Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Inżynieria genetyczna niekonwencjonalnych drożdży do produkcji biopaliw odnawialnych i biochemicznych

14.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54371

⸱

20 września 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2NUS Synthetic Biology for Clinical and Technological Innovation (SynCTI), Life Sciences Institute, National University of Singapore, 3Food Science and Chemical Engineering, Singapore Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszym opisujemy metody molekularnej manipulacji genetycznej szczepu Yarrowia lipolytica Po1g w celu poprawy efektywności delecji genów. Powstałe w ten sposób zmodyfikowane szczepy Y. lipolytica mają potencjalne zastosowania w produkcji biopaliw i biochemii.

Streszczenie

Yarrowia lipolytica to niepatogenny, dymorficzny i ściśle tlenowy gatunek drożdży. Ze względu na swoje charakterystyczne cechy fizjologiczne i metaboliczne, te niekonwencjonalne drożdże są nie tylko dobrym modelem do badania fundamentalnej natury różnicowania grzybów, ale są również obiecującą platformą mikrobiologiczną do produkcji biochemicznej i różnych zastosowań biotechnologicznych, które wymagają rozległych manipulacji genetycznych. Jednak manipulacje genetyczne Y. lipolytica były ograniczone ze względu na brak wydajnego i stabilnego systemu transformacji genetycznej, a także bardzo wysokie wskaźniki rekombinacji niehomologicznej, które można przypisać głównie genowi KU70. W tym miejscu przedstawiamy łatwy i szybki protokół skutecznej transformacji genetycznej i delecji genu w Y. lipolytica Po1g. W pierwszej kolejności ustalono protokół efektywnej transformacji egzogennego DNA w Y. lipolytica Po1g. Po drugie, aby osiągnąć zwiększoną szybkość podwójnej krzyżowej rekombinacji homologicznej w celu dalszej delecji genów docelowych, gen KU70 został usunięty przez przekształcenie kasety rozrywającej zawierającej ramiona homologii 1 kb. Po trzecie, aby zademonstrować zwiększoną skuteczność delecji genu po delecji genu KU70, indywidualnie usunęliśmy 11 docelowych genów kodujących dehydrogenazę alkoholową i oksydazę alkoholową, stosując te same procedury na szczepie platformy nokautującej KU70. Zaobserwowano, że szybkość precyzyjnej rekombinacji homologicznej znacznie wzrosła z mniej niż 0,5% dla delecji genu KU70 w Po1g do 33%-71% dla pojedynczej delecji genu 11 genów docelowych w Po1g KU70Δ. Skonstruowano replikacyjny plazmid przenoszący marker oporności higromycyny B i system Cre / LoxP, a gen markera selekcyjnego w szczepach nokautujących drożdży został ostatecznie usunięty przez ekspresję rekombinazy Cre, aby ułatwić wiele rund ukierunkowanych manipulacji genetycznych. Powstałe w ten sposób mutanty delecji pojedynczego genu mają potencjalne zastosowanie w produkcji biopaliw i biochemii.

Wprowadzenie

W przeciwieństwie do Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, niekonwencjonalne drożdże, mogą rosnąć w postaci drożdży lub grzybni w odpowiedzi na zmiany warunków środowiskowych 1,2. Tak więc te drożdże dymorficzne mogą być wykorzystane jako dobry model do badania różnicowania, morfogenezy i taksonomii grzybów 3,4,5. Jest ogólnie uważany za bezpieczny (GRAS) gatunek drożdży, który jest szeroko stosowany do produkcji różnych dodatków do żywności, takich jak kwasy organiczne, polialkohole, związki aromatyczne, emulgatory i środki powierzchniowo czynne 6,7,8,9. Jest to obowiązkowy tlenowce i dobrze znane drożdże oleiste zdolne do naturalnej akumulacji lipidów w dużych ilościach, tj. do 70% suchej masy komórek 10. Może również wykorzystywać szerokie spektrum źródeł węgla do wzrostu, w tym różnego rodzaju pozostałości w zasobach odpadowych jako składniki odżywcze 11,12,13. Wszystkie te unikalne cechy sprawiają, że Y. lipolytica jest bardzo atrakcyjna do różnych zastosowań biotechnologicznych.

