Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Niezawodna i wysokowydajna izolacja komórek odpornościowych nerek

10.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54368

⸱

19 sierpnia 2016

 ,  ,  , 
1Division of Nephrology, Department of Medicine, University of Missouri-Columbia and Harry S Truman Memorial Veteran's Hospital, 2Division of Biomedical Sciences, Department of Medicine, University of Missouri-Columbia and Harry S Truman Memorial Veteran's Hospital, 3Division of Endocrinology, Department of Medicine, University of Missouri-Columbia and Harry S Truman Memorial Veteran's Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Techniki, które są niezawodne i skuteczne w izolacji komórek odpornościowych nerek, są potrzebne do dalszych zastosowań. Wymaga to znakowania powierzchniowego przeciwciałami niewielkiej liczby komórek odpornościowych nerek. W niniejszym artykule opisujemy zwięzłą metodę izolacji komórek odpornościowych nerek, która pozornie osiąga ten cel.

Streszczenie

Aktywacja układu odpornościowego występuje w wielu chorobach nerek i procesach patofizjologicznych. Układ odpornościowy składa się zarówno z elementów adaptacyjnych, jak i wrodzonych oraz wielu typów komórek. Czasami interesujący typ komórek występuje w bardzo małej liczbie wśród dużej liczby wszystkich komórek wyizolowanych z nerki. W związku z tym wiarygodna i wydajna izolacja populacji komórek jednojądrzastych nerek jest ważna w celu zbadania problemów immunologicznych związanych z chorobami nerek. Tradycyjnie, izolację tkanek komórek jednojądrzastych nerek przeprowadzano poprzez trawienie enzymatyczne przy użyciu różnych odmian i mocy kolagenaz / DNA, co daje różną liczbę żywotnych komórek odpornościowych. Ostatnio, wraz z rozwojem mechanicznych substancji zaburzających funkcjonowanie tkanek do izolacji pojedynczych komórek, unika się etapu trawienia kolagenazy i zastępuje go proste mechaniczne uszkodzenie nerek po ekstrakcji od myszy. W tym artykule przedstawiamy prostą, ale skuteczną metodę izolacji komórek jednojądrzastych nerek do codziennej ekstrakcji komórek odpornościowych. Następnie pokazujemy przykład analizy podzbioru komórek odpornościowych w nerce. Co ważne, technikę tę można dostosować do innych tkanek miękkich i niewłóknistych, takich jak wątroba i mózg.

Wprowadzenie

Aktywacja układu odpornościowego występuje w wielu chorobach nerek i procesach patofizjologicznych 6,10,11,13. Potencjalne obszary aktywnych badań obejmują różne czynniki wyzwalające aktywację układu odpornościowego, różne typy zaangażowanych komórek, wzorzec cytokin/chemokina w określonym środowisku chorobowym, modulację wszystkich wyżej wymienionych procesów przez dany lek itp. Na przykład w uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym (model ostrego uszkodzenia nerek) w ciągu kilku godzin następuje wzrost komórek odpornościowych lub komórek krwiotwórczych pochodzących ze szpiku kostnego lub komórek CD45 +, który utrzymuje się przez okres naprawy lub zwłóknienia (6 tygodni później) 5,12. Te komórki odpornościowe wydzielają zarówno prozapalne, jak i przeciwzapalne cytokiny i chemokiny, aby koordynować proces naprawy 5,12. Obecnie możliwość jednoczesnego używania wielu fluoroforów do znakowania populacji komórek w zawiesinie pojedynczej komórki wzrosła wraz z pojawieniem się nowoczesnych maszyn do cytometrii przepływowej z czterema do pięciu laserami. To znacznie zwiększyło zdolność do rozróżniania populacji komórek na podstawie ich statusu funkcjonalnego 3,7. Na przykład, aby dokładnie oznaczyć makrofaga jako F4 / 80niskiCD11bwysokiLy6bwysokiCD206niski, co najmniej 3 dodatkowe fluorofory w tej samej objętości próbki byłyby potrzebne do bramki dla żywych komórek, CD45 + (leukocyty) i Ly6G- (neutrofile), a jest to bardzo możliwe dzięki nowszym cytometrom przepływowym 3. Jednak dalsze testy wydzielania cytokin, proliferacji komórek, cytotoksyczności, aktywacji makrofagów i ilościowego oznaczania liczby różnych podzbiorów limfocytów i monocytów wymagają nie tylko dobrej jakości (żywe komórki, singlety), ale także odpowiedniej liczby komórek.

