Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Protokół izolowania mysiego kręgu Willisa

12.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54352

⸱

22 października 2016

 ,  , 
1UPMC Univ Paris 06, Sorbonne Universités

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy tutaj powtarzalny protokół izolowania mysiego kręgu Willisa.

Streszczenie

Mózgowy krąg tętniczy (circulus arteriosus cerebri) lub krąg Willisa (CoW) to zespolenie krążeniowe otaczające skrzyżowanie wzrokowe i podwzgórze, które dostarcza krew do mózgu i otaczających go struktur. Jest zaangażowany w kilka zaburzeń naczyniowo-mózgowych, w tym unaczynienie związane z mózgową angiopatią amyloidową (CAA), miażdżycę wewnątrzczaszkową i tętniaki wewnątrzczaszkowe. Badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tych chorób w celu identyfikacji nowych celów leków w celu ich zapobiegania wymagają modeli zwierzęcych. Niektóre z tych modeli mogą być transgeniczne, podczas gdy inne będą obejmować izolację naczyń mózgowych, w tym CoW.Opisana tutaj metoda jest odpowiednia do izolacji CoW w każdej linii myszy i ma znaczny potencjał w badaniach przesiewowych (ekspresja genów, produkcja białek, potranslacyjne modyfikacje białek, analiza sekretomu itp.) na dużych naczyniach mózgowo-naczyniowych myszy. Może być również stosowany do badań ex vivo, poprzez adaptację systemu kąpieli narządowej opracowanego dla izolowanych tętnic węchowych myszy.

Wprowadzenie

Mózgowy krąg tętniczy (circulus arteriosus cerebri), znany również jako okrąg Willisa (CoW), pętla wielokąta Willisora) został po raz pierwszy opisany przez Thomasa Willisa w 1664 roku. Jest to zespolenie krążeniowe zlokalizowane wokół skrzyżowania wzrokowego i podwzgórza, które można uznać za centralny węzeł dostarczający krew do mózgu i otaczających go struktur. Krew dostaje się do tej struktury przez tętnice szyjne wewnętrzne i kręgowe i wypływa z koła przez wewnętrzne tętnice środkowe i tylne tętnice mózgowe. Każda z tych tętnic ma lewą i prawą odnogę po obu stronach koła. Tętnice podstawne, po komunikacji i przednie tętnice komunikacyjne zamykają krąg (ryc. 1 i ryc. 2). Ryzyko upośledzenia przepływu krwi w którejkolwiek z tętnic odpływowych jest zminimalizowane przez zlewanie się krwi wchodzącej do kręgu z tętnic szyjnych i mózgowych, gwarantując w ten sposób dostarczenie wystarczającej ilości krwi do mózgu. Struktura ta służy również jako główna droga obocznego przepływu krwi w ciężkich chorobach okluzyjnych tętnicy szyjnej wewnętrznej.

Kilka rodzajów zaburzeń naczyniowo-mózgowych ma swoje źródło w krowie. Najczęstsze z nich to naczynia krwionośne związane z mózgową angiopatią amyloidową (CAA), miażdżyca tętnic wewnątrzczaszkowych i tętniaki wewnątrzczaszkowe. 1,2,3 Zaburzenia te mogą prowadzić do hipoperfuzji z powodu rozszerzenia naczyń krwionośnych oraz krwotoków śródmózgowych i/lub podpajęczynówkowych, co ostatecznie przekłada się na udary niedokrwienne lub krwotoczne lub, w najlepszym razie, przemijający atak niedokrwienny. Ostatnie postępy w procedurach diagnostycznych, w tym neuroobrazowaniu, prawdopodobnie w połączeniu z angiografią, umożliwiły kliniczne zdiagnozowanie tych głównych chorób naczyń mózgowych, bez konieczności biopsji mózgu. Niemniej jednak obecnie brakuje skutecznych i specyficznych metod leczenia (farmakologicznego lub wewnątrznaczyniowego) i w związku z tym istnieje potrzeba zdefiniowania nowych celów molekularnych.

