu lipidowego poprzez obracanie probówki w łaźni wodnej (2). Pozostałe ślady rozpuszczalnika są usuwane w wysokiej próżni (3). Film lipidowy jest hydratyzowany w buforze do rekonstytucji zawierającym detergent i białko podczas mieszania w wibratorze (4). Jeśli zawartość ma zostać zamknięta wewnątrz pęcherzyków (enkapsulowana), barwnik jest dodawany na tym etapie oraz podczas etapu rozcieńczania (5). Rozcieńczenie stężenia detergentu poniżej jego krytycznego stężenia micelarnego prowadzi do formowania liposomów. Detergent jest usuwany w drodze dializy przez noc (6). W przypadku t-SUV do tworzenia SBL zawierających NBD-PE (zielony), pęcherzyki są wypławiane w gradiencie gęstości i zbierane na granicy między dwiema warstwami (7a). Aby oddzielić v-SUV z enkapsulowanym markerem zawartości od wolnego barwnika, próbka jest przepuszczana przez kolumnę do chromatografii wykluczania cząsteczkowego i zbierana w frakcjach po 0.5 ml (7b). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

  1. Przygotować 4 L buforu do rekonstytucji zawierającego 25 mM HEPES-KOH, 140 mM KCl, 100 µM EGTA i 1 mM DTT, pH 7,4. Większość buforu wykorzystać do dializy, a 100 ml do pozostałych etapów.
    Uwaga: Można stosować inne bufory, jednak ważne jest zachowanie stałej osmolarności buforu w całym eksperymencie oraz wybór warunków, w których białka pozostają funkcjonalne. W celu przygotowania t-SUV oraz v-SUV zawierających wyłącznie znaczniki lipidowe, należy postępować zgodnie z instrukcjami Karatekina i Rothmana25.
  2. Ponieważ zapasy lipidów są przechowywane w temperaturze -20 °C w chloroformie lub mieszaninie chloroform:metanol (2:1, v/v), należy odczekać, aż fiolki osiągną temperaturę pokojową przed ich otwarciem, aby uniknąć kondensacji.
  3. Opłukać szklaną probówkę chloroformem w celu usunięcia śladowych ilości detergentu, a następnie zmieszać lipidy w pożądanym stosunku, tak aby końcowa ilość wynosiła 1 µmol, w mieszaninie chloroformu i metanolu (2:1, v/v). Do manipulowania rozpuszczalnikami organicznymi i rozpuszczonymi lipidami należy używać wyłącznie szklanych strzykawek i probówek.
    Uwaga: Lipidy użyte w tej procedurze to POPC:SAPE:DOPS:Cholesterol:PEG2000-DOPE:DiD w stosunku molowym 57,4:15:12:10:4,6:1 dla pęcherzyków zawierających v-SNARE oraz POPC:SAPE:DOPS:Cholesterol:brain PI(4,5)P2:PEG2000-DOPE:NBD-PE (54,9:15:12:10:3:4,6:0,5) dla t-SNARE SUV. Szczegóły znajdują się w sekcji Materiały. Można stosować inne składy lipidowe.
  4. Odparować rozpuszczalnik pod delikatnym strumieniem azotu lub w ewaporatorze rotacyjnym. Zanurzyć końcówkę probówki w kąpieli wodnej (37 °C) podgrzanej powyżej najwyższej temperatury topnienia lipidów, aby uzyskać jednorodny film lipidowy i uniknąć dużych zmian temperatury podczas odparowywania rozpuszczalnika. Próżnię uruchomić przy ok. 300 mbar, aż do utworzenia się filmu lipidowego, a następnie kontynuować przez ok. 2 min przy najwyższej możliwej próżni w ewaporatorze rotacyjnym.
  5. Wyjąć szklaną probówkę i owinąć ją folią aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na światło, a następnie usunąć pozostałe ślady rozpuszczalnika, umieszczając probówkę w eksykatore pod wysoką próżnią na co najmniej 2 h. Ten etap można również przeprowadzić przez noc.
  6. Aby rehydratować wysuszony film lipidowy, przygotować mieszaninę detergentu (n-oktylo-β-D-glukopiranozydu, OG), białka (v-SNARE) i SRB w buforze do rekonstytucji (końcowa objętość 500 µl). Końcowe stężenie detergentu utrzymać na poziomie ok. 2 razy wyższym niż krytyczne stężenie micelarne (CMC, 20-25 mM dla OG) i dostosować końcową objętość tak, aby stosunek detergentu do lipidów wynosił >10. Proszek Sulforodaminy B (SRB) rozpuścić w roztworze białko-detergent poprzez delikatne wstrząsanie, aby uzyskać końcowe stężenie SRB 10-50 mM. Przy dodawaniu wysokich stężeń SRB dostosować osmolarność buforu do rekonstytucji poprzez odpowiednie zmniejszenie stężenia chlorku potasu.
    Uwaga: Stosunek lipidów do białek (LP) dla t-SNARE jest wysoki (LP ~20 000, ok. 70 t-SNARE na mikrometr kwadratowy25). Znacznie wyższa gęstość t-SNARE w SBL może prowadzić do powstawania nieaktywnych agregatów białkowych, co znacząco obniża szybkość fuzji17,24. LP dla v-SNARE jest znacznie niższe (LP ~200, ok. 7 000 v-SNARE na µm2), co jest zbliżone do gęstości v-SNARE występujących na pęcherzykach synaptycznych46,47. Aby upewnić się co do funkcjonalności białek po ekspresji rekombinowanej i oczyszczaniu v- oraz t-SNARE, warto przeprowadzić prosty test fuzji masowej (bulk fusion assay)48 przed przystąpieniem do wszystkich etapów testu fuzji pojedynczych pęcherzyków.
  7. Delikatnie wstrząsać uprzednio ogrzaną szklaną probówką zawierającą wysuszony film lipidowy, dodając roztwór białko-detergent-SRB z etapu 3.6. Należy starać się unikać tworzenia pęcherzyków powietrza. Kontynuować wstrząsanie przez 15 min w temperaturze 37 °C.
  8. Rozcieńczyć detergent pięciokrotnie, dodając bufor do rekonstytucji zawierający SRB (dodać 2 ml, końcowa objętość 2,5 ml) podczas intensywnego mieszania w wortexie, aby uniknąć gradientów stężeń. Kontynuować wstrząsanie przez okres od 15 min do 1 h w temperaturze 37 °C.
    Uwaga: Dłuższa inkubacja zwiększa wydajność rekonstytucji białek. Szybkie rozcieńczenie obniża stężenie detergentu poniżej poziomu CMC, co prowadzi do powstania małych liposomów.
  9. Zawiesinę pęcherzyków dializować najpierw przeciwko ~1 L buforu do rekonstytucji przez 1-2 h w temperaturze otoczenia, a następnie przeciwko 3 L buforu do rekonstytucji przez noc w temperaturze 4 °C z dodatkiem 4 g adsorbenta polistyrenowego, używając probówki lub kasety do dializy o MWCO 20 000. Do dializy pęcherzyków z SRB i bez SRB należy używać osobnych zlewków, aby zapobiec zanieczyszczeniom krzyżowym.
