Oczyszczanie kompleksów natywnych do badań strukturalnych za pomocą metody tandemowego znacznika powinowactwa

Summary

Metoda Tandem Affinity Purification (TAP) była szeroko stosowana do izolowania natywnych kompleksów z ekstraktu komórkowego, głównie eukariotycznego, do proteomiki. W tym miejscu przedstawiamy protokół metody TAP zoptymalizowany pod kątem oczyszczania kompleksów natywnych do badań strukturalnych.

Abstract

Metody oczyszczania powinowactwa okazały się skuteczne w izolowaniu natywnych kompleksów do charakterystyki proteomicznej. Niejednorodność strukturalna i stopień niejednorodności składowej kompleksu zwykle nie hamują postępu w prowadzeniu takich badań. Natomiast kompleks przeznaczony do charakterystyki strukturalnej powinien być oczyszczony w stanie, który jest jednorodny zarówno pod względem składu, jak i struktury, a także w stężeniu wyższym niż wymagane dla proteomiki. W ostatnim czasie nastąpił znaczny postęp w zastosowaniu mikroskopii elektronowej do określania struktury dużych kompleksów makromolekularnych. Spowodowało to wzrost zainteresowania podejściami do oczyszczania natywnych kompleksów o jakości i ilości wystarczającej do określenia struktury za pomocą mikroskopii elektronowej. Metoda Tandem Affinity Purification (TAP) została zoptymalizowana do ekstrakcji i oczyszczania 18-podjednostkowego, ~ 0,8 zespołu rybonukleoproteinowego MDa z pączkujących drożdży (Saccharomyces cerevisiae) nadających się do barwienia ujemnego i kriomikroskopii elektronowej. W niniejszym dokumencie szczegółowo opisano modyfikacje dokonane w metodzie TAP, uzasadnienie wprowadzenia tych zmian oraz podejścia przyjęte do oznaczania jednorodnego składu i struktury kompleksu.

Introduction

Wiele głównych procesów komórkowych jest przeprowadzanych przez duże kompleksy białkowe i białko-RNA¹. Istotnym wąskim gardłem w prowadzeniu badań biofizycznych i strukturalnych takich kompleksów jest uzyskanie ich odpowiedniej jakości (tj. jednorodności) i w odpowiednim stężeniu. Wyizolowanie kompleksu od natywnego źródła ma wiele zalet, w tym zachowanie odpowiednich modyfikacji potranskrypcyjnych i/lub translacyjnych podjednostek oraz zapewnienie prawidłowego składania kompleksu. Jednak duże kompleksy komórkowe są często obecne w komórce przy niskiej liczbie kopii, a oczyszczanie musi być bardzo wydajne i zachodzić w warunkach zbliżonych do fizjo....

Protocol

Uwaga: Następujący protokół został opracowany dla oczyszczania kompleksu z 4 l hodowli komórkowej, około 40 g mokrej masy komórek. Po przygotowaniu wszystkie powinny być przechowywane w temperaturze 4 °C i zużyte w ciągu miesiąca od ich przygotowania. Środek redukujący i inhibitory proteazy są dodawane do tylko tuż przed użyciem.

1. Przygotowanie ekstraktu z całych komórek do tandemowego oczyszczania powinowactwa

1. Wzrost komórek S. cerevisiae
   1. Umieść żądany szczep S. cerevisiae oznaczony jako TAP z miejsca przechowywania (-80 °C) na płytce dekstrozy peptonowej (YPD) drożdży. Inkubować przez 3 - 5 dni (30....

Results

Zmodyfikowana metoda TAP została użyta do oczyszczenia z S. cerevisiae U1 snRNP, 18-podjednostkowego kompleksu rybonukleoproteinowego. Wstępne oczyszczanie kompleksu metodą TAP zgodnie z opublikowanym protokołem^2,3 dało kompleks, który wydawał się niejednorodny, migrując jako trzy pasma na natywnym żelu poliakrylamidowym barwionym srebrem (ryc. 2A). Wielokrotne rundy optymalizacji metody TAP dały kompleks, który migrował głównie jako pojedyncze pasmo n.......