Identyfikacja nowych celów leków do zapobiegania tym chorobom u ludzi będzie wymagała modeli zwierzęcych i sposobów izolowania naczyń mózgowych, w tym krowy. Takie modele powinny dostarczyć dowodów i wskazówek dotyczących konkretnych zmian, w tym zmian zapalnych, zachodzących w ścianach dużych naczyń w modelach zwierzęcych tętniaka tętnicy wewnątrzczaszkowej, CAA lub miażdżycy śródczaszkowej. 4,5,6

Ustaliliśmy metodę izolacji krowy myszy, aby ułatwić badania nad zapaleniem naczyń w chorobie Alzheimera (AD) i chorobach pokrewnych, takich jak CAA. Ta metoda izolowania myszy CoW została opracowana do oceny ekspresji genów zapalnych naczyń mózgowych podczas progresji choroby. Wraz z wykryciem odkładania się beta amyloidu w ścianach tętnic oponowo-rdzeniowych i pialnych, metoda ta może ułatwić określenie możliwego związku między ekspresją genów zapalnych w ścianie mózgowo-naczyniowej a akumulacją peptydu Aβ. Sieć naczyniowa mózgu, w tym opona mózgowo-rdzeniowa i opona mózgowo-rdzeniowa w przestrzeni podpajęczynówkowej, jest przedłużeniem dużych tętnic tworzących koło Willisa. Opisana tutaj metoda może być wykorzystana do wyizolowania krowy z dowolnej linii myszy i może być stosowana do wszystkich rodzajów badań przesiewowych (np. ekspresji genów, produkcji białek i potranslacyjnych modyfikacji białek) na dużych naczyniach mózgowo-naczyniowych myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami Wspólnoty Europejskiej dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych, za zgodą lokalnej komisji etyki ds. eksperymentów na zwierzętach (Ile de France-Paris-Committee, zezwolenie 4270).

1. Znieczulenie

  1. Przed zabiegiem podać dorosłym myszom dootrzewnowo letalną dawkę pentobarbitalu (do 1 mg/10 g masy ciała), używając igły 27G i strzykawki 1 ml.

2. Perfuzja naczynia

UWAGA: Podczas perfuzji naczyń nie ma potrzeby nakładania maści weterynaryjnej na oczy. Procedura ta jest szybka (5-10 minut) i kończy się śmiercią zwierzęcia. Potwierdź brak reakcji, uciskając palec u stopy.

  1. Za pomocą nożyczek irydowych należy wykonać nacięcie ściany brzucha i otrzewnej o długości około 4 cm, tuż poniżej klatki piersiowej.
  2. Należy wykonać niewielkie nacięcie (o długości kilku milimetrów) w przeponie, a następnie kontynuować nacinanie przepony wzdłuż całej klatki piersiowej, aby odsłonić jamę opłucnową.
  3. Należy unieść mostek i zacisnąć jego końcówkę hemostatem; hemostat należy umieścić na szyi. Ostrożnie należy wyciąć tkankę tłuszczową łączącą mostek z sercem.
  4. Należy wprowadzić igłę perfuzyjną o rozmiarze 15G przez lewą komorę do szczytu serca.
  5. Na koniec należy użyć nożyczek, aby wyciąć jeden z płatów wątroby w celu utworzenia otworu odpływowego.
    UWAGA: Alternatywny otwór odpływowy można utworzyć, wykonując nacięcie prawego przedsionka za pomocą nożyczek irydowych.
  6. Należy przeprowadzić perfuzję zwierzęcia 25 do 50 ml soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) za pomocą pompy pracującej z prędkością 2,5 ml/min. Wątroba powinna pobleknąć w miarę zastępowania krwi przez PBS.
  7. Po około pięciu minutach, gdy płyn wypływający z wątroby będzie całkowicie przejrzysty, należy przerwać perfuzję.
  8. W przypadku planowania immunobarwienia lub standardowego barwienia, należy przeprowadzić perfuzję zwierzęcia 50 ml paraformaldehydu (PFA; 4% w PBS) przez 15 min.
    UWAGA: Uwaga, opary PFA są toksyczne. Perfuzję zwierzęcia z użyciem PFA należy przeprowadzać w wentylowanej komorze z wyciągiem.