  10. Równoważyć kolumnę do filtracji żelowej buforem do rekonstytucji. Przepuścić zawiesinę pęcherzyków przez kolumnę, aby oddzielić wolny SRB od v-SUV z enkapsulowanym SRB. Jako eluent stosować bufor do rekonstytucji bez SRB, gdy cała próbka znajdzie się w kolumnie. Zbierać v-SUV w frakcjach 0,5 ml.
  11. Zweryfikować pomyślną enkapsulację SRB w stężeniach samogaszących poprzez pomiar fluorescencji SRB przed i po dodaniu detergentu do alikwotu pęcherzyków16. Używając spektrometru fluorescencyjnego, wzbudzić próbkę przy 550 nm i przeskanować emisję SRB w zakresie od 570 nm do 630 nm. Po dodaniu detergentu należy spodziewać się 4-8 krotnego wzrostu fluorescencji SRB, w zależności od ilości enkapsulowanej, ponieważ błona ulega solubilizacji, a uwolniony SRB ulega rozcieńczeniu.
  12. Określić odzyski lipidów i białek odpowiednio za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej24 oraz elektroforezy żelowej SDS-PAGE. Stosować czułą metodę barwienia, szczególnie w przypadku próbek t-SUV o wysokim LP (patrz Lista Materiałów). Zazwyczaj podczas przygotowania traci się około 50% obu składników (lipidów i białek), co skutkuje uzyskaniem LP bliskiego wartości nominalnej.
  13. Określić wielkości SUV za pomocą dynamicznego rozpraszania światła24 lub mikroskopii elektronowej48. Przechowywać v-SUV zawierające SRB w temperaturze 4 °C do ok. 3-4 dni. Nie zamrażać, ponieważ zamrażanie i rozmrażanie niszczy błonę i powoduje uwolnienie enkapsulowanego SRB.

4. Test fuzji SUV-SBL do monitorowania wyłącznie uwalniania lipidów

  1. Tworzenie przytwierdzonej dwuwarstwy wspieranej w mikrofluidycznych kanałach przepływowych
    1. Umieść blok PDMS (krok 1.11) w wysokiej próżni na co najmniej 20 min przed eksperymentem, aby usunąć rozpuszczone gazy. Znacznie zmniejsza to ryzyko powstania pęcherzyków powietrza w kanałach mikrofluidycznych podczas eksperymentu z fuzją.
    2. Włącz zestaw mikroskopowy i podgrzej stolik oraz uchwyt na próbkę (Rysunki 3 oraz 4) do pożądanej temperatury.
    3. Przefiltruj bufor do rekonstytucji używany do rozcieńczania pęcherzyków przez filtr o rozmiarze porów 0.45 µm lub mniejszym.
    4. Rozcieńcz ~30 µl t-SUV-ów znakowanych NBD-PE lub kontrolnych liposomów wolnych od białek (pf-SUV-ów) (roztwór stokowy 0.5-1 mM lipidów) w ~60 µl buforu. Końcowe stężenie nie jest tutaj krytyczne.
    5. Odgazuj tę mieszaninę za pomocą strzykawki 3 ml. Wypchnij większość powietrza znad próbki, trzymając strzykawkę pionowo. Uszczelnij końcówkę (bez igły) folią parafinową i wytwórz próżnię, odciągając tłok. Opukaj korpus strzykawki, aby przyspieszyć odgazowanie roztworu. Powtórz ten proces kilka razy, aż przestaną pojawiać się pęcherzyki po zastosowaniu próżni.
    6. Użyj igły hipodermicznej o średnicy nieco większej niż rurka przyłączona do bloku PDMS, aby przebić otwór w zakrętce probówki do mikrocentryfugi. Upewnij się, że przebity kawałek plastiku nie znajduje się wewnątrz probówki, ponieważ mógłby później zatkać rurkę połączoną z wlotem kanału mikrofluidycznego.
    7. Napełnij probówkę do mikrocentryfugi z otworem w zakrętce odgazowanym roztworem SUV i umieść ją w uchwycie na stoliku mikroskopu, aby wyrównała się do ustawionej temperatury.
    8. Umieść wcześniej oczyszczoną laminkę (sekcja 2) w czyszczarce plazmowej i przeprowadź plazmowanie powietrzem przez około 5 min. Połóż poddaną działaniu plazmy laminkę (stroną traktowaną do góry) na kilku chusteczkach beztkankowych służących jako podkładka.
    9. Zdejmij folię aluminiową z odgazowanego bloku PDMS i połóż blok na lamince. Przy ponownym użyciu bloku PDMS przyklej i odklej kawałek taśmy klejącej od strony kanału, aby go oczyścić. Przyciśnij blok PDMS do laminki za pomocą pęsety, aby przylgnął, ale nie naciskaj zbyt mocno, ponieważ szkło może pęknąć.
    10. Umieść zmontowaną celę przepływową na stoliku mikroskopu i podłącz odpowiednio rurkę do zbiornika SUV oraz do pompy strzykawkowej. Przymocuj laminkę do stolika taśmą (Rysunek 3B).
    11. Zacznij aspirację SUV-ów z prędkością 3 µl/min, aż roztwór całkowicie wypełni kanały (~2.25 mm/sec dla przekroju kanału 75 µm x 300 µm). Gdy roztwory we wszystkich kanałach zaczną przemieszczać się w górę rurki po stronie wylotowej, zmniejsz przepływ do 0.5 µl/min i inkubuj przez 30-45 min.
      Uwaga: Czas między plazmowaniem laminki szklanej a wprowadzeniem SUV-ów do kanału nie powinien przekraczać 10-20 min, ponieważ efekt plazmowania jest przejściowy.
    12. Sprawdź kanały pod kątem wycieków. Użyj obiektywu powietrznego 10-20X, aby zaobserwować fluorescencję NBD-PE z t- lub pf-SUV-ów zawierających NBD-PE. Wzbudź fluorofory NBD za pomocą lasera 488 nm. Wycieki są trudne do wykrycia przy użyciu oświetlenia w jasnym polu.
    13. Umieść probówkę z odgazowanym buforem do rekonstytucji w uchwycie i poczekaj na wyrównanie temperatury, ponieważ gwałtowne zmiany temperatury mogą spowodować defekty w SBL. Zatrzymaj przepływ i odczekaj ~1 min, aby upewnić się, że przepływ całkowicie ustał i żaden pęcherzyk powietrza nie zostanie zasysany do probówki przed przełączeniem rurek wlotowych na odgazowany bufor.
