Wysokowydajna identyfikacja polimerów odstraszających bakterie do wyrobów medycznych

Podsumowanie

Opisano wysokoprzepustową metodę mikromatrycową do identyfikacji polimerów, które redukują wiązanie powierzchni bakteryjnej na urządzeniach medycznych.

Streszczenie

Urządzenia medyczne są często kojarzone z zakażeniami szpitalnymi, które stanowią ogromne obciążenie dla pacjentów i systemu opieki zdrowotnej, a także przyczyniają się do oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. Jednym z możliwych sposobów na ograniczenie infekcji związanych z urządzeniami jest identyfikacja odpornych na bakterie powłok polimerowych dla tych urządzeń, które zapobiegałyby wiązaniu się bakterii na początkowym etapie mocowania. Opisano tutaj metodę identyfikacji takich odstraszających polimerów, opartą na równoległym przesiewaniu setek polimerów za pomocą mikromacierzy. Ta wysokoprzepustowa metoda pozwoliła na zidentyfikowanie szeregu obiecujących polimerów, które były odporne na wiązanie różnych klinicznie istotnych gatunków bakterii pojedynczo, a także jako społeczności wielogatunkowe. Jeden polimer, PA13 (poli(metakrylan metylu-ko-dimetyloakrylamid)), wykazał znaczne zmniejszenie przyczepiania wielu izolatów szpitalnych po nałożeniu na dwa dostępne na rynku cewniki do żył centralnych. Opisana metoda może być zastosowana do identyfikacji polimerów w szerokim zakresie zastosowań, w których istotna jest modyfikacja przyczepiania się bakterii.

Wprowadzenie

Mikromacierze polimerowe to zminiaturyzowane platformy o wysokiej przepustowości, w których do 7 000 polimerów¹ jest drukowanych na szkiełkach podstawowych do równoległej analizy z komórkami prokariotycznymi lub eukariotycznymi². Przedstawiona tutaj metoda opiera się na tej, którą po raz pierwszy opisaliśmy w 2010 roku³. Ten system badań przesiewowych został zastosowany do wielu typów komórek, w tym ludzkich hepatocytów⁴, komórek macierzystych⁵, komórek nabłonka kanalików nerkowych², bakterii^3,6 i patogenów pierwotniaków⁷. W każdym^{przypadku zidentyfikowano} polimery, które sprzyjają wiązaniu badanych komórek lub są im przeciwstawne8. Kompleksy DNA z syntetycznymi polimerami polikationowymi wykorzystano również w formacie mikromacierzy do wysokoprzepustowych badań przesiewowych kandydatów do transfekcji genów⁹. Oprócz badań przesiewowych pod kątem interakcji komórka-substrat, mikromacierze polimerowe wykorzystano również do oceny właściwości materiału¹⁰.

Zdolność syntetycznych polimerów do modulowania przyczepiania bakterii do powierzchni jest dobrze znana^3,6,11. Wiadomo, że wiele czynników, w tym ładunek, hydrofobowość i chropowatość powierzchni polimeru, wpływa na wiązanie bakteryjne. Konwencjonalne podejścia polegające na odkrywaniu biomateriałów, które są odporne na wiązanie bakterii, poprzez sekwencyjne lub empiryczne projektowanie i testowanie jednego materiału na raz, są pracochłonne, kosztowne i czasochłonne. Mikromacierze polimerowe stanowią atrakcyjną alternatywę dla obejścia takich ograniczeń.

Bakterie związane z powierzchnią rosną jako złożona populacja określana jako biofilm - takie biofilmy są wysoce odporne na wiele stresów środowiskowych i antybiotyków. Wynika to po części z ich gęstej macierzy zewnątrzkomórkowej (złożonej z białek, polisacharydów i kwasów nukleinowych)¹², a po części ze zwiększonej obecności wytrzymałych komórek "trwałych" w biofilmach¹³. Chociaż dokładne mechanizmy asocjacji powierzchniowej i późniejszego tworzenia biofilmu są trudne do scharakteryzowania, ogólnie uważa się, że istnieją trzy różne etapy wzrostu powierzchniowego^14-16. Po początkowym, odwracalnym przyczepieniu następuje silniejsza adhezja komórek, utworzenie biofilmu poprzez produkcję białka zewnątrzkomórkowego i matrycy polisacharydowej oraz proliferacja komórek. Wreszcie, dojrzały biofilm uwalnia wolno żyjące komórki planktonowe, które mogą inicjować nowe infekcje w innych miejscach. Polimery odpychające bakterie, które zapobiegają początkowemu przyczepianiu się bakterii, a tym samym zapobiegają wczesnym etapom tworzenia się biofilmu, potencjalnie stanowią doskonałe rozwiązanie w celu zminimalizowania infekcji. Biorąc pod uwagę wzrost oporności na antybiotyki (a także z natury większą oporność bakterii związanych z^{powierzchnią12}), szczególnie interesujące są niezawierające antybiotyków środki ograniczania zakażeń. W warunkach szpitalnych odstraszające bakterie powłoki polimerowe mogą mieć bezpośrednie zastosowanie medyczne w ograniczaniu zakażeń szpitalnych, które często tworzą się wokół wszczepionych wyrobów¹⁷.

