Artykuł metodologiczny

Protokół izolowania mysiego kręgu Willisa

DOI:

10.3791/54352

⸱

22 października 2016

 ,  , 
1UPMC Univ Paris 06, Sorbonne Universités

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj powtarzalny protokół izolowania mysiego kręgu Willisa.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mózgowy krąg tętniczy (circulus arteriosus cerebri) lub krąg Willisa (CoW) to zespolenie krążeniowe otaczające skrzyżowanie wzrokowe i podwzgórze, które dostarcza krew do mózgu i otaczających go struktur. Jest zaangażowany w kilka zaburzeń naczyniowo-mózgowych, w tym unaczynienie związane z mózgową angiopatią amyloidową (CAA), miażdżycę wewnątrzczaszkową i tętniaki wewnątrzczaszkowe. Badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tych chorób w celu identyfikacji nowych celów leków w celu ich zapobiegania wymagają modeli zwierzęcych. Niektóre z tych modeli mogą być transgeniczne, podczas gdy inne będą obejmować izolację naczyń mózgowych, w tym CoW.Opisana tutaj metoda jest odpowiednia do izolacji CoW w każdej linii myszy i ma znaczny potencjał w badaniach przesiewowych (ekspresja genów, produkcja białek, potranslacyjne modyfikacje białek, analiza sekretomu itp.) na dużych naczyniach mózgowo-naczyniowych myszy. Może być również stosowany do badań ex vivo, poprzez adaptację systemu kąpieli narządowej opracowanego dla izolowanych tętnic węchowych myszy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mózgowy krąg tętniczy (circulus arteriosus cerebri), znany również jako okrąg Willisa (CoW), pętla wielokąta Willisora) został po raz pierwszy opisany przez Thomasa Willisa w 1664 roku. Jest to zespolenie krążeniowe zlokalizowane wokół skrzyżowania wzrokowego i podwzgórza, które można uznać za centralny węzeł dostarczający krew do mózgu i otaczających go struktur. Krew dostaje się do tej struktury przez tętnice szyjne wewnętrzne i kręgowe i wypływa z koła przez wewnętrzne tętnice środkowe i tylne tętnice mózgowe. Każda z tych tętnic ma lewą i prawą odnogę po obu stronach koła. Tętnice podstawne, po komunikacji i przednie tętnice komunikacyjne zamykają krąg (ryc. 1 i ryc. 2). Ryzyko upośledzenia przepływu krwi w którejkolwiek z tętnic odpływowych jest zminimalizowane przez zlewanie się krwi wchodzącej do kręgu z tętnic szyjnych i mózgowych, gwarantując w ten sposób dostarczenie wystarczającej ilości krwi do mózgu. Struktura ta służy również jako główna droga obocznego przepływu krwi w ciężkich chorobach okluzyjnych tętnicy szyjnej wewnętrznej.

Kilka rodzajów zaburzeń naczyniowo-mózgowych ma swoje źródło w krowie. Najczęstsze z nich to naczynia krwionośne związane z mózgową angiopatią amyloidową (CAA), miażdżyca tętnic wewnątrzczaszkowych i tętniaki wewnątrzczaszkowe. 1,2,3 Zaburzenia te mogą prowadzić do hipoperfuzji z powodu rozszerzenia naczyń krwionośnych oraz krwotoków śródmózgowych i/lub podpajęczynówkowych, co ostatecznie przekłada się na udary niedokrwienne lub krwotoczne lub, w najlepszym razie, przemijający atak niedokrwienny. Ostatnie postępy w procedurach diagnostycznych, w tym neuroobrazowaniu, prawdopodobnie w połączeniu z angiografią, umożliwiły kliniczne zdiagnozowanie tych głównych chorób naczyń mózgowych, bez konieczności biopsji mózgu. Niemniej jednak obecnie brakuje skutecznych i specyficznych metod leczenia (farmakologicznego lub wewnątrznaczyniowego) i w związku z tym istnieje potrzeba zdefiniowania nowych celów molekularnych.

