Artykuł metodologiczny

Opracowanie systemu kohodowli inkubacyjnej dwóch typów komórek przy braku kontaktu komórka-komórka

DOI:

10.3791/54356

⸱

17 lipca 2016

 , 
1Dept. of Medical Biology, University of Québec

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W organizmach wielokomórkowych wydzielane rozpuszczalne czynniki wywołują reakcje różnych typów komórek w wyniku sygnalizacji parakrynnej. Systemy kohodowli typu insert oferują prosty sposób oceny zmian, w których pośredniczą wydzielane czynniki rozpuszczalne przy braku kontaktu komórka-komórka.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rola wydzielanych rozpuszczalnych czynników w modyfikacji odpowiedzi komórkowych jest powtarzającym się tematem w badaniach wszystkich tkanek i układów. Próbując wyjaśnić bardzo złożone relacje między kilkoma podtypami komórkowymi, z których składają się organizmy wielokomórkowe, opracowano techniki in vitro, które pomagają naukowcom w zdobyciu szczegółowego zrozumienia populacji pojedynczych komórek. Jedna z tych technik wykorzystuje wkładki z przepuszczalną membraną, która umożliwia dyfuzję wydzielanych rozpuszczalnych czynników. W ten sposób populacja komórek hodowanych we wstawkach może być hodowana wspólnie w studzience lub naczyniu zawierającym inny typ komórki w celu oceny zmian komórkowych po sygnalizacji parakrynnej przy braku kontaktu komórka-komórka. Takie systemy kohodowli inkubacyjnej mają różne zalety w porównaniu z innymi technikami kohodowli, a mianowicie sygnalizację dwukierunkową, zachowaną polaryzację komórek i wykrywanie zmian komórkowych specyficzne dla populacji. Oprócz tego, że są wykorzystywane w dziedzinie zapalenia, raka, angiogenezy i różnicowania, te systemy kohodowli mają pierwszorzędne znaczenie w badaniu skomplikowanych relacji, które istnieją między różnymi podtypami komórkowymi obecnymi w ośrodkowym układzie nerwowym, szczególnie w kontekście zapalenia nerwów. W artykule przedstawiono ogólne wskazówki metodologiczne w celu przeprowadzenia eksperymentu w celu oceny zmian komórkowych, w których pośredniczą wydzielane czynniki rozpuszczalne, przy użyciu systemu kohodowli insertowej. Co więcej, szczegółowo oceniony zostanie szczegółowy protokół pomiaru neurozapalnego wpływu cytokin wydzielanych przez mikroglej N9 aktywowany lipopolisacharydem na neuronalne komórki PC12, co pozwoli na konkretne zrozumienie metodologii kohodowli insertowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie tkanek, organów lub systemów in vitro jest próbą uproszczenia bardzo skomplikowanych relacji istniejących między kilkoma podtypami komórek, które składają się na organizmy wielokomórkowe. Rzeczywiście, badania in vitro umożliwiają szczegółowe zrozumienie populacji pojedynczych komórek. Istnieją dwie główne zalety przeprowadzania eksperymentów in vitro: 1) zmniejszone interakcje komórkowe oraz 2) możliwość łatwego manipulowania środowiskiem komórkowym. W związku z tym te dwie zalety pozwoliły naukowcom przewidzieć zachowanie określonych typów komórek in vivo, co doprowadziło do zdolności do regulowania wyników wpływów zewnętrznych w całych organizmach. W tym sensie hodowla komórkowa in vitro często działa jako pomost łączący podstawowe i stosowane nauki przyrodnicze. Niemniej jednak istnieje również kilka wad pracy in vitro, z których najważniejszą jest to, że pewne zastrzeżenie może dotyczyć fizjologicznego znaczenia obserwowanych fenotypów. Rzeczywiście, gdy pojedynczy typ komórki jest hodowany w naczyniu, kultura traci, w różnym stopniu, swoje połączenia komórka-komórka z innymi typami komórek, swój wkład w środowisko humoralne z tkanki i organizmu, z którego pochodzi, oraz kotwice w tkance, które umożliwiły jej utrzymanie określonej trójwymiarowej struktury, czasami kluczowej dla funkcjonowania komórki.

Kwestia relacji komórka-komórka została rozwiązana dzięki rozwojowi technik hodowli mieszanej. W tej metodzie dwie lub więcej populacji komórek jest hodowanych razem w tym samym naczyniu hodowlanym. Jednak te mieszane kultury niosą ze sobą poważne niedogodności. Z jednej strony niektóre podtypy komórek nie oddziałują fizycznie ze sobą w tkance pochodzenia i polegają wyłącznie na komunikacji parakrynnej podtrzymywanej przez wydzielane czynniki rozpuszczalne i pobliskie receptory. Dzieje się tak w przypadku kilku procesów zapalnych, które zależą od sygnalizacji cytokin proksymalnych. W kulturach mieszanych interakcje fizyczne są nieuniknione i uniemożliwiają badanie komunikacji parakrynnej przy braku kontaktów komórka-komórka, które mogą dawać zmienione wyniki. Z drugiej strony, uzyskanie interpretacji specyficznych dla komórek w mieszanej populacji staje się niewykonalne bez zastosowania ostrych technik separacji, które mogą znacząco wpłynąć na wyniki.

Aby rozwiązać te ważne problemy, opracowano technikę pozwalającą na dzielenie kultur na przedziały i badanie sygnalizacji parakrynnej. Metoda ta polega na przeniesieniu supernatantu jednego typu komórki, nazwanego w ten sposób pożywką kondycjonowaną, do studzienek zawierających inną populację komórek. Jednak ważną wadą jest to, że krótkotrwałe cząsteczki nie przeżywają wystarczająco długo w kondycjonowanym pożywce, aby mogły zostać przeniesione do studzienek drugiej populacji komórek. Nawet długożyciowe cząsteczki z czasem ulegną znacznemu rozcieńczeniu z powodu dyfuzji. Co więcej, obie populacje komórek uczestniczą tylko w jednokierunkowej komunikacji parakrynnej, a nie w aktywnej komunikacji dwukierunkowej. Prowadzi to do braku sygnalizacji sprzężenia zwrotnego, która jest niezbędna do odtworzenia dokładnych relacji wielokomórkowych, jakie istnieją in vivo.

