Method Article

Porównanie trzech różnych metod określania proliferacji komórek w liniach komórkowych raka piersi

DOI:

10.3791/54350

⸱

September 3rd, 2016

 ,  , 
1Medical Genetics, Hunter Medical Research Institute, 2Priority Research Centre for Cancer, School of Biomedical Sciences and Pharmacy, Faculty of Health and Medicine, University of Newcastle, 3Pathology North, John Hunter Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje użycie trzech różnych metod analizy proliferacji komórek w liniach komórkowych raka piersi. Obejmuje to stosowanie konwencjonalnego zliczania komórek, żywotności komórek na podstawie luminescencji oraz zliczania komórek za pomocą obrazowania komórek. Każdy z nich oferuje korzyści w zakresie powtarzalnego pomiaru proliferacji komórek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomiar proliferacji komórek może być przeprowadzony za pomocą wielu różnych metod, z których każda ma inny poziom czułości, powtarzalności i kompatybilności z formatowaniem o wysokiej przepustowości. Protokół ten opisuje zastosowanie trzech różnych metod pomiaru proliferacji komórek in vitro, w tym konwencjonalnej komory zliczającej hemocytometr, testu opartego na luminescencji, który wykorzystuje zmianę aktywności metabolicznej żywych komórek jako miarę względnej liczby komórek, oraz wielotrybowego obrazowania komórek, który mierzy liczbę komórek za pomocą algorytmu zliczania. Każda metoda ma swoje zalety i wady w pomiarze proliferacji komórek, w tym czas, koszt i kompatybilność o wysokiej przepustowości. Protokół ten pokazuje, że każda metoda może dokładnie mierzyć proliferację komórek w czasie i jest czuła na wykrywanie wzrostu przy różnych gęstościach komórek. Ponadto pomiar proliferacji komórek za pomocą obrazowania komórek był w stanie dostarczyć dalszych informacji, takich jak morfologia, konfluencja i pozwolił na ciągłe monitorowanie proliferacji komórek w czasie. Podsumowując, każda metoda jest w stanie zmierzyć proliferację komórek, ale wybrana metoda zależy od użytkownika.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gen supresorowy nowotworu, p53, jest niezbędnym regulatorem wielu procesów komórkowych, w tym zatrzymania cyklu komórkowego, apoptozy i starzeniasię 1. Jest odpowiedzialny za utrzymanie stabilności genomu, a zatem ma kluczowe znaczenie dla utrzymania równowagi między śmiercią komórki a wzrostem komórki. Mutacje p53 są powszechne w raku i są główną przyczyną inaktywacji p53 prowadzącej do niekontrolowanej proliferacji komórek rakowych2. Co ciekawe, mutacje w p53 odpowiadają tylko za około 25% nowotworów piersi3, co sugeruje, że inne mechanizmy są odpowiedzialne za utratę funkcji p53. Wykazano, że niedawno odkryte izoformy p53 ulegają nadekspresji w wielu nowotworach u ludzi i mogą modulować funkcję p534,5. Wcześniej wykazaliśmy, że izoforma p53, Δ40p53, jest izoformą o najwyższej ekspresji w raku piersi i jest znacznie podwyższona w komórkach raka piersi w porównaniu z normalną sąsiednią tkanką6. Następnie stabilnie transdukowaliśmy ludzką linię komórkową raka piersi MCF-7 do nadekspresji Δ40p53 za pomocą wektora LeGO-iG2-puro + (GFP+)7. Komórki te wykorzystano do zbadania, czy wysoka ekspresja Δ40p53 zwiększa tempo proliferacji komórek w komórkach raka piersi.