Identyfikacja nowych celów leków do zapobiegania tym chorobom u ludzi będzie wymagała modeli zwierzęcych i sposobów izolowania naczyń mózgowych, w tym krowy. Takie modele powinny dostarczyć dowodów i wskazówek dotyczących konkretnych zmian, w tym zmian zapalnych, zachodzących w ścianach dużych naczyń w modelach zwierzęcych tętniaka tętnicy wewnątrzczaszkowej, CAA lub miażdżycy śródczaszkowej. 4,5,6

Ustaliliśmy metodę izolacji krowy myszy, aby ułatwić badania nad zapaleniem naczyń w chorobie Alzheimera (AD) i chorobach pokrewnych, takich jak CAA. Ta metoda izolowania myszy CoW została opracowana do oceny ekspresji genów zapalnych naczyń mózgowych podczas progresji choroby. Wraz z wykryciem odkładania się beta amyloidu w ścianach tętnic oponowo-rdzeniowych i pialnych, metoda ta może ułatwić określenie możliwego związku między ekspresją genów zapalnych w ścianie mózgowo-naczyniowej a akumulacją peptydu Aβ. Sieć naczyniowa mózgu, w tym opona mózgowo-rdzeniowa i opona mózgowo-rdzeniowa w przestrzeni podpajęczynówkowej, jest przedłużeniem dużych tętnic tworzących koło Willisa. Opisana tutaj metoda może być wykorzystana do wyizolowania krowy z dowolnej linii myszy i może być stosowana do wszystkich rodzajów badań przesiewowych (np. ekspresji genów, produkcji białek i potranslacyjnych modyfikacji białek) na dużych naczyniach mózgowo-naczyniowych myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami Wspólnoty Europejskiej dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, za zgodą lokalnej komisji etycznej ds. doświadczeń na zwierzętach (Ile de France-Paris-Committee, Autoryzacja 4270).

1. Znieczulenie

  1. Śmiertelny dawkę pentobarbitalu (do 1 mg/10 g masy ciała) należy podać dootrzewnowo (igła 27 G i strzykawka 1 ml) dorosłym myszom przed operacją.

2. Perfuzja naczynia

UWAGA: Nie ma potrzeby nakładania maści weterynaryjnej na oczy podczas perfuzji naczyń. Ta procedura jest szybka (5-10 minut) i kończy się śmiercią zwierzęcia. Potwierdź brak odpowiedzi szczyptaniem palca u nogi.

  1. Za pomocą nożyczek do tęczówki wykonaj nacięcie o długości około 4 cm w ścianie brzucha i otrzewnej, tuż pod klatką piersiową.
  2. Wykonaj małe nacięcie (o długości kilku milimetrów) w przeponie, a następnie kontynuuj nacięcie przepony na całej długości klatki piersiowej, aby odsłonić jamę opłucnej.
  3. Podnieś mostek i zaciśnij końcówkę mostka hemostatem; umieść hemostat na szyi. Ostrożnie przyciąć tkankę tłuszczową łączącą mostek z sercem.
  4. Przełóż igłę perfuzyjną o rozmiarze 15 przez lewą komorę do wierzchołka serca.
  5. Na koniec użyj nożyczek, aby przeciąć jeden z płatów wątroby, aby stworzyć ujście.
    UWAGA: Alternatywny ujść można utworzyć, używając nożyczek do tęczówki, aby wykonać nacięcie w prawym przedsionku.
  6. Przeprowadzić perfuzję zwierzęcia za pomocą 25 do 50 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) za pomocą pompy działającej z szybkością 2,5 ml/min. Wątroba powinna zblednąć, gdy krew zostanie zastąpiona PBS.
  7. Po około pięciu minutach, gdy płyn z wątroby jest całkowicie czysty, przerwij perfuzję.
  8. Jeśli planowane jest barwienie immunologiczne lub regularne barwienie, należy przeprowadzić perfuzję zwierzęcia z 50 ml paraformaldehydu (PFA; 4% w PBS) przez 15 min.
    UWAGA, opary PFA są toksyczne. Perfuzję zwierzęcia z PFA należy przeprowadzić w wentylowanym dygestorium.