Tutaj opisana jest wysokoprzepustowa metoda badania przesiewowego 381 polimerów pod kątem działania odstraszającego przeciwko szeregowi bakterii chorobotwórczych związanych z infekcjami szpitalnymi, po której następuje walidacja trafień, a następnie powlekanie i oznaczanie materiałów cewnika do żyły centralnej (Rysunek 1). Krótko mówiąc, polimery naniesiono na szkiełka pokryte agarozą za pomocą druku kontaktowego, a po wysuszeniu i sterylizacji zminiaturyzowane matryce inkubowano z klinicznie ważnymi kulturami bakterii. Po inkubacji mikromacierze delikatnie przemyto, a przylegające komórki bakteryjne wybarwiono i uwidoczniono za pomocą fluorescencji. Następnie polimery, które hamowały wiązanie bakterii, badano na większą skalę poprzez powlekanie na szkiełkach nakrywkowych i wizualizację za pomocą mikroskopii elektronowej. Wybrane polimery odstraszające zostały następnie pokryte komercyjnymi cewnikami i wykazano, że zmniejszają one przyczepianie się bakterii prawie 100-krotnie.

Protokół

1. Przygotowanie preparatów pokrytych agarozą

UWAGA: Przed wytworzeniem mikromacierzy polimerowych, szkiełka szkiełkowe pokryte aminoalkilosilanem są powlekane agarozą I-B, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie tła i umożliwić ocenę polimerów, które wiążą lub odstraszają bakterie⁶. Powłoka silanowa ułatwia wiązanie agarozy ze szkiełkami.

1. Uzupełnić 2% (m/v) roztwór agarozy I-B w wodzie destylowanej w butelce o pojemności 250 ml.
2. Po luźnym zamknięciu butelki zawiesinę podgrzewać w kuchence mikrofalowej przez 30 sekund, aż do rozpuszczenia. Upewnij się, że nasadka nie jest szczelnie zamknięta, aby uniknąć potencjalnego wzrostu ciśnienia. Regularnie wyjmuj butelkę i delikatnie obracaj.
3. Upewnij się, że ciało stałe się rozpuściło, a roztwór jest klarowny. Wlać ten roztwór agarozy do zlewki o pojemności 100 ml i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C, aby uzyskać płynny roztwór.
4. Zanurz szkiełka pokryte silanem w roztworze agarozy, zapewniając równomierne pokrycie, i przetrzyj tylną część szkiełka bibułką.
5. Szkiełka należy suszyć powlekaną stroną do góry w środowisku wolnym od kurzu (np. w szafce lub dygestorium) przez co najmniej 24 godziny.
6. Potwierdzić jednolitą powłokę przez oględziny. Powłokę można łatwo ocenić, wdychając ją na szkiełko — na niepowlekanych obszarach utworzy się kondensacja. Do drukowania mikromacierzy należy używać wyłącznie szkiełek pokrytych całkowicie i równomiernie.

2. Przygotowanie roztworów polimerowych do druku

1. Przygotować roztwory (1% w/v) wybranych wstępnie uformowanych polimerów składających się z poliakrylanów, poliakryloamidów i poliuretanów w N-metylopirolidonie (NMP) w szklanych fiolkach. (przygotować 1 ml każdego polimeru). Wirować, aż polimer całkowicie się rozpuści. Synteza polimerów jest opisana w innym miejscu⁶.
2. Za pomocą mikropipety napełnij każdą studzienkę płytki mikrodołkowej 384 roztworem polimeru o objętości 25 μl, upewniając się, że nie ma zanieczyszczenia krzyżowego, a każda studzienka zawiera unikalny polimer. Użyj NMP jako kontroli negatywnej w co najmniej 2 studzienkach. Zapisz tożsamość roztworu polimeru w każdym dołku na szablonie płytki studzienki lub pliku arkusza kalkulacyjnego.

3. Drukowanie mikromacierzy polimerowych za pomocą drukarki kontaktowej

UWAGA: Drukowanie mikromacierzy odbywało się za pomocą drukarki stykowej. Szczegółowe instrukcje dotyczące drukowania mikromacierzy polimerowych znajdują się poniżej. Aby uzyskać ogólne wskazówki dotyczące korzystania z drukarki i zalecenia dotyczące bezpieczeństwa, postępuj zgodnie z instrukcją obsługi producenta. Chociaż korzystamy z drukarki kontaktowej, można również użyć odpowiedniego ręcznego urządzenia do stemplowania.