Układ odpornościowy w nerce składa się zarówno z adaptacyjnych, jak i wrodzonych składników oraz wielu typów komórek 1,7,13. Na przykład u myszy dwie nerki razem zawierają 2-17% (28 000-266 000) komórek CD45 + z całkowitej izolowanej komórki odpornościowej nerek (1,4 x 106 komórek), a około 5-15% (1,400-4,200) z nich to komórki CD4 + 1,5,12. Niewielki procent (5-15%, 70-630) tych komórek CD4 + to komórki FoxP3 + (ryc. 1)1. Ze względu na te stopniowe zmniejszanie procentu komórek, czasami populacja komórek będących przedmiotem zainteresowania (w tym przypadku komórki CD45 + CD4 + FoxP3 +) jest reprezentowana przez zaledwie ~100 komórek. Niewielka liczba komórek CD45 + CD4 + FoxP3 + sprawia, że konieczne jest wyizolowanie dużej liczby wszystkich komórek, a komórki są dobrej jakości do dalszych badań, takich jak testy wydzielania cytokin. Co więcej, może być konieczne połączenie nerek od 2-3 myszy, ponieważ subpopulacje nie są reprezentowane w wystarczająco dużej liczbie, aby przeprowadzić ilościowe testy. W związku z tym pożądana jest niezawodna i wydajna izolacja populacji komórek jednojądrzastych nerek w celu zbadania spektrum immunologicznego związanego z chorobami nerek.

Tradycyjnie, do izolacji komórek jednojądrzastych nerki, badacze używali różnych metod trawienia enzymatycznego, takich jak kolagenaza 1A lub II, w tym DNaza 1 1,5,12. Powszechnie wiadomo, że kolagenazy mają aktywność enzymatyczną, która różni się w zależności od numeru partii i firmy produkcyjnej, co wymaga miareczkowania w celu uzyskania optymalnego stężenia i czasu inkubacji 4,14,15. Ponadto trawienie kolagenazą wydłuża czas na rozdrobnienie nerki na małe kawałki, wymaga inkubacji fragmentów nerki w podgrzanej (37 °C) kąpieli i dodatkowego czasu na inkubację w EDTA w celu zatrzymania reakcji. Ponadto można osiągnąć mniejszą sterylność w przypadku niektórych dalszych procedur wymagających hodowli komórek. Co ważniejsze, w zależności od badacza i wszystkich zaangażowanych zmiennych, prowadzi to do zmienności danych i interpretacji w różnych laboratoriach. Ostatnio, wraz z rozwojem mechanicznych substancji zaburzających funkcjonowanie tkanek/homogenizatorów 16, etap trawienia kolagenazy został całkowicie wyeliminowany i zastąpiony prostym mechanicznym zakłóceniem pracy nerek 2. W tym artykule przedstawiamy prostą, ale skuteczną metodę izolacji komórek odpornościowych nerek do codziennej ekstrakcji komórek odpornościowych. Co ważne, technikę tę można dostosować do innych tkanek miękkich i niewłóknistych, takich jak wątroba i mózg 16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie wykonane kroki protokołu zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Missouri (ACUC). W tym protokole wykorzystano samce myszy C57Bl/6 w wieku 15 tygodni, chociaż teoretycznie każdy gryzoń w każdym wieku może być wykorzystany do eksperymentów. Ponieważ jest to operacja, która nie daje szansy na przeżycie, eutanazję osiąga się poprzez wykrwawienie i obustronną odmę opłucnową.

1. Perfuzja nerek

Uwaga: Perfuzja narządów, takich jak serce, wątroba i nerki, usuwa krew, która może zakłócać interpretację danych. Stąd, jeśli to możliwe, zawsze wykonujemy perfuzję narządów.