Chociaż cała sekwencja genomu Y. lipolytica została opublikowana 14,15, manipulacja genetyczna tych niekonwencjonalnych drożdży jest bardziej złożona niż w przypadku innych gatunków drożdży. Po pierwsze, transformacja tego gatunku drożdży jest znacznie mniej wydajna ze względu na brak stabilnego i wydajnego systemu transformacji genetycznej 16,17. Po drugie, pracochłonna integracja genomowa kaset ekspresji liniowej jest powszechnie stosowana do ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania, ponieważ w tych drożdżach nie znaleziono naturalnego systemu plazmidów episomalnych 18. Po trzecie, generowanie genetycznych nokautów i knock-inów jest ograniczone, ponieważ skuteczność celowania genu poprzez dokładną rekombinację homologiczną w tych drożdżach jest niska, a większość zdarzeń integracji zachodzi poprzez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) 19.

W tym badaniu opisujemy zoptymalizowany protokół transformacji dla szczepu Y. lipolytica Po1g, który jest łatwy, szybki, wydajny i powtarzalny. Aby zwiększyć częstotliwość precyzyjnej rekombinacji homologicznej, usunęliśmy gen KU70, który koduje kluczowy enzym w szlaku NHEJ. Korzystając ze zoptymalizowanego protokołu transformacji i przekształcając liniową kasetę nokautującą zawierającą flankujące regiony homologii o wielkości 1 kb, gen KU70 Y. lipolytica Po1g został pomyślnie usunięty. Solidność tej metodologii delecji genów została następnie wykazana poprzez celowanie w geny dehydrogenazy alkoholowej i oksydazy alkoholowej w szczepie Po1g KU70Δ. Zaobserwowano, że szczep delecji KU70 wykazywał znacznie wyższą skuteczność celowania genów za pośrednictwem rekombinacji homologicznej niż szczep Po1g typu dzikiego. Ponadto skonstruowano replikacyjny plazmid ekspresji Cre przenoszący marker oporności higromycyny B w celu ratowania markera. Uratowanie markera ułatwia wiele rund celowania w geny w uzyskanych mutantach delecji genów. Oprócz delecji genów, nasz protokół transformacji genetycznej i delecji genów opisany tutaj może być stosowany do wstawiania genów do określonych loci oraz do wprowadzania mutacji specyficznych dla miejsca do genomu Y. lipolytica.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Generacja szczepu delecji Y. lipolytica KU70

