Method Article

Porównanie trzech różnych metod określania proliferacji komórek w liniach komórkowych raka piersi

DOI:

10.3791/54350

⸱

September 3rd, 2016

 ,  , 
1Medical Genetics, Hunter Medical Research Institute, 2Priority Research Centre for Cancer, School of Biomedical Sciences and Pharmacy, Faculty of Health and Medicine, University of Newcastle, 3Pathology North, John Hunter Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje użycie trzech różnych metod analizy proliferacji komórek w liniach komórkowych raka piersi. Obejmuje to stosowanie konwencjonalnego zliczania komórek, żywotności komórek na podstawie luminescencji oraz zliczania komórek za pomocą obrazowania komórek. Każdy z nich oferuje korzyści w zakresie powtarzalnego pomiaru proliferacji komórek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomiar proliferacji komórek może być przeprowadzony za pomocą wielu różnych metod, z których każda ma inny poziom czułości, powtarzalności i kompatybilności z formatowaniem o wysokiej przepustowości. Protokół ten opisuje zastosowanie trzech różnych metod pomiaru proliferacji komórek in vitro, w tym konwencjonalnej komory zliczającej hemocytometr, testu opartego na luminescencji, który wykorzystuje zmianę aktywności metabolicznej żywych komórek jako miarę względnej liczby komórek, oraz wielotrybowego obrazowania komórek, który mierzy liczbę komórek za pomocą algorytmu zliczania. Każda metoda ma swoje zalety i wady w pomiarze proliferacji komórek, w tym czas, koszt i kompatybilność o wysokiej przepustowości. Protokół ten pokazuje, że każda metoda może dokładnie mierzyć proliferację komórek w czasie i jest czuła na wykrywanie wzrostu przy różnych gęstościach komórek. Ponadto pomiar proliferacji komórek za pomocą obrazowania komórek był w stanie dostarczyć dalszych informacji, takich jak morfologia, konfluencja i pozwolił na ciągłe monitorowanie proliferacji komórek w czasie. Podsumowując, każda metoda jest w stanie zmierzyć proliferację komórek, ale wybrana metoda zależy od użytkownika.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gen supresorowy nowotworu, p53, jest niezbędnym regulatorem wielu procesów komórkowych, w tym zatrzymania cyklu komórkowego, apoptozy i starzeniasię 1. Jest odpowiedzialny za utrzymanie stabilności genomu, a zatem ma kluczowe znaczenie dla utrzymania równowagi między śmiercią komórki a wzrostem komórki. Mutacje p53 są powszechne w raku i są główną przyczyną inaktywacji p53 prowadzącej do niekontrolowanej proliferacji komórek rakowych2. Co ciekawe, mutacje w p53 odpowiadają tylko za około 25% nowotworów piersi3, co sugeruje, że inne mechanizmy są odpowiedzialne za utratę funkcji p53. Wykazano, że niedawno odkryte izoformy p53 ulegają na....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie komórek do testów proliferacji

Uwaga: Przygotuj dwie linie komórkowe w ten sam sposób i zasiewaj w tym samym formacie dla każdej metody, która ma być analizowana.

  1. Hoduj 7 komórek MCF-7-LeGO i MCF-7-Δ40p53 do 75-80% konfluencji w kolbach do hodowli tkankowych T 75 cm2 przy użyciu wolnego od czerwieni fenolu zmodyfikowanego podłoża Dulbecco Eagle Medium (DMEM) uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 200 mM L-glutaminy, 2 μg/ml insuliny i 1 μg/ml Puromycyny w temperaturze 37 °C z 5% CO2. Obsługa komórek w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II.
    Uwag....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zbadać różne metody pomiaru proliferacji hodowanych komórek, porównano proliferację komórek transdukowanych MCF-7-Δ40p53 z nietransdukowaną linią komórkową raka piersi MCF-7-LeGO. Trzy metody, które zostały porównane – konwencjonalna metoda hemocytometru, test żywotności komórek, test luminescencji i analiza obrazowania komórek – przedstawiono na schemacie ideowym (ryc. 1). Każda metoda ma zalety i wady, aby dokładnie mierzyć zliczanie komórek w czasie, a najskuteczni.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W protokole tym zbadano trzy różne metody pomiaru proliferacji komórek w hodowanych komórkach. Każda metoda była w stanie zapewnić powtarzalne i dokładne pomiary proliferacji komórek w ciągu 96 godzin, a wyniki były porównywalne między każdą z badanych metod (ryc. 2 i 3). Zarówno test oparty na luminescencji, jak i metoda obrazowania komórek dały najbardziej wiarygodne wyniki, wykazując liniowy wzrost proliferacji komórek po 96 godzinach (Figura 2b, c). Ponadto obrazowan.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Dr Hamishowi Campbellowi i Prof. Antony'emu Braithwaite'owi za pomoc w rozwoju transdukowanych linii komórkowych MCF-7-LeGO. Chcielibyśmy podziękować za wsparcie finansowe ze strony Fundacji Bloomfield Group za pośrednictwem Hunter Medical Research Institute. BCM jest wspierany przez stypendium APA za pośrednictwem Uniwersytetu w Newcastle oraz stypendium MM Sawyer za pośrednictwem Hunter Medical Research Institute.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco's Modified Eagle Medium, bez czerwieni fenolowejThermoFisher Scientific21063-045Uzupełniony 10% FBS, 200 mM L-glutaminy, 2 i mikro; g/ml insuliny i 1 &mikro; g/ml puromycyny,
roztwór L-glutaminy (100x)ThermoFisher Scientific25030-081
Roztwór insuliny ludzkiejSigma-AldrichI9278-5ML
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Bovogen BiologicalsSFBS-F-500ml
Dichlorowodorek PuromycynySigma-AldrichP9620-10ML
0,5% roztwór trypsyny-EDTA (10x)ThermoFisher Scientific15400-054Rozcieńczyć do 2x w DPBS
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco (1x)ThermoFisher Scientific30028-02
Kolba do hodowli tkankowych, 75 cm2 obszar wzrostuGreiner Bio-One658175
Scepter 2.0 Licznik komórekMerck MilliporeAutomatyczny licznik komórek
96-dołkowa płytka wielodołkowa, płaskie dnoNunc167008
Ulepszony hemocytometr NeubaueraBOECO NiemcyBOE 01
Mikroskop odwrócony Olympus IX51Test OlympusIX51
CellTiter-Glo 2.0PromegaG9242Test oparty na luminescencji
Cytacja 3 Obrazowanie komórek Czytnik wielomodowyBioTekCzytnik płytek do luminescencji, fluorescencji i obrazowanie komórek w jasnym polu
Gen5 Oprogramowanie do analizy danych BioTekGEN5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lane, D. P. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 358 (6381), 15-16 (1992).
  2. Olivier, M., Hollstein, M., Hainaut, P. TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (1), a001008(2010).
  3. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell ProliferationHemocytometer CountingLuminescence AssayCell ImagerMCF 7 Cell LinesAutomated Cell CounterMulti Mode Plate ReaderTrypsinization Protocol96 Well PlateGFP Imaging

Related Articles