W konsekwencji i kierując się potrzebą lepszego symulowania pierwotnych warunków in vivo w środowisku komórkowym in vitro, na przestrzeni lat osiągnięto kilka postępów w technikach hodowli komórkowych. Jednym z najbardziej znaczących osiągnięć było zastosowanie przepuszczalnych nośników z mikroporowatymi membranami do podziału kultur komórkowych, zastosowanych po raz pierwszy przez Grobsteina w 1953roku1. Takie przepuszczalne podpory zostały na przestrzeni lat dostosowane do wielu typów komórek i mogą być używane w kilku różnych zastosowaniach. Obecnie podpory te istnieją jako puste wkładki, które są zaprojektowane tak, aby spoczywały w studzienkach z wielodołkowej płytki do hodowli tkankowej lub w okrągłych naczyniach. W systemie kohodowli wkładka zawiera jeden typ komórek, podczas gdy studzienka lub szalka zawiera drugą populację komórkową, co pozwala na zbadanie wpływu dwóch różnych populacji komórek na ich środowisko humoralne (ryc. 1). W rezultacie zachowana jest polaryzacja komórkowa (wydzielanie podstawno-boczne i wierzchołkowe lub odbiór sygnału), co daje systemom kohodowli indukcyjnej ważną przewagę nad kulturami mieszanymi i technikami kondycjonowanych pożywek. Dostępnych jest kilka rodzajów materiałów membranowych, z których najpopularniejsze to poliester (PET), poliwęglan (PC) lub politetrafluoroetylen pokryty kolagenem (PTFE) i występują one w różnych rozmiarach porów od 0,4 μm do 12,0 μm. Te różnorodność materiałów i rozmiarów porów oferuje spektrum wkładek o zmiennych cechach związanych z właściwościami optycznymi, grubością membrany i przyleganiem komórek, co czyni je praktycznymi na różnych poziomach w następujących zastosowaniach, między innymi:
-badanie różnicowania komórek, rozwoju embrionalnego, przerzutów nowotworowych i gojenia się ran za pomocą testów chemotaktycznych przez przepuszczalne błony;
-ocena przenikania leków poprzez ocenę ich transportu przez monowarstwy nabłonkowe lub śródbłonkowe hodowane na przepuszczalnych nośnikach, i;
-wykonywanie kokultur komórkowych w celu analizy modulacji zachowania komórek indukowanych przez wydzielane czynniki rozpuszczalne przy braku kontaktu komórka-komórka.

Celem tego artykułu jest opisanie ogólnych wytycznych metodologicznych do spełnienia trzeciej funkcji opisanej powyżej, czyli oceny zmian komórkowych, w których pośredniczą wydzielane czynniki rozpuszczalne przy braku kontaktu komórka-komórka przy użyciu systemu kohodowli insertowej. W kilku różnych dziedzinach badań wykorzystuje się systemy kohodowli inkubacyjnych w celu uzyskania odpowiedzi na pytania dotyczące wpływu wydzielanych czynników rozpuszczalnych na populacje komórek. Rzeczywiście, sygnalizacja parakrynna, która moduluje zachowanie komórkowe na różnych poziomach, jest istotna we wszystkich tkankach i układach, co sprawia, że systemy kohodowli indukcyjnej są niezbędne do zapewnienia postępów w tych dziedzinach. I odwrotnie, zastosowanie wkładek może potwierdzić, że transdukcja sygnału odbywa się przez bezpośredni kontakt komórka-komórka, a nie przez wydzielane czynniki. Jednym z najważniejszych zastosowań insertów są badania stanu zapalnego2-14, w których ocenia się wpływ wydzielanych cytokin na różne komórkowe czynniki odporności. W szczególności badania nad stanem zapalnym w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) przyniosły ogromne korzyści z badań nad współhodowlą inkubacyjną, które pozwoliły lepiej zdefiniować odrębne role parakrynne neuronów i mikrogleju w napędzaniu zapalenia układu nerwowego15-21. Systemy te zostały również opracowane w celu zbadania potencjału przeciwzapalnego cząsteczek, który opiera się na ich zdolności do zmniejszania lub hamowania wydzielania czynników prozapalnych22-26. Badania dotyczące nowotworów27-31, w szczególności mechanizmy leżące u podstaw angiogenezy32-34 i stanu zapalnego35-42 w nowotworzenia, również korzystają z systemów kohodowli inkubowanych. Co więcej, czynniki rozpuszczalne mają pierwszorzędne znaczenie w procesach, które napędzają różnicowanie, a w kilku badaniach wykorzystano wstawki, aby odpowiedzieć na pytania w tej konkretnej dziedzinie43-50. W OUN, ponieważ tkanka nerwowa ma bardzo ograniczony potencjał odnawiania, badanie neurotrofizmu i neuroprotekcji ma fundamentalne znaczenie i zostało szeroko zapewnione dzięki zastosowaniu komórek macierzystych w systemach kohodowli51-56. Ponadto wstawki są również wykorzystywane w tak różnych dziedzinach, jak nefrologia57,58, interakcje śródbłonka i angiogeneza59-62, sygnalizacja apoptozy63-65, zapalenie w otyłości i zespole metabolicznym22,23,66-67, ochrona komórek rzęsatych ucha wewnętrznego68,69, a nawet w zjadliwości grzybów70,71 i parazytologia72,73.