  1. Budowa kasety zakłócającej
    Uwaga: W Tabeli 1 przedstawiono wszystkie startery stosowane w amplifikacjach reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
    1. Zaprojektuj startery od 20 do PCR, amplifikuj kasetę ekspresji LEU2 (patrz Tabela 1) z wektora ekspresji Y. lipolytica i wprowadzaj miejsca LoxP do końców 5' i 3' kasety LEU2 za pomocą startera o długim przodzie (# 1; Tabela 1) i długi odwrócony starter (# 2; Tabela 1). Aby wprowadzić dodatkowe miejsce z ograniczeniami dla kolejnych kroków procesu klonowania, dodaj witrynę ograniczeń BamHI w primerze #1.
    2. Przeprowadzić PCR przy użyciu polimerazy DNA o wysokiej wierności, jak opisano w Tabeli 2.
    3. Oczyść kasetę produktu PCR LoxP-promotor-LEU2-terminator-LoxP za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Dodać zwisy 3'-A do oczyszczonego produktu PCR zgodnie z instrukcjami producenta 21. Użyj ligazy DNA T4 do ligacji produktu A-tailed PCR do wektora klonowania TA w celu uzyskania plazmidu T-LEU2 zgodnie z tabelą 3.
    4. PCR amplifikuje sekwencję 1 kb 5' w górę genu KU70 przy użyciu starterów # 3/# 4 z genomowego DNA Y. lipolytica Po1g 22 zgodnie z tabelą 2. Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta.
      1. Podwójne trawienie zarówno oczyszczonego produktu PCR, jak i plazmidu T-LEU2 za pomocą enzymów SacII i BamHI zgodnie z tabelą 4. Oczyść mieszaninę wytrawiającą za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj ligazy DNA T4 do ligacji oczyszczonego i strawionego produktu PCR do miejsc SacII/BamHI T-LEU2 w celu uzyskania plazmidu T-LEU2-5E, zgodnie z tabelą 3.
    5. PCR amplifikuje sekwencję 1 kb 3' w dół genu KU70 przy użyciu starterów # 5/# 6 z genomowego DNA Y. lipolytica Po1g 22 zgodnie z tabelą 2. Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Podwójne trawienie zarówno oczyszczonego produktu PCR, jak i plazmidu T-LEU2-5E z enzymami NotI i NdeI, zgodnie z tabelą 4.
      1. Oczyść mieszaninę wytrawiającą za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie podwiązać oczyszczony i strawiony produkt PCR do miejsc NotI/NdeI T-LEU2-5E, aby uzyskać plazmid T-KO przy użyciu ligazy DNA T4, zgodnie z tabelą 3.
    6. Roztrawić plazmid T-KO enzymami SacII i NdeI, zgodnie z tabelą 4, aby wytworzyć kasetę rozrywającą (ryc. 1). Oczyść strawione fragmenty DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Właściwe przygotowanie komórek i transformacja szczepu Y. lipolytica Po1g
    1. Właściwe przygotowanie komórek
      1. Zaszczepić kolonię szczepu Y. lipolytica Po1g ze świeżej płytki z ekstraktem drożdżowym-peptonem-dekstrozą (YPD) w 10 ml pożywki YPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 2% dekstrozy i 50 mM buforu cytrynianowego o pH 4,0) w kolbie o pojemności 100 ml. Inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C przy prędkości obrotowej 225 obr./min przez 20 godzin, aż do nasycenia (OD600 około 15, mierzone za pomocą spektrofotometru).
      2. Granulować komórki, wirując przez 5 minut przy 5 000 x g w temperaturze pokojowej. Przemyć komórki 20 ml buforu Tris-EDTA (TE) (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5) i zawiesić komórki zgodnie z opisem w kroku 1.2.1.2. Zawiesić komórki w 1 ml 0,1 M octanu litu (pH 6,0, dostosowany kwasem octowym) i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
      3. Podzielić właściwe komórki (100 μl) do sterylnych probówek o pojemności 1,5 ml. Natychmiast należy przejść do poniższych etapów przemiany lub dodać glicerol do końcowego stężenia 25% (v/v) i przechowywać w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania.
    2. przekształcenie
      1. Delikatnie wymieszać 10 μl zdenaturowanego DNA plemników łososia (10 mg/ml) i 1-5 μg oczyszczonej kasety rozrywającej ze 100 μl kompetentnych komórek i inkubować w temperaturze 30 °C przez 15 min.
      2. Dodać 700 μl 40% glikolu polietylenowego (PEG)-4000 (rozpuszczonego w 0,1 M octanu litu o pH 6,0), dobrze wymieszać i inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 30 °C przy 225 obr./min przez 60 min.
        Uwaga: Ważne jest, aby używać PEG o średniej masie cząsteczkowej 4000, zamiast PEG-3350 (zwykle stosowanego w przemianach konwencjonalnych drożdży).
      3. Mieszaninę przemian należy poddać szokowi cieplnemu, umieszczając probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 39 °C na 60 minut.
      4. Dodać 1 ml pożywki YPD i odmowywać przez 2 godziny w temperaturze 30 °C i 225 obr./min. Wirować przy 9 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu TE.
      5. Ponownie zagnieździć komórki przez odwirowanie przy 9 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w 100 μl buforu TE i płytce na selektywnych płytkach (np. płytkach z niedoborem leucyny) i inkubować w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni.
      6. Wybrać od 4 do 10 pojedynczych kolonii i zaszczepić oddzielnie w 2 ml pożywki YPD. Inkubować przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 30 °C przy prędkości 225 obr./min. Zidentyfikuj dodatnie kolonie za pomocą analizy PCR genomowego DNA z transformantów 22 zgodnie z tabelą 5 przy użyciu dwóch zestawów starterów # 55/# 56 i # 56/# 57, odpowiednio.
        Uwaga: Niezlinearyzowany wektor pYLEX1 jest przekształcany w komórki kompetentne Y. lipolytica Po1g w celu określenia wydajności transformacji poprzez zliczenie liczby jednostek tworzących kolonie (cfu) na μg użytego plazmidowego DNA 23.