1. Zgodnie z zaleceniami zawartymi w instrukcji obsługi drukarki utwórz procedurę (patrz krok 3.3), która umożliwia drukowanie 384 cieczy (roztworów polimerów lub NMP) w poczwórnych odstępach, przy użyciu 32-pinowej głowicy mikromacierzującej (ułożonej jako 8 rzędów i 4 kolumny).
2. Wydrukuj 1 536 miejsc podzielonych na 48 wierszy i 32 kolumny. Zaprogramuj procedurę tak, aby drukowała w 12 sekcjach, tj. 32 roztworach na raz, tak aby drukarka mogła zostać zatrzymana po wydrukowaniu każdej sekcji, aby umożliwić oczyszczenie pinów.
3. Aby utworzyć procedurę drukowania:
   1. Otwórz oprogramowanie i z dostępnych opcji wybierz "Utwórz nową rutynę". Wybierz kartę "Opis", aby wprowadzić szczegółowe informacje o eksperymencie. Wybierz zakładkę "Głowica" i wybierz "32-pinowa głowica mikromacierzy".
   2. Wybierz zakładkę 'Źródło' i wybierz uchwyt płyty (uchwyt płyty źródłowej (1x5)), typ płyty (płyta 384 x 6 000), łączne tabliczki (1) i kolejność źródeł (według kolumn).
   3. W zakładce 'Projekt slajdu' wybierz 'Slajd 3x1'' i wybierz ustawienie według 'Numer pola'. Następnie wybierz 'Wzorzec szyku'. Wprowadź "Widok punktowy" jako "układ" i "Wymiary wzoru" jako "Liczba wierszy" (6), "Liczba kolumn" (8), "Rozstaw wierszy" (750) i "Rozstaw kolumn" (560). Wybierz jedną sekcję do wydrukowania jako pierwszą.
   4. W zakładce "Układ slajdów" wprowadź liczbę slajdów używanych do drukowania. Wybierz zakładkę 'Drukuj', aby wprowadzić parametry drukowania (liczba stempli na farbę: 1, liczba stempli na punkt: 5, czas stemplowania: 200 ms, czas tuszowania: 100 ms).
      UWAGA: Stworzono teraz procedurę drukowania 384 cieczy (roztworów polimerów lub NMP) w poczwórnych odstępach, przy użyciu 32-pinowej głowicy mikromacierzującej (ułożonej jako 8 rzędów i 4 kolumny). W sumie program powinien wydrukować 1 536 punktów ułożonych w 48 rzędów i 32 kolumny o rozstawie rzędów 750 μm i rozstawie kolumn 560 μm.
4. Umieść prowadnice pokryte agarozą na platformie i upewnij się, że jest dobrze uszczelnione próżniowo, aby utrzymać prowadnice na miejscu.
5. Wyreguluj głowicę drukującą tak, aby wszystkie kołki znajdowały się na tej samej wysokości. Sprawdź to, ręcznie opuszczając głowicę na szklaną szkiełko i upewniając się, że kołki przesuwają się w tym samym czasie. Jeśli występują jakiekolwiek rozbieżności z wysokością, wyreguluj za pomocą tulei na sworzniu w górę lub w dół.
6. Umieść płytkę studzienkową na uchwycie talerza we właściwej orientacji, tj. studzienka A1 znajduje się w prawym górnym rogu uchwytu i upewnij się, że płytka studzienki jest mocno zamocowana.
7. Za pomocą regulatora wysokości upewnij się, że wysokość uchwytu płytki jest taka, aby podczas pobierania roztworów polimerowych kołki nie dotykały dna studzienek.
   UWAGA: Jest to ważne dla równomiernego plamienia polimeru, a także dla uniknięcia rozlania roztworów polimerów do sąsiednich studzienek, powodując w ten sposób zanieczyszczenie krzyżowe.
8. Wybierz zakładkę "Start" i wybierz "Typ uruchamiania" jako "Normalny". Kliknij "Uruchom" i potwierdź, że szkiełko, płytka studzienki itp. są na swoim miejscu, gdy zostaniesz o to poproszony.
9. Drukuj 1 sekcję na raz (32 roztwory na raz; 12 sekcji), co pozwala na czyszczenie pinów między sekcjami. Dokładnie wyczyść szpilki ręcznikiem papierowym zamoczonym w acetonie, a następnie suchą bibułą, aby upewnić się, że szpilki są całkowicie suche.
10. Po zakończeniu drukowania mikromacierzy umieść je w uchwycie na szkiełka i wysusz przez noc w piecu próżniowym ustawionym na 45 °C, aby usunąć NMP z plam polimerowych. Po sterylizacji światłem UV przez 30 minut, mikromacierze są gotowe do zaszczepienia bakterii.
11. Przed zaszczepieniem szkiełek bakteriami należy wykonać pomiar fluorescencji tła (zgodnie z opisem w punkcie 5). Użyj tego pomiaru w obliczeniach wiązania bakteryjnego.

4. Inokulacja mikromacierzy polimerowych bakteriami

UWAGA: Upewnij się, że masz dobrą technikę aseptyczną. Wszelkie obchodzenie się z kulturami powinno odbywać się w sterylnym środowisku: albo przy użyciu palnika Bunsena, albo w okapie przepływowym. Kultury powinny być uprawiane z dostępnością tlenu, podłożem wzrostowym i temperaturą dostosowaną do wymagań każdego gatunku.

1. Przygotuj nocne kultury, zaszczepiając 5 ml bulionu Luria-Bertani (LB: 10 g ^L-1 bakto-tryptonu, 5 g ^L-1 NaCl i 10 g ekstraktu drożdżowego ^L-1) kolonią z talerza. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 200 obr./min.
2. Przygotować wywar z nocnych kultur zamrażarkowych przez dodanie glicerolu (stężenie ogólne 10%) i przechowywać wywar w temperaturze -80 °C.
3. W celu określenia liczby komórek z próbek rozmrożonych zasobów bakteryjnych, należy wykonać seryjne rozcieńczenia każdego z nich i hodować bakterie przez noc na pożywkach stałych. Dokładne określenie liczby komórek w stadach zapewnia odpowiednią inokulację każdego gatunku⁶.
4. Przygotować inokulant do mikromacierzy. Kultury jednogatunkowe są uprawiane jak powyżej i stosowane bezpośrednio do mikromacierzy. BacMix-1 jest mieszaniną bakteryjną Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus) i Staphylococcus aureus (S. aureus). BacMix-2 jest mieszaniną bakteryjną składającą się z Streptococcus mutans (S. mutans), S. aureus, K. pneumoniae i Enterococcus faecalis (E. faecalis).
5. Aby uzyskać mieszaną kulturę, należy wymieszać przez noc w równych objętościach (po 3 ml każda) i rozcieńczyć czterokrotnie świeżym LB (do około 50 ml końcowej objętości).
6. Umieścić mikromacierze polimerowe sterylizowane promieniami UV na prostokątnych płytkach 4-dołkowych i inkubować je z 6 ml mieszanych kultur bakteryjnych w temperaturze 37 °C z delikatnym mieszaniem (30 obr./min) przez 5 dni.
7. Po inkubacji delikatnie przepłukać mikromacierze dwukrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄) i inkubować roztworem 1 μg ^ml-1 barwienia 4',6-diamidyn-2-fenyloindolowego (DAPI) w PBS przez 30 min.
8. Umyj zabarwione szkiełka do mikromacierzy na świeżej płytce studzienki, przykrywając PBS i delikatnie obracając, zmieniając PBS jeden raz. Suszyć pod strumieniem powietrza. Nałóż szklane szkiełko nakrywkowe na szkiełko do mikromacierzy i uszczelnij za pomocą kleju. Po wyschnięciu wysterylizuj zewnętrzną powierzchnię 70% (v/v) etanolem.
9. Bezpiecznie utylizuj kultury zgodnie z ich poziomem hermetyczności.