  1. Umieść mysz w komorze indukcyjnej izofluranu (3 ml/min) do momentu, aż stanie się nieruchoma. Następnie należy wyjąć mysz z komory, położyć ją grzbietowo na stole sekcyjnym i umieścić stożek izofluranu na nosie myszy i przepchnąć izofluran z szybkością 1,5 ml/min przez regulator.
  2. Sprawdź reakcję na uszczypnięcie palca u nogi za pomocą pęsety, aby ocenić, czy zwierzę osiągnęło chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia. Oczyść brzuszną część brzucha solą fizjologiczną i rozetnij brzuch nożyczkami i wypchnij narządy jamy brzusznej (poza pole operacyjne) na lewą stronę myszy.
  3. Pobrać krew z żyły głównej dolnej za pomocą igły o rozmiarze 25 przymocowanej do strzykawki o pojemności 1 ml i dodać ją do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 10 μl 0,5 M EDTA.
    Uwaga: Pobranie krwi jest opcjonalne. Osocze może być używane do pomiarów biochemicznych. Leukocyty mogą być używane do testów cytometrii przepływowej.
  4. Za pomocą nożyczek wykonaj małe nacięcie w prawym przedsionku, aby wypuścić mieszaninę krwi i PBS z następnego kroku.
  5. Weź strzykawkę o pojemności 50 ml i napełnij lodowatym PBS (20-30 cm3). Następnie przymocuj igłę 21-25 G do strzykawki, nakłuj lewą komorę na jej wierzchołku (delikatnie trzymając serce między kleszczami) i powoli perfunduj lewą komorę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami o pH 7,4 (PBS) w ciągu 1-2 minut
    Uwaga: Serce blednie natychmiast po pierwszych kilku mililitrach perfuzji. Obserwuj wątrobę pod kątem blanszowania, ponieważ oznacza to, że perfuzja odprowadza krew z wątroby przez powrót żylny przez żyłę główną. Ponadto należy upewnić się, że płuca nie rozszerzają się podczas infuzji, ponieważ wskazuje to na przebicie prawej komory. Jeśli płuca miałyby się rozszerzyć, należy lekko wycofać igłę z powrotem do lewej komory i kontynuować perfuzję. Czas od pierwszego nacięcia do eutanazji wynosi mniej niż 2 minuty

2. Rozwarstwienie nerek

  1. Po zakończeniu perfuzji użyj nożyczek i kleszczy, aby wypreparować prawą nerkę z jej przyczepów (naczyń krwionośnych, tłuszczu i nadnerczy) i wyciąć.
  2. Delikatnie usunąć kapsułkę zakrywającą nerkę, przecinając ją i preparując kleszczami. Zważ nerkę.
    Uwaga: Ważenie nerki jest opcjonalne. Jednak niektóre eksperymenty mogą spowodować zmianę rozmiaru/masy nerki, która może być wykorzystana do normalizacji wydajności komórek na gram tkanki.
  3. Po zważeniu nerki umieścić ją w 1 ml RPMI-1640 zawierającym 0,5% FBS lub roztworze buforowym do barwienia metodą cytometrii przepływowej (50 ml stożkowa probówka z nakrętką) i umieścić probówkę na lodzie do dalszego użycia.
    Uwaga: Dla ułatwienia opisu opiszemy resztę izolacji komórek odpornościowych w roztworze buforowym barwiącym cytometrię przepływową. Ponadto opiszemy izolację komórek odpornościowych z pojedynczej nerki, chociaż obie nerki lub 1 + 1/3 nerki mogą być używane w zależności od dalszych eksperymentów (opcjonalnie). 1/3 nerki może zostać zamrożona do eksperymentów białkowych/RNA, a 1/3 może zostać umieszczona w do immunohistochemii lub transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