2. Na ratunek znacznikowi

  1. Budowa plazmidu ekspresji Cre
    1. Budowa pomp pYLEX1-CRE i pYLEX1-HPH
      1. Zaprojektuj startery 20 do PCR wzmacniają otwarte ramki odczytu cre i hph. Dodaj dodatkowy nukleotyd adeninowy przed kodonami start w starterach do przodu # 82 i # 84 i wstaw miejsca restrykcyjne KpnI poniżej kodonów stop w starterach odwrotnych # 83 i # 85. PCR wzmacnia otwarte ramki odczytu cre i hph z pSH69 (numer dostępu HQ412578) 24 zgodnie z tabelą 2.
      2. Oczyść zarówno fragmenty cre, jak i hph za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Trawić zarówno oczyszczone fragmenty cre, jak i hph enzymem KpnI zgodnie z tabelą 4. Podwójnie trawić plazmid pYLEX1 enzymami PmlI i KpnI, zgodnie z tabelą 4. Oczyść mieszaninę wytrawiającą za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta.
      3. Użyj ligazy DNA T4 zgodnie z tabelą 3 do ligacji oczyszczonych i strawionych fragmentów cre i hph do miejsc PmlI/KpnI wektora ekspresyjnego Y. lipolytica, dając odpowiednio pYLEX1-CRE i pYLEX1-HPH.
    2. Budowa pSL16-CRE-HPH
      1. PCR amplifikuje kasetę promotor-terminator genu cre z pYLEX1-CRE przy użyciu starterów # 86/# 87 otaczających miejsca restrykcyjne SalI/PstI, zgodnie z tabelą 2. Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta.
        1. Podwójnie trawić zarówno oczyszczony produkt PCR, jak i plazmid 25 pSL16-CEN1-1 (227) z enzymami SalI i PstI, zgodnie z tabelą 4. Oczyść mieszaninę wytrawiającą za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie podwiązać oczyszczony i strawiony produkt PCR do pSL16-CEN1-1 (227) w odpowiednich miejscach, aby wytworzyć pSL16-CRE przy użyciu ligazy DNA T4, jak podano w tabeli 3.
      2. PCR amplifikuje kasetę terminatora genu promotora hph z pYLEX1-HPH za pomocą starterów # 88/# 89 flankujących miejsca restrykcyjne XhoI/BglII, zgodnie z tabelą 2. Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta.
        1. Podwójnie trawić zarówno oczyszczony produkt PCR, jak i plazmid pSL16-CRE enzymami XhoI i BglII zgodnie z tabelą 4. Oczyść mieszaninę wytrawiającą za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie podwiązać oczyszczony i strawiony produkt PCR do pSL16-CRE w odpowiednich miejscach, aby wytworzyć pSL16-CRE-HPH przy użyciu ligazy DNA T4, zgodnie z tabelą 3.
          Uwaga: Otrzymany plazmid ekspresji Cre, pSL16-CRE-HPH, zawiera wybieralny marker higromycyny B i jest wektorem centromerowym i episomalnym replikującym (Figura 2).
      3. Sprawdzić wszystkie konstrukty przez trawienie z odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi (np. SalI/PstI, w celu wycięcia insertu z wektora) zgodnie z tabelą 4.
  2. Ratowanie markerów za pośrednictwem rekombinazy Cre
    1. Przekształć pSL16-CRE-HPH w kompetentne komórki szczepu nokautującego KU70 zgodnie z protokołem transformacji opisanym w sekcji 1.2 powyżej. Komórki przekształcić na płytce YPD plus higromycyna B (YPDH) (zawierające 400 μg/ml higromycyny B) i inkubować w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni.
    2. Przeprowadzić PCR kolonii zgodnie z tabelą 5 przy użyciu starterów # 84/# 85 w celu zidentyfikowania dodatnich kolonii zawierających plazmid pSL16-CRE-HPH po transformacji.
      Uwaga: Starter do przodu # 84 i starter do tyłu # 85 znajdują się wewnątrz regionu kodującego genu hph (Tabela 1). Tylko dodatnie klony generują specyficzny produkt PCR w reakcji PCR.
    3. Wybrać dodatni klon i zaszczepić w 2 ml pożywki YPDH, a następnie inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C przy 225 obr./min przez noc do nasycenia. Zmierz średnicę zewnętrznej komórki600 za pomocą spektrofotometru. Zbierz komórki przy OD600 ~15. Wirować przy 5 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i przemyć raz 2 ml sterylnej wody.
    4. Ponownie zaszczepić komórki w 2 ml pożywki YPD o początkowym OD600 wynoszącym 0,1 i pozwolić komórkom rosnąć w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C przy 225 obr./min przez noc. Umieść nocną hodowlę komórkową na płytkach YPD, aby wyizolować pojedyncze kolonie 23. Repliki kolonii płytek na płytkach YPD, YPDH i z niedoborem leucyny 23,
      Uwaga: Kolonie, które utraciły zarówno marker LEU2, jak i plazmid pSL16-CRE-HPH, mogą rosnąć tylko na płytkach YPD (ryc. 3).