    14. Przepłucz wszystkie kanały odgazowanym buforem, aby wypłukać niezwiązane SUV-y.
    15. Przełącz na obiektyw TIRF o większym powiększeniu (60X, olej, NA 1.45-1.49) i zweryfikuj, czy dwuwarstwa wygląda jednorodnie i jest wolna od oczywistych defektów w dużej skali, takich jak ciemne plamy lub tubule lipidowe wystające z SBL.
  2. Sprawdzenie płynności dwuwarstwy
    1. Jeśli dedykowana jednostka FRAP nie jest dostępna lub jeśli nie można zaprogramować sekwencji FRAP, przetestuj jakościowo płynność błony w następujący sposób.
      1. Przymknij przysłonę pola do małego rozmiaru (~40 µm średnicy) i dostosuj intensywność światła wzbudzenia 488 nm za pomocą oprogramowania (20-80 µW lub 15-60 nW/µm2), aby znacząco, ale nie całkowicie, wybielić fluorescencję NBD-PE w naświetlanym obszarze. W przypadku płynnej dwuwarstwy, w stanie stacjonarnym intensywność fluorescencji w środku naświetlanego obszaru powinna być niższa niż na krawędziach, ponieważ nienaruszone cząsteczki NBD-PE wnikają do naświetlanego obszaru i dyfundują na pewną odległość przed wybieleniem. W przeciwieństwie do tego, jeśli przytwierdzone do powierzchni SUV-y nie pękły lub z innego powodu dwuwarstwa wspierana nie jest płynna, wszystkie fluorofory w naświetlanym obszarze powinny ulec wybieleniu.
        Uwaga: Wartości intensywności lasera w tym i w kolejnych krokach są podane jako orientacyjny punkt wyjścia i powinny zostać zoptymalizowane dla danego zestawu warunków.
      2. Zatrzymaj oświetlenie i uruchom je ponownie po kilku minutach, aby zweryfikować wyniki pomiarów w stanie stacjonarnym.
    2. Jeśli to możliwe, zaprogramuj sekwencję FRAP dla pomiaru bardziej ilościowego. Szczegóły znajdują się w plikach uzupełniających i odpowiadającej im legendzie.
      Uwaga: Czasami SUV-y przywierają do laminki szklanej, ale nie pękają i nie tworzą płynnej dwuwarstwy. Jeśli tak się stanie, przepłucz kanały odgazowanym buforem do rekonstytucji zawierającym 10 mM Mg2+, aby wspomóc tworzenie dwuwarstwy wspieranej. Użyj wybielania fluorescencyjnego do oceny płynności dwuwarstwy, jak w punkcie 4.2. Po utworzeniu płynnej dwuwarstwy przepłucz ją buforem do rekonstytucji wolnym od Mg2+.
  3. Wprowadzanie v-SUV-ów do mikrofluidycznych kanałów przepływowych
    1. Odgazuj bufor do rekonstytucji i użyj go do rozcieńczenia roztworu stokowego v-SUV około 103 do 105 razy, w zależności od stężenia stokowego v-SUV. Dąż do rozcieńczenia, które zaowocuje około 10-100 zdarzeniami fuzji w ciągu 60 s w polu widzenia.
      Uwaga: Zbyt duża liczba fuzji zwiększa fluorescencję tła (ponieważ każde zdarzenie osadza znaczniki lipidowe LR-PE lub DiD w SBL) i utrudnia detekcję oraz analizę zdarzeń fuzji. Z kolei zbyt niska częstotliwość fuzji skutkuje słabą statystyką lub wymaga zarejestrowania znacznie większej liczby filmów. Dla stężenia v-SUV wynoszącego 0.1 mM lipidów, zacznij od rozcieńczenia 5 µl stoku SUV w 995 µl buforu do rekonstytucji, a następnie rozcieńcz 5-50 µl tego roztworu w 950-995 µl buforu do rekonstytucji.
    2. Poczekaj na wyrównanie temperatury przed zatrzymaniem przepływu i włożeniem rurki wlotowej do rozcieńczonego roztworu v-SUV.
    3. Dostosuj kąt TIRF i polaryzację w następujący sposób.
      1. Po ustawieniu pożądanej polaryzacji poprzez obrót wiązki wzbudzenia, dostosuj nachylenie lustra sterującego pozycją wiązki za pomocą silnika krokowego poprzez oprogramowanie. Powoli przesuń pozycję wiązki lasera z centrum obiektywu w tylnej płaszczyźnie ogniskowej na jedną stronę poza centrum. Obserwuj światło z przedniej strony obiektywu, które wyłania się pod coraz większym kątem względem osi obiektywu w miarę przesuwania pozycji dalej poza centrum.
      2. Zanotuj pozycję silnika, gdy wychodząca wiązka po raz pierwszy znika w obiektywie, t.j. gdy po raz pierwszy zostaje osiągnięte TIR.
      3. Powoli przesuwaj pozycję wiązki dalej poza centrum, monitorując fluorescencję z powierzchni. Zanotuj pozycję silnika, gdy fluorescencja powierzchni znika, gdy wiązka została przesunięta zbyt daleko poza centrum.
      4. Wybierz pozycję wiązki pomiędzy dwiema powyżej określonymi granicami. Dla najlepszego stosunku sygnału do szumu i większego wzmocnienia sygnału podczas fuzji, wybierz małą głębokość penetracji (pozycję wiązki bliżej krawędzi obiektywu), która nadal zapewnia równomierne oświetlenie pola widzenia.
        Uwaga: Najlepiej zachować tę samą pozycję wiązki TIR (tę samą głębokość penetracji) dla wszystkich eksperymentów po zoptymalizowaniu ustawień. Upewnij się, że obrót polaryzacji nie powoduje zmian w pozycji wiązki.
    4. Wprowadź v-SUV-y do kanału z przepływem 2 µl/min, co odpowiada średniej liniowej prędkości przepływu ~1.5 mm/sec dla przekroju 75 µm x 300 µm. Przełącz na ustawienia wzbudzenia/emisji w celu monitorowania mieszania lipidów (tylko LR lub DiD).
  4. Obserwacja fuzji pomiędzy pojedynczymi v-SUV a SBL

Schemat procesu fuzji pęcherzyków z wykresem intensywności i układem mikroskopowym; pompa strzykawkowa, uchwyt na próbkę.
Rycina 3. Experimentalny układ pTIRF. (A) Schematyczne przedstawienie v-SUV i t-SBL na szklanym podłożu. Obrazy TIRFM w fałszywych kolorach pojedynczego zdarzenia fuzji SUV-SBL pokazujące dokowanie lipidów (1) i uwalnianie barwnika lipidowego do SBL (2), a następnie blaknięcie i spadek intensywności fluorescencji (3). Przedstawiono sygnał całkowitej intensywności fluorescencji (suma wartości pikseli w obszarze 5.3 µm x 5.3 µm). (B) Przykrywo szkiełko przyklejone do bloku PDMS jest przymocowane taśmą do podgrzewanego stolika. Rurka wlotowa kanałów mikroprzepływowych pobiera próbki z probówki w metalowym uchwycie na próbki (po prawej), zasysane przez pompę strzykawkową (po lewej). Pod pompą znajduje się jednostka emisji podwójnej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat mikroskopii optycznej; układ PDMS; kamera EMCCD; wzbudzenie, detekcja; spektroskopia.