3. Homogenizacja nerek

  1. Oznacz worek do homogenizacji o pojemności 5-80 ml informacjami identyfikującymi próbkę, wyjmij wewnętrzne sitko (STR) i wyrzuć je. Napełnij worek 5 ml lodowatego roztworu buforowego do barwienia cytometrii przepływowej i przenieś nerkę do buforu. Powtórz ten proces dla drugiej próbki lub większej liczby próbek, które wymagają przetworzenia.
  2. Złóż worek homogenizacyjny na pół, tak aby w jednej połowie nerka była zanurzona w roztworze buforu barwiącego cytometrii przepływowej, a druga połowa była po prostu złożona na niej.
  3. Włącz homogenizator tkanek i ustaw go na szybkie (ustawiające) obroty. Umieść złożony worek homogenizacyjny z nerką skierowaną w stronę łopatki, blisko dolnej krawędzi, ale upewnij się, że dolny koniec torebek nie zsuwa się poniżej dolnej krawędzi łopatek.
    1. Przetwarzaj drugą próbkę jednocześnie, ponieważ są 2 łopatki. Wybierz czas jako 120 sek. Obserwuj, jak łopatki poruszają się do przodu i do tyłu, aby homogenizować nerki.
      Uwaga: W międzyczasie ten przestój można wykorzystać do przygotowania 2 dodatkowych próbek nerek (lub innych tkanek), podczas gdy pierwsze dwie są przetwarzane.
  4. Po zakończeniu pierwszego zestawu homogenizacji przenieś torebki do lodu i ponownie załaduj homogenizator tkankowy następnym zestawem próbek i tak dalej. Wizualnie upewnij się, że nerki są odpowiednio homogenizowane i nie są widoczne żadne duże kawałki.
    Uwaga: Ogólnie rzecz biorąc, 2 minuty w homogenizatorze tkankowym przy szybkich obrotach są wystarczające dla nerki.
  5. Umieść sitko o wielkości 100 μm w stożkowej probówce o pojemności 50 ml na lodzie. Następnie należy całkowicie odpipetować homogenat na sitko do komórek. Ustawić wirówkę podłogową na 50 x g na 1 minutę w temperaturze 4 °C i załadować próbki do wirówki.
    Uwaga: Wirowanie zapewni, że cały homogenat (zawierający komórki) przeszedł przez sitko do komórek.
  6. Wyjmij probówki z wirówki i umieść je z powrotem na lodzie. Wyrzuć sitka do komórek i zachowaj homogenat. Dodać równą objętość (~ 6 ml) 1x buforu do lizy RBC do osadu/supernatantu komórkowego i kilkakrotnie pipetować w górę iw dół, aby uzyskać jednolitą zawiesinę komórek. Wizualnie zauważ, że część czerwonego koloru w zawieszeniu natychmiast się zmniejsza. Pozostaw probówki na lodzie na 5 minut, aby osiągnąć maksymalną lizę RBC.
    Uwaga: etap lizy RBC można pominąć, jeśli badacz jest pewien perfuzji nerek i pożądana jest mniejsza manipulacja komórkami. Zaobserwowaliśmy znaczny wzrost wydajności komórek nerkowych poprzez niepoddawanie zawiesiny komórek lizie RBC.
  7. Obracać probówki w wirówce ustawionej na 500 x g, 4 °C przez 5 minut, aby utworzyć osad komórek.
    Uwaga: W krokach 3.6 i 3.7 przygotuj się do wirowania w gradionym gradieniu gęstości na bazie krzemionki koloidalnej (Percoll).
    1. Weź 10 ml okrągłodennych probówek polipropylenowych i oznacz je odpowiednimi numerami próbek, a następnie umieść je w stojaku na probówki.
      Uwaga: Poniżej opisano, jak uzyskać wystarczającą ilość odczynników gradientu gęstości dla 4 próbek nerek.
    2. Pobrać 7 ml roztworu buforowego do barwienia metodą cytometrii przepływowej i odpipetować do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodać 1 ml 2 M sacharozy, aby przygotować 0,25 M sacharozy.
    3. Następnie pobrać 7,2 ml odczynnika o gradiencie gęstości i odpipetować go do kolejnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodać 1,55 ml roztworu buforowego do barwienia cytometrii przepływowej i 1,25 ml 2 M sacharozy, aby przygotować odczynnik o gradiencie gęstości 72% i 0,25 M sacharozy.
    4. Odpipetować 1 ml odczynnika o gradiencie gęstości 72% do jednej probówki polipropylenowej o okrągłym dnie dla każdej próbki.