3. Izolacja mózgu i kręgu Willisa

  1. Izolacja mózgu
    1. Zdejmij głowę nożyczkami chirurgicznymi.
    2. Wykonaj nacięcie linii środkowej nożyczkami do tęczówki, wzdłuż skóry od szyi do nosa.
    3. Odetnij skórę, aby odsłonić czaszkę i usuń wszelkie resztki mięśni i tkanki tłuszczowej za pomocą nożyczek do tęczówki.
    4. Umieść ostry koniec nożyczek tęczówki w otworze wielkim z jednej strony i ostrożnie przesuń je wzdłuż wewnętrznej powierzchni czaszki do zewnętrznego przewodu słuchowego (znanego również jako przewód słuchowy).
    5. Odtworzyć nacięcie opisane w ppkt 3.1.4 po stronie przeciwnej i wykonać cięcie linii środkowej wzdłuż wewnętrznej powierzchni kości międzyciemieniowej do początku szwu strzałkowego.
    6. Posadź nożyczki tęczówki w kości czołowej, tuż między oczami, w szwie strzałkowym, a następnie otwórz je, aby podzielić czaszkę na dwie części.
    7. Podnieś mózg, chwytając za opuszki węchowe i używając nożyczek do tęczówki, aby odciąć połączenia nerwowe na jego brzusznej powierzchni.
    8. Usuń mózg i umieść go na 60-milimetrowej szalce Petriego zawierającej lodowaty PBS do izolacji krów. Całkowicie zanurz mózg w PBS. Jeśli mózg został utrwalony za pomocą 4% PFA (w celu późniejszego cięcia i barwienia immunologicznego lub regularnego barwienia), trzymaj go w kąpieli z 4% PFA w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.
  2. Izolacja kręgu Willisa
    UWAGA: Do izolacji krów wymagany jest mikroskop preparacyjny. Mózg powinien być utrzymywany w temperaturze 4 °C przez cały czas trwania zabiegu.
    1. Połóż mózg do góry nogami (tj. na jego grzbietowej powierzchni), aby uwidocznić krowę.
    2. Użyj małych kleszczy, aby chwycić przednie tętnice mózgowe (ACA) u podstawy płatów węchowych (a, ryc. 1) i wywrzeć nacisk, aby oddzielić je od kontinuum naczynia. Użyj tej samej procedury, aby przeciąć tętnice środkowe mózgu (MCA) w b (ryc. 1).
    3. Użyj ostrych końców kleszczy, aby podnieść i usunąć główne tętnice tworzące krowę z kory.
    4. Podnieś początek tylnych tętnic komunikacyjnych (PCA), aby odłączyć je od mózgu, chwytając środkowe tętnice mózgowe (MCA) kleszczami. Podnieś tętnice przednie (ACA i MCA) i delikatnie przeciągnij je przez skrzyżowanie wzrokowe w kierunku przednio-grzbietowym. Aby zapobiec zakłóceniu pracy krowy, przerwij procedurę, aby poradzić sobie z innymi tętnicami.
    5. Powtórz kroki 3.2.2 i 3.2.3 dla tętnic móżdżkowych górnych i tylnych (SCA)/(PCA) (c, ryc. 1) oraz dla tętnicy podstawnej (BA) (d, ryc. 1), ciągnąc je w kierunku grzbietowo-przednim. Zatrzymać się na końcu procedury opisanej w ppkt 3.2.4.
    6. Usuń całą krowę, delikatnie ciągnąc kleszczami. Umieść krowę na 60-milimetrowej szalce Petriego wypełnionej lodowatym PBS i usuń pozostałą tkankę mózgową za pomocą dwóch kleszczy, przytrzymując krowę na miejscu za pomocą małych szpilek.
    7. Utrzymuj zebraną krowę w temperaturze -80 °C do późniejszego przetwarzania w celu oczyszczenia RNA (ekstrakcja RNA daje duże ilości RNA - około 500 ng) lub ekstrakcji białka.
      Uwaga: Krowa może być utrzymywana ex vivo przez 24 godziny, poprzez dostosowanie systemu kąpieli narządowej opracowanego dla izolowanej tętnicy węchowej myszy. 7

figure-protocol-1
Ryc. 1: Schemat ideowy przedstawiający widok brzuszny mózgu myszy z podkreśleniem krowy. Krowa powstaje z dwóch tętnic szyjnych wewnętrznych (MCA), które pochodzą z dwóch przednich tętnic mózgowych (ACA); tętnica podstawna (BA) rozgałęzia się na tętnice mózgowe tylne (PCA) i górne (SCA) oraz dwie tętnice kręgowe (VA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mysz z perfuzją PBS jest zabijana, a krowa izolowana zgodnie z opisem w sekcji 3.2 protokołu. Gdy sekcja zostanie wykonana prawidłowo, krowa powinna wyjść w jednym kawałku i powinna być lekko przezroczysta ze względu na brak resztkowej krwi w układzie krwionośnym.