Ten artykuł oferuje ogólne wytyczne metodologiczne w celu przeprowadzenia eksperymentu w celu oceny zmian komórkowych, w których pośredniczą wydzielane rozpuszczalne czynniki za pomocą systemu kohodowli insertowej. W szczególności skupimy naszą uwagę na kokulturach komórek nerwowych i ich zastosowaniach w badaniu procesu neurozapalnego. Biorąc pod uwagę bardzo szerokie spektrum eksperymentów, które umożliwiają pilotowanie za pomocą wstawek, nie do zniesienia jest objęcie każdego aspektu tej techniki hodowli komórkowej. Na przykład szczegółowo oceniony zostanie konkretny protokół pomiaru wpływu cytokin wydzielanych przez mikroglej N9 aktywowany lipopolisacharydem (LPS) na neuronalne komórki PC12, oferując konkretne zrozumienie metodologii kohodowli insercyjnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Każdy z poniższych kroków powinien być wykonywany w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym, tak jak jest to wymagane do hodowli komórek ssaków. Ponadto obowiązują ogólne wytyczne dotyczące optymalnej hodowli komórek sterylnych, np. wyrzucanie końcówek za każdym razem, gdy mogą prowadzić do zanieczyszczenia krzyżowego, skrócenie czasu wystawiania komórek na działanie powietrza podczas wykonywania całkowitej wymiany pożywki, prawidłowe, ale delikatne mieszanie wszystkich zawiesin komórek w celu zapewnienia ich jednorodnego pipetowania itp. Co więcej, wkładki są rodzajem wyrobów z tworzyw sztucznych, które wymagają specjalnego obchodzenia się. Po pierwsze, za każdym razem, gdy manipuluje się wkładkami, unikaj dotykania delikatnej membrany, która łatwo się rozrywa i może w ten sposób zagrozić eksperymentowi. Nie nadaje się również do zasysania próżniowego pożywki do hodowli komórkowych, ponieważ istnieje ryzyko perforacji błony lub dysocjacji przylegających komórek. Następnie wkładki zwisają luźno na wielodołkowej płytce do hodowli tkankowej, dlatego należy zachować ostrożność podczas przenoszenia plastiku lub pipetowania, aby uniknąć dysocjacji przylegających komórek. Ponadto, w przypadku stosowania wkładek o dużych rozmiarach porów, istnieje możliwość, że pożywka do hodowli komórkowych przesiąka przez membranę, dlatego ważne jest częste monitorowanie poziomu cieczy. Na koniec należy zauważyć, że poniższy protokół jest przeznaczony dla komórek przylegających i wymaga niewielkich modyfikacji, aby był odpowiedni dla komórek zawiesinowych.

1. Ogólne wytyczne dotyczące przeprowadzania eksperymentów z kokulturą wstawiania

  1. Komora wysiewająca typu #1 we wkładkach
    1. Rozpakuj wkładki z opakowania.
    2. Umieścić wkładki na pustej wielodołkowej płytce do hodowli tkankowej o odpowiednim wymiarze. W tym celu chwyć za pomocą pęsety górną krawędź wkładki.
    3. Aby poprawić przyczepianie i rozprzestrzenianie się przylegających komórek, przed wysiewem należy kondycjonować wkładki pożywką do hodowli komórkowych. W tym celu należy pokryć całą powierzchnię membrany pożywką do hodowli komórkowych za pomocą mikropipety.
      UWAGA: Zrób to dla tylu wkładek, ile jest to wymagane.
    4. Założyć pokrywkę na płytkę i inkubować przez co najmniej 1 godzinę lub O/N w tych samych warunkach (zwykle 37°C, 5-10% CO2 ).
    5. Po kondycjonowaniu wkładek należy usunąć całą pożywkę z hodowli komórkowych za pomocą mikropipety. Wyrzuć zużyte podłoże.
    6. Komórka nasienna typu #1 w pożywce do hodowli świeżych komórek w taki sam sposób, jak na płytce wielodołkowej. W tym celu należy pobrać odpowiednią objętość zawiesiny komórek za pomocą mikropipety i dozować płyn do wkładu.
      UWAGA: Przygotuj tyle wkładek, ile potrzeba.
    7. Po wysianiu wszystkich wkładek delikatnie kołysz płytką w lewo i w prawo, a następnie w przód i w tył, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Unikaj wykonywania ruchów okrężnych, ponieważ spowoduje to gromadzenie się komórek w środku wkładek.
    8. Umieść pokrywkę na płytce i inkubuj zgodnie z wymaganiami komórkowymi (zwykle 37°C, 5-10% CO2 ).
  2. Komórka wysiewająca typu #2 w wielodołkowych płytkach do kultur tkankowych
    1. Komórka nasienna typu #2 w pożywce do hodowli świeżych komórek zgodnie z sekcją 1.
    2. Przygotuj tyle dołków, ile jest wymagane dla liczby wkładek. Kołysz płytką jak w kroku 1.1.7), aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w studzienkach.
    3. Umieść pokrywkę na szalce i inkubuj w tych samych warunkach (zwykle 37°C, 5-10% CO2 ).
  3. Odświeżający medium we wkładkach
    1. Za pomocą mikropipety usunąć część lub całość pożywki do hodowli komórkowych z wkładek zawierających komórki typu #1. Wyrzuć zużyte podłoże.
    2. Pobrać odpowiednią objętość świeżej pożywki do hodowli komórkowych. Delikatnie oprzyj końcówkę na wewnętrznej ściance wkładu i powoli dozuj pożywkę do hodowli komórkowych.
    3. Umieścić pokrywkę na płytce i inkubować zgodnie z krokiem 1.1.4.
  4. Pożywka odświeżająca na wielodołkowych płytkach do hodowli tkankowych
    1. Za pomocą mikropipety usuń część lub całość pożywki do hodowli komórkowych z dołków zawierających komórki typu #2. Wyrzuć zużyte podłoże.
    2. Pobrać odpowiednią objętość świeżej pożywki do hodowli komórkowych. Oprzyj końcówkę na wewnętrznej ścianie studzienki i powoli dozuj pożywkę do hodowli komórkowych.
    3. Umieścić pokrywkę na płytce i inkubować zgodnie z wcześniej ustalonymi protokołami hodowli komórkowych.
  5. Przenoszenie wkładek zawierających typ komórki #1 na wielodołkowe płytki do hodowli tkankowych zawierające typ komórki #2.
    UWAGA: Wykonaj ten krok, gdy oba typy komórek osiągną odpowiedni etap wzrostu.
    1. Przed przeniesieniem wkładek do studzienek należy dokonać wszelkich niezbędnych zmian podłoża, jak opisano wcześniej w krokach 1.3) i 1.4).
      UWAGA: W tym momencie ważne jest, aby dozować odpowiednie objętości nośnika w obu komorach, zgodnie z instrukcjami producenta wkładu.
    2. Za pomocą pęsety chwyć za górną krawędź wkładki zawierającej komórkę typu #1 i delikatnie umieść ją w odpowiednim dołku zawierającym komórkę typu #2.
    3. Po przeniesieniu wszystkich wkładek sprawdź, czy pod membraną wkładek nie ma pęcherzyków powietrza.
      UWAGA: Pęcherzyki powietrza zapobiegają jakiejkolwiek wymianie w poprzek membrany wkładki i mogą zagrozić całemu eksperymentowi.
    4. Jeśli obecne są pęcherzyki powietrza, bardzo delikatnie wyjmij wkładkę ze studzienki za pomocą pęsety i zanurz ją z powrotem w pożywce do hodowli komórkowych. Bąbelki znikną. Jeśli są nadal obecne, spróbuj delikatnie zanurzyć wkładki z powrotem w pożywce do hodowli komórkowej pod kątem.
      UWAGA: Nie uderzaj ani nie mieszaj wkładek, aby uniknąć dysocjacji przylegających komórek.
    5. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza i sprawdzeniu, czy objętość pożywki w obu komorach, przykryj pokrywką płytkę i rozpocznij inkubację.
  6. Pożywki odświeżające w systemie kohodowli
    UWAGA: Chociaż membrana z łatwością umożliwia wymianę mediów między wkładką a studnią, odświeżanie pożywki odbywa się w obu komorach, ponieważ czas wymagany do osiągnięcia równowagi w górnej i dolnej komorze przez samą dyfuzję może być dość długi.
    1. Odświeżanie podłoża we wstawkach zawierających typ komórki #1 odbywa się w taki sam sposób, jak w kroku 1.3).
    2. Aby odświeżyć pożywkę w studzienkach zawierających komórkę typu #2, delikatnie przesuń wkładkę na bok, aby utworzyć przestrzeń wystarczająco szeroką, aby pomieścić końcówkę pipety. Odśwież nośnik jak w kroku 1.4).
    3. Sprawdź, czy nie ma pęcherzyków powietrza i sprawdź objętości zgodnie z krokami od 1.5.3) do 1.5.5).

