Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) i analiza ekspresji genów neuronów eksprymujących fos ze świeżej i mrożonej tkanki mózgowej szczura

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół Fluorescencji Aktywowanego Sortowania Komórek (FACS) do badania molekularnych zmian w zespołach neuronalnych wyrażających Fos zarówno ze świeżej, jak i mrożonej tkanki mózgowej. Zastosowanie zamrożonej tkanki pozwala na izolację FACS wielu obszarów mózgu podczas wielu sesji, aby zmaksymalizować wykorzystanie cennych zwierząt osobistych.

Streszczenie

Badanie neuroplastyczności i molekularnych zmian w wyuczonych zachowaniach przechodzi z badania całych regionów mózgu na badanie specyficznych zestawów rzadko rozmieszczonych aktywowanych neuronów zwanych zespołami neuronalnymi, które pośredniczą w wyuczonych skojarzeniach. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) zostało niedawno zoptymalizowane dla tkanki mózgowej dorosłego szczura i umożliwiło izolację aktywowanych neuronów za pomocą przeciwciał przeciwko markerowi neuronalnemu NeuN i białku Fos, markerowi silnie aktywowanych neuronów. Do tej pory neurony wykazujące ekspresję fos i inne typy komórek izolowano ze świeżych tkanek, co wiązało się z długimi dniami przetwarzania i pozwalało na ocenę bardzo ograniczonej liczby próbek mózgu po długich i złożonych procedurach behawioralnych. Tutaj stwierdziliśmy, że wydajność neuronów eksprymujących Fos i mRNA Fos z prążkowia grzbietowego była podobna między świeżo wypreparowaną tkanką a tkanką zamrożoną w temperaturze -80 ºC przez 3 - 21 dni. Ponadto potwierdziliśmy fenotyp posortowanych komórek NeuN-dodatnich i NeuN-ujemnych, oceniając ekspresję genów markerów neuronalnych (NeuN), astrocytarnych (GFAP), oligodendrocytarnych (Oligo2) i mikrogialnych (Iba1), co wskazuje, że zamrożona tkanka może być również stosowana do izolacji FACS typów komórek glejowych. Ogólnie rzecz biorąc, możliwe jest pobranie, wypreparowanie i zamrożenie tkanki mózgowej podczas wielu sesji FACS. Maksymalizuje to ilość danych uzyskanych od cennych zwierząt, które często przeszły długie i złożone procedury behawioralne.

Wprowadzenie

Podczas nauki, zwierzęta tworzą skojarzenia między złożonymi zestawami bardzo specyficznych bodźców. Uważa się, że te informacje o wysokiej rozdzielczości są kodowane przez zmiany w określonych wzorcach rzadko rozmieszczonych neuronów zwanych zespołami neuronalnymi. Zespoły neuronalne zostały niedawno zidentyfikowane poprzez indukcję natychmiast wczesnych genów (IEG), takich jak Fos, Arc i Zif268 oraz ich produktów białkowych w neuronach, które były silnie aktywowane podczas zachowania lub ekspozycji na sygnały. W szczególności wykazano, że neurony wyrażające fos odgrywają rolę przyczynową w wyuczonych zachowaniach specyficznych dla kontekstu i wskazówek ^1-4. Tak więc unikalne neuroadaptacje molekularne w tych aktywowanych neuronach eksprymujących Fos są głównymi kandydatami na mechanizmy neuronalne, które kodują wyuczone skojarzenia powstałe podczas normalnego uczenia się i nieprawidłowych zaburzeń uczenia się, takich jak uzależnienie i zespół stresu pourazowego (PTSD) ⁵.

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) umożliwiło ostatnio analizę unikalnych neuroadaptacji molekularnych w neuronach wykazujących ekspresję fos. Cytometria przepływowa i sortowanie komórek zostały opracowane w latach sześćdziesiątych XX wieku ^6,7 w celu scharakteryzowania i izolowania komórek zgodnie z ich charakterystyką rozpraszania światła i immunofluorescencji i od dawna są stosowane w immunologii i badaniach nad rakiem. Jednak cytometria przepływowa i FACS wymagają zdysocjowanych pojedynczych komórek, które są trudne do uzyskania z dorosłej tkanki mózgowej. FACS został po raz pierwszy użyty do wyizolowania i analizy neuronów prążkowia eksprymujących zielone białko fluorescencyjne (GFP) od myszy transgenicznych, które nie wymagały znakowania przeciwciałami ^8,9. Opracowaliśmy metodę FACS opartą na przeciwciałach ¹⁰ w celu wyizolowania i oceny zmian molekularnych w neuronach wykazujących ekspresję Fos aktywowanych przez lek i / lub sygnały u zwierząt typu dzikiego ^11-15. W tej metodzie neurony są znakowane przeciwciałem przeciwko ogólnemu markerowi neuronalnemu NeuN, podczas gdy silnie aktywowane neurony są znakowane przeciwciałem przeciwko Fos. Chociaż nasza początkowa metoda wymagała zebrania do 10 szczurów na próbkę w celu uzyskania świeżej tkanki, późniejsze modyfikacje protokołu pozwoliły na izolację FACS neuronów eksprymujących fos i ilościową analizę reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) dyskretnych obszarów mózgu od pojedynczego szczura ^{w wieku 13-15} lat. Ogólnie rzecz biorąc, unikalne zmiany molekularne stwierdzono w neuronach eksprymujących fos aktywowanych podczas różnych zachowań aktywowanych kontekstem i wskazówkami w badaniach nad uzależnieniami ^12,14,15.

Głównym problemem logistycznym związanym z wykonywaniem FACS na świeżej tkance jest to, że potrzeba jednego całego dnia, aby oddzielić tkankę i przeprowadzić ją za pomocą FACS. Ponadto dziennie można przetwarzać tylko około czterech próbek. Zwykle oznacza to, że tylko jeden obszar mózgu może być oceniany z każdego mózgu, a pozostałe obszary mózgu muszą zostać odrzucone. Jest to poważny problem w przypadku procedur behawioralnych o niskiej przepustowości, takich jak samodzielne podawanie i trening wygaszania, który wymaga operacji i wielu tygodni intensywnego treningu. Co więcej, długie i skomplikowane procedury behawioralne w dniu testu utrudniają wykonanie FACS tego samego dnia. Byłaby to znacząca zaleta, gdyby można było zamrozić mózgi zwierząt natychmiast po testach behawioralnych, a następnie wyizolować neurony wyrażające fos z jednego lub więcej obszarów mózgu w różnych momentach wybranych przez badaczy.

Tutaj pokazujemy, że nasz protokół FACS może być używany do izolowania neuronów eksprymujących Fos (i innych typów komórek) zarówno ze świeżej, jak i zamrożonej tkanki mózgowej. Na przykład wyizolowaliśmy neurony wykazujące ekspresję fos z prążkowia szczura po ostrym wstrzyknięciu metamfetaminy oraz od naiwnych szczurów bez zastrzyków (warunek kontrolny). Jednak ten protokół FACS może być stosowany po każdym leczeniu behawioralnym lub farmakologicznym. Późniejsza analiza qPCR naszych próbek wykazała, że ekspresję genów z tych typów komórek można ocenić z podobną skutecznością zarówno ze świeżej, jak i mrożonej tkanki.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of the National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory ^{animals 16}.

Uwaga: Wszystkie poniższe kroki używają probówek wirówkowych o niskim stopniu wiązania, które były trzymane na lodzie, chyba że określono inaczej.

1. Przygotowanie przed pobraniem tkanek

1. Ustaw wirówkę na 4 ^oC.
2. Wypoleruj ogniowo zestaw trzech szklanych pipet Pasteura o zmniejszających się średnicach około 1,3, 0,8 i 0,4 mm dla każdej próbki.
3. Przygotować oznakowane probówki o pojemności 1,7 ml zawierające 1 ml zimnego buforu A i przechowywać probówki na lodzie.
4. Przygotuj tackę na lód zawierającą matrycę do krojenia mózgu, szpatułki i szklane talerze (lub odwróconą szklaną szalkę Petriego), na której przeprowadzisz sekcję. Wstępnie schłodź dwie lub więcej żyletek na szklanych płytkach i użyj bibułki do wysuszenia wszystkich narzędzi, które dotykają chusteczki.
5. Rozmrażać roztwór enzymu w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 minut przed pobraniem tkanki.

2. Pobieranie i sekcja tkanek

1. Rozpocznij leczenie behawioralne lub farmakologiczne 90 minut przed pobraniem tkanki.
   UWAGA: W przypadku przedstawionych tutaj wyników wykonano ostre wstrzyknięcia dootrzewnowe metamfetaminy w dawce 5 mg/kg metamfetaminy szczurom w nowym środowisku (warunek testowy) i naiwnym szczurom trzymanym w klatkach domowych (warunki kontrolne).
2. Znieczulij szczura, umieszczając go w szklanym słoiku z eksykatorem z nasyconym izofluranem i odetnij głowę szczurowi 30 - 60 sekund później za pomocą gilotyny.
   Użyj nożyczek, aby usunąć skórę i mięśnie z głowy i odsłonić czaszkę. Użyj rongeurs, aby przeciąć czaszkę i otworzyć otwór wielki i usunąć tylną część czaszki. Użyj rongeurs, aby przeciąć wzdłuż górnych krawędzi czaszki, aby odsłonić mózg. Uważaj, aby nie uszkodzić mózgu. Użyj małej szpatułki, aby delikatnie zgarnąć i podnieść mózg. Podnieś mózg i przetnij nerwy, aż mózg będzie wolny ¹⁷.
3. Wypreparuj tkankę za pomocą żyletek.
   UWAGA: Próbki tkanek należy pobrać przy użyciu jednej z następujących metod: (2.3.1) świeżo wypreparowana tkanka; (2.3.2) zamrożona tkanka po sekcji; lub (2.3.3) zamrożoną tkankę wypreparowaną z zamrożonego całego mózgu. Utrzymuj matrycę do krojenia mózgu, żyletki i szklaną płytkę suchą podczas procesów sekcji i mielenia, ponieważ skondensowana woda może prowadzić do hipotonicznej lizy komórek. Użyj szkieł powiększających, aby zapewnić dokładne rozwarstwienie.
   1. W przypadku świeżo wypreparowanej tkanki umieść świeżo wyekstrahowany mózg w matrycy do krojenia mózgu (metalowa forma w kształcie mózgu szczura ze szczelinami na żyletki w odstępach 1 mm), która została schłodzona na lodzie. Włóż dwie lub więcej wstępnie schłodzonych żyletek do szczelin, aby wyciąć plastry koronalne, które zawierają interesujący obszar (obszary) mózgu. Ułóż pokrojony plasterek na schłodzonym szklanym talerzu.
      Uwaga: Przeanalizuj interesujące Cię obszary mózgu na schłodzonej szklanej płytce.
   2. W przypadku zamrożonej tkanki po rozbiorze, należy wypreparować obszar (obszary) mózgu będący przedmiotem zainteresowania z wycinków świeżo wyekstrahowanego mózgu, podobnie jak opisano to powyżej w ppkt 2.3.1. Wypreparowaną tkankę umieścić w mikroprobówce i szybko zamrozić tkankę, zanurzając mikroprobówkę w izopentanie o temperaturze -40 ºC na 20 sekund. Wypreparowaną tkankę należy przechowywać przez cały czas zamrożoną w zamrażarce w temperaturze -80 ºC do czasu dalszej obróbki.
   3. W przypadku zamrożonej tkanki świeżo wyekstrahowany mózg należy natychmiast zamrozić w izopentanie o temperaturze -40 ºC i przechowywać w szczelnie zamkniętej torbie w temperaturze -80 ºC przez okres do 6 miesięcy.
      1. W dniu sekcji umieść zamrożony mózg w kriostacie ustawionym na około -20 ºC (nie cieplejszym niż -18 ºC) na około 2 godziny w celu zrównoważenia temperatury.
         UWAGA: Mózg można łatwo przeciąć w tej temperaturze, podczas gdy znacznie niższe temperatury sprawiają, że mózg jest zbyt kruchy, aby można go było bezpiecznie przeciąć.
      2. Użyj żyletek, aby pokroić 1-2 mm plastry koronalne zamrożonych mózgów w kriostacie. Użyj igły o rozmiarze od 12 do 16, aby uzyskać stemple tkankowe z tych plastrów w warunkach zamrażania. Wypreparowaną tkankę należy przechowywać w pozycji zamrożonej przez cały czas do czasu dalszego przetwarzania.
4. Dodaj 1-2 krople buforu A, aby przykryć wypreparowaną tkankę przed mieleniem. Usuń większość istoty białej z tkanki za pomocą dwóch żyletek, aby zapobiec utracie neuronów podczas pozostałej części procesu tarcia. Jeśli zaczynasz od zamrożonej tkanki, pozwól chusteczce rozmrozić się na zimnej szklanej płytce nie dłużej niż 1 minutę przed zastosowaniem roztworu buforu A.
5. Zmiel tkankę 100 razy w każdym prostopadłym kierunku za pomocą żyletki na schłodzonej szklanej płytce. Podczas mielenia trzymaj żyletkę pionowo do szklanej płytki.
   UWAGA: Dokładne mielenie ma kluczowe znaczenie dla wszystkich etapów protokołu.
6. Za pomocą żyletek przenieś zmieloną tkankę do probówek mikrowirówek zawierających 1 ml zimnego buforu A. Odwróć probówkę 3 - 5 razy, aby cała zmielona tkanka pozostała w roztworze.

3. Dysocjacja komórek

UWAGA: Używaj delikatnego mieszania koniec po końcu dla wszystkich poniższych kroków. Nie używaj mieszalnika wirowego i unikaj pęcherzyków powietrza, które powodują uszkodzenie komórek.

1. Odwirować probówki z próbkami o stężeniu 110 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Powoli dodaj 1 ml zimnego, świeżo rozmrożonego roztworu enzymatycznego (zawierającego mieszaninę enzymów proteolitycznych) w dół wewnętrznej ścianki mikroprobówki. Natychmiast zassać cały granulat i delikatnie pipetować w górę i w dół tylko 4 razy pipetą o umiarkowanie dużej średnicy końcówki, aby rozproszyć zmielone granulki tkankowe.
2. Natychmiast odwrócić mikroprobówki, aby zapobiec przywieraniu osadu do dna i inkubować próbki, mieszając koniec po końcu przez 30 minut w temperaturze 4 ^oC.
3. Po enzymatycznym trawieniu tkanek odwirować probówki o sile 960 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i dodać 0,6 ml zimnego buforu A. Natychmiast po dodaniu buforu A należy użyć tej samej końcówki pipety do rozproszenia osadu poprzez zassanie całej osadki i delikatnie pipetować w górę i w dół 5 razy.
4. Mechanicznie rozcierać strawioną tkankę i zbierać do probówek o pojemności 15 ml, wykonując następujące czynności. Do każdej próbki należy użyć oddzielnego zestawu 3 pipet Pasteura z polerowanego szkła o malejących średnicach około 1,3, 0,8 i 0,4 mm przymocowanych do bańek lateksowych.
   1. Delikatnie rozetrzeć każdą próbkę 10 razy za pomocą szklanej pipety o średnicy 1,3 mm. Pozostaw próbkę na lodzie na 2 minuty (szczątki i niezdysocjowane komórki osiądą na dnie). Zebrać sklarowany osad (~ 0,6 ml) i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml (probówka #1).
   2. Dodać 0,6 ml roztworu buforu A do pozostałego osadu. Próbkę należy rozcierać 10 razy za pomocą szklanej pipety o średnicy 0,8 mm. Pozostaw próbkę na lodzie na 2 minuty. Zebrać supernatant (~ 0,6 ml) i przenieść do tej samej 15 ml stożkowej probówki #1.
   3. Dodać 0,6 ml roztworu buforu A do pozostałego osadu. Próbkę należy rozcierać 10 razy za pomocą szklanej pipety o średnicy 0,4 mm. Pozostaw próbkę na lodzie na 2 minuty. Zebrać supernatant (~ 0,6 ml; bez dotykania osadu z niezdysocjowanymi komórkami) i przenieść do tej samej 15 ml probówki stożkowej #1,
      UWAGA: Pipetę o średnicy 0.4 mm należy przechowywać w probówce #1 w celu wykonania następujących czynności związanych z rozcieraniem.
   4. Powtórzyć krok 3.4.3 jeszcze trzy razy, używając najmniejszej szklanej pipety (o średnicy ~ 0,4 mm) i zebrać supernatant do oddzielnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml (probówka #2).
   5. Zebrane zawiesiny komórek należy rozcierać w probówkach #1 i #2 jeszcze 10 razy za pomocą szklanej pipety o średnicy 0,4 mm i przechowywać na lodzie.

4. Utrwalanie i przenikanie komórek

1. Przygotuj 4 mikroprobówki na próbkę (dwie mikroprobówki dla komórek z probówki #1 i dwie dla komórek z probówki #2), dodając 800 μl 100% zimnego etanolu (przechowywanego w temperaturze -20 ^oC przed użyciem) do każdej probówki i trzymaj je na lodzie. Uwaga: Końcowe stężenie etanolu wyniesie 50%.
2. Odpipetować ~ 800 μl zawiesin komórek (z probówki #1 i probówki#2) do każdej z 4 probówek zawierających zimny etanol i odwrócić probówki w celu wymieszania próbek.
3. Inkubuj probówki na lodzie przez 15 minut, odwracając probówki co 5 minut.
4. Po utrwaleniu/przepuszczalności odwirować probówki o stężeniu 1 700 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Pozostaw 50 μl roztworu, aby zapobiec utracie komórek.
   UWAGA: Granulki na tym etapie są białe i mniej przylegają do ścianki rurek niż przed przepuszczalnością. Dlatego należy ostrożnie usunąć supernatant, dotykając ścianki mikroprobówki, w której nie ma osadu, i powoli pobrać supernatant za pomocą mikropipety.

5. Filtracja komórkowa

1. Ponownie zawiesić granulki z kroku 4.4 za pomocą zimnego PBS w następujący sposób:
   1. Dodaj 550 μl zimnego PBS do jednej z dwóch mikroprobówek pochodzących z probówki #1 i użyj końcówki pipety o umiarkowanie dużej średnicy, aby delikatnie odpipetować zawiesinę komórek w górę iw dół 5 razy. Powtórz to samo dla jednej mikroprobówki pochodzącej z probówki #2.
   2. W przypadku komórek z probówki #1, używając tej samej pipety, przenieś pierwszą zawiesinę komórek do drugiej granulki. Zawiesić drugą osadkę, delikatnie pipetując zawiesinę połączonych komórek 5 razy w górę i w dół.
   3. W przypadku ogniw z probówki #2 ponownie zawiesić i połączyć granulki (tj. trzecią i czwartą mikroprobówkę) zgodnie z opisem w ppkt 5.1.2.
2. Przefiltrować oddzielnie dwie zawiesiny komórek z etapów 5.1.2 i 5.1.3, używając dwóch różnych par filtrów siatkowych (o wielkości porów 100 μm i 40 μm) w następujący sposób:
   1. Wstępnie zwilż sitko do każdej komórki, dodając PBS do wnętrza sitka. Użyj pipety, aby usunąć nadmiar PBS z zewnętrznej strony sitka.
   2. Równomiernie odpipetować zawiesinę komórek z kroku 5.1.2 na pierwsze sitko do komórek o wielkości porów 100 μm. Zebrać przepływ do probówki o pojemności 50 ml na lodzie. Użyj pipety, aby zebrać przepływ, który jest przymocowany do zewnętrznej strony spodu sitka do komórek.
   3. Za pomocą tej samej pipety przenieś przepływ z sitka o pojemności 100 μm do sitka o średnicy 40 μm. Zebrać ten przepływ do innej probówki o pojemności 50 ml na lodzie. W przypadku przenoszenia przepływu z sitka o średnicy 40 μm należy wymienić końcówki do pipet na nowe, aby uniknąć zanieczyszczenia sitkiem o średnicy 100 μm.
   4. Powtórz te kroki dla zawiesiny komórek z kroku 5.1.3, używając nowego zestawu filtrów.
3. Połączyć oba przepływy z każdej próbki, aby uzyskać końcową objętość około 1 ml na próbkę.

6. Inkubacja z przeciwciałami

UWAGA: Użyj małych porcji zawiesin komórek mózgowych, aby przygotować wiele próbek kontrolnych do ustawienia odpowiednich ustawień cytometru przepływowego przed uruchomieniem głównej próbki. Dla każdego znakowania przeciwciał należy przygotować próbki kontrolne, które nie zawierają przeciwciał, a jedynie przeciwciało drugorzędowe (lub inny znacznik fluorescencyjny), a następnie zarówno przeciwciała pierwszorzędowe, jak i drugorzędowe (lub inne znaczniki fluorescencyjne). Użyj tych elementów sterujących, aby ustawić bramki, które oddzielają specyficzne i niespecyficzne etykietowanie w cytometrze przepływowym. Jeśli to możliwe, używaj fluorochromów, które nie wymagają kompensacji. Zwiększyć końcową objętość kontrolnych próbek z bramkowaniem do końcowej objętości 700 μl, dodając PBS przed dodaniem przeciwciał pierwszorzędowych.

1. Przygotować próbkę rozpraszającą światło i kontrolną DAPI, przenosząc 100 μl próbki przefiltrowanych komórek do mikroprobówki o pojemności 1,7 ml. Dodać 600 μl zimnego PBS z 1 μg/ml DAPI do barwienia jąder. Inkubować przez 10 minut z mieszaniem od końca do końca i przemyć (jak wskazano w krokach 6.4.2-6.4.5) przed przepuszczeniem przez cytometr przepływowy.
   UWAGA: Ta próbka jest używana tylko do ustawienia bramki komórki/jąder przed sortowaniem pozostałych komórek w maszynie FACS.
2. Przygotować pojedyncze próbki kontrolne znakowane immunologicznie, przenosząc 100 μl przefiltrowanych komórek do mikroprobówki o pojemności 1,7 ml. Dodać 600 μl zimnego PBS z jednym przeciwciałem (np. przeciwciałem NeuN). Dodać 600 μl zimnego PBS do mikroprobówki z innym przeciwciałem (np. przeciwciałem Fos). Dodaj odpowiednie przeciwciało drugorzędowe, jeśli nie jest to przeciwciało pierwszorzędowe sprzężone bezpośrednio.
   UWAGA: Próbki te służą do określenia odpowiedniego napięcia lampy fotopowielacza (PMT) oraz do oceny nakładania się dwóch sygnałów fluorescencyjnych, jeśli to konieczne. Stężenia przeciwciał należy miareczkować, aby osiągnąć najlepszy stosunek sygnału do szumu we wszystkich kanałach. Nakładające się sygnały fluorescencyjne można również skompensować poprzez wewnętrzną kalibrację różnych kanałów fluorescencyjnych w cytometrze przepływowym.
3. Przygotować podwójnie znakowaną fluorescencyjnie ujemną próbkę kontrolną, przenosząc 100 μl przefiltrowanych komórek do mikroprobówki o pojemności 1,7 ml. Dodać 600 μl zimnego PBS z samymi przeciwciałami drugorzędowymi lub bezpośrednio sprzężonymi przeciwciałami pierwszorzędowymi IgG.
   UWAGA: Ta próbka kontrolna może być używana za każdym razem przed sortowaniem w celu określenia fluorescencji tła dla każdego fluoroforu.
4. Przygotować główną próbkę do sortowania.
   1. Przenieść 700 μl przefiltrowanych komórek do mikroprobówki o pojemności 1,7 ml. Dodać 7 μl (1:100) pierwszorzędowego przeciwciała Fos sprzężonego bezpośrednio z Alexa Fluor 647 (anty-Fos-AF647) i 1,4 μl (1:500) pierwszorzędowego przeciwciała NeuN sprzężonego bezpośrednio z fikoerytryną (anty-NeuN-PE). Inkubować probówki przez 30 minut w temperaturze 4 °C z mieszaniem od końca do końca.
   2. Pod koniec inkubacji dodać 800 μl zimnego PBS do każdej mikroprobówki, w tym próbki głównej i próbek kontrolnych, i wymieszać przez inwersję.
   3. Odwirować mikroprobówki o masie 1 300 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, pozostawiając 50 μl supernatantu, aby zapobiec utracie komórek.
   4. Dodać 1 ml zimnego PBS do osadu i ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety o umiarkowanie dużej średnicy końcówki.
   5. Wirować przy 1 300 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
   6. Ponownie zawiesić granulat w 500 μl zimnego PBS (dostosować końcową objętość w zależności od wielkości granulki).
   7. Przenieść i przefiltrować zawiesinę do okrągłodennej probówki na próbkę FACS z nasadką z sitkiem do komórek (40 μm). Trzymaj komórki znakowane immunologicznie na lodzie i natychmiast wykonaj FACS. Uwaga: W celu przefiltrowania dotknij końcówki pipety pionowo na nasadce sitka i przepchnij przez nią zawiesinę komórek.
5. Ustawić bramki cytometru przepływowego za pomocą próbek kontrolnych.
   1. Użyj próbki rozpraszającej światło i kontrolnej DAPI, aby zidentyfikować populację komórek neuronalnych na podstawie całkowitych zdarzeń i szczątków komórkowych.
      UWAGA: Ciała komórkowe w tym preparacie stanowią tylko 1 - 2% wszystkich zdarzeń (reszta to szczątki i przerwane procesy komórkowe). Na podstawie sygnału fluorescencyjnego DAPI (wskazującego jądra) i rozproszenia do przodu (wielkość komórki) możliwe jest zlokalizowanie ciał komórek i bramki wstecznej w oparciu o właściwości rozpraszania światła do przodu i z boku komórek (jak pokazano na rysunku 1 A, B).
   2. Użyj pojedynczych próbek kontrolnych znakowanych immunologicznie, aby określić ustawienia napięcia PMT i przeanalizować rozlanie się emisji z jednego określonego fluorochromu do innego filtra/kanału (np. Alexa Fluor 488/FITC lub fikoerytryna). Jeśli sygnały fluorescencyjne nakładają się na siebie, skoryguj nakładanie się, ręcznie dostosowując poziomy kompensacji.
   3. Użyj podwójnie znakowanej fluorescencyjnie kontroli ujemnej, aby ustawić próg dla populacji dodatniej.
      UWAGA: Uważa się, że sygnał pochodzący z tej próbki jest spowodowany autofluorescencją, a komórki głównej próbki znajdujące się powyżej tego progu można uznać za dodatnie. Zazwyczaj parametry progowe sortowania są bardziej rygorystyczne i w rzeczywistości sortowane są około 2/3 górnych oznaczonych komórek powyżej kontroli ujemnej.
6. Posortuj neurony z głównej próbki za pomocą FACS do mikroprobówek o pojemności 1,7 ml. Zebrać komórki do 50 μl buforu do ekstrakcji RNA. Po sortowaniu należy odwirować i odwirować probówkę i wymieszać zawiesinę, pipetując 10 razy w górę i w dół, aby odzyskać wszystkie posortowane komórki ze ścianek probówki.
7. Inkubować posortowaną zawiesinę komórkową w temperaturze 42 °C przez 30 minut, aby upewnić się, że wszystkie komórki są poddawane lizie przed ekstrakcją RNA, a następnie odwirować przy 2 800 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
8. Przenieść supernatant do probówki wolnej od RNaz w celu długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 ºC lub natychmiast przetworzyć próbkę do izolacji RNA, syntezy cDNA, wstępnej amplifikacji genu docelowego i qPCR, jak opisano wcześniej ^13-15.

Wyniki

Sortowanie neuronów Fos-dodatnich i Fos-ujemnych ze świeżych i mrożonych tkanek prążkowia grzbietowego od pojedynczych szczurów po ostrych iniekcjach metamfetaminy.

Opisany powyżej protokół został użyty do sortowania neuronów Fos-dodatnich i Fos-ujemnych z pojedynczego prążkowia grzbietowego szczura 90 minut po dootrzewnowym wstrzyknięciu metamfetaminy (5 mg/kg). Naiwne szczury w swoich domowych klatkach były używane jako kontro...

Dyskusja

FACS może być używany do sortowania neuronów i innych typów komórek ze świeżej lub zamrożonej dorosłej tkanki mózgowej. Jak wspomniano we wstępie, możliwość wykorzystania zamrożonej tkanki pozwala na optymalne wykorzystanie próbek pochodzących od zwierząt, które przeszły złożone i długotrwałe procedury behawioralne, takie jak samodzielne podawanie i badania nawrotów w badaniach nad uzależnieniami. Te procedury behawioralne trwają zwykle 1-2 godziny lub dłużej i wymagają, aby wszystkie zwierzęta (w sumie 10-20) zostały pr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Macierz mózgu	CellPoint Scientific	69-2160-1	do otrzymywania koronalnych wycinków mózgu
Hibernate A o niskiej fluorescencji	Brain Bits	HA-lf	Bufor A w protokole służy do przetwarzania tkanek i komórek od etapów dysocjacji do utrwalenia
Accutase	Millipore	SCR005	Roztwór enzymatyczny w protokole służy do enzymatycznego trawienia tkanki przed rozcieraniem
Białkowa tubka LoBind 1,5 ml, PCR clean	Eppendorf	22431081	zapobiegająca utracie komórek podczas protokołu
Sitko do komórek, 40 &mikro; m	BD Falcon	352340	do filtrowania zawiesiny komórek
Sitko do komórek, 100 i mikro; m	BD Falcon	352360	do filtrowania zawiesiny komórek
Falcon 5 ml probówka z polistyrenu okrągłodennego z zatrzaskową nasadką sitową	BD Bioscience	352235	do filtrowania zawiesiny komórek przed przejściem przez cytometr przepływowy
Pipet Pasteura, szkło	Dostawa NIH	6640-00-782-6008	do rozcierania tkanek
Milli-Mark Anti-NeuN-PE, przeciwciało klonowe A60 (mysie przeciwciało monoklonalne)	EMD Przeciwciało Millipore	FCMAB317PE	do wykrywania neuronów
Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (koniugat Alexa Fluor 647)	Technologia sygnalizacji komórkowej	Przeciwciało 8677	do wykrywania komórek wykazujących ekspresję fos
DAPI	Sigma	D8417	do znakowania jąder
PicoPure RNA Isolation Kit	Applied Biosystems.	KIT0204	Zestaw zawiera bufor do ekstrakcji RNA dla kroku 6.14. Służy do zbierania posortowanych komórek,
indeksu górnego III, systemu syntezy pierwszej nici cDNA	Invitrogen	18080-051	, do syntezy cDNA z RNA
, TaqMan, PreAmp, Master, Mix	Applied Biosystems.	4391128	wykonać celowaną preamplifikację z cDNA
TaqMan Advance Fast Master	Biosystemy stosowane.	4444963	wykonać PCR za pomocą sond TaqMan Sonda
Fos TaqMan Applied	Biosystems.	Rn00487426_g1	Sonda/startery TaqMan
NeuN Sonda TaqMan	Applied Biosystems.	Sekwencja nukleotydowa CACTCCAACAGCGTGAC	dla markera genu neuronalnego
NeuN Forward primer	Applied Biosystems.	GGCCCCTGGCAGAAAGTAG	sekwencja nukleotydowa dla markera genu neuronalnego
NeuN< / em> Odwrotny starter	Applied Biosystems.	Sekwencja nukleotydowa TTCCCCCTGGTCCTTCTGA	dla markera genu neuronalnego
Gfap Sonda TaqMan	Applied Biosystems.	Rn00566603_m1	Sonda/startery TaqMan do markera genu astrocityc
iba-1 Sonda TaqMan	Applied Biosystems.	Rn00574125_g1	Sonda/startery TaqMan do markera genu mikroglya
Gapdh Sonda TaqMan	Applied Biosystems.	Sekwencja nukleotydowa CTCATGACCACAGTCCA	dla genu referencyjnego/porządkowego
Gapdh Forward primer	Applied Biosystems.	Sekwencja nukleotydowa GACAACTTTGGCATCGTGGAA	dla genów referencyjnych/porządkowych
Gapdh Odwrotny starter	Applied Biosystems.	CACAGTCTCTGAGTGGCAGTGA	dla genu referencyjnego/porządkowego
Oligo2 Sonda TaqMan	Applied Biosystems.	Rn01767116_m1	Sonda/startery TaqMan do markera genów oligodendrocytarnych
Pipetor P1000	Rainin	17014382	Jest określany jako pipeta o dużej średnicy końcówki w krokach 3.1 i 3.3 do łagodnego rozcierania tkanek oraz kroku 6.7 do ponownego zawieszenia komórek
7500 Szybki system PCR w czasie rzeczywistym	firmy Applied Biosystems.	446985	do ilościowego sortowania komórek PCR
FACSAria I,	BD Biosciences		do sortowania FACS