Rycina 4. Schemat układu eksperymentalnego. Fala ewanescentna powstaje na granicy szkło-bufor w kanale mikrofluidycznym. SBL tworzy się na szkle, a v-SUV są aspirowane z metalowego uchwytu próbki (u góry po prawej) przez kanał do strzykawki (u góry po lewej). M, lustro; DM, lustro dichroiczne; L, soczewka; F, filtr; P, polaryzator. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

  1. W sposób ciągły wzbudzać i monitorować fluorescencję v-SUV przy użyciu lasera 561 nm (dla LR-PE) lub 638 nm (dla DiD), w zależności od fluoroforu wbudowanego w v-SUV. W momencie, gdy v-SUV dotrą do kanału przepływowego, przyłączą się do SBL i z nią fusionują, sygnał fluorescencji tła zacznie narastać.
  2. Dostosować intensywność lasera wzbudzającego za pomocą oprogramowania, aby stale wybielać fluorescencję tła w taki sposób, by w stanie stacjonarnym można było łatwo obserwować nowe zdarzenia dokowania i fuzji.
    Uwaga: Jeśli wybielanie jest zbyt wolne, fluorescencja tła będzie zbyt wysoka. Jeśli wybielanie jest zbyt szybkie, sygnały z przyłączonych SUV oraz z fluoroforów uwolnionych do SBL będą szybko zanikać, co skróci czas, w którym można wykryć fuzję przyłączonych SUV lub śledzić fluorofor. Dla LR-PE wzbudzanego przy 561 nm, rozsądną wartością początkową jest moc 2,5-7,5 mW oświetlająca okrąg o średnicy 190 µm (100-250 nW/µm2). Dla wzbudzania DiD przy 638 nm, w testach wstępnych można zastosować moc 0,8-1,6 mW na okrąg o średnicy 190 µm (30-60 nW/µm2).
  3. Nagrać kilka filmów w różnych pozycjach w danym kanale. Sprawdzić fluorescencję NBD-PE, aby zweryfikować, czy SBL nie posiada defektów w tych pozycjach. Nagrywać filmy pełnoklatkowe z maksymalną prędkością (~50 frames/sec) lub wycięty obszar zainteresowania (ROI) z wyższą prędkością klatek (do ~100 Hz) przez 60 sec.
  4. Przejść do innego kanału mikrofluidycznego i powtórzyć pomiary dla innych warunków. Uwzględnić kontrole negatywne, takie jak SBL pozbawiona białek lub SUV, dodać rozpuszczalną domenę cytoplazmatyczną v-SNARE VAMP2 (CDV) jako inhibitor lub potraktować v-SUV neurotoksyną tężcową (30 min w 37 °C) w jednym lub więcej kanałach na tym samym szkiełku podstawowym.
  1. Sprzątanie i recykling PDMS
    1. Aby ponownie wykorzystać blok PDMS, przepłucz kanały mikrofluidyczne ~200 µl 70% etanolu przy szybkości przepływu 5 µl/min. Na koniec odessij powietrze przez rurki i kanały.
    2. Ostrożnie odczep blok PDMS od szkiełka podstawowego, lekko go ściskając. Umieść go na czystym kawałku folii aluminiowej. Przechowuj w eksykatorze próżniowym. Może być on wykorzystany wielokrotnie.
    3. W celu dokładniejszego czyszczenia przepłucz kanały detergentem lub roztworem wodorotlenku sodu przed zastosowaniem 70% etanolu. Alternatywnie, usuń wszystkie rurki z PDMS i poddaj blok sonikacji przez 30 min w izopropanolu, a następnie wysusz go i włóż nowe rurki.

5. Test fuzji SUV-SBL do jednoczesnego monitorowania uwalniania lipidów i zawartości

  1. W celu dwukolorowego monitorowania jednoczesnego uwalniania lipidów i zawartości rozpuszczalnej, należy postępować zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 4, z wyjątkiem zastosowania liposomów znakowanych zarówno markerem lipidowym (DiD), jak i markerem zawartości rozpuszczalnej (SRB), zgodnie z wyjaśnieniami w sekcji 3. SRB jest enkapsulowany w stężeniu 10 mM i początkowo wykazuje silne samowygaszanie.
  2. Korzystając z konfiguracji przedstawionej schematycznie na Rysunku 4, należy jednocześnie wzbudzać fluorescencję SRB i DiD, używając odpowiednio laserów o długości fali 561 nm i 638 nm. Lustro dichroiczne (640 nm) rozdziela emisję na dwie wiązki, które przechodzą przez filtr krótkofalowy (595/50 nm) i długofalowy (700/75 nm), aby odpowiednio wykryć emisje SRB i DiD. Dwie wiązki emisji są rzutowane obok siebie na matrycę EM-CCD.

6. Analiza danych

  1. Analiza danych FRAP
    1. Użyć programu MATLAB dostarczonego w informacjach uzupełniających, aby oszacować współczynnik dyfuzji lipidów, D. Program odczytuje listę plików OME-TIFF49, wykrywa obszar wybielony, wykreśla średnie wartości pikseli w obszarze wybielonym jako funkcję czasu i dopasowuje wynikową krzywą powrotu do modelu Soumpasisa50, aby wyznaczyć czas powrotu, Równanie statycznej równowagi τ=w²/(4D), schemat formuły dla analizy dyfuzji., gdzie w jest promieniem wybielonego koła.
      Uwaga: Wcześniej dostarczono program MATLAB25 do analizy filmów FRAP z plików Nikon ND2. Obecny program odczytuje pliki OME-TIFF49, ponieważ większość formatów plików można łatwo przekonwertować na OME-TIFF. Ilościowa analiza danych FRAP jest najprostsza i najdokładniejsza, gdy wybielanie jest natychmiastowe, obszar wybielony ma kształt koła, a wybielanie podczas odczytu jest pomijalne. Chociaż kryteria te nie są ściśle spełnione w prostych pomiarach FRAP opisanych tutaj, można uzyskać rozsądne oszacowanie współczynnika dyfuzji. Aby uzyskać dokładniejszą wartość, należy zastosować śledzenie pojedynczych barwników lipidowych (sekcja 6.3).
  2. Analiza szybkości dokowania, szybkości fuzji oraz czasów opóźnienia od dokowania do fuzji
    1. Użyć programu ImageJ do otwarcia filmu do analizy i dostosować jasność oraz kontrast, aby wyraźnie zidentyfikować zdarzenia dokowania i fuzji pęcherzyków. Uruchomić wtyczkę SpeckleTrackerJ26. Instrukcje użytkowania znajdują się w pracy Smith et al.26 oraz w dokumentacji online SpeckleTrackerJ.