5. Obrazowanie i analiza mikromacierzy

1. Rejestruj pojedyncze obrazy dla każdej plamki polimerowej w kanałach jasnego pola i DAPI (Ex/Em = 358 nm / 361 nm). Zrób to ręcznie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub za pomocą automatycznego mikroskopu fluorescencyjnego (ze stolikiem X-Y-Z sterowanym przez oprogramowanie do akwizycji obrazu) wyposażonego w obiektyw 20X.
   UWAGA: Zapoznaj się z instrukcją¹⁸, aby uzyskać informacje na temat obsługi oprogramowania i regulacji mikroskopu w celu uzyskania obrazów przy użyciu kanałów jasnego pola i DAPI. Upewnij się, że wzmocnienie i czas naświetlania obrazu dla wszystkich mikromacierzy są takie same.
2. Uzyskaj średnią intensywność fluorescencji każdego punktu w kanale DAPI, wybierając obszar plamki i określając ilościowo fluorescencję za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu.
3. W celu uzyskania fluorescencji tła każdej plamki należy uzyskać obrazy plamek polimerowych na kontruplikowanej mikromacierzy inkubowanej tylko z pożywką bez bakterii. Odejmij fluorescencję tła od intensywności plamki, aby uzyskać fluorescencję od bakterii.
4. Oblicz średnią wartość znormalizowaną z czterech plamek reprezentujących każdy polimer, używaną do porównywania wiązania bakterii różnych polimerów⁶.
5. Polimery, które wykazują najmniejsze wiązanie bakteryjne (najniższą fluorescencję), należy zidentyfikować jako polimery "trafione"⁶.

6. Powlekanie szkiełek nakrywkowych w celu walidacji "trafienia"

1. Aby pokryć szkiełka nakrywkowe polimerami:
   1. Przygotować roztwory polimerów "trafionych" (~2% w/v) w tetrahydrofuranie (THF) lub innym odpowiednim rozpuszczalniku.
   2. Okrągłe szkiełka nakrywkowe o odpowiedniej wielkości należy wirować roztworami polimerowymi za pomocą powlekarki wirowej z prędkością 2.000 obr./min przez 10 sek.
      UWAGA: W przypadku braku powlekarki wirowej, szkiełka nakrywkowe lub inne materiały mogą być powlekane zanurzeniowo, chociaż powlekanie wirowe zapewnia bardziej jednolitą powierzchnię.
   3. Pokryte szkiełka nakrywkowe wysuszyć w piecu konwekcyjnym w temperaturze 40 °C przez noc i sterylizować światłem UV przez 30 minut przed zaszczepieniem bakterii.
2. Aby pokryć szkiełka nakrywkowe agarozą w celu kontroli negatywnej:
   1. Szkiełka nakrywkowe czyścić metodą obróbki plazmowej przez 10 minut lub zanurzając w 1 M NaOH na 4 godziny.
   2. Zanurz szkiełka nakrywkowe w acetonitrylu zawierającym 1% (3-aminopropylo) trietoksysilan na noc. Szkiełka nakrywkowe należy 3 razy oczyścić acetonem i wstawić do piekarnika (100 °C) na 1 godzinę.
   3. Zanurz wysuszone szkiełka nakrywkowe w 1% wodnym roztworze agarozy utrzymywanym w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C. Umieść szkiełka nakrywkowe pokryte agarozą na płaskiej powierzchni w warunkach otoczenia wolnego od kurzu na 24 godziny i sterylizuj światłem UV przez 30 minut przed zaszczepieniem bakterii.