2. Przykład: pomiar wpływu cytokin wydzielanych przez aktywowany przez LPS mikroglej N9 na neuronalne komórki PC12

UWAGA: Poniższe kroki są przeznaczone dla określonych rozmiarów kolb, studzienek i naczyń. Protokół można jednak dostosować do dowolnych wymiarów wyrobów z tworzyw sztucznych. Aby zapoznać się z mediami i kompozycją, patrz tabela materiałów.

  1. Wysiew i różnicowanie komórek PC12 na wielodołkowych płytkach do hodowli tkankowych
    1. Ciepła, rutynowa pożywka do hodowli komórkowych PC12, pożywka różnicująca PC12 i trypsyna-EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37°C.
    2. Użyj komórek PC12 przy 60-80% zbiegu z kolby o średnicy 75cm2.
    3. Za pomocą pipety Pasteura o średnicy 15 mm przeprowadzić aspirację próżniową całej pożywki do hodowli komórkowych w kolbie.
    4. Delikatnie przepłukać monowarstwę komórek 5 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym i usunąć płyn pipetą Pasteura. Uważaj, aby na tym etapie nie dysocjować komórek.
    5. Przykryj monowarstwę komórek 3 ml trypsyny-EDTA i inkubuj przez 2-3 minuty w temperaturze 37°C.
    6. Upewnij się, że wszystkie komórki są odłączone pod mikroskopem. Jeśli na wodzie unosi się bardzo mało komórek, inkubuj przez dłuższy czas, maksymalnie 5 minut.
    7. Dodać 10 ml rutynowej pożywki do hodowli komórek PC12 w celu inaktywacji trypsyny-EDTA.
    8. Za pomocą pipety o pojemności 10 ml delikatnie rozcierać, upewniając się, że większość komórek jest oddzielona od dna kolby. Należy unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza w zawiesinie komórek.
    9. Za pomocą tej samej pipety o pojemności 10 ml przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
    10. Wirować przez 1 minutę przy 3 200 x g
    11. Odrzucić supernatant za pomocą pipety Pasteura, uważając, aby nie naruszyć osadu.
    12. Dodać 10 ml rutynowej pożywki do hodowli komórkowych PC12 za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
      UWAGA: Objętość tę można regulować, jeśli granulka jest niezwykle mała lub duża.
    13. Rozetrzeć tą samą pipetą o pojemności 10 ml w celu homogenizacji osadu. Komórki PC12 często zlepiają się ze sobą, więc konieczne jest co najmniej 20 pipetowania w górę i w dół.
      UWAGA: Chociaż konieczne jest energiczne rozcieranie, należy unikać tworzenia pęcherzyków powietrza w zawiesinie komórek.
    14. W probówce o pojemności 1,5 ml przygotować odpowiednie rozcieńczenie zawiesiny komórek w błękicie trypanowym. Policz komórki za pomocą hemocytometru zgodnie z wcześniej ustalonymi protokołami74.
    15. W oddzielnej probówce o pojemności 50 ml podzielić zawiesinę komórek za pomocą pożywki różnicującej PC12, aby uzyskać rozcieńczoną zawiesinę komórkową odpowiednią do wysiewu ze studzienek z płytki 24-dołkowej (30 000 ¢/cm2, 0,6 ml na studzienkę zgodnie z protokołem producenta).
      UWAGA: Płytka 24-dołkowa musi być wcześniej pokryta kolagenem, zgodnie z wcześniej ustalonymi protokołami75.
    16. Rozprowadzić 0,6 ml zawiesiny komórek w każdym dołku za pomocą mikropipety.
    17. Gdy wszystkie dołki zostaną wysiane, kołysz płytą, jak w kroku 1.1.7).
    18. Aby umożliwić prawidłowe różnicowanie komórek PC12, przed przeprowadzeniem eksperymentów z hodowlą należy inkubować płytki 24-dołkowe przez 7-9 dni w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w pożywce różnicującej PC1215,16.
    19. Zmiany podłoża należy wykonywać co drugi dzień, usuwając połowę płynu i zastępując go równą objętością świeżej pożywki różnicującej PC12.
  2. Wysiew mikrogleju N9 we wkładkach i zaprawianie LPS
    1. Na jeden dzień przed przeprowadzeniem eksperymentów z jednoczesną hodowlą, należy wstępnie potraktować wkładki PTFE o porach 0,4 μm rutynową pożywką do hodowli komórkowych N9, aby zoptymalizować przyleganie komórek, wykonując kroki od 1.1.1) do 1.1.4)
    2. Ciepła pożywka do hodowli komórkowych N9 i trypsyna-EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37°C.
    3. W międzyczasie odważyć około 10 mg LPS w probówce o pojemności 1,5 ml do późniejszego wykorzystania.
      UWAGA: Ponieważ LPS jest silną endotoksyną prozapalną i wymaga szczególnych środków ostrożności, zdecydowanie zaleca się noszenie okularów, rękawic i respiratora cząstek stałych.
    4. Użyj komórek N9 przy 80-90% zbiegu z kolby o średnicy75 cm2.
    5. Wykonaj kroki od 2.1.3) do 2.1.14). Zawsze używaj rutynowej pożywki do hodowli komórkowych N9 zamiast rutynowej pożywki do hodowli komórkowych PC12. Należy również zauważyć, że mikroglej N9 nie zlepia się ze sobą tak bardzo jak komórki PC12, więc na kroku 2.1.13 może być konieczne mniej pipetowania w górę i w dół).
    6. W oddzielnej probówce o pojemności 50 ml podzielić zawiesinę komórek za pomocą pożywki do hodowli komórkowych N9, aby uzyskać rozcieńczoną zawiesinę komórkową odpowiednią do wkładek wysiewających przeznaczonych do przechowywania w płytkach 24-dołkowych (60 000 ¢/cm2, 0,05 ml na wkładkę zgodnie z protokołem producenta, dla powierzchni membrany patrz informacje producenta).
      UWAGA: Wkładki te są już pokryte kolagenem przez producenta i są zoptymalizowane pod kątem adhezji komórek.
    7. Rozprowadzić 0,05 ml zawiesiny komórek na wkładkę za pomocą mikropipety.
    8. Gdy wszystkie wkładki zostaną wysiane, kołysz płytką jak w kroku 1.1.7).
    9. Przeprowadzić seryjne rozcieńczenia LPS przy użyciu pożywki zabiegowej N9 w celu uzyskania roztworów roboczych 4 μg/ml, 2 μg/ml i 1 μg/ml.
    10. Odmierzyć pipetą 0,05 ml roztworu roboczego o stężeniu 4 μg/ml w jednym zestawie wkładek w celu uzyskania końcowego rozcieńczenia 2 μg/ml.
    11. Powtórzyć krok 2.2.10) dla pozostałych dwóch roztworów roboczych w różnych zestawach wkładek, uzyskując końcowe rozcieńczenia odpowiednio 1 μg/ml i 0,5 μg/ml.
    12. Inkubować płytki zawierające wstawki przez 24 godziny w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 , aby umożliwić aktywację mikrogleju N9 za pomocą LPS przed przeprowadzeniem eksperymentów z kokulturą.
  3. Współhodowla neuronalnych komórek PC12 z mikroglejem N9
    1. Po 7-9 dniach różnicowania komórek PC12 aktywuj mikroglej N9 po 24 godzinach inkubacji z LPS za pomocą ciepłej pożywki zabiegowej N9 i pożywki PC12 w łaźni wodnej o temperaturze 37°C.
    2. Przeprowadzić całkowitą zmianę pożywki dla mikrogleju N9, jak w kroku 1.3), zastępując całą użytą pożywkę 0,1 ml pożywki N9 poddawanej zabiegowi. Zrób to dla każdej wkładki. Jest to konieczne, aby usunąć wszelkie ślady LPS, pozostawiając we wkładkach tylko aktywowany mikroglej N9.
    3. Wykonaj całkowitą zmianę pożywki dla neuronalnych komórek PC12, jak w kroku 1.4). Przenieść wkładki do płytek 24-dołkowych, jak w kroku 1.5). Inkubować kokultury N9-PC12 przez 24 godziny lub 48 godzin w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 .
    4. Po 24 godzinach lub 48 godzinach należy pobrać supernatant i/lub komórki pod kątem cytotoksyczności, testu immunoenzymatycznego (ELISA), Western blot lub innych testów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użycie systemów współhodowli insertów jest szczególnie istotne w badaniu procesów neurozapalnych, które pokazują relacje parakrynne między różnymi graczami komórkowymi OUN. Odporność w OUN jest osiągana głównie przez komórki rezydentne zwane mikroglejem, które monitorują swoje środowisko w stanie spoczynku rozgałęzionym (ryc. 2A) i są zdolne do wyczuwania zakłóceń, które mogą zakłócić bardzo cenną homeostazę niezbędną do prawidłowego funkcjonowania neuronów76-78