figure-results-1
Rysunek 2: Mysia krowa po izolacji. (A) Przegląd krowy na 10-ce...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj powtarzalny protokół izolacji kręgu Willisa. Najczęstszymi zaburzeniami naczyniowo-mózgowymi z udziałem krowy są waskulopatie związane z CAA, miażdżyca tętnic wewnątrzczaszkowych i tętniak wewnątrzczaszkowy, z których wszystkie wpływają na ściany naczyń tętniczych. Czynniki ryzyka są dobrze znane, ale patogeneza molekularna tych zaburzeń mózgowych pozostaje słabo poznana i brakuje specyficznych markerów biologicznych do przewidywania ich wystąpienia. Istnieje duże zainteresowanie metodami izolowania krowy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Uniwersytet Paris VI i grant Pierre Fabre Innovation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSigma-AldrichD8537
Dumont #55 KleszczePrecyzyjne narzędzia naukowe11295-51
Hartowane nożyczki do drobnej tęczówki Nożyczki Fine Science Tools14090-11
- proste / ostre / ostre    Narzędzia naukowe 16,5 cm14002-16
Kleszcze do #7b Dumont Fine Science Tools11270-20
Stereoskopowy mikroskop zmiennoogniskowyNikonSMZ745T
CellBIND Powierzchnia 60 mm NaczynieCorning#3295
Pompa perystaltyczna - MINIPULS 3GilsonM312
Pentobarbital SodiqueCeva Santé AnimaleFR/V/2770465 3/1992
hodowlane

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beckmann, N., et al. Age-dependent cerebrovascular abnormalities and blood flow disturbances in APP23 mice modeling Alzheimer's disease. J Neurosci. 23 (24), 8453-8459 (2003).
  2. Sadasivan, C., Fiorella, D. J., Woo, H. H., Lieber, B. B. Physical factors effecting cerebral aneurysm pathophysiology. Ann Biomed Eng. 41 (7), 1347-1365 (2013).
  3. Ritz, K., Denswil, N., Stam, O., van Lieshout, J., Daemen, M. Cause and mechanisms of intracranial atherosclerosis. Circulation. 130 (16), 1407-1414 (2014).
  4. Tulamo, R., Frösen, J., Hernesniemi, J., Niemelä, M. Inflammatory changes in the aneurysm wall: a review. J Neurointerv Surg. 2 (2), 120-130 (2009).
  5. Yamada, M. Cerebral amyloid angiopathy: emerging concepts. J Stroke. 17 (1), 17-30 (2015).
  6. Oy, B. Intracranial atherosclerotic stroke: specific focus on the metabolic syndrome and inflammation. Curr Atheroscler Rep. 8 (4), 330-336 (2006).
  7. Lee, H. J., Dietrich, H. H., Han, B. H., Zipfel, G. J. Development of an ex vivo model for the study of cerebrovascular function utilizing isolated mouse olfactory artery. J Korean Neurosurg Soc. 57 (1), 1-5 (2015).
  8. Hosaka, K., Downes, D. P., Nowicki, K. W., Hoh, B. L. Modified murine intracranial aneurysm model: aneurysm formation and rupture by elastase and hypertension. J Neurointerv Surg. 6 (6), 474-479 (2013).
  9. Gauthier, S. A., Sahoo, S., Jung, S. S., Levy, E. Murine cerebrovascular cells as a cell culture model for cerebral amyloid angiopathy: isolation of smooth muscle and endothelial cells from mouse brain. Methods Mol Biol. 849, 261-274 (2012).
  10. Choi, S., Kim, J., Kim, K., Suh, S. Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice. Korean J Physiol Pharmacol. 19 (1), 35-42 (2015).
  11. Peters, D. G., Kassam, A. B., Yonas, H., O'Hare, E. H., Ferrell, R. E., Brufsky, A. M. Comprehensive transcript analysis in small quantitiesof mRNA by SAGE-Lite. Nucleic Acids Res. 27 (24), (1999).
  12. Badhwar, A. Stanimirovic, Hamel, & Haqqani The proteome of mouse cerebral arteries. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (6), 1033-1046 (2014).
  13. Castro, L., Brito, M., et al. Striatal neurones have a specific ability to respond to phasic dopamine release. J Physiol. 591 (13), 3197-3214 (2013).
  14. Hübscher, D., Nikolaev, V. Generation of transgenic mice expressing FRET biosensors. Methods Mol Biol. 1294, 117-129 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

uk ad naczyniowy m zgu myszyizolacja naczysekcja m zgutechnika perfuzjimarkery mi ni g adkichg adka mi ni wka naczyniowano yczki irydowesekcja p setperfuzja PBS

Powiązane artykuły