7. Dołączanie i analiza kartki nakrywkowej za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM)

1. Po sterylizacji światłem UV przez 30 minut, umieścić szkiełka nakrywkowe (szkło pokryte polimerem/agarozą lub niepowlekane) na standardowej płytce 12-dołkowej lub 24-dołkowej (w zależności od wielkości szkiełek nakrywkowych) i inkubować z bakteriami, jak opisano w sekcji 4.
2. Po inkubacji z bakteriami przemyć niepowlekane i powlekane szkiełka nakrywkowe dwukrotnie 0,1 M buforem kakodylowym (pH 7,4), a następnie utrwalić 2,5% (w/v) aldehydem glutarowym w 0,1 M buforze kakodylowym (pH 7,4) przez 2 godziny.
3. Próbki po utrwaleniu należy poddać tetratlenkowi osmu o stężeniu 1% (w/v) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i odwodnić sekwencyjnym płukaniem etanolem w temperaturze 50, 70, 90 i 100% (v/v) przez 30 minut każde.
4. Suche próbki w CO₂ zgodnie z protokołami^{standardowymi 19}. Czas schnięcia będzie zależał od rodzaju próbki.
5. Pokryj próbki stopem złota/palladu (60/40%) za pomocą napylarki o natężeniu prądu 30 mA i próżni o sile 0,75 Torr. Zbadaj pod mikroskopem elektronowym zgodnie ze standardowymi protokołami²⁰.
   UWAGA: Należy zapewnić odpowiednie środki ostrożności w celu zarządzania ryzykiem wynikającym z przechowywania, obchodzenia się i usuwania tetratlenku osmu, ponieważ jest on wysoce toksyczny.
6. Porównaj wizualnie obrazy niepowlekanych szkiełek nakrywkowych z tymi pokrytymi agarozą lub polimerami "uderzonymi", aby potwierdzić zdolność polimerów do wiązania/odpychania bakterii.
   UWAGA: Opór przyczepu powinien być łatwo widoczny jako zmniejszenie obecnych komórek.
7. Do badań powlekania wyrobami medycznymi należy wybrać najbardziej obiecujące polimery niewiążące typu "hit"6
.

8. Wybór rozpuszczalnika do powlekania cewników

1. Oceń różne rozpuszczalniki pod kątem ich kompatybilności z częścią cewnika na stałe, a także ich zdolności do rozpuszczania "uderzającego" polimeru. Wytnij części kat. 1 i na cylindryczne kawałki o długości 5 mm i zmierz za pomocą cyfrowej suwmiarki z noniuszem.
2. Oceń różne rozpuszczalniki, takie jak kwas octowy, amoniak, aceton, acetonitryl, eter dietylowy, tetrahydrofuran (THF), dimetyloformamid (DMF), N-metylo-2-pirolidon (NMP), etanol, metanol, glikol etylenowy, toluen i ksylen. Zanurz fragmenty cewnika w rozpuszczalnikach na 12 godzin i oceń wizualnie integralność cewnika i klarowność rozpuszczalnika.
   UWAGA: Wybierz rozpuszczalnik, który nie powoduje pęcznienia lub rozpadu cewników ani nie powoduje zmętnienia rozpuszczalnika. Rozpuszczalnik musi rozpuścić "uderzone" polimery.

9. Analiza przyczepu bakterii do cewników za pomocą mikroskopii konfokalnej

1. Przygotować 2,5% (m/v) roztwory polimerów w acetonie lub innym odpowiednim rozpuszczalniku, jak określono w sekcji 8. Umieścić kawałki cewnika o średnicy 5 mm w małych szklanych fiolkach (5 ml) i zanurzyć je w 1 ml roztworu polimeru na 2 minuty. Usunąć nadmiar roztworu polimeru i wysuszyć kawałki cewnika przez noc w piecu próżniowym w temperaturze 40 °C.
2. Przygotuj inokulum, mieszając rozmrożone wywary bakteryjne, aby uzyskać około 10⁶ komórek każdego gatunku w 50 ml LB⁶.
3. Sterylizować powlekane i niepowlekane kawałki cewnika światłem UV przez 30 minut i inkubować z 1 ml zaszczepionego LB na 24-dołkowej płytce, w temperaturze 37 °C przez 3 dni, delikatnie mieszając⁶.
4. Po inkubacji przemyć cewniki PBS (2x, 2 ml), utrwalić bakterie 10% paraformaldehydem w PBS przez 30 minut i przemyć PBS (1 ml). Wybarwić bakterie na elementach cewnika DAPI (1 μg ml⁻¹) przez 20 minut i przemyć PBS (1 ml).
5. Uzyskaj obrazy konfokalne fragmentów cewnika przy użyciu następujących ustawień: niebieski laser diodowy 405 nm, zakres detektora od 414 do 502 nm, otwór na pin - Airy1, rozmiar obrazu - 1 024 × 1 024 pikseli, szerokość woksela - 105,2 nm, rozstaw stosów Z 0,5 μm, powiększenie - 40X 1,25.
6. Uzupełnij obrazowanie konfokalne, umieszczając 50 obrazów w Z na cewniku o długości 100 μm.
7. Przeanalizuj obrazy za pomocą odpowiedniego oprogramowania analitycznego: spłaszcz obrazy ułożone w stos Z w płaszczyźnie Z, korzystając z funkcji rozszerzania głębi ostrości, aby utworzyć pojedynczy obraz fragmentu cewnika.
   UWAGA: Obraz ten należy następnie przeanalizować w celu uzyskania obszaru cewnika pokrytego bakteriami, po korekcji tła za pomocą funkcji "spłaszcz tło".

10. Analiza przyczepiania bakterii do cewników przez SEM

1. Przygotować 10% roztwór polimeru (w/v) w acetonie.
2. Wciśnij końcówkę pipety (dla mikropipety 200 μl) w środkową część odciętego kawałka cewnika, aby go przytrzymać, a następnie zanurz końcówkę w roztworze polimeru na około 30 sekund. Suszyć powlekany kawałek w warunkach otoczenia przez 30 minut. Nałożyć drugą warstwę, ponownie zanurzając ją w roztworze polimeru i schnąć przez noc w warunkach otoczenia.
3. Po poddaniu działaniu promieniowania UV i inkubacji z bakteriami umyj kawałki (n = 3) PBS (2x, 1 ml) i przenieś je na 48-dołkowe płytki zawierające 10% formaldehydu w PBS przez 30 min. Po utrwaleniu umyj kawałki PBS (1 ml), wysusz przez noc w temperaturze pokojowej, zamontuj na króćcach z przewodzącymi krążkami węglowymi i pokryj złotem za pomocą powlekarki rozpylającej (patrz krok 7.5).
4. Uzyskiwanie obrazów za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego⁶.