    2. Zidentyfikować wszystkie nowo zadokowane SUV w SpeckleTrackerJ. Aby odróżnić SUV, które dokują trwale, od tych, które odbijają się od SBL, należy wprowadzić minimalny czas trwania dokowania wynoszący kilka klatek. Zapisać trajektorie i powtórzyć czynność dla wszystkich filmów.
      Uwaga: W przypadku szybkości dokowania istotne jest jedynie zidentyfikowanie momentu zadokowania SUV, zatem w tych trajektoriach należy zapisać tylko pierwszą klatkę, w której SUV zadokował. Pozostała część trajektorii nie będzie brana pod uwagę w analizie. Jednak automatyczne śledzenie każdego SUV aż do jego wybielenia lub fuzji pomaga oznaczyć SUV, które zostały już prześledzone.
    3. Zidentyfikować wszystkie fuzujące pęcherzyki. W ich przypadku trajektorie powinny obejmować wszystkie klatki od pierwszej klatki zadokowania SUV do pierwszej klatki, w której fuzja jest widoczna poprzez nagły wzrost fluorescencji śledzonego punktu. Czas trwania tych trajektorii służy do obliczenia opóźnień od dokowania do fuzji. Zapisać wszystkie trajektorie. Powtórzyć dla wszystkich filmów.
    4. W celu analizy seryjnej danych o dokowaniu lub fuzji, skompilować listę plików trajektorii z odpowiednich filmów i uruchomić programy MATLAB dostarczone wraz z pracą Karatekin i Rothman25. Postępować zgodnie z instrukcjami dostarczonymi wraz z programami.
      Uwaga: Programy wykreślają skumulowane zdarzenia dokowania i fuzji jako funkcję czasu na podstawie informacji wyodrębnionych z plików trajektorii. Szybkości dokowania i fuzji szacuje się na podstawie nachyleń tych wykresów. Dla danych o fuzji oblicza się również opóźnienia od dokowania do fuzji i wykreśla ich rozkład jako wykres przeżywalności, t.j. prawdopodobieństwo, że fuzja jeszcze nie nastąpiła po określonym czasie opóźnienia od dokowania.
  3. Dyfuzyjność lipidów
    1. Dla każdego zdarzenia fuzji śledzić pojedyncze fluorescencyjne lipidy, gdy stają się one widoczne po wystarczającym oddaleniu się od miejsca fuzji (Rysunek 6). Do śledzenia użyć SpeckleTrackerJ i zapisać trajektorie do dalszej analizy w programie MATLAB. W zależności od wielkości fuzującego pęcherzyka można zazwyczaj prześledzić od 3 do 30 pojedynczych fluoroforów. Ponieważ do obliczenia Koncepcja statycznej równowagi, formuła ΣFx=0, równanie w mechanice, słowo kluczowe pożądane są dłuższe trajektorie, należy starać się śledzić pojedyncze cząsteczki tak długo, jak to możliwe, stosując w razie potrzeby ręczną korektę trajektorii.
    2. Obliczyć średni kwadrat przemieszczenia (MSD) dla trajektorii pojedynczych markerów lipidowych, które trwają > 40-50 klatek (około ~1,5 s). Użyć MSD do obliczenia współczynnika dyfuzji lipidów, Koncepcja statycznej równowagi, formuła ΣFx=0, równanie w mechanice, słowo kluczowe. Szczegóły znajdują się w pracach Smith et al.26 oraz Stratton et al.27.
  4. Intensywność pojedynczego barwnika lipidowego, czynnik redukcji intensywności SUV-SBL i wielkość pęcherzyka
    1. Zmierzyć sumę wartości pikseli markera lipidowego w obszarze 3 x 3 piksele (0,8 µm x 0,8 µm) wokół markera przez ~15 klatek przed i po wybieleniu markera w jednym kroku. Od intensywności przed wybieleniem, uśrednionej przed wybieleniem, odjąć intensywność tła uśrednioną z klatek po wybieleniu, aby uzyskać intensywność śledzonego markera lipidowego. Powtórzyć pomiar dla tak wielu markerów, jak to jest praktyczne dla danego filmu.
    2. Wykreślić rozkład intensywności pojedynczych znaczników lipidowych, Formuła statycznej równowagi \(I_{\text{lip}}\) oznaczająca indeks lipofilności w równaniach chemicznych., i dopasować rozkład Gaussa, aby oszacować średnią.
    3. Obliczyć opóźnienie między momentem wystąpienia fuzji a momentem, w którym trajektoria pojedynczego markera lipidowego uwolnionego w tym zdarzeniu zakończyła się wybieleniem w jednym kroku. Wyznaczyć czas wybielania fluoroforu w SBL, Symbol równania τ_bleach używany w analizie danych dla badań fotowybielania, wynik mikroskopowy., wykreślając funkcję przeżywalności opóźnień i dopasowując ją do funkcji wykładniczej.
      Uwaga: Ponieważ spolaryzowane pole wzbudzenia słabiej oddziałuje z fluoroforami w SUV, czas wybielania SUV jest zazwyczaj znacznie dłuższy27.
    4. Oszacować Równanie reprezentujące fluorescencję całkowitego wewnętrznego odbicia (\( \lambda_{TIRF} \)), analiza optyczna., czynnik redukcji intensywności dla barwnika lipidowego w SUV w stosunku do jego intensywności w SBL, zgodnie z metodą Stratton27 (Równanie reprezentujące fluorescencję całkowitego wewnętrznego odbicia (\( \lambda_{TIRF} \)), analiza optyczna.Formuła statycznej równowagi \(I_{\text{lip}}\) oznaczająca indeks lipofilności w równaniach chemicznych. jest intensywnością pojedynczego barwnika w SUV).
      Uwaga: Gdyby wybielanie było pomijalne,  Równanie reprezentujące fluorescencję całkowitego wewnętrznego odbicia (\( \lambda_{TIRF} \)), analiza optyczna. byłoby równe intensywności zadokowania Równanie It=Idock, notacja chemiczna, opisująca energie oddziaływania dokowania. (punkt (1) na Rysunku 3A, panel prawy), podzielonej przez całkowitą intensywność osiągniętą po osadzeniu wszystkich fluoroforów w SBL podczas fuzji (linia przerywana oznaczona jako Statyczna równowaga, równanie ΣFx=0, analiza opisowa; istotne dla koncepcji fizycznych. na Rysunku 3). Jednak ze względu na szybkie wybielanie w SBL, wartość Statyczna równowaga, równanie ΣFx=0, analiza opisowa; istotne dla koncepcji fizycznych. zazwyczaj nie jest osiągana, a dokładne oszacowanie Równanie reprezentujące fluorescencję całkowitego wewnętrznego odbicia (\( \lambda_{TIRF} \)), analiza optyczna. wymaga dopasowania kinetyki uwalniania do wyrażenia27, które obejmuje zarówno Symbol równania τ_bleach używany w analizie danych dla badań fotowybielania, wynik mikroskopowy. (patrz 6.4.3), jak i Równanie reprezentujące fluorescencję całkowitego wewnętrznego odbicia (\( \lambda_{TIRF} \)), analiza optyczna.. W pracy Stratton et al.27 podano oddzielne wyrażenia dla przypadków kinetyki uwalniania ograniczonej przez pory oraz ograniczonej dyfuzyjnie; najlepsze dopasowanie różni się w zależności od zdarzenia (patrz 6.5.1 dla przypadku kinetyki ograniczonej przez pory).