3. Izolacja mózgu i kręgu Willisa

  1. Izolacja mózgu
    1. Odetnij głowę za pomocą nożyczek chirurgicznych.
    2. Wykonaj nacięcie w linii środkowej nożyczkami irydologicznymi, wzdłuż skóry od szyi do nosa.
    3. Odetnij skórę, aby odsłonić czaszkę, a następnie usuń pozostałe mięśnie i tkankę tłuszczową za pomocą nożyczek irydowych.
    4. Wprowadź ostrą końcówkę nożyczek irydologicznych do otworu wielkiego czaszki z jednej strony, a następnie ostrożnie przesuń je wzdłuż wewnętrznej powierzchni czaszki w kierunku zewnętrznego przylepcatka (znanego również jako kanał słuchowy).
    5. Powtórzyć nacięcie opisane w punkcie 3.1.4 po stronie przeciwległej i wykonać cięcie w linii środkowej wzdłuż wewnętrznej powierzchni kości ciemieniowej aż do początku szwu strzałkowego.
    6. Wprowadź nożyczki irydologiczne w kość czołową, dokładnie pomiędzy oczy, w szew strzałkowy, a następnie otwórz je, aby rozdzielić czaszkę na dwie części.
    7. Wyjmij mózg, chwyćce cebulki węchowe i użyj nożyczek irydowych, aby przeciąć połączenia nerwowe na jego powierzchni brzusznej.
    8. Wyjąć mózg i umieścić go w 60-mm szalce Petri z lodowatym PBS w celu izolacji CoW. Całkowicie zanurzyć mózg w PBS. Jeśli mózg został utrwalony w 4% PFA (do późniejszego krojenia i immunobarwienia lub barwienia rutynowego), należy go przechowywać w kąpieli z 4% PFA w 4 °C przez 24 h.
  2. Izolacja kręgu Willisa
    UWAGA: Do izolacji CoW wymagany jest mikroskop stereoskopowy. Mózg należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez cały czas trwania procedury.
    1. Umieść mózg odwrócony do góry nogami (t. j. (na jego powierzchni grzbietowej) w celu wizualizacji CoW.
    2. Użyj małej pęsety, aby chwycić tętnice mózgu przednie (ACA) u podstawy płatów węchowych (a, Rycina 1) i wywrzeć nacisk, aby oddzielić je od ciągłości naczynia. Tą samą procedurą należy przeciąć tętnice mózgu środkowego (MCA) w b (Rysunek 1).
    3. Za pomocą ostrych końców pęsety unieś i usuń główne tętnice tworzące CoW z kory.
    4. Unieś początkowy odcinek tętnic komunikujących tylnych (PCA), aby odłączyć je od mózgowia, chwytając pęsetą tętnice środkowe mózgu (MCA). Chwyć tętnice przednie (ACA i MCA) i delikatnie przesuń je nad skrzyżowaniem wzrokowym w kierunku przednio-grzbietowym. Aby zapobiec przerwaniu ciągłości kręgu Willisa (CoW), przerwij procedurę, aby zająć się pozostałymi tętnicami.
    5. Powtórz kroki 3.2.2 i 3.2.3 dla górnej tętnicy móżdżkowej (SCA) i tylnej tętnicy mózgu (PCA) (c, Rycina 1) oraz dla tętnicy podstawnej (BA) (d, Rycina 1), pociągając je w kierunku grzbietowo-przednim. Należy zatrzymać się na etapie zakończenia procedury opisanej w punkcie 3.2.4.
    6. Usunąć całą korę węchową (CoW), delikatnie pociągając ją pęsetą. Umieścić CoW w 60-milimetrowej płytce Petriego wypełnionej lodowatym PBS i usunąć wszelką pozostałą przytwierdzoną tkankę mózgową za pomocą dwóch pęset, unieruchamiając CoW małymi szpilkami.
    7. Przechowywać pobrane CoW w temperaturze -80 °C do dalszej obróbki w celu oczyszczania RNA (ekstrakcja RNA pozwala na uzyskanie dużych ilości RNA — około 500 ng) lub ekstrakcji białek.
      Uwaga: CoW można utrzymać ex vivo przez 24 h, adaptując układ kąpieli organowej opracowany dla izolowanej tętnicy węchowej myszy. 7