Istnieje wiele bezpośrednich i pośrednich metod pomiaru proliferacji komórek hodowanych in vitro8,9. Można je wykonywać albo jako pomiary ciągłe w czasie, albo jako testy końcowe10. Nadal przydatne są konwencjonalne metody, takie jak zliczanie komórek za pomocą hemocytometru. Ten test jest tanią i bezpośrednią miarą liczby komórek, ale opiera się na dużej liczbie komórek i wysoko wykwalifikowanym szkoleniu w celu zminimalizowania błędów i dużych odchyleń standardowych od zliczeń. Potrzeba wykonywania pomiarów zgodnych z formatami o wysokiej przepustowości doprowadziła do opracowania testów na płytkach wielodołkowych. Te testy oparte na luminescencji mierzą liczbę komórek na podstawie sygnału luminescencyjnego, który jest proporcjonalny do aktywności metabolicznej komórki11,12. Niedawne wprowadzenie platform obrazowania o wysokiej zawartości umożliwiło opracowanie nowych narzędzi, które monitorują proliferację komórek, zapewniając jednocześnie ilościowe i jakościowe gromadzenie danych fenotypowych i obejmują różne systemy13. Wszystkie te metody zapewniają możliwości pomiaru wzrostu komórek, zarówno za pomocą pomiarów ciągłych, jak i testów końcowych, a każda z nich ma szereg zalet i wad w odniesieniu do czułości, przepustowości liczby próbek i informacji o komórkach, z których wszystkie można odpowiednio zważyć w zależności od pytania badawczego.

Ten protokół opisuje trzy różne metody pomiaru proliferacji komórek in vitro, z których każda wykorzystuje różne zakresy czułości, odtwarzalności i formatów płytek wielodołkowych. Protokół ten miał na celu porównanie wykorzystania komory zliczającej hemocytometru, testu żywotności komórek opartego na luminescencji i obrazowania komórek w pomiarze proliferacji komórek w ciągu 96 godzin. W tym celu porównano wzrost komórek transdukowanych wektorem (MCF-7-LeGO) z komórkami transdukowanymi w celu nadekspresji Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), przy użyciu trzech różnych gęstości komórek. Proliferację komórek mierzono co 24 godziny przez okres do 96 godzin. Stwierdzono, że każda metoda ma swoje zalety i wady, a w zależności od celu eksperymentu, każda z nich jest cenną metodą dostarczania informacji na temat tempa proliferacji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie komórek do testów proliferacji

Uwaga: Przygotuj dwie linie komórkowe w ten sam sposób i zasiewaj w tym samym formacie dla każdej metody, która ma być analizowana.

  1. Hoduj 7 komórek MCF-7-LeGO i MCF-7-Δ40p53 do 75-80% konfluencji w kolbach do hodowli tkankowych T 75 cm2 przy użyciu wolnego od czerwieni fenolu zmodyfikowanego podłoża Dulbecco Eagle Medium (DMEM) uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 200 mM L-glutaminy, 2 μg/ml insuliny i 1 μg/ml Puromycyny w temperaturze 37 °C z 5% CO2. Obsługa komórek w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II.
    Uwaga: Czas potrzebny do wyhodowania komórek do zbiegu różni się w zależności od rozcieńczenia siewu. W ramach przygotowań do posiewu komórek do testów proliferacji, wysiewaj komórki w rozcieńczeniu 1:3 w uzupełnionym DMEM i utrzymuj w normalnych warunkach wzrostu przez 3 dni do zbiegu 75-80%.
  2. Aby usunąć komórki z kolby, należy wylać pożywkę do pojemnika na odpady. Natychmiast umyj warstwę komórkową 2 ml podgrzanej 2x trypsyny. Odessać trypsynę. Dodać kolejne 2 ml wstępnie podgrzanej trypsyny do warstwy komórkowej i umieścić w inkubatorze na 5 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    1. Po odłączeniu komórek umyj je 10 ml podgrzanego, świeżo uzupełnionego DMEM. Przenieść zawiesinę komórkową do sterylnej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 491 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej stężenia. Ostrożnie odessać i usunąć supernatant.
  3. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml świeżo uzupełnionego DMEM. Wykonaj liczenie komórek, aby określić prawidłową gęstość do zasiewu komórek na 96-dołkowych płytkach.
    1. Rozcieńczyć 100 μl zawiesiny komórkowej w 900 μl 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS). Umieść nowy czujnik 60 μm na automatycznym liczniku komórek. Przytrzymaj tłok i zanurz czujnik w zawiesinie rozcieńczonej komórki. Powoli zwolnić tłok na liczniku ogniw. Po zakończeniu wyjmij czujnik z licznika ogniw.
      Uwaga: Liczba komórek zostanie wyświetlona na liczniku komórek w komórkach/ml.
  4. Komórki nasienne w końcowej objętości 100 μl (w DMEM) na 96-dołkowej płytce przy ~20% konfluencji, aby zapewnić miejsce na wzrost komórek i pomiar proliferacji w ciągu 3-5 dni (patrz Tabela 1). Wysiewaj wszystkie linie komórkowe w trzech egzemplarzach.
    Uwaga: W tym eksperymencie oceniono trzy różne gęstości komórek w celu określenia optymalnej gęstości komórek. Wymagane numery komórek podsumowano w tabeli 1. Komórki nasienne o mniejszej gęstości, jeśli wymagany jest pomiar bardziej długoterminowego wzrostu.
    1. W przypadku hemocytometru i testów opartych na luminescencji należy przygotować jedną płytkę na punkt czasowy (tj. 4 płytki na test). Do testu obrazowania komórek należy przygotować tylko jedną płytkę na czas trwania eksperymentu.
  5. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny.