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najbardziej krytycznym krokiem każdego eksperymentu z systemem kohodowli wkładek jest wybór odpowiedniej wkładki do użycia. Należy dokładnie wziąć pod uwagę wielkość porów i materiał błony, nie zapominając o rozważeniu rodzaju komórek, które zostaną wysiane, oraz celu eksperymentu. Na przykład testy chemotaksyjne mogą wykorzystywać ten sam rodzaj błony, co kokultury komórkowe do analizy modulacji zachowania komórek indukowanych przez wydzielane rozpuszczalne czynniki przy braku kontaktu komórka-komórka. Jednak oba rodzaj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana z grantu Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Canada dla MGM. JR jest stypendystą NSERC-Vanier.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RPMI-1640 średniSigmaR8755Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Mieszanina pożywki i składników odżywczych F-12 SzynkaSigmaD6421Ciepła w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem musi być uzupełniona 0,365 gm/L L-glutaminą
Serum dla koniATCC30-2040Ciepłe w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem
Płodowa surowica bydlęcaMultiCell80350Ciepła w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem
Nerve Growth Factor-7S z mysiego gruczołu podszczękowegoSigmaN0513Rozpuść liofilizowany proszek w roztworze buforowanej soli fizjologicznej lub pożywce do hodowli tkankowej zawierającej 0,1– 1,0% albumina surowicy bydlęcej lub 1-10%
roztwór trypsyny-EDTASigmaT3924Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem
Lipopolisacharydy z  Escherichia coli  055:B5SigmaL2880
Wkładki do hodowli komórek toksycznych do stosowania z płytkami 24-dołkowymiBD Falcon3530950,4 i mu; m pores
24-dołkowe płytkiTrueLineTR5002Płaszcz z kolagenem przed użyciem
Pożywka do hodowli komórkowych Routine PC12 Pożywkahodowli komórkowych Routine N9
            85% RPMI średnie-            90% DMEM-F12 średni-
            10% inaktywowana termicznie surowica-            10% inaktywowana termicznie surowica końska
-            5% inaktywowana termicznie płodowa surowica
PC12 pożywkaróżnicująca N9 pożywka
zabiegowa-              99% RPMI średnie-            99% DMEM-F12 średni-
              1% inaktywowana termicznie płodowa surowica-            1% inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca
-              50 ng / ml czynnik
PC12 pożywka
zabiegowa-              99% RPMI średnie
-              1% inaktywowana termicznie płodowa surowica
w surowicy do - końskabydlęca bydlęcawzrostu nerwów bydlęca