4. Wirowanie gradientowe

  1. Po kroku 3.7 wyjmij probówki i delikatnie zdekantuj supernatant jednym płynnym ruchem, a także zdekantuj następną kroplę cieczy, która powstaje, gdy probówka jest trzymana do góry nogami.
    Uwaga: Ten krok jest ważny, ponieważ pozostawienie nadmiaru cieczy może zmienić gradient gęstości na tyle, aby spowodować różnice w wydajności. Po ponownym ustawieniu probówki w pozycji pionowej z osadem komórkowym pozostaje ~ 200-300 μl płynu.
  2. Odpipetować 1 ml 0,25 M sacharozy na osad komórkowy i delikatnie, ale energicznie pipetować w górę i w dół, aby doprowadzić komórki do jednolitej zawiesiny. Następnie dodać zawiesinę komórek do 1 ml odczynnika o gradientzie gęstości 72% (3.7.4) i ponownie energicznie pipetować, aby wymieszać komórki w celu utworzenia odczynnika o gradiencie gęstości 36%.
  3. Pobrać 1 ml odczynnika o gradiencie gęstości 72% do polipropylenowej pipety Pasteura (transferowej). Przy równomiernym nacisku na bańkę (utrzymuje kolumnę cieczy w końcówce i zapobiega tworzeniu się pęcherzyków), delikatnie włóż pipetę Pasteura do dna zawiesiny komórek (odczynnik o gradinie gęstości 36%) i rozładuj odczynnik o gradiencie gęstości 72%, aby utworzyć wyraźną, cięższą warstwę.
  4. Delikatnie pobrać probówki z próbkami i umieścić je w wirówce, która na tym etapie ma temperaturę pokojową. Wirować przez 20-30 min przy 500 x g.
  5. W międzyczasie przygotuj kolejne dwa zestawy polipropylenowych probówek wirówkowych z okrągłym dnem z odpowiednimi identyfikatorami próbek.
  6. Po zakończeniu kroku 4.4 delikatnie wyjmij próbkę zawierającą rurki polipropylenowe, przy minimalnym wstrząsaniu i połóż ją na stojaku na probówki.
  7. Podnieś pierwszą probówkę z próbką i odpowiadającą jej pustą probówkę. Za pomocą polipropylenowej pipety Pasteura, delikatnie, ale dokładnie z odmierzonym odsysaniem, usuń górną "warstwę śmieci" lub "lepki materiał" i włóż go do pustej probówki wirówkowej z okrągłym dnem.
    1. Kontynuuj usuwanie górnej części gradientu, aż do osiągnięcia "kożuchowego płaszcza" (może wydawać się białawy z czerwonawym odcieniem [czerwone krwinki]). Przestań ssać, jeśli osiągnięta zostanie wysokość ~3 mm od "kożuchowego płaszcza".
      Uwaga: Upewnij się, że ten materiał całkowicie zniknął z górnej części gradientu przed kontynuowaniem ssania.
  8. Weź świeżą pipetę Pasteura i świeżą probówkę wirówkową z okrągłym dnem i delikatnie usuń kożuchową powłokę. Kontynuuj odsysanie 3 - 5 mm poniżej otoczki kożuchowej, aby upewnić się, że większość komórek została zebrana i dodana do 2. nowej probówki z okrągłym dnem o odpowiednim identyfikatorze próbki.
  9. Dodać 1-2 ml roztworu buforu barwiącego do cytometrii przepływowej do drugiej probówki i dokładnie wymieszać, pipetując w górę iw dół.
  10. Wirować komórki w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Drugietap płukania roztworem buforu barwiącego cytometrię przepływową jest opcjonalny. Zawiesić ponownie w 500 μl roztworu buforowego barwiącego cytometrię przepływową i przystąpić do zliczania komórek za pomocą hemocytometru.