    5.  Obliczyć pole powierzchni pęcherzyka dla poszczególnych zdarzeń na podstawie27 Równanie statycznej równowagi, A_ves z I_dock, λ_TIRF, symbolami oddziaływania lipidów; formuła edukacyjna., gdzie Równanie It=Idock, notacja chemiczna, opisująca energie oddziaływania dokowania. jest intensywnością zadokowanego SUV, Formuła statycznej równowagi \(I_{\text{lip}}\) oznaczająca indeks lipofilności w równaniach chemicznych. jest średnią intensywnością pojedynczego barwnika lipidowego w SBL, Równanie reprezentujące fluorescencję całkowitego wewnętrznego odbicia (\( \lambda_{TIRF} \)), analiza optyczna. jest czynnikiem redukcji intensywności dla barwnika lipidowego w SUV w stosunku do SBL, a Symbol ρ<sub>lip</sub> dla obliczeń gęstości lipidów, koncepcja w analizie biochemicznej. jest znaną gęstością powierzchniową barwników lipidowych.
  5. Właściwości porów fuzyjnych
    1. Zakładając, że uwalnianie jest ograniczone przez pory, dopasować kinetykę uwalniania znaczników lipidowych do 27  Formuła matematyczna analizy fotowybielania z zanikiem wykładniczym, schemat równania., gdzie Symbol prądu fuzji \( I_{\text{fus}} \), powiązany z równaniami elektromagnetycznymi w badaniach naukowych. jest intensywnością zadokowanego SUV tuż przed fuzją, a pozostałe parametry są zdefiniowane wcześniej. Użyć wartości Symbol równania τ_bleach używany w analizie danych dla badań fotowybielania, wynik mikroskopowy. uzyskanej w 6.4.3 jako parametru stałego i wyznaczyć najlepsze dopasowania dla  Równanie reprezentujące fluorescencję całkowitego wewnętrznego odbicia (\( \lambda_{TIRF} \)), analiza optyczna. oraz Symbol τ<sub>release</sub> dla stałych czasowych uwalniania w analizie systemów dynamicznych..
    2. Oszacować ułamek czasu, w którym por jest otwarty, P0, zakładając, że opóźnienie uwalniania lipidów wynika z migotania porów27: schemat równania statycznej równowagi ΣFx=0; słowa kluczowe: równowaga sił, zasady mechaniki = Równanie statycznej równowagi; symbol; edukacyjne; ΣFx=0; analiza badawcza., gdzie Aves jest polem powierzchni pęcherzyka (sekcja 6.4.5), b jest wysokością poru (zazwyczaj przyjmuje się ~15 nm), rp ≈ 3 nm jest efektywnym promieniem poru widzianym przez dyfundujące znaczniki lipidowe i obejmuje połowę grubości dwuwarstwy (~2 nm), Koncepcja statycznej równowagi, formuła ΣFx=0, równanie w mechanice, słowo kluczowe jest dyfuzyjnością lipidów (obliczoną w 6.3), a Symbol τ<sub>release</sub> dla stałych czasowych uwalniania w analizie systemów dynamicznych. jest czasem uwalniania lipidów z SUV do SBL (z 6.5.1).
    3. Aby potwierdzić, że nominalna wartość P0 > 1 wskazuje na całkowicie otwarty por, P0 = 1, dopasować przebieg intensywności w czasie do równania 4 z pracy Stratton et al.27, czyli przewidywanej kinetyki dla stale otwartego poru. Takie dopasowanie powinno być lepsze niż dopasowanie wyrażenia z 6.5.1 dla stale otwartego poru.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jakość SBL

Przed eksperymentem fuzji kluczowe jest zweryfikowanie jakości i płynności SBL. Fluorescencja na dnie, od strony szklanej kanału mikroprzepływowego, powinna być jednolita, bez żadnych widocznych defektów. Jeśli przez kanał przejdzie pęcherzyk powietrza, zazwyczaj pozostawia on widoczne ślady na SBL. W przypadku wystąpienia takich rozległych blizn/defektów nie należy używać tego kanału. Czasami SUV mog...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pomyślna implementacja opisanego tutaj testu fuzji SUV-SBL zależy w sposób krytyczny od kilku kluczowych etapów, takich jak funkcjonalna rekonstytucja białek w liposomach, uzyskanie wysokiej jakości SBL oraz wybór odpowiednich parametrów obrazowania w celu detekcji pojedynczych cząsteczek. Choć osiągnięcie sukcesu może wymagać czasu i wysiłku, raz pomyślnie wdrożony test dostarcza bogatego zestawu informacji o procesie fuzji, które nie są dostępne w żadnym innym teście fuzji in vitro omówionym we Wstępie. Można ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Vladimirowi Polejaevowi (Yale West Campus Imaging Core) za zaprojektowanie i zbudowanie spolaryzowanego mikroskopu TIRF, Davidowi Baddeleyowi (Yale University) za pomoc w dwukolorowym oprzyrządowaniu do detekcji, a także Jamesowi E. Rothmanowi (Yale University) i Benowi O'Shaughnessy'emu (Columbia University) oraz członkom ich grup za inspirację do dyskusji. EK jest wspierany przez Kavli Neuroscience Scholar Award od Kavli Foundation i grant NIH 1R01GM108954.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Reodczynniki
Milli-Q (MQ) wodaMilipory
KOHJ.T. Baker3040-05
Etanol 190 ProofDecon
IsopropanolFisher ChemicalA416P4
HEPESAmericanBioAB00892
Cholride sodu (KCl)AmericanBioAB01915
DithiothreitolAmericanBioAB00490
N-[2-hydroksyetylo]piperazyno-N'-[kwas 2-etanosulfonowy] (HEPES)AmericanBioAB00892
EGTAAcros Organics409911000
Buffers
Bufor HEPES-KOH (pH 7,4)25 mM HEPES-KOH, 140  mM KCl, 100  μ M EGTA, 1  mM DTT
Rozpuszczalniki
Chloroform J.T. Baker9180-01w szklanej butelce, UWAGA, nosić PPE
MetanolJ.T. Baker9070-03w szklanej butelce, UWAGA, nosić PPE
Preparat liposomowy
Gazoszczelna strzykawka Hamiltono różnych rozmiarachużywaj tylko szklanego pierścienia z solentami (Chlorophorm/ Methanon, 2:1, v/v)
Rurki szklane Pyrex Vista 11 ml, nakrętka 16x100 mm rurka hodowlanaPyrex 70825-16dokładnie oczyść, spłukać chloroformem
1-palmitoilo-2-oleoiloil-sn-glicero-3-fosfocholina, 16:0-18:1 PC (POPC)Avanti Polar Lipids850457Lipidy są rozpuszczone w CHCl3 lub w postaci lifilizowanego proszku w szczelnie zamkniętych fiolkach. Aliquot po otwarciu. Przechowywać dodatkowe w postaci wysuszonych filmów lipidowych w atmosferze obojętnej w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Przechowywać zapasy w CHCl3/MeOH (2:1, v/v) w temperaturze -20 & deg;C. pozwól przyjść do RT przed otwarciem
1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfo-L-seryna (sól sodowa), 18:1 PS (DOPS)Avanti Polar Lipids840035Tak jak wyżej.