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172 (4384), 869-870 (1953).
  2. Hoffman, R. A. Intraepithelial lymphocytes coinduce nitric oxide synthase in intestinalepithelial cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 278 (6), G886-G894 (2000).
  3. Zhang, W. C., et al. Regulatory T cells protect fine particulate matter-induced inflammatory responses in human umbilical vein endothelial cells. Mediators Inflamm. 2014, 869148(2014).
  4. Vasileiadou, K., et al. alpha1-Acid glycoprotein production in rat dorsal air pouch in response to inflammatory stimuli, dexamethasone and honey bee venom. Exp. Mol. Pathol. 89 (1), 63-71 (2010).
  5. Talayev, V. Y., et al. The effect of human placenta cytotrophoblast cells on the maturation and T cell stimulating ability of dendritics cells in vitro. Clin. Exp. Immunol. 162 (1), 91-99 (2010).
  6. Elishmereni, M., et al. Physical interactions between mast cells and eosinophils: a novel mechanism enhancing eosinophil survival in vitro. Allergy. 66 (3), 376-385 (2011).
  7. Ishihara, Y., et al. Regulation of immunoglobulin G2 production by prostaglandin E(2) and platelet-activating factor. Infect. Immun. 68 (3), 1563-1568 (2000).
  8. Kranzer, K., Bauer, M., Lipford, G. B., Heeg, K., Wagner, H., Lang, R. CpG-oligodeoxynucleotides enhance T-cell receptor-triggered interferon- gamma production and up-regulation of CD69 via induction of antigen- presenting cell-derived interferon type I and interleukin-12. Immunology. 99 (2), 170-178 (2000).
  9. Vendetti, S., Chai, J. G., Dyson, J., Simpson, E., Lombardi, G., Lechler, R. Anergic T cells inhibit the antigen-presenting function of dendritic cells. J. Immunol. 165 (3), 1175-1181 (2000).
  10. Haller, D., Bode, C., Hammes, W. P., Pfeifer, A. M., Schiffrin, E. J., Blum, S. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
  11. Dono, M., et al. In vitro stimulation of human tonsillar subepithelial B cells: requirement for interaction with activated T cells. Eur. J. Immunol. 31 (3), 752-756 (2001).
  12. Yu, Y., et al. Enhancement of human cord blood CD34+ cell-derived NK cell cytotoxicity by dendritic cells. J. Immunol. 166 (3), 1590-1600 (2001).
  13. Watanabe, T., Tokuyama, S., Yasuda, M., Sasaki, T., Yamamoto, T. Changes of tissue factor-dependent coagulant activity mediated by adhesion between polymorphonuclear leukocytes and endothelial cells. Jpn J. Pharmacol. 86 (4), 399-404 (2001).
  14. Krampera, M., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide. Blood. 101 (9), 3722-3729 (2003).
  15. Bournival, J., Plouffe, M., Renaud, J., Provencher, C., Martinoli, M. G. Quercetin and sesamin protect dopaminergic cells from MPP+-induced neuroinflammation in a microglial (N9)-neuronal (PC12) coculture system. Oxid. Med. Cell. Longev. 2012, 921941(2012).
  16. Bureau, G., Longpré, F., Martinoli, M. G. Resveratrol and quercetin, two natural polyphenols, reduce apoptotic neuronal cell death induced by neuroinflammation. J. Neurosci. Res. 86 (2), 403-410 (2008).
  17. Zhu, L., Bi, W., Lu, D., Zhang, C., Shu, X., Lu, D. Luteolin inhibits SH-SY5Y cell apoptosis through suppression of the nuclear transcription factor-κB, mitogen-activated protein kinase and protein kinase B pathways in lipopolysaccharide-stimulated cocultured BV2 cells. Exp. Ther. Med. 7 (5), 1065-1070 (2014).
  18. Luo, X., et al. BV2 enhanced the neurotrophic functions of mesenchymal stem cells after being stimulated with injured PC12. Neuroimmunomodulation. 16 (1), 28-34 (2009).
  19. Polazzi, E., Gianni, T., Contestabile, A. Microglial cells protect cerebellar granule neurons from apoptosis: evidence for reciprocal signaling. Glia. 36 (3), 271-280 (2001).
  20. Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid precursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synaptic function. J. Neurochem. 76 (3), 846-854 (2001).
  21. Zujovic, V., Taupin, V. Use of cocultured cell systems to elucidate chemokine-dependent neuronal/microglial interactions: control of microglial activation. Methods. 29 (4), 345-350 (2003).
  22. Iwashita, M., et al. Valsartan, independently of AT1 receptor or PPARγ, suppresses LPS-induced macrophage activation and improves insulin resistance in cocultured adipocytes. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 302 (3), E286-E296 (2012).
  23. Oliver, E., et al. Docosahexaenoic acid attenuates macrophage-induced inflammation and improves insulin sensitivity in adipocytes-specific differential effects between LC n-3 PUFA. J. Nutr. Biochem. 23 (9), 1192-1200 (2012).
  24. Tang, S. Y., Cheah, I. K., Wang, H., Halliwell, B. Notopterygium forbesii Boiss extract and its active constituent phenethyl ferulate attenuate pro-inflammatory responses to lipopolysaccharide in RAW 264.7 macrophages. A "protective" role for oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (8), 1473-1482 (2009).
  25. De Boer, A. A., Monk, J. M., Robinson, L. E. Docosahexaenoic acid decreases pro-inflammatory mediators in an in vitro murine adipocyte macrophage co-culture model. PLoS One. 9 (1), e85037(2014).
  26. Li, Y., Liu, L., Barger, S. W., Mrak, R. E., Griffin, W. S. Vitamin E suppression of microglial activation is neuroprotective. J. Neurosci. Res. 66 (2), 163-170 (2001).
  27. Brizuela, L., et al. Osteoblast-derived sphingosine 1-phosphate to induce proliferation and confer resistance to therapeutics to bone metastasis-derived prostate cancer cells. Mol. Oncol. 8 (7), 1181-1195 (2014).