5. Opcjonalnie (etykietowanie komórek)

  1. Zbacz każdą próbkę dla tej samej liczby komórek. Dodać przeciwciało blokujące w rozcieńczeniu 0,5 μg na 10-6 komórek (anty-CD16/CD32 FcR) i inkubować na lodzie przez 15 minut.
  2. Dodaj pożądany koktajl pierwszorzędowych przeciwciał (sprzężonych z odpowiednimi fluoroforami), które zostały określone jako dobrze ze sobą współpracujące przez badacza, przed właściwymi eksperymentami. Inkubować na lodzie przez 30 minut. Umyj komórki za pomocą PBS.
    Uwaga: Aby zademonstrować znakowanie komórek odpornościowych nerek na potrzeby tego manuskryptu, użyliśmy limfocytów T i panelu makrofagów / komórek dendrytycznych. Panel limfocytów T składał się z Fixable Viability Stain FVS510, anty-CD45 (klon: 30-F11) BV421, Anti-Foxp3 (klon: FJK-16s) APC, Anti-CD127 (klon: A7R34) PE/Cy7, anty-CD44 (klon: IM7) PerCP/Cy5.5, anty-CD4 (klon: RM4-5), APC-Cy7, anty-CD8 (klon: 53-6,7) BV785. Panel makrofagów składał się z Fixable Viability Stain FVS510, anty-CD45 (klon: 30-F11) BV421, Anti-Ly6G (klon: 1A8) FITC, Anti-CD11b (klon: M1/70) PerCP-Cy5.5, Anti-F4/80 (klon: BM8) APC, Anti-CD11c (klon: N418) BV785.
  3. Dodaj Fixable Viability Stain i pozostaw na stole na 5 minut. Umyj komórki roztworem buforowym do barwienia cytometrii przepływowej, aby usunąć nadmiar możliwej do naprawienia plamy żywotności.
  4. Dodać odczynnik do utrwalania/permeabilizacji i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Przemyć w roztworze do utrwalania.
  5. W przypadku barwienia wewnątrzkomórkowego ponownie zablokuj anty-CD16/32 FcR przez 10 minut. Dodaj plamy wewnątrzkomórkowe i inkubuj przez 20-30 min. Przemyć 2x w roztworze przepuszczalnym.
  6. Zawiesić w roztworze buforu barwiącego cytometrię przepływową i przepuścić próbki przez maszynę FACS 3,9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Liczba paneli, które można przeprowadzić, zależy od liczby komórek odpornościowych, które można niezawodnie wyekstrahować z nerek. W niniejszej pracy demonstrujemy możliwość przeprowadzenia 2 paneli: jednego dla limfocytów T i jednego dla makrofagów/komórek dendrytycznych. W panelu dla limfocytów T najpierw analizujemy wzorzec rozproszenia światła przedniego (FSC) i bocznego (SSC) i wyznaczamy populację docelową, jak pokazano na Rysunku 1 (wykres kropkowy w górnym lewym r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiliśmy tutaj metodologię pozyskiwania komórek odpornościowych z nerki w niezawodny i skuteczny sposób. Główna modyfikacja szeroko stosowanego etapu trawienia kolagenazy (mechaniczne rozerwanie tkanki) pozwala zaoszczędzić około 30 minut, a izolacja dużej liczby żywotnych komórek odpornościowych zajmuje mniej niż dwie godziny dla 4 próbek nerek. Co więcej, w zależności od naszego pytania badawczego, używamy teraz tylko jednej nerki (druga nerka może być użyta do analizy białek za pomocą Western Blot, immunohistoc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez Research Grant od Dialysis Clinics Inc. oraz przez University of Missouri Research Board Grant.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stomacher 80 System laboratoryjny BiomasterSeward
Stomacher 80 Klasyczne workiSewardBA6040/STR
Sorvall Legend XFR WirówkaThermo ScientificLub równoważny sprzęt 
HemocytometrMikroskopia elektronowa Nauki63514-11
Analityczny cytometr przepływowyBD LSR-X20 Fortessa
Percoll SigmaP1644
Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami 1x (DPBS)Gibco, Life Technologies14190-250
Rurki polipropylenowe, bez nasadkiBecton Dickinson352002
Fixable Viability StainBD Biosciences FVS510,  564406
Anty-CD16/32 (Klon: 93)EBioscience14-0161
anty-CD45 (klon: 30-F11)  BV421 BD Pharmingen103133/4
Anti-Foxp3 (Klon: FJK-16s) APCEBioscience17-5773
Anty-CD127 (Klon: A7R34) PE/Cy7Biolegend135013/4
anty-CD44 (Klon: IM7) PerCP/Cy5.5Biolegend103031/2
anty-CD4 (Klon: RM4-5) APC-Cy7Biolegend100413/4
anty-CD8 (Klon: 53-6.7) BV785Biolegend100749/50
Anti-Ly6G (Klon: 1A8) FITCBiolegend127605/6
Anti-CD11b (Klon: M1/70) PerCP-Cy5.5Biolegend101227/8
Anti-F4/80 (Klon: BM8) APCBiolegend123115/6
Anti-CD11c (Klon: N418) BV785Biolegend117335/6
Anti-CD301 (Klon: LOM-14) PE-Cy7Biolegend145705/6
Anti-CD26 (Klon: H194-112) PEBiolegend137803/4
100 μ Filtr M Fisher Scientific22363548
Rurki Fisherbrand 50 mlFisherLub równoważne wyposażenie 
Rurki Fisherbrand 15 mlFisherLub równoważne wyposażenie 
SacharozaFisher chemicznaS5-3
Pipeta transferowa z cienką końcówkąSamco Scientific232Lub równoważny sprzęt 
Cytometria przepływowa Roztwór buforowy do barwieniaEBioscience00-4222-26Lub równoważny sprzęt 
1x bufor do lizy RBCEBioscience00-4333-57Lub równoważny sprzęt 

Bibliografia

  1. Ascon, D. B., et al. Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury. J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).
  2. Ascon, M., et al. Renal ischemia-reperfusion leads to long term infiltration of activated and effector-memory T lymphocytes. Kidney Int. 75 (5), 526-535 (2009).
  3. Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (6), 1363-1377 (2015).
  4. Chen, Z., et al. Collagenase digestion down-regulates the density of CD27 on lymphocytes. J. Immunol. Methods. 413, 57-61 (2014).
  5. Dong, X., et al. Resident dendritic cells are the predominant TNF-secreting cell in early renal ischemia-reperfusion injury. Kidney Int. 71 (7), 619-628 (2007).
  6. Hickey, F. B., Martin, F. Diabetic kidney disease and immune modulation. Curr. Opin. Pharmacol. , (2013).
  7. Kawakami, T., et al. Resident renal mononuclear phagocytes comprise five discrete populations with distinct phenotypes and functions. J. Immunol. 191 (6), 3358-3372 (2013).
  8. Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp. Ther. Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
  9. Picot, J., Guerin, C. L., Le Van, K. C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
  10. Ricardo, S. D., van, G. H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J. Clin. Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
  11. Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Herrera-Acosta, J., Johnson, R. J. Role of immunocompetent cells in nonimmune renal diseases. Kidney Int. 59 (5), 1626-1640 (2001).
  12. Vielhauer, V., et al. Efficient renal recruitment of macrophages and T cells in mice lacking the duffy antigen/receptor for chemokines. Am. J. Pathol. 175 (1), 119-131 (2009).
  13. Weisheit, C. K., Engel, D. R., Kurts, C. Dendritic Cells and Macrophages: Sentinels in the Kidney. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. , (2015).
  14. Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
  15. Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
  16. Zhou, J., Nagarkatti, P., Zhong, Y., Nagarkatti, M. Immune modulation by chondroitin sulfate and its degraded disaccharide product in the development of an experimental model of multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 223 (1-2), 55-64 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Cytometria przepływowawirowanie w gradiencie gęstościmechaniczna dysocjacja tkanekfrakcja naczyniowo-stromalnaizolacja komórekprotokół perfuzjiliza erytrocytówizolacja warstwy leukocytarnejwielokolorowa cytometria przepływowa
Niezawodna i wysokowydajna izolacja komórek odpornościowych nerek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.