1-stearoilo-2-arachidonoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina, 18:0-20:4 PE (SAPE)Lipidy polarne Avanti850804Jak wyżej.
L-&alfa;-fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforan (mózg, świnia) (sól amonowa), Mózg PI(4,5)P2Avanti Polar Lipids840046Jak wyżej.
1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-(7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-ylo) (sól amonowa), 18:1 NBD PEAvanti Polar Lipids810145Jak wyżej.
1,2-dioleoiloilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-2000] (sól amonowa), 18:1 PEG2000 PEAvanti Polar Lipids880130Jak wyżej.
cholesterol (wełna owcza, >98%)Avanti Polar Lipids700000Tak jak powyżej.
Olej DiD; Olej DiIC18(5) (nadchloran 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametylolindodikarbocyjaniny)Sondy molekularneD-307
Rotavapor R-210BuchiR-210łaźnia cieplna powyżej Tm lipidów stosowanych
OG n-oktylo-β-D-glukopiranozydAffymetrix0311przechowywać w temperaturze -20 &; C, pozwól przyjść do RT przed otwarciem
Shaker - Eppendorf Thermomixer REppendorf
Slide-A-Lyze, 20k MWCO, 3  mllife technologies66003
Bio-Beads SM-2 AdsorbentyBio-Rad1523920
OptiPrep  Gradient gęstości MediumSigma-AldrichD1556
Ultrawirówka Probówka, Cienkościenna, Ultra-Clear, 13.2  ml, 14 x 89 mmBeckman Coulter41121703
Beckman SW41 Ti rotor
SuflorodamineBSondy molekularneS-1307
Econo-Column  Kolumny chromatograficzne, 2,5 i razy; 10 cmBio-Rad7372512
Sepharose CL-4BGE Healthcare17-0150-01
sondy molekularnew żelu białkowymS-66505,000x Koncentrat w DMSO
PDMS block
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych, PDMSDow Corning3097358-1004
Szalka Petriego ze szkła Pyrex, 150 x 20 mm, w komplecie zpokrywą Corning3160-152
Dziurkacz - Dziurkacz wielokrotnego użytku, 0,75  mmWorld Precision Instruments504529
ręczna maszyna do dziurkowania Wiertło SYNEOMHPM-UNV
.035 x .026 x 1.5 304 SS TiN Okrągły dziurkaczSYNEOCR0350265N20R4średnica wiertła: 0,9 mm, rozmiar otworu stempla: 0,74 mm
Rurka z mikrootworem Tygon, średnica wewnętrzna 0,25 mm, średnica zewnętrzna 0,76 mmCole-Parmer06419-000,010" średnica wewnętrzna, 0,030" średnicy
zewnętrznej Rurka silikonowa (średnica zewnętrzna 0,51 mm, średnica zewnętrzna 2,1 mmCole-Parmer95802-000,020 średnicy, średnica zewnętrzna
Szkło nakrywkowe - czyste pomieszczenie posprzątane
Szkło nakrywkowe Schott Nexterion DSchott
HarrickPDC-32G
pTIRF konfiguracja i akcesoria
IX81 korpus mikroskopuOlympusIX81
EM CCDAndorixon-ultra-897
Thermo Plate, podgrzewany stolik mikroskopowyTokai HitMATS-U52RA26
1 ml szklane strzykawki Hamilton (4x)Pompa81365
kd ScientificKDS-230
Kasety dializacyjne SYPRO Pomarańczowe 0,083" Odkurzacz plazmowy 1472305 strzykawkowa Hamilton

Bibliografia

  1. Sudhof, T. C., Rothman, J. E. Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins. Science. 323, 474-477 (2009).
  2. Wickner, W., Schekman, R. Membrane fusion. Nat Struct Mol Biol. 15, 658-664 (2008).
  3. Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Nat Struct Mol Biol. 15, 690-698 (2008).
  4. Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs--engines for membrane fusion. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 631-643 (2006).
  5. Lindau, M., Alvarez de Toledo, G. The fusion pore. Biochim Biophys Acta. 1641, 167-173 (2003).
  6. Staal, R. G., Mosharov, E. V., Sulzer, D. Dopamine neurons release transmitter via a flickering fusion pore. Nat Neurosci. 7, 341-346 (2004).
  7. Wu, Z., et al. Nanodisc-cell fusion: Control of fusion pore nucleation and lifetimes by SNARE protein transmembrane domains. Sci. Rep. 6, 27287(2016).
  8. Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Ann Rev Physiol. 75, 393-422 (2013).
  9. Rossetto, O., Pirazzini, M., Montecucco, C. Botulinum neurotoxins: genetic, structural and mechanistic insights. Nature Rev Microbiol. 12, 535-549 (2014).
  10. Weber, T., et al. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
  11. Nickel, W., et al. Content mixing and membrane integrity during membrane fusion driven by pairing of isolated v-SNAREs and t-SNAREs. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 12571-12576 (1999).
  12. McNew, J. A., et al. Compartmental specificity of cellular membrane fusion encoded in SNARE proteins. Nature. 407, 153-159 (2000).
  13. Melia, T. J., You, D. Q., Tareste, D. C., Rothman, J. E. Lipidic antagonists to SNARE-mediated fusion. J Biol Chem. 281, 29597-29605 (2006).
  14. Hernandez, J. M., et al. Membrane fusion intermediates via directional and full assembly of the SNARE complex. Science. 336, 1581-1584 (2012).
  15. Fix, M., et al. Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7311-7316 (2004).
  16. Bowen, M. E., Weninger, K., Brunger, A. T., Chu, S. Single molecule observation of liposome-bilayer fusion thermally induced by soluble N-ethyl maleimide sensitive-factor attachment protein receptors (SNAREs). Biophys J. 87, 3569-3584 (2004).
  17. Liu, T., Tucker, W. C., Bhalla, A., Chapman, E. R., Weisshaar, J. C. SNARE-driven, 25-millisecond vesicle fusion in vitro. Biophys J. 89, 2458-2472 (2005).
  18. Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19731-19736 (2006).
  19. Diao, J., et al. A single-vesicle content mixing assay for SNARE-mediated membrane fusion. Nat Commun. 1, 1-6 (2010).