  28. Yuan, L., Chan, G. C., Fung, K. L., Chim, C. S. RANKL expression in myeloma cells is regulated by a network involving RANKL promoter methylation, DNMT1, microRNA and TNFα in the microenvironment. Biochim. Biophys. Acta. 1843, 1834-1838 (2014).
  29. Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98 (21), 12072-12077 (2001).
  30. Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E., Jacobs, I. J., Dafou, D., Gayther, S. A. Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer. Neoplasia. 12 (4), 317-325 (2010).
  31. Liu, J., et al. BCR-ABL mutants spread resistance to non-mutated cells through a paracrine mechanism. Leukemia. 22 (4), 791-799 (2008).
  32. Giuliani, N., et al. Proangiogenic properties of human myeloma cells: production of angiopoietin-1 and its potential relationship to myeloma-induced angiogenesis. Blood. 102 (2), 638-645 (2003).
  33. Gupta, D., et al. Adherence of multiple myeloma cells to bone marrow stromal cells upregulates vascular endothelial growth factor secretion: therapeutic applications. Leukemia. 15 (12), 1950-1961 (2001).
  34. Anderson, I. C., Mari, S. E., Broderick, R. J., Mari, B. P., Shipp, M. A. The angiogenic factor interleukin 8 is induced in non-small cell lung cancer/pulmonary fibroblast cocultures. Cancer Res. 60 (2), 269-272 (2000).
  35. Hoechst, B., et al. A new population of myeloid-derived suppressor cells in hepatocellular carcinoma patients induces C4(+)CD25(+)Foxp3(+) T cells. Gastroenterology. 135 (1), 234-243 (2008).
  36. Karadag, A., Oyajobi, B. O., Apperley, J. F., Russell, R. G., Croucher, P. I. Human myeloma cells promote the production of interleukin 6 by primary human osteoblasts. Br. J. Haematol. 108 (2), 383-390 (2000).
  37. Garrido, S. M., Appelbaum, F. R., Willman, C. L., Banker, D. E. Acute myeloid leukemia cells are protected from spontaneous and drug- induced apoptosis by direct contact with a human bone marrow stromal cell line (HS-5). Exp. Hematol. 29 (4), 448-457 (2001).
  38. Heissig, B., Pasternak, G., Horner, S., Schwerdtfeger, R., Rossol, S., Hehlmann, R. CD14+ peripheral blood mononuclear cells from chronic myeloid leukemia and normal donors are inhibitory to short- and long-term cultured colony-forming cells. Leuk. Res. 24 (3), 217-231 (2000).
  39. Moore, M. B., Kurago, Z. B., Fullenkamp, C. A., Lutz, C. T. Squamous cell carcinoma cells differentially stimulate NK cell effector functions: the role of IL-18. Cancer Immunol Immunother. 52 (2), 107-115 (2003).
  40. Giuliana, N., et al. Human myeloma cells stimulate the receptor activator of nuclear factor- kappa B ligand (RANKL) in T lymphocytes: a potential role in multiple myeloma bone disease. Blood. 100 (13), 4615-4621 (2002).
  41. Ye, Z., Haley, S., Gee, A. P., Henslee-Downey, P. J., Lamb, L. S. Jr In vitro interactions between gamma deltaT cells, DC, and CD4+ T cells; implications for the immunotherapy of leukemia. Cytotherapy. 4 (3), 293-304 (2002).
  42. Zhang, X. M., Xu, Q. Metastatic melanoma cells escape from immunosurveillance through the novel mechanism of releasing nitric oxide to induce dysfunction of immunocytes. Melanoma Res. 11 (6), 559-567 (2001).
  43. Zhang, M., et al. The differentiation of human adipose-derived stem cells towards a urothelium-like phenotype in vitro and the dynamic temporal changes of related cytokines by both paracrine and autocrine signal regulation. PLoS One. 9 (4), e95583(2014).
  44. Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
  45. Krassowska, A., et al. Promotion of haematopoietic activity in embryonic stem cells by the aorta-gonad-mesonephros microenvironment. Exp. Cell. Res. 312 (18), 3595-3603 (2006).
  46. Darcy, K. M., et al. Mammary fibroblasts stimulate growth, alveolar morphogenesis, and functional differentiation of normal rat mammary epithelial cells. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36 (9), 578-592 (2000).
  47. Spector, J. A. Co-culture of osteoblasts with immature dural cells causes an increased rate and degree of osteoblast differentiation. Plast. Reconstr. Surg. 109 (2), 631-642 (2002).
  48. Khanolkar, A., Fu, Z., Underwood, L. J., Bondurant, K. L., Rochford, R., Cannon, M. J. CD4+ T cell-induced differentiation of EBV-transformed lymphoblastoid cells is associated with diminished recognition by EBV-specific CD8+ cytotoxic T cells. J. Immunol. 170 (6), 3187-3194 (2003).
  49. Fritsch, C. Epimorphin expression in intestinal myofibroblasts induces epithelial morphogenesis. J. Clin. Invest. 110 (11), 1629-1641 (2002).
  50. Abouelfetouh, A., Kondoh, T., Ehara, K., Kohumra, E. Morphological differentiation of bone marrow stromal cells into neuron-like cells after co-culture with hippocampal slice. Brain Res. 1029 (1), 114-119 (2004).
  51. Llado, J., Haenggeli, C., Maragakis, N., Snyder, E., Rothstein, J. Neural stem cells protect against glutamate-induced excitotoxicitiy and promote survival of injured motor neurons through the secretion of neurotrophic factors. Mol. Cell. Neurosci. 27 (3), 322-331 (2004).
  52. Fong, S. P., et al. Trophism of neural progenitor cells to embryonic stem cells: Neural induction and transplantation in a mouse ischemic stroke model. J. Neurosci. Res. 85 (9), 1851-1862 (2007).
  53. Gordon-Keylock, S. A., et al. Induction of hematopoietic differentiation of mouse embryonic stem cells by an AGM-derived stromal cell line is not further enhanced by overexpression of HOXB4. Stem Cells. 19 (11), 1687-1698 (2010).
  54. Yang, T., Tsang, K. S., Poon, W. S., Ng, H. K. Neurotrophism of bone marrow stromal cells to embryonic stem cells: noncontact induction and transplantation to a mouse ischemic stroke model. Cell transplant. 18 (4), 391-404 (2009).
  55. Kim, J. Y., et al. Umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect amyloid-β42 neurotoxicity via paracrine. World J. Stem Cells. 4 (11), 110-116 (2012).
  56. Mauri, M., et al. Mesenchymal stem cells enhance GABAergic transmission in co-cultured hippocampal neurons. Mol. Cell Neurosci. 49 (4), 395-405 (2012).
  57. Ichikawa, J., et al. Increased crystal-cell interaction in vitro under co-culture of renal tubular cells and adipocytes by in vitro co-culture paracrine systems simulating metabolic syndrome. Urolithiasis. 42 (1), 17-28 (2014).
  58. Zuo, L., et al. A Paracrine mechanism involving renal tubular cells, adipocytes and macrophages promotes kidney stone formation in a simulated metabolic syndrome environment. J. Urol. 191 (6), 1906-1912 (2014).
  59. Fan, W., Zheng, J. J., McLaughlin, B. J. An in vitro model of the back of the eye for studying retinal pigment epithelial-choroidal endothelial interactions. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 38 (4), 228-234 (2002).
  60. Mierke, C. T., Ballmaier, M., Werner, U., Manns, M. P., Welte, K., Bischoff, S. C. Human endothelial cells regulate survival and proliferation of human mast cells. J. Exp. Med. 192 (6), 801-811 (2000).
  61. Beckner, M. E., Jagannathan, S., Peterson, V. A. Extracellular angio-associated migratory cell protein plays a positive role in angiogenesis and is regulated by astrocytes in coculture. Microvasc. Res. 63 (3), 259-269 (2002).
  62. Damon, D. H. VSM growth is stimulated in sympathetic neuron/VSM cocultures: role of TGF-beta2 and endothelin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 278 (2), H404-H411 (2000).
  63. Anna De Berardinis, M., Ciotti, M. T., Amadoro, G., Galli, C., Calissano, P. Transfer of the apoptotic message in sister cultures of cerebellar neurons. Neuroreport. 12 (10), 2137-2140 (2001).
  64. Lange-Sperandio, B., Fulda, S., Vandewalle, A., Chevalier, R. L. Macrophages induce apoptosis in proximal tubule cells. Pediatr. Nephrol. 18 (4), 335-341 (2003).
  65. Vjetrovic, J., Shankaranarayanan, P., Mendoza-Parra, M. A., Gronemeyer, H. Senescence-secreted factors activate Myc and sensitize pretransformed cells to TRAIL-induced apoptosis. Aging Cell. 13 (3), 487-496 (2014).
  66. Fujiya, A., et al. The role of S100B in the interaction between adipocytes and macrophages. Obesity (Silver Spring). 22 (2), 371-379 (2014).
  67. Suganami, T., Nishida, J., Ogawa, Y. A paracrine loop between adipocytes and macrophages aggravates inflammatory changes: role of free fatty acids and tumor necrosis factor alpha. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 25 (10), 2062-2068 (2005).
  68. Yoshida, A., Kitajiri, S., Nakagawa, T., Hashido, K., Inaoka, T., Ito, J. Adipose tissue-derived stromal cells protect hair cells from aminoglycoside. Laryngoscope. 121 (6), 1281-1286 (2011).
  69. May, L. A., et al. Inner ear supporting cells protect hair cells by secreting HSP70. J. Clin. Invest. 123 (8), 3577-3587 (2013).
  70. Jarosz, L. M., Deng, D. M., vander Mei, H. C., Crielaard, W., Krom, B. P. Streptococcus mutans competence-stimulating peptide inhibits Candida albicans hypha formation. Eukaryot Cell. 8 (11), 1658-1664 (2009).
  71. Dagenais, T. R., Giles, S. S., Aimanianda, V., Latgé, J. P., Hull, C. M., Keller, N. P. Aspergillus fumigatus LaeA-mediated phagocytosis is associated with a decreased hydrophobin layer. Infect. Immun. 78 (2), 823-829 (2010).
  72. Spiliotis, M., Lechner, S., Tappe, D., Scheller, C., Krohne, G., Brehm, K. Transient transfection of Echinococcus multilocularis primary cells and complete in vitro regeneration of metacestode vesicles. Int. J. Parasitol. 38 (8-9), 1025-1039 (2008).
  73. Scholzen, A., Mittag, D., Rogerson, S. J., Cooke, B. M., Plebanski, M. Plasmodium falciparum-mediated induction of human CD25Foxp3 CD4 T cells is independent of direct TCR stimulation and requires IL-2, IL-10 and TGFbeta. PLoS Pathog. 5 (8), e1000543(2009).
  74. Fedoroff, S., Richardson, A. Quantification of Cells in Culture. Protocols for Neural Cell Culture. , 4th ed, Humana. Totowa, NJ. 333-335 (2001).
  75. Fedoroff, S., Richardson, A. Primary Cultures of Sympathetic Ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. , 4th ed, Humana. Totowa, NJ. 88-89 (2001).
  76. Kreutzberg, G. W. Microglia: a sensor for pathological events in the CNS. Trends Neurosci. 19 (8), 312-318 (1996).
  77. Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
  78. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
  79. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
  80. Qureshi, S. T., Larivière, L., Leveque, G., Clermont, S., Moore, K. J., Gros, P., Malo, D. Endotoxin-tolerant mice have mutations in Toll-like receptor 4 (Tlr4). J. Exp. Med. 189, 615-625 (1999).
  81. Sabroe, I., Jones, E. C., Usher, L. R., Whyte, M. K., Dower, S. K. Toll-like receptor (TLR)2 and TLR4 in human peripheral blood granulocytes: a critical role for monocytes in leukocyte lipopolysaccharide responses. J. Immunol. 168, 4701-4710 (2002).
  82. Winterbourn, C. C. Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species. Nat. Chem. Bio. 4 (5), 278-286 (2008).
  83. Spencer, K. H., Kim, M. Y., Hughes, C. C., Hui, E. E. A screen for short-range paracrine interactions. Integr. Biol. (Camb). 6 (4), 382-387 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Insert Co culture SystemParacrine SignalingCell Cell ContactN9 MicrogliaPC12 CellsLipopolysaccharide ActivationCytokine SecretionCytotoxicity AssayTissue Culture PlatePermeable Membrane Inserts

Powiązane artykuły