3. Usunięcie genów dehydrogenazy alkoholowej i oksydazy alkoholowej

  1. Przeszukaj bazę danych genomu Y. lipolytica za pomocą narzędzia Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), aby zidentyfikować kandydatów na geny do delecji 26. Wprowadź sekwencję białka dehydrogenazy alkoholowej I S. cerevisiae do wyszukiwarki BLAST (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa).
    Uwaga: Narzędzie wyszukiwania BLAST zwraca najbardziej podobne sekwencje białek w bazie danych genomu Y. lipolytica.
  2. Skonstruować kasety delecyjne metodą PCR ze starterami od # 7 do # 56 (Tabela 1) i przeprowadzić reakcje trawienia i ligacji enzymów restrykcyjnych przy użyciu tych samych metod, jak opisano w sekcji 1.1 powyżej.
  3. Przygotować kompetentne komórki szczepu nokautującego KU70, przeprowadzić transformacje i przeprowadzić PCR w celu identyfikacji dodatnich kolonii ze starterami # 55, # 58 do # 81 (Tabela 1), postępując zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 1.2 powyżej.
    Uwaga: Jako przykład, procedura delecji genu YALI0E17787g jest opisana na rysunkach 4 i 5. Opisano wpływ regionu homologicznego o długości 1 kb i 2 kb na szybkość rekombinacji homologicznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zlinearyzowany wektor ekspresyjny Y. lipolytica został wprowadzony do platformy dokującej pBR w genomie szczepu Y. lipolytica Po1g poprzez przeprowadzenie pojedynczej rekombinacji krzyżowej 27. Dzięki zastosowaniu szybkiej procedury transformacji chemicznej opracowanej w niniejszym badaniu, zlinearyzowany wektor ekspresyjny Y. lipolytica został pomyślnie przekształcony do szczepu dzikiego Po1g z wydajnością transformacji >100 cfu/µg DNA. Kaseta kno...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Naszym celem w tym badaniu jest umożliwienie szybkiego i wydajnego generowania celowanych nokautów genów w szczepie Y. lipolytica Po1g. Aby to osiągnąć, należy wziąć pod uwagę kilka kwestii. Po pierwsze, wymagana jest wysoka wydajność transformacji. W związku z tym w pracy opisano skuteczny i wygodny protokół przemiany chemicznej dla szczepu Y. lipolytica Po1g. Zastosowanie PEG-4000 jest kluczowym czynnikiem dla udanej transformacji tego szczepu. Nie uzyskano transformantów do transformacji pla...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy za wsparcie finansowe ze strony Narodowej Agencji Środowiska Singapuru (ETRP 1201102), Konkurencyjnego Programu Badawczego Narodowej Fundacji Badawczej Singapuru (NRF-CRP5-2009-03), Agencji ds. Nauki, Technologii i Badań Singapuru (1324004108), Globalnego Programu Projektów R&D, Ministerstwa Gospodarki Opartej na Wiedzy, Republiki Korei (N0000677), Agencji Redukcji Zagrożeń Obronnych (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) oraz Inicjatywa Biologii Syntetycznej Narodowego Uniwersytetu Singapuru (DPRT/943/09/14).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik/Materiał
Startery oligonukleotydoweZintegrowane technologie25 nmole DNA oligos
Y. lipolytica szczep Po1gYeastern Biotechauksotroficzny pochodna leucyny typu dzikiego szczepu W29 (ATCC 20460)
Wektor pYLEX1Yeast BiotechFYY203-5MGY. lipolytica wektor ekspresyjny
E. coli TOP10InvitrogenDo klonowania i rozmnażania plazmidów
wektor pGEM-T Wektor klonowaniaPromegaA3600
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106Do izolacji plazmidu
Wizard SV Gel i
PCR Clean-Up System		PromegaA9282Ekstrahuj fragmenty DNA z żeli agarozowych
i oczyszczaj produkty PCR z reakcji amplifikacji
Polimeraza DNA iProof o wysokiej wierności
Bio-Rad172-5302Polimeraza DNA o wysokiej wierności
BamHI New England BiolabsR0136SEnzym restrykcyjny
BglII New England BiolabsR0144LEnzym restrykcyjny
KpnINew England BiolabsR0142SEnzym restrykcyjny
NdeI New England BiolabsR0111SEnzym restrykcyjny
NotINew England BiolabsR0189LEnzym restrykcyjny
PmlINew England BiolabsR0532SEnzym restrykcyjny
PstI New England BiolabsR0140SEnzym restrykcyjny
SacIINew England BiolabsR0157SEnzym restrykcyjny
SalINew England BiolabsR0138SEnzym restrykcyjny
XhoINew England BiolabsR0146LEnzym restrykcyjny
Ligaza DNA T4New England BiolabsM0202L
Taq DNA polimeraza i nbsp;Bio-RadM0267L
AmpicylinaGibco-Life Technologies11593-027Antybiotyki
Higromycyna BPAAP21-014Antybiotyki
GeneRuler 1 kb Drabinka DNAThermo ScientificSM03121 kb Drabinka DNA
PEG4000Sigma95904-F
TrisPromegaH5135
EDTABio-Rad161-0729
DNA plemników łososiaInvitrogen15-632-011
Octan lituSigma
Kwas octowyKoraliki szklane Sigma
(425-600 &mikro; m)SigmaG8772
RNAza AThermo ScientificEN0531
Barwnik ładujący DNAThermo ScientificR0611
Ekstrakt z drożdży baktonowychBD212750
Bacto PeptoneBD211677
D-Glucose1st BaseBIO-1101
YNB bez aminokwasówSigmaY0626
DO Suplement-LeuClontech630414
GlycerolSigmaG5516
Difco LB BulionBD244620
Difco LB AgarBD244520
Bacto AgarBD214010
Sprzęt
Maszyna do PCRBioradT100 Termocykler
Łaźnia wodnaMemmertWNB 14
Inkubator stacjonarny/wytrząsającyYihderLM-570RD
Wytrząsarkatermiczna AllshengMS-100
MikrowirówkaEppendorf5424R
WirówkaEppendorf5810R
SpektrofotometrEppendorf BioPhotometer plus
Żelowy imagerGEAmersham Imager 600
DNA TA