Wyniki

Rysunek 2 pokazuje przyczepienie się bakterii (znormalizowana intensywność fluorescencji) do wielu polimerów, jak określono za pomocą analizy mikromacierzy. Plamy drukowane bez polimeru (tylko NMP) są kontrolą negatywną, ponieważ agaroza jest silnie odporna na wiązanie bakteryjne⁶ — zarejestrowana fluorescencja jest bardzo niska. Wszystkie prezentowane polimery mają słabe wiązanie, chociaż w większości przypadków właściwości odstraszające polimeru różnią się znacznie w zależności od badanego gatunku bakterii. Odzwierciedla to duże różnice między mechanizmami przywiązania u różnych gatunków. Wybór odpowiedniego polimeru jest zatem zależny od zastosowania, ale polimery o niskiej wartości wiązania można łatwo zidentyfikować w porównaniu z agarozą. Polimery o wysokim stopniu wiązania mogą zostać zidentyfikowane w macierzy i mogą być wykorzystane jako kontrole pozytywne w kolejnych eksperymentach. W przypadku polimerów, które nie wykazują autofluorescencji w kanale DAPI, można dokonać jakościowego porównania obrazów plamek (jak pokazano na rysunku 3, podkreślając jeden reprezentatywny polimer o wysokim poziomie wiązania i trzy przykładowe polimery o niskim poziomie wiązania). Takie porównanie, choć dostarcza mniej informacji niż analiza statystyczna, może być użytecznym wizualnym potwierdzeniem obliczonych wartości intensywności.

Z 22 odpowiednimi polimerami zidentyfikowanymi za pomocą mikroukładu, przeprowadzane są eksperymenty zwiększające skalę, aby potwierdzić ich właściwości odstraszające bakterie, gdy są używane do powlekania większych powierzchni. Pokazano przykłady o najlepszych parametrach, stosowane do powlekania szklanych szkiełek nakrywkowych (analizowanych za pomocą SEM (ryc. 4 i 5)) oraz wycinków cewnika (analizowanych za pomocą mikroskopii konfokalnej (ryc. 6) i SEM (ryc. 7)). Obie metody mikroskopowe mają tę zaletę, że umożliwiają bezpośrednie zliczanie komórek na powierzchni, dostarczając jednoznacznych danych; Zmniejszenie przyczepu komórek jest łatwo widoczne. Dalsze badania przeprowadzono w przypadku powłok, które najlepiej zachowały swoje właściwości odstraszające w miarę zwiększania skali, a także były podatne na techniki powlekania na dużą skalę. Przedstawione wyniki ilustrują najlepiej działające polimery na każdym etapie.

Rysunek 1: Etapy identyfikacji polimerów odstraszających bakterie za pomocą mikromacierzy polimerowych do zastosowań biomedycznych. SEM = skaningowa mikroskopia elektronowa.

Rysunek 2: Wiązanie bakterii na szeregu polimerów, określone za pomocą analizy mikromacierzy. Słabe wiązanie bakteryjne obserwuje się na wielu poliakrylanach/akrylamidach (PA) i poliuretanach (PU). Wyniki badań mikromacierzy polimerowych z kilkoma gatunkami bakterii (C. jejuni, C. difficile, C. perfringens, S. mutans i dwa konsorcja; BacMix-1 i BacMix-2). Wiązanie bakteryjne wyrażone jako średnia intensywność fluorescencji DAPI skorygowana o tło (znormalizowana). Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Na podstawie odnośnika⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przykładowe obrazy plamek polimerowych. Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej (DAPI) i jasnego pola BacMix-2 pokazujące przyczepienie bakterii do reprezentatywnych polimerów. Dołączono silnie wiążący polimer w celu porównania z kilkoma polimerami niewiążącymi (PU-20, PA-336 i PU-179). Podziałka = 100 μm. Na podstawie odnośnika⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Eksperymenty na dużą skalę ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi. Obrazy SEM przedstawiające przyczepianie się bakterii do szkła niepowlekanego i szkła pokrytego polimerami typu "hit" (przykłady wybrane z tabeli 1). Podziałka = 20 μm.

Ryc. 5: Wiązanie bakteryjne określone ilościowo za pomocą liczby komórek na obrazach SEM. Porównanie ogniw przymocowanych na jednostkę powierzchni powierzchni pokrytych polimerami o najlepszym "trafieniu". Agaroza została użyta jako kontrolna "niewiążąca" powierzchnia, a szkło jako kontrolna powierzchnia wiążąca. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe.

Rycina 6: Porównanie wiązania bakteryjnego na powlekanych i niepowlekanych wycinkach cewnika. Obrazy konfokalne porównujące nieleczony cewnik (cewnik-1) (A) i cewnik pokryty PA13 (B) po inkubacji z BacMix-2. Zdjęcia wykonane obiektywem 40X (podziałka = 20 μm). Na podstawie odnośnika⁶.