2. Określanie liczby komórek za pomocą hemocytometru

  1. Podgrzej zarówno pożywkę, jak i trypsynę do temperatury 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych, piekarniku lub łaźni wodnej. Odessać pożywkę z komórek do pojemnika na odpady, przemyć raz 30 μl 2x trypsyny i odessać trypsynę.
  2. Ponownie umyć komórki 30 μl 2x trypsyny i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Delikatnie postukać w krawędź płytki, aby usunąć komórki z płytki. Dodać 50 μl uzupełnionego DMEM i mieszać komórki przez pipetowanie, aż komórki utworzą zawiesinę jednokomórkową.
  3. Przygotuj hemocytometr, czyszcząc powierzchnię i szklaną pokrywę 70% etanolem.
  4. Umieścić szkiełko nakrywkowe na komorach liczących i przymocować tak, aby między krawędziami szkiełka nakrywkowego a hemocytometrem można było zobaczyć "pierścienie załamania Newtona".
    Uwaga: Oznacza to, że szkiełko nakrywkowe prawidłowo przylegało do hemocytometru.
  5. Delikatnie odpipetować 20 μl zawiesiny komórek pod szkiełkiem nakrywkowym, wypełniając komorę liczenia ruchem kapilarnym. Umieść hemocytometr pod 10-krotnym powiększeniem mikroskopu i zwizualizuj komory zliczające w układzie siatki.
  6. Policz komórki w 4 zewnętrznych kwadratach układu siatki. Aby zwiększyć dokładność, w razie potrzeby powtórz liczenie dodatkowych zewnętrznych kwadratów lub do momentu, gdy liczba osiągnie 70 - 100 komórek14,15.
    1. Oblicz stężenie komórek na ml w następujący sposób: Średnia liczba komórek na kwadrat x współczynnik rozcieńczenia (jeśli jest używany) x 104
  7. Powtarzaj kroki 2.1-2.8 co 24 godziny przez 96 godzin po wysiewie.

3. Określanie proliferacji komórek za pomocą testu opartego na luminescencji

Uwaga: To jest pomiar końcowy. Po dodaniu odczynnika do komórek, płytkę można oznaczyć ilościowo tylko raz.