Schemat okluzji tętnicy mózgowej z opisanymi tętnicami: ACA, MCA, PCA, SCA; w pobliżu znajduje się narzędzie chirurgiczne.
Rysunek 1: Schematyczny rysunek mózgu myszy w widoku brzusznym z zaznaczonym kręgiem Willisa (CoW). CoW jest tworzony przez dwie tętnice szyjne wewnętrzne (MCA), które wywodzą się z dwóch tętnic przednich mózgu (ACA); tętnica podstawna (BA) rozgałęzia się na tętnice tylne (PCA) i górne (SCA) mózgu oraz dwie tętnice kręgowe (VA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Myszy po perfuzji PBS uśmierca się, a CoW izoluje zgodnie z opisem w sekcji 3.2 protokołu. Przy prawidłowo wykonanej dyssekcji CoW powinna zostać wyjęta w jednym kawałku i powinna być lekko przezroczysta ze względu na brak resztek krwi w naczyniach krwionośnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisujemy tutaj powtarzalny protokół izolacji kręgu Willisa. Najczęstszymi zaburzeniami naczyniowo-mózgowymi z udziałem krowy są waskulopatie związane z CAA, miażdżyca tętnic wewnątrzczaszkowych i tętniak wewnątrzczaszkowy, z których wszystkie wpływają na ściany naczyń tętniczych. Czynniki ryzyka są dobrze znane, ale patogeneza molekularna tych zaburzeń mózgowych pozostaje słabo poznana i brakuje specyficznych markerów biologicznych do przewidywania ich wystąpienia. Istnieje duże zainteresowanie metodami izolowania krowy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Uniwersytet Paris VI i grant Pierre Fabre Innovation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSigma-AldrichD8537
Dumont #55 KleszczePrecyzyjne narzędzia naukowe11295-51
Hartowane nożyczki do drobnej tęczówki Nożyczki Fine Science Tools14090-11
- proste / ostre / ostre    Narzędzia naukowe 16,5 cm14002-16
Kleszcze do #7b Dumont Fine Science Tools11270-20
Stereoskopowy mikroskop zmiennoogniskowyNikonSMZ745T
CellBIND Powierzchnia 60 mm NaczynieCorning#3295
Pompa perystaltyczna - MINIPULS 3GilsonM312
Pentobarbital SodiqueCeva Santé AnimaleFR/V/2770465 3/1992
hodowlane

Bibliografia

  1. Beckmann, N., et al. Age-dependent cerebrovascular abnormalities and blood flow disturbances in APP23 mice modeling Alzheimer's disease. J Neurosci. 23 (24), 8453-8459 (2003).
  2. Sadasivan, C., Fiorella, D. J., Woo, H. H., Lieber, B. B. Physical factors effecting cerebral aneurysm pathophysiology. Ann Biomed Eng. 41 (7), 1347-1365 (2013).
  3. Ritz, K., Denswil, N., Stam, O., van Lieshout, J., Daemen, M. Cause and mechanisms of intracranial atherosclerosis. Circulation. 130 (16), 1407-1414 (2014).
  4. Tulamo, R., Frösen, J., Hernesniemi, J., Niemelä, M. Inflammatory changes in the aneurysm wall: a review. J Neurointerv Surg. 2 (2), 120-130 (2009).
  5. Yamada, M. Cerebral amyloid angiopathy: emerging concepts. J Stroke. 17 (1), 17-30 (2015).
  6. Oy, B. Intracranial atherosclerotic stroke: specific focus on the metabolic syndrome and inflammation. Curr Atheroscler Rep. 8 (4), 330-336 (2006).
  7. Lee, H. J., Dietrich, H. H., Han, B. H., Zipfel, G. J. Development of an ex vivo model for the study of cerebrovascular function utilizing isolated mouse olfactory artery. J Korean Neurosurg Soc. 57 (1), 1-5 (2015).
  8. Hosaka, K., Downes, D. P., Nowicki, K. W., Hoh, B. L. Modified murine intracranial aneurysm model: aneurysm formation and rupture by elastase and hypertension. J Neurointerv Surg. 6 (6), 474-479 (2013).
  9. Gauthier, S. A., Sahoo, S., Jung, S. S., Levy, E. Murine cerebrovascular cells as a cell culture model for cerebral amyloid angiopathy: isolation of smooth muscle and endothelial cells from mouse brain. Methods Mol Biol. 849, 261-274 (2012).
  10. Choi, S., Kim, J., Kim, K., Suh, S. Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice. Korean J Physiol Pharmacol. 19 (1), 35-42 (2015).
  11. Peters, D. G., Kassam, A. B., Yonas, H., O'Hare, E. H., Ferrell, R. E., Brufsky, A. M. Comprehensive transcript analysis in small quantitiesof mRNA by SAGE-Lite. Nucleic Acids Res. 27 (24), (1999).
  12. Badhwar, A. Stanimirovic, Hamel, & Haqqani The proteome of mouse cerebral arteries. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (6), 1033-1046 (2014).
  13. Castro, L., Brito, M., et al. Striatal neurones have a specific ability to respond to phasic dopamine release. J Physiol. 591 (13), 3197-3214 (2013).
  14. Hübscher, D., Nikolaev, V. Generation of transgenic mice expressing FRET biosensors. Methods Mol Biol. 1294, 117-129 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

uk ad naczyniowy m zgu myszyizolacja naczysekcja m zgutechnika perfuzjimarkery mi ni g adkichg adka mi ni wka naczyniowano yczki irydowesekcja p setperfuzja PBS
Protokół izolowania mysiego kręgu Willisa
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.