Przygotowanie i zastosowanie organotypowych kultur grasicy w warstwach

Podsumowanie

Opisujemy przygotowanie wycinków grasicy, które w połączeniu z cytometrią przepływową mogą być użyte do modelowania pozytywnej i negatywnej selekcji rozwijających się limfocytów T. Plastry grasicy można również przystosować do analizy in situ migracji, lokalizacji i sygnalizacji tymocytów za pomocą immunofluorescencji i mikroskopii dwufotonowej.

Streszczenie

Selekcja grasicy przebiega w unikalnym i wysoce zorganizowanym mikrośrodowisku grasicy, co prowadzi do powstania funkcjonalnego, samotolerancyjnego repertuaru limfocytów T. Modele in vitro do badania zaangażowania i rozwoju linii T dostarczyły cennych informacji na temat tego procesu. Jednak systemy te nie mają pełnego trójwymiarowego środowiska grasicy niezbędnego do rozwoju limfocytów T, a zatem są niekompletnymi przybliżeniami selekcji grasicy in vivo. Niektóre z wyzwań związanych z modelowaniem rozwoju limfocytów T można przezwyciężyć poprzez zastosowanie modeli in situ, które zapewniają nienaruszone mikrośrodowisko grasicy, które w pełni wspiera selekcję grasicy rozwijających się komórek T. Organotypowe hodowle plastrów grasicy uzupełniają istniejące techniki in situ. Plastry grasicy zachowują integralność obszarów kory grasicy i rdzenia oraz stanowią platformę do badania rozwoju nałożonych tymocytów o określonym stadium rozwojowym lub endogennych limfocytów T w dojrzałym mikrośrodowisku grasicy. Biorąc pod uwagę możliwość generowania ~20 wycinków na mysz, wycinki grasicy stanowią wyjątkową zaletę pod względem skalowalności w przypadku eksperymentów o wysokiej przepustowości. Co więcej, względna łatwość generowania wycinków grasicy i możliwość nakładania różnych podzbiorów grasicy lub innych populacji komórek z różnych środowisk genetycznych zwiększa wszechstronność tej metody. W tym miejscu opisano protokół przygotowania plastrów grasicy, izolacji i nakładania tymocytów oraz dysocjacji plastrów grasicy do analizy cytometrii przepływowej. System ten można również dostosować do badania niekonwencjonalnego rozwoju limfocytów T, a także do wizualizacji migracji tymocytów, interakcji komórek tymocyt-zręb oraz sygnałów TCR związanych z selekcją grasicy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Wprowadzenie

Limfocyty T różnicują się poprzez szereg pośrednich procesów rozwojowych w grasicy, podczas których napotykają kilka punktów kontrolnych, które zapewniają wytworzenie funkcjonalnego, samotolerancyjnego repertuaru limfocytów T^1-3. Selekcja pozytywna sprzyja przetrwaniu tymocytów z receptorami limfocytów T (TCR) zdolnymi do rozpoznawania, z niskim lub umiarkowanym powinowactwem, peptydu prezentowanego przez główne cząsteczki kompleksu zgodności tkankowej (MHC) na komórkach nabłonka grasicy korowej (cTEC)^2,3. Selekcja negatywna i rozwój regulatorowych limfocytów T (_{T reg}) przyczyniają się do ustanowienia samotolerancji poprzez eliminację ....

Protokół

Protokoły wszystkich badań na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami w Centre de recherche - Hôpital Maisonneuve-Rosemont.

1. Zbieranie grasicy myszy w celu przygotowania plastrów grasicy i zawiesin jednokomórkowych

1. Poddaj mysz eutanazji za pomocą CO₂ , a następnie zwichnięciu szyjki macicy.
2. W kapturze z przepływem laminarnym przypnij mysz brzuszną stroną do deski preparucyjnej. Spryskaj mysz 70% etanolem. Usuń nadmiar alkoholu, przecierając go gazą, aby zapobiec przedostawaniu się etanolu do jamy klatki piersiowej i uszkodzeniu tkanki.
3. Podnieś skórę u podstawy mostka za pomocą kleszc....

Wyniki

Przekroje grasicy umożliwiają analizę różnych aspektów rozwoju limfocytów T, takich jak selekcja pozytywna i negatywna. Dla powodzenia eksperymentów kluczowa jest jakość przekroju grasicy. W związku z tym należy zbadać przekroje grasicy, aby upewnić się, że tkanka grasicy jest nienaruszona, a otaczający ją agar pozostaje w całości (Rycina 1A). Uszkodzenie agaru może zaburzyć napięcie powierzchniowe, co prowadzi do znacznego zmniejszenia liczby tymocytów m.......

Dyskusja

W tym miejscu opisano protokół przygotowania plastrów grasicy i reprezentatywne wyniki skutecznej pozytywnej i ujemnej selekcji nałożonych na siebie transgenicznych tymocytów TCR klasy I ograniczonych przed selekcją MHC za pomocą cytometrii przepływowej. System ten został wykorzystany z podobnym powodzeniem do wspierania pozytywnej selekcji limfocytów T CD4 ⁺ z ograniczeniami MHC klasy II z preselekcji tymocytów DP³² oraz, w obecności antygenu agonistycznego, selekcji negatywnej i rozwoju T_reg<.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Vibratome	Leica Biosystems	VT1000S
NuSieve GTG Agaroza	Lonza	50080	Agaroza o niskiej temperaturze topnienia
Forma do zatapiania (ścięta - T12)	Polietyleny	18986	22 mm x 22 mm kwadrat, ścięty do 12 mm x 12 mm
Ostrza przygotowawcze z podwójną krawędzią	Personna	74-0002
Klej do tkanek	3M	1469SB
0,4 i mikro; m Wkładki do hodowli komórkowych	BD Falcon	353090	Spośród kilku testowanych marek, te utrzymywały komórki na wierzchu plastrów najlepsze
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco	ThermoFisher	21600-010
RPMI-1640 z L-glutaminą	Żubr	350-000-CL
Płodowa surowica bydlęca Żubr		080-110	Inaktywowana termicznie
L-glutamina, 200 mM	Żubr	609-065-EL
Penicylina/Streptomycyna, 100x	Żubr	450-201-EL
2-Merkaptoetanol	Alfa Aesar	A15890
15 ml Młynki do tkanek Tenbroeck	Wheaton	357426
Dostawa komponentów	z siatki nylonowej	U-CMN-255
Tłuczek do mikrowirówki	Bel-Art	F19922-0000
40 i mikro; m Nylonowy sitko komórkowe	BD Falcon	352340
Kleszcze Inox Tip	Dumont	RS-5047	Kleszcze zakrzywione z cienką końcówką, rozmiar .17 x .10 mm
Mikrokleszcze	Dumont	Złącze RS-5090

filtra