Bibliografia

  1. Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M. Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis. J, R. uiz-H. errera , 58-66 (2012).
  2. Coelho, M., Amaral, P., Belo, I. Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology. Méndez-Vilas, A. , 930-940 (2010).
  3. Martinez-Vazquez, A., et al. Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Plos One. 8 (6), e66790(2013).
  4. Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).
  5. Flores, C. L., Martìnez-Costa, O. H., Sánchez, V., Gancedo, C., Aragòn, J. J. The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene. Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).
  6. Domìnguez, Á, et al. Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production. Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).
  7. Zinjarde, S. S. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chem. 152, 1-10 (2014).
  8. Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects. Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).
  9. Groguenin, A., et al. Genetic engineering of the β-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds. J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).
  10. Meng, X., et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms. Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).
  11. Papanikolaou, S., Aggelis, G. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture. Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).
  12. Tai, M., Stephanopoulos, G. Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production. Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).
  13. Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future. Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).
  14. Liu, L., Alper, H. S. Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host. Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).
  15. Dujon, B., et al. Genome evolution in yeasts. Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).
  16. Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).
  17. Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica. J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).
  18. Matsuoka, M., et al. Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica. Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).
  19. Kretzschmar, A., et al. Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining. Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).
  20. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998(2012).
  21. Kobs, G. Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems. Promega Notes. 62, 15-18 (1997).
  22. JoVE Science Education Database. Isolating Nucleic Acids from Yeast. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast (2016).
  23. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064(2012).
  24. Hegemann, J. H., Heick, S. B. Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).
  25. Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission. J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).
  26. McGinnis, S., Madden, T. L. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).
  27. Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).
  28. Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones. J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Yarrowia lipolyticarekombinacja homologicznadelecja genuknockout KU70transformacja DNAsystem Cre loxPprodukcja biopaliwukierunkowana dysrupcja genu
Inżynieria genetyczna niekonwencjonalnych drożdży do produkcji biopaliw odnawialnych i biochemicznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.