  20. Kyoung, M., et al. In vitro system capable of differentiating fast Ca2+-triggered content mixing from lipid exchange for mechanistic studies of neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E304-E313 (2011).
  21. Domanska, M. K., Kiessling, V., Stein, A., Fasshauer, D., Tamm, L. K. Single vesicle millisecond fusion kinetics reveals number of SNARE complexes optimal for fast SNARE-mediated membrane fusion. J Biol Chem. 284, 32158-32166 (2009).
  22. Kreutzberger, A. J., Kiessling, V., Tamm, L. K. High Cholesterol Obviates a Prolonged Hemifusion Intermediate in Fast SNARE-Mediated Membrane Fusion. Biophys J. 109, 319-329 (2015).
  23. Schwenen, L. L., et al. Resolving single membrane fusion events on planar pore-spanning membranes. Sci Rep. 5, 12006(2015).
  24. Karatekin, E., et al. A fast, single-vesicle fusion assay mimics physiological SNARE requirements. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3517-3521 (2010).
  25. Karatekin, E., Rothman, J. E. Fusion of single proteoliposomes with planar, cushioned bilayers in microfluidic flow cells. Nat Protoc. 7, 903-920 (2012).
  26. Smith, M. B., et al. Interactive, computer-assisted tracking of speckle trajectories in fluorescence microscopy: application to actin polymerization and membrane fusion. Biophys J. 101, 1794-1804 (2011).
  27. Stratton, B. S., et al. Cholesterol Increases the Openness of SNARE-mediated Flickering Fusion Pores. Biophysical journal. 110, (2016).
  28. Diao, J., et al. Synaptic proteins promote calcium-triggered fast transition from point contact to full fusion. Elife. 1, e00109(2012).
  29. Kiessling, V., Domanska, M. K., Tamm, L. K. Single SNARE-mediated vesicle fusion observed in vitro by polarized TIRFM. Biophys J. 99, 4047-4055 (2010).
  30. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365, 160-163 (1993).
  31. Washbourne, P., et al. Genetic ablation of the t-SNARE SNAP-25 distinguishes mechanisms of neuroexocytosis. Nat Neurosci. 5, 19-26 (2002).
  32. Diaz, A. J., Albertorio, F., Daniel, S., Cremer, P. S. Double cushions preserve transmembrane protein mobility in supported bilayer systems. Langmuir. 24, 6820-6826 (2008).
  33. Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
  34. Albertorio, F., et al. Fluid and air-stable lipopolymer membranes for biosensor applications. Langmuir. 21, 7476-7482 (2005).
  35. Daniel, S., Albertorio, F., Cremer, P. S. Making lipid membranes rough, tough, and ready to hit the road. Mrs Bulletin. 31, 536-540 (2006).
  36. Gao, Y., et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages. Science. 337, 1340-1343 (2012).
  37. Kenworthy, A. K., Hristova, K., Needham, D., Mcintosh, T. J. Range and Magnitude of the Steric Pressure between Bilayers Containing Phospholipids with Covalently Attached Poly(Ethylene Glycol). Biophys J. 68, 1921-1936 (1995).
  38. Knoll, W., et al. Solid supported lipid membranes: New concepts for the biomimetic functionalization of solid surfaces. Biointerphases. 3, Fa125-Fa135 (2008).
  39. Quinn, P., Griffiths, G., Warren, G. Density of newly synthesized plasma membrane proteins in intracellular membranes II. Biochemical studies. J Cell Biol. 98, 2142-2147 (1984).
  40. Sund, S. E., Swanson, J. A., Axelrod, D. Cell membrane orientation visualized by polarized total internal reflection fluorescence. Biophys J. 77, 2266-2283 (1999).
  41. Johnson, D. S., Toledo-Crow, R., Mattheyses, A. L., Simon, S. M. Polarization-controlled TIRFM with focal drift and spatial field intensity correction. Biophys J. 106, 1008-1019 (2014).
  42. Anantharam, A., Onoa, B., Edwards, R. H., Holz, R. W., Axelrod, D. Localized topological changes of the plasma membrane upon exocytosis visualized by polarized TIRFM. J Cell Biol. 188, 415-428 (2010).
  43. Axelrod, D. Carbocyanine dye orientation in red cell membrane studied by microscopic fluorescence polarization. Biophys J. 26, 557-573 (1979).
  44. Wang, T., Smith, E. A., Chapman, E. R., Weisshaar, J. C. Lipid mixing and content release in single-vesicle, SNARE-driven fusion assay with 1-5 msec resolution. Biophys J. 96, 4122-4131 (2009).
  45. Chernomordik, L. V., Frolov, V. A., Leikina, E., Bronk, P., Zimmerberg, J. The pathway of membrane fusion catalyzed by influenza hemagglutinin: restriction of lipids, hemifusion, and lipidic fusion pore formation. J Cell Biol. 140, 1369-1382 (1998).
  46. Takamori, S., et al. Molecular anatomy of a trafficking organelle. Cell. 127, 831-846 (2006).
  47. Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
  48. Scott, B. L., et al. Liposome fusion assay to monitor intracellular membrane fusion machines. Methods Enzymol. 372, 274-300 (2003).
  49. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).
  50. Soumpasis, D. M. Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments. Biophys J. 41, 95-97 (1983).
  51. Ohki, S. A mechanism of divalent ion-induced phosphatidylserine membrane fusion. Biochim Biophys Acta. 689, 1-11 (1982).
  52. Berquand, A., et al. Two-step formation of streptavidin-supported lipid bilayers by PEG-triggered vesicle fusion. Fluorescence and atomic force microscopy characterization. Langmuir. 19, 1700-1707 (2003).
  53. Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophys J. 47, 105-113 (1985).
  54. Rawle, R. J., van Lengerich, B., Chung, M., Bendix, P. M., Boxer, S. G. Vesicle fusion observed by content transfer across a tethered lipid bilayer. Biophys J. 101, L37-L39 (2011).
  55. Wagner, M. L., Tamm, L. K. Reconstituted syntaxin1a/SNAP25 interacts with negatively charged lipids as measured by lateral diffusion in planar supported bilayers. Biophys J. 81, 266-275 (2001).
  56. Kalb, E., Frey, S., Tamm, L. K. Formation of Supported Planar Bilayers by Fusion of Vesicles to Supported Phospholipid Monolayers. Biochimica Et Biophysica Acta. 1103, 307-316 (1992).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wspierana dwuwarstwatransfer barwnika lipidowegozdarzenia fuzji p cherzyk wpowr t fluorescencjiwzbudzenie spolaryzowaneuwalnianie rozpuszczalnego adunkudynamika por w fuzyjnych
Fuzja pojedynczych proteoliposomów za pośrednictwem SNARE z dwuwarstwami na uwięzi w mikroprzepływowej komórce przepływowej monitorowanej za pomocą spolaryzowanej mikroskopii TIRF
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.