  1. Rozmrażać odczynnik luminescencyjny w łaźni wodnej o temperaturze 22 °C przez 30 minut.
  2. Delikatnie wymieszaj odczynnik, odwracając butelkę, aby uzyskać jednorodną mieszankę.
  3. Równowaga jednej płytki z wysianymi komórkami (z kroku 1.5) w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  4. Dodać 100 μl odczynnika luminescencyjnego do każdej studzienki. Mieszaj zawartość na wytrząsarce orbitalnej przez 2 minuty. Pozostawić płytkę do inkubacji przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Konfiguracja eksperymentu luminescencyjnego za pomocą wielotrybowego oprogramowania do odczytywania płytek.
    1. Włącz wielotrybowy czytnik płytek i otwórz oprogramowanie. W "menedżerze zadań" wybierz "eksperymenty" i "utwórz nowe". Wybierz "plik" z bocznego paska narzędzi, a następnie w zakładce "protokół" wybierz "procedura".
    2. Wybierz typ tabliczki "Grenier 96 z płaskim dnem" i zaznacz pole "użyj pokrywy". Wybierz akcję "odczyt" w polu "metoda odczytu". Wybierz metodę wykrywania "luminescencji". Kliknij "OK".
    3. W polu kroku odczytu wybierz studzienki, które mają zostać zeskanowane w zakładce "pełna płyta", a następnie wybierz studzienki, które mają pełnić rolę studni ślepych.
    4. Ustaw zestaw filtrów na pusty filtr (np. wtyczka, Em: otwór, lustro: brak). Ustaw wzmocnienie na 135, z czasem integracji 0,5 sekundy na studzienkę i wysokością odczytu 6,5 mm. Kliknij "OK", aby zapisać ustawienia odczytu luminescencji.
  6. Wykonywanie odczytu luminescencyjnego
    1. Wysuń uchwyt płyty, wybierając zakładkę "sterowanie instrumentem" i kliknij "wyjdź z płyty". Umieść 96-dołkową płytkę na uchwycie płytki, upewniając się, że pokrywka jest założona. Zamknij uchwyt tabliczki rejestracyjnej, klikając przycisk "wejście tablicy" w zakładce "sterowanie instrumentem". Kliknij "przeczytaj teraz" na pasku narzędzi, aby wykonać odczyt luminescencyjny.
    2. Eksportuj pomiary względnych jednostek luminescencyjnych (RLU) dla każdej studzienki do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy.
  7. Powtórz kroki 3.1-3.6, aby rejestrować proliferację co 24 godziny do 96 godzin po wysianiu komórek.