Rycina 7: Porównanie wiązania bakteryjnego na powlekanych i niepowlekanych wycinkach cewnika. Obrazy SEM przedstawiają porównanie nieleczonego cewnika (cath-1) (A) i cewnika pokrytego PA13 (B) po inkubacji z koktajlem bakteryjnym składającym się z BacMix-2. Podziałka = 10 μm. Na podstawie odnośnika⁶.

powiedział: (wersja angielska) powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: ) powiedział: powiedział:

polimer	Monomer 1	Monomer 2	Monomer 3	Stosunek monomerów
PA465	MEMA (Massachusetts)	DEAEMA (DEMON)	HEA (HEA)	8	1	1
PA475	MEMA (Massachusetts)	DEAEA (Niemcy)	HEMA	6	1	3
PA513	MEMA (Massachusetts)	DEAEMA (DEMON)	MMA MMA	8	1	1
PA515	MEMA (Massachusetts)	DEAEA (Niemcy)	MMA MMA	6	1	3
PA13	MMA MMA	Protokół DMAA	-	9	1	-
PU1	PEG2000	Usługa HDI	-	Pytanie 4.9	5.2	-
PU16	PEG2000	Mdi	-	Pytanie 4.9	5.2	-
Silnik PU161	PEG2000	Mdi	Bd	Rozdział 2.5	5.2	2.3
PU7	PEG900	BICH	-	Pytanie 4.9	5.2	-
PU83	PEG900	HMDI powiedział:	Bd	Rozdział 2.5	5.2	2.3
Silnik PU227	PPG-PEG-1900	Usługa HDI	-	Pytanie 4.9	5.2	-
PU129	Zobacz materiał PPG425 (Zobacz materiał PPG425	BICH	DMAPD (Język angielski)	Rozdział 2.5	5.2	2.3
PU10	PTMG2000	BICH	-	Pytanie 4.9	5.2	-
Silnik PU179	PTMG2000	Usługa HDI	NMAPD (Język angielski)	Rozdział 2.5	5.2	2.3
PU20	PTMG2000	Mdi	-	Pytanie 4.9	5.2	-
PU5	PTMG2000	Usługa HDI	-	Pytanie 4.9	5.2	-

Tabela 1: Skład bakterii niewiążących polimerów "uderzeniowych" na rysunku 2.

Dyskusja

Przyczepianie się bakterii do powierzchni jest złożonym procesem determinowanym przez szeroki zakres czynników zależnych od gatunku bakterii, właściwości powierzchni, otaczającego podłoża i środowiska fizycznego. Chociaż wiadomo, że niektóre grupy chemiczne wpływają na wiązanie bakteryjne (na przykład poliglikole zwykle są odporne na przyłączenie¹¹), skorelowanie biologicznego wpływu polimerów z ich strukturami chemicznymi jest trudne, co sprawia, że racjonalne projektowanie polimerów dla określonych funkcji jest wyzwaniem. Wobec braku szczegółowych mechanizmów mocowania, inne badania próbowały naśladować naturalnie występujące powierzchnie odstraszające, z długotrwałymi i rozległymi procesami optymalizacji²¹. Przedstawiona tutaj zminiaturyzowana metoda wysokoprzepustowa pokonuje te wyzwania, ułatwiając równoległe badania przesiewowe setek polimerów w celu zidentyfikowania potencjalnych wyników do dalszych badań.

Wyniki uzyskane za pomocą metody mikromacierzy służą przede wszystkim do identyfikacji prawdopodobnych głównych kandydatów. Rysunek 2 ilustruje 22 kandydatów z niskim wiązaniem co najmniej jednego gatunku, podczas gdy rysunek 3 pokazuje wyraźne zmniejszenie zdolności wiązania. Wszystkie 22 polimery o niskim poziomie wiązania pokazane na rysunku 2 zostały poddane eksperymentom na dużą skalę, podczas których najlepsze (pod względem właściwości odpychania i powłoki) określono jako PU83, PA13 i PA515 (rysunki 4 i 5). Poliakrylany oferują większą elastyczność pod względem metod polimeryzacji, dlatego do badań powłok cewnika wybrano poliakrylan o najniższym poziomie wiązania, PA13 (ryc. 6 i 7). Przeprowadzono bardziej szczegółowe dalsze prace nad innymi kandydatami, o których informowano w innym miejscu⁶.

Dzięki wielu iteracjom eksperymentalnym odkryliśmy, że kluczem do sukcesu i powtarzalności jest kilka drobnych kroków. Oprócz ułatwienia przylegania polimerów do szkiełek szkiełkowych, zastosowanie podkładu agarozowego zapewnia czyste tło, ponieważ agaroza jest wysoce odporna na kolonizację bakteryjną. Podobnie niezbędna jest spójność samych plamek polimerowych, zarówno w obrębie tej samej matrycy, jak i między matrycami, dlatego drukowanie matryc musi być dokładnie kontrolowane. Aby zapewnić równomierne plamienie, wymagana jest staranna regulacja pinów w głowicy drukującej, a także równomierne wypełnienie płytki 384-dołkowej. Ponieważ niektóre z użytych przez nas polimerów wykazywały pewien stopień autofluorescencji, niezbędne było zebranie danych dotyczących fluorescencji tła dla każdego preparatu przed inkubacją z bakteriami. Zaleca się, aby uwzględnić różnice i uzyskać wiarygodne repliki mikromacierzy.

Zastosowane tutaj barwienie (DAPI) nie ma selektywności dla gatunków bakterii, wiążąc się niespecyficznie z DNA. Dlatego dobra technika aseptyczna jest niezbędna po wprowadzeniu kultur bakteryjnych, ponieważ zanieczyszczenia mogą pozostać niezauważone, myląc interpretację wyników. To samo odnosi się do późniejszych eksperymentów z użyciem skaningowej mikroskopii elektronowej, gdzie możliwe jest jedynie rozróżnienie pałeczek i ziarniaków, ale nie rodzaju czy gatunku.