Discussion

Metoda TAP wykorzystuje dwa znaczniki, które równoważą potrzebę ścisłego i selektywnego wiązania z żywicą o powinowactwie z pragnieniem utrzymania warunków zbliżonych do fizjologicznych roztworu. Równowaga ta służy zachowaniu stabilnych interakcji znakowanego białka z czynnikiem (czynnikami) oddziaływania w celu charakterystyki po oczyszczeniu. Ponadto pojedyncze ORF-y znakowane TAP są dostępne ze źródła komercyjnego, dzięki czemu można uzyskać dowolny szczep drożdży z oznakowanym białkiem dla dowolnego kompleksu drożdży.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Szczep oznaczony tagiem S. cerevisiae	TAP Open Biosystems	YSC1177	Jest to główny szczep drożdży użyty do opracowania protokołu TAP. Jego tłem jest S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ 1, leu2 i Delta; 0, met15 i Delta; 0, ura3 i Delta; 0, SNU71::TAP::HIS3MX6
Młynek do kawy	Mr. Coffee	IDS77	Używany do hemocytometru do lizy komórek
, Bright Line	Hausser Scientific	3120	Służy do oceny lizy komórek
Wirnik wirówki JA 9.100	Beckman Coulter, Inc.		Służy do zbierania komórek drożdży
Wirówka o stałym kącie nachylenia JA 20	Beckman Coulter, Inc.		Służy do oczyszczania ekstraktu komórkowego z nierozpuszczalnego materiału komórkowego
Ti 60 wirnik wirówki o stałym kącie	Beckman Coulter, Inc.		Służy do dalszego oczyszczania ekstraktu z komórek rozpuszczalnych
Thermomixer	Eppendorf	R5355	Wytrząsarka z kontrolowaną temperaturą
System żelowy Novex	Thermo Fisher Scientific
Żywica IgG	GE Healthcare	17-0969-01	Sepharose 6 szybkoprzepływna
żywica Calmodulin	Agilent Technologies, Inc.	214303	Żywica Affinity
Koktajl inhibitorów proteazy, mini tabletki	Sigma Aldrich	589297	Mini cOmplete ultra tabletki wolne od EDTA
Koktajl inhibitorów proteazy, duże tabletki	Sigma Aldrich	5892953	cOmplete ultra Tabletki wolne od EDTA
Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)			Rozpuszczony w izopropanolu
2 ml Kolumna Bio-spin	Bio-Rad Laboratoria, Inc.	7326008	Służy do pakowania i mycia kolumny poly-prep z żywicy Calmodulin
10 ml	Bio-Rad Laboratories, Inc.	7311550	Służy do pakowania i mycia żywicy IgG:
Prefabrykaty, natywne żele PAGE Bis-Tris,	Life Technologies	BN1002	Novex, NativePAGE, Bis-Tris 4 - 16% prefabrykowane żele poliakrylamidowe,
standard białka NativeMark	Thermo Fisher Scientific	LC0725	Niebarwiony wzorzec białka stosowany dla natywnego PAGE. Obciążenie 7,5 μ l dla żelu barwionego srebrem i 5 μ l dla SYPRO Żel barwiony rubinowo
Prefabrykaty SDS PAGE Żele Bis-Tris	Life Technologies	NP0321	Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% prefabrykowane żele poliakrylamidowe
PageRuler wzorzec białka	Thermo Fisher Scientific	26614	Niebarwiony wzorzec białka stosowany do Western blotting
SDS running buffer	Life Technologies	NP0001	1x NuPAGE MOPS SDS
Buffer TAP przeciwciało	Thermo Fisher Scientific	CAB1001	Pierwszorzędowe przeciwciało przