Method Article

Niezawodna i skuteczna ekstrakcja komórek odpornościowych nerek

DOI:

10.3791/54368

⸱

August 19th, 2016

 ,  ,  , 
1Division of Nephrology, Department of Medicine, University of Missouri-Columbia and Harry S Truman Memorial Veteran's Hospital, 2Division of Biomedical Sciences, Department of Medicine, University of Missouri-Columbia and Harry S Truman Memorial Veteran's Hospital, 3Division of Endocrinology, Department of Medicine, University of Missouri-Columbia and Harry S Truman Memorial Veteran's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki, które są niezawodne i skuteczne w izolacji komórek odpornościowych nerek, są potrzebne do dalszych zastosowań. Wymaga to znakowania powierzchniowego przeciwciałami niewielkiej liczby komórek odpornościowych nerek. W niniejszym artykule opisujemy zwięzłą metodę izolacji komórek odpornościowych nerek, która pozornie osiąga ten cel.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aktywacja układu odpornościowego występuje w wielu chorobach nerek i procesach patofizjologicznych. Układ odpornościowy składa się zarówno z elementów adaptacyjnych, jak i wrodzonych oraz wielu typów komórek. Czasami interesujący typ komórek występuje w bardzo małej liczbie wśród dużej liczby wszystkich komórek wyizolowanych z nerki. W związku z tym wiarygodna i wydajna izolacja populacji komórek jednojądrzastych nerek jest ważna w celu zbadania problemów immunologicznych związanych z chorobami nerek. Tradycyjnie, izolację tkanek komórek jednojądrzastych nerek przeprowadzano poprzez trawienie enzymatyczne przy użyciu różnych odmian i mocy kolagenaz / DNA, co daje różną liczbę żywotnych komórek odpornościowych. Ostatnio, wraz z rozwojem mechanicznych substancji zaburzających funkcjonowanie tkanek do izolacji pojedynczych komórek, unika się etapu trawienia kolagenazy i zastępuje go proste mechaniczne uszkodzenie nerek po ekstrakcji od myszy. W tym artykule przedstawiamy prostą, ale skuteczną metodę izolacji komórek jednojądrzastych nerek do codziennej ekstrakcji komórek odpornościowych. Następnie pokazujemy przykład analizy podzbioru komórek odpornościowych w nerce. Co ważne, technikę tę można dostosować do innych tkanek miękkich i niewłóknistych, takich jak wątroba i mózg.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aktywacja układu odpornościowego występuje w wielu chorobach nerek i procesach patofizjologicznych 6,10,11,13. Potencjalne obszary aktywnych badań obejmują różne czynniki wyzwalające aktywację układu odpornościowego, różne typy zaangażowanych komórek, wzorzec cytokin/chemokina w określonym środowisku chorobowym, modulację wszystkich wyżej wymienionych procesów przez dany lek itp. Na przykład w uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym (model ostrego uszkodzenia nerek) w ciągu kilku godzin następuje wzrost komórek odpornościowych lub komórek krwiotwórczych pochodzących ze szpiku kostnego lub komórek CD45 +, który utrzymuje się przez okres naprawy lu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie wykonane kroki protokołu zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Missouri (ACUC). W tym protokole wykorzystano samce myszy C57Bl/6 w wieku 15 tygodni, chociaż teoretycznie każdy gryzoń w każdym wieku może być wykorzystany do eksperymentów. Ponieważ jest to operacja, która nie daje szansy na przeżycie, eutanazję osiąga się poprzez wykrwawienie i obustronną odmę opłucnową.

1. Perfuzja nerek

Uwaga: Perfuzja narządów, takich jak serce, wątroba i nerki, usuwa krew, która może zakłócać interpretację danych. Stąd, jeśli to możliwe, zawsze wykonujemy perfuzj....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liczba paneli, które można uruchomić, zależy od liczby komórek odpornościowych, które można niezawodnie pobrać z nerek. W tym miejscu demonstrujemy możliwość uruchomienia 2 paneli, jednego dla limfocytów T i jednego dla makrofagów/komórek dendrytycznych. Na panelu limfocytów T najpierw przyglądamy się wzorowi rozproszenia do przodu (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC) i wyznaczamy populację będącą przedmiotem zainteresowania, jak pokazano na rysunku 1 (wykres kropkowy w le.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiliśmy tutaj metodologię pozyskiwania komórek odpornościowych z nerki w niezawodny i skuteczny sposób. Główna modyfikacja szeroko stosowanego etapu trawienia kolagenazy (mechaniczne rozerwanie tkanki) pozwala zaoszczędzić około 30 minut, a izolacja dużej liczby żywotnych komórek odpornościowych zajmuje mniej niż dwie godziny dla 4 próbek nerek. Co więcej, w zależności od naszego pytania badawczego, używamy teraz tylko jednej nerki (druga nerka może być użyta do analizy białek za pomocą Western Blot, immunohistoc.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest wspierana przez Research Grant od Dialysis Clinics Inc. oraz przez University of Missouri Research Board Grant.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Stomacher 80 System laboratoryjny BiomasterSeward
Stomacher 80 Klasyczne workiSewardBA6040/STR
Sorvall Legend XFR WirówkaThermo ScientificLub równoważny sprzęt 
HemocytometrMikroskopia elektronowa Nauki63514-11
Analityczny cytometr przepływowyBD LSR-X20 Fortessa
Percoll SigmaP1644
Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami 1x (DPBS)Gibco, Life Technologies14190-250
Rurki polipropylenowe, bez nasadkiBecton Dickinson352002
Fixable Viability StainBD Biosciences FVS510,  564406
Anty-CD16/32 (Klon: 93)EBioscience14-0161
anty-CD45 (klon: 30-F11)  BV421 BD Pharmingen103133/4
Anti-Foxp3 (Klon: FJK-16s) APCEBioscience17-5773
Anty-CD127 (Klon: A7R34) PE/Cy7Biolegend135013/4
anty-CD44 (Klon: IM7) PerCP/Cy5.5Biolegend103031/2
anty-CD4 (Klon: RM4-5) APC-Cy7Biolegend100413/4
anty-CD8 (Klon: 53-6.7) BV785Biolegend100749/50
Anti-Ly6G (Klon: 1A8) FITCBiolegend127605/6
Anti-CD11b (Klon: M1/70) PerCP-Cy5.5Biolegend101227/8
Anti-F4/80 (Klon: BM8) APCBiolegend123115/6
Anti-CD11c (Klon: N418) BV785Biolegend117335/6
Anti-CD301 (Klon: LOM-14) PE-Cy7Biolegend145705/6
Anti-CD26 (Klon: H194-112) PEBiolegend137803/4
100 μ Filtr M Fisher Scientific22363548
Rurki Fisherbrand 50 mlFisherLub równoważne wyposażenie 
Rurki Fisherbrand 15 mlFisherLub równoważne wyposażenie 
SacharozaFisher chemicznaS5-3
Pipeta transferowa z cienką końcówkąSamco Scientific232Lub równoważny sprzęt 
Cytometria przepływowa Roztwór buforowy do barwieniaEBioscience00-4222-26Lub równoważny sprzęt 
1x bufor do lizy RBCEBioscience00-4333-57Lub równoważny sprzęt 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ascon, D. B., et al. Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury. J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).
  2. Ascon, M., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Kidney Immune CellsFlow CytometryDensity Gradient CentrifugationMechanical Tissue DisruptionStromal Vascular FractionCell IsolationPerfusion ProtocolRBC LysisBuffy Coat IsolationMulticolor Flow Cytometry

Related Articles