Po przeprowadzeniu badań przesiewowych mikromacierzy należy wybrać obiecujące polimery do dalszej walidacji. W przedstawionym przykładzie zidentyfikowano siedem interesujących polimerów na podstawie ich wyraźnego zmniejszenia fluorescencji na mikromacierzy, a ich hamowanie przyczepiania zostało potwierdzone przez pokrycie ich na większych powierzchniach. Rysunki 4 i 5 pokazują zmniejszenie wiązania osiągnięte na szklanych szkiełkach nakrywkowych, co jest praktycznym sposobem testowania zachowania polimerów jako powłok masowych, a nie jako plamek mikromacierzy. Następnie polimery te zostały pokryte powłokami na wyrobach medycznych, aby w pełni określić ilościowo redukcję przyczepiania się bakterii. Ważne jest, aby wybrany rozpuszczalnik (patrz sekcja 8 protokołu) do tych badań powlekania był łagodny dla pożądanego podłoża (w tym przypadku cewnika), zachowując jednocześnie zdolność do rozpuszczania interesującego polimeru, aby umożliwić powlekanie. Tutaj użyliśmy acetonu, który oprócz wymienionych właściwości ma niską temperaturę wrzenia i szybko odparowuje, pozostawiając jednolitą powłokę.

Wybrany sposób walidacji będzie zależał od konkretnego badanego zastosowania. Ponieważ obserwacja komórek za pomocą mikroskopii elektronowej i fluorescencyjnej umożliwia bezpośrednią kwantyfikację przyczepu poszczególnych komórek, wybraliśmy te techniki jako uzupełnienie testu barwienia masowego mikromacierzy. Wyniki przedstawiono na rysunkach 6 i 7, które pokazują znaczenie uzupełniających metod walidacji. Obrazy konfokalne na rycinie 6 zapewniają bardzo wyraźne obrazy pojedynczych komórek, podczas gdy SEM ma dodatkową zaletę polegającą na umożliwieniu oceny powierzchni polimeru, która jest tutaj gładka i jednolita. Metody te są ograniczone polem widzenia używanych mikroskopów, dlatego ważne jest, aby wykonać serię zdjęć, aby mieć pewność co do wyników. Opisana powyżej metoda nie jest w stanie określić ilościowo przylegania bakterii na całej powierzchni, a jedynie wywnioskować pokrycie z kilku małych obszarów. Uważamy, że jest to wystarczające dla opisanej aplikacji. Zmniejszenie wiązania bakteryjnego można ocenić, zliczając bakterie przylegające do powierzchni na całych powlekanych i niepowlekanych częściach cewnika przy użyciu metod opisanych w innym miejscu²². Jednak takie metody wymagają, aby przesiewane powierzchnie biomateriałów miały jednolitą powierzchnię, co jest trudne do utrzymania, gdy testy są wykonywane za pomocą urządzeń medycznych, które często mają złożoną geometrię.

Oczywiste jest, że każdy wyrób przeznaczony do użytku klinicznego musi przejść dalsze badania, aby zapewnić bezpieczeństwo i skuteczność u ludzi. Przedstawiona tu metoda stanowi początek tego procesu, a dalsze prace muszą obejmować potwierdzenie aktywności in vivo . W tym przypadku, badając cewniki żylne, wstępne prace mogą zbadać wiązanie składników krwi i całych komórek z polimerem. Należy również wziąć pod uwagę wpływ składników krwi na wiązanie bakteryjne, w miarę możliwości poprzez powtórzenie testów wiązania w obecności inaktywowanej surowicy lub krwi zdefibrynowanej²³. Ostateczny test technologii odbędzie się w modelu in vivo , takim jak model podskórnego zakażenia implantu²⁴.

Pokazujemy potencjał metody mikromacierzy polimerowej do przesiewania polimerów zmieniających powierzchnię. Takie polimery (zarówno oporne, jak i wspomagające wiązanie bakteryjne) mają wiele zastosowań w medycynie, przemyśle spożywczym i biotechnologii, co oznacza, że metoda ta może być przydatna w wielu obszarach badań. Chociaż w niniejszej pracy wykorzystano bakterie, metodę można dostosować do innych typów komórek, a także innych mikromacierzy chemicznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agaroza	Sigma	05066
Preparaty silanowe	Sigma	S4651
Polimery	syntetyzowane we własnym zakresie	Nie dotyczy
NMP	Sigma	494496
LB Bulion	Oxoid	CM1018
DAPI	Thermo Fisher	D1306
Tetrahydrofuran	Sigma	401757
(3- szkiełka szklane pokryte aminopropylem) trietoksysilanem	Sigma	Silane-prep
Bufor kakodylowy	Sigma	97068
Cewnik 1	Arrow International	CS12123E
Cewnik 2	Baxter Healthcare	ECS1320
Tetroxide osmu	Sigma	201030
Equipment
Drukarka kontaktowa	Genetix	Qarraymini
Mikroskop mikromatrycowy	IMSTAR	Pathfinder
Spin Coater	Speedline Technologies	6708D
Mikroskop konfokalny	Leica	SP5
Oprogramowanie do analizy obrazu	Cybernetyka	Image-Pro Plus
Skaningowy mikroskop	elektronowy Philips	XL30CP
Napylarka	Bal-Tec	SCD050