4. Określanie liczby komórek za pomocą skanera komórek

  1. Konfigurowanie eksperymentu obrazowania komórkowego za pomocą oprogramowania do obrazowania komórek w wielu trybach
    1. Włącz wielotrybowy imager komórek i otwórz oprogramowanie.
    2. W "menedżerze zadań" wybierz zakładkę "eksperymenty" i "utwórz nowy". Na pasku narzędzi "plik" kliknij zakładkę "protokół" i otwórz zakładkę "procedura". Wybierz akcję "ustaw temperaturę". Ustaw inkubator w pozycji "włączonej" i ustaw temperaturę na 37 °C, a następnie zaznacz pole "podgrzewanie" przed przejściem do następnego kroku. Kliknij "OK", aby zapisać ustawienia.
    3. Wybierz akcję "odczyt". Kliknij metodę wykrywania "obraz", wybierz typ odczytu "punkt końcowy/kinetyczny" i typ optyki "filtry". Kliknij "OK". Kliknij zakładkę "pełna płyta" i wybierz dołki na płycie, które mają zostać zobrazowane. Kliknij "OK", aby zapisać ustawienia.
    4. Wybierz obiektyw 2,5X z rozwijanych opcji "Cele". W zakładce "kanały" wybierz dwa kanały: GFP 469, 525 i Bright Field. Sprawdź "automatyczną" ekspozycję dla obu kanałów i wybierz dobrze automatyczną ekspozycję.
    5. Aby określić ustawienia autofokusa, wybierz "autofokus" i kliknij "opcje". Aby uzyskać opcje automatycznego ustawiania ostrości, wybierz metodę "skanuj, a następnie automatyczne ustawianie ostrości". Kliknij "OK", aby zapisać ustawienia.
    6. Ustaw przesunięcie poziome i pionowe od środka studzienki (μm) na 0.Wybierz, aby zeskanować wiele obrazów na studzienkę w montażu 3 x 2, z odstępami poziomymi (μm) = 2,881 i odstępami pionowymi (μm) = 2,127. Kliknij 'OK', aby zapisać ustawienia procedury.
      Uwaga: Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z odczytanymi parametrami.
  2. Przeprowadzanie eksperymentu odczytu na wybranej płycie
    1. Kliknij zakładkę "sterowanie instrumentem" i wybierz funkcję "plate out". Umieść 96-dołkową płytkę w uchwycie na płytkę, upewniając się, że pokrywka jest założona. W zakładce "Sterowanie instrumentami" wybierz funkcję "wejście na płytę". Wybierz "przeczytaj teraz" z zakładki płyty. Powtarzaj odczyt co 24 godziny do 96 godzin po wysiewie.
  3. Analiza liczby komórek za pomocą oprogramowania Cell Imager.
    1. Aby przeanalizować obraz, kliknij zakładkę "dane" na zobrazowanej płycie, wybierz "obraz [GFP 469, 525 + Jasne pole]". Kliknij dwukrotnie na zobrazowaną studnię.
    2. Kliknij załadowany obraz. Wybierz opcję "analizuj" i wybierz pojedynczy obraz montażu, który ma zostać poddany analizie. Kliknij "OK". Sprawdź tylko kanał "GFP" i ustaw parametry zgodnie z opisem w Tabeli 3. Kliknij "START", aby zastosować parametry do obrazowanych komórek.
    3. Obserwuj maskę zliczania komórek umieszczoną nad obrazowanymi komórkami, która służy do określania liczby komórek na obrazie. Kliknij "zastosuj zmiany" i zachowaj te ustawienia dla każdej zobrazowanej płyty w trakcie eksperymentu.
    4. Po powrocie na zobrazowaną płytę kliknij menu rozwijane "dane" i wybierz "liczba komórek". Spowoduje to wygenerowanie całkowitej liczby komórek na studzienkę.
    5. Wyeksportuj wszystkie dane do arkusza kalkulacyjnego, klikając zakładkę "eksport", aby uzyskać dalszą analizę liczby komórek na dołku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zbadać różne metody pomiaru proliferacji hodowanych komórek, porównano proliferację komórek transdukowanych MCF-7-Δ40p53 z nietransdukowaną linią komórkową raka piersi MCF-7-LeGO. Trzy metody, które zostały porównane – konwencjonalna metoda hemocytometru, test żywotności komórek, test luminescencji i analiza obrazowania komórek – przedstawiono na schemacie ideowym (ryc. 1). Każda metoda ma zalety i wady, aby dokładnie mierzyć zliczanie komórek w czasie, a najskuteczni...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W protokole tym zbadano trzy różne metody pomiaru proliferacji komórek w hodowanych komórkach. Każda metoda była w stanie zapewnić powtarzalne i dokładne pomiary proliferacji komórek w ciągu 96 godzin, a wyniki były porównywalne między każdą z badanych metod (ryc. 2 i 3). Zarówno test oparty na luminescencji, jak i metoda obrazowania komórek dały najbardziej wiarygodne wyniki, wykazując liniowy wzrost proliferacji komórek po 96 godzinach (Figura 2b, c). Ponadto obrazowan...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Dr Hamishowi Campbellowi i Prof. Antony'emu Braithwaite'owi za pomoc w rozwoju transdukowanych linii komórkowych MCF-7-LeGO. Chcielibyśmy podziękować za wsparcie finansowe ze strony Fundacji Bloomfield Group za pośrednictwem Hunter Medical Research Institute. BCM jest wspierany przez stypendium APA za pośrednictwem Uniwersytetu w Newcastle oraz stypendium MM Sawyer za pośrednictwem Hunter Medical Research Institute.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco's Modified Eagle Medium, bez czerwieni fenolowejThermoFisher Scientific21063-045Uzupełniony 10% FBS, 200 mM L-glutaminy, 2 i mikro; g/ml insuliny i 1 &mikro; g/ml puromycyny,
roztwór L-glutaminy (100x)ThermoFisher Scientific25030-081
Roztwór insuliny ludzkiejSigma-AldrichI9278-5ML
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Bovogen BiologicalsSFBS-F-500ml
Dichlorowodorek PuromycynySigma-AldrichP9620-10ML
0,5% roztwór trypsyny-EDTA (10x)ThermoFisher Scientific15400-054Rozcieńczyć do 2x w DPBS
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco (1x)ThermoFisher Scientific30028-02
Kolba do hodowli tkankowych, 75 cm2 obszar wzrostuGreiner Bio-One658175
Scepter 2.0 Licznik komórekMerck MilliporeAutomatyczny licznik komórek
96-dołkowa płytka wielodołkowa, płaskie dnoNunc167008
Ulepszony hemocytometr NeubaueraBOECO NiemcyBOE 01
Mikroskop odwrócony Olympus IX51Test OlympusIX51
CellTiter-Glo 2.0PromegaG9242Test oparty na luminescencji
Cytacja 3 Obrazowanie komórek Czytnik wielomodowyBioTekCzytnik płytek do luminescencji, fluorescencji i obrazowanie komórek w jasnym polu
Gen5 Oprogramowanie do analizy danych BioTekGEN5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lane, D. P. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 358 (6381), 15-16 (1992).
  2. Olivier, M., Hollstein, M., Hainaut, P. TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (1), a001008(2010).
  3. Olivier, M., et al. The clinical value of somatic TP53 gene mutations in 1,794 patients with breast cancer. Clin Cancer Res. 12 (4), 1157-1167 (2006).
  4. Bourdon, J. C., et al. p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity. Genes Dev. 19 (18), 2122-2137 (2005).
  5. Avery-Kiejda, K. A., et al. Small molecular weight variants of p53 are expressed in human melanoma cells and are induced by the DNA-damaging agent cisplatin. Clin Cancer Res. 14 (6), 1659-1668 (2008).
  6. Avery-Kiejda, K. A., Morten, B., Wong-Brown, M. W., Mathe, A., Scott, R. J. The relative mRNA expression of p53 isoforms in breast cancer is associated with clinical features and outcome. Carcinogenesis. 35 (3), 586-596 (2014).
  7. Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral "gene ontology" (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16 (4), 698-706 (2008).
  8. Riss, T. L., Moravec, R. A. Cell Biology. Celis, J. E. , Third Edition, Academic Press. 25-31 (2006).
  9. Ng, K. W., Leong, D. T., Hutmacher, D. W. The challenge to measure cell proliferation in two and three dimensions. Tissue Eng. 11 (1-2), 182-191 (2005).
  10. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev Technol. 2 (1), 51-62 (2004).
  11. Butzler, M., Worzella, T., Hungriano, M., Osorio, F., Hanegraaff, I., Cowan, C. Automated cytotoxicity profiling using the CyBi-FeliX instrument, cell health assays and thaw-and-use cells. , http://au.promega.com/resources/pubhub/automated-profiling-using-the-cybi-felix-instrument-cell-health-assays-and-thaw-and-use-cells (2014).
  12. CellTiter-Glo 2.0 Assay Technical Manual #403. , http://www.promega.com/~/media/files/resources/protocols/technical%20manuals/101/celltiterglo%202%200%20assay%20protocol.pdf (2015).
  13. Banks, P., Brescia, P. J. Application Guide: Automated Digital Microscopy. , http://www.biotek.com/resources/articles/automated-digital-microscopy.html (2015).
  14. Bastidas, O. Cell Counting with Neubauer Chamber: Basic Hemocytometer Usage. , http://www.celeromics.com/en/resources/Technical%20Notes/cell-article-chamber.php (2016).
  15. Bastidas, O. Technical Note: Cell Count for Low Concentration Samples . , http://www.celeromics.com/en/resources/docs/Articles/Low-concentration-cell-counting.pdf (2012).
  16. Riss, T. L., Moravec, R., Niles, A. L., et al. Cell Viability Assays. Assay Guidance Manual[Internet]. Sittampalam, G. S., Coussens, N. P., Nelson, H., et al. , (2013 May 1 [Updated 2015 Jun 29]) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/ (2013).
  17. Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).
  18. Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. , (2013 May 1 [Updated 2015 Jun 29]) https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSVerse_CellCycleAnalysis_AppNote.pdf 1-12 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell ProliferationHemocytometer CountingLuminescence AssayCell ImagerMCF 7 Cell LinesAutomated Cell CounterMulti Mode Plate ReaderTrypsinization Protocol96 Well PlateGFP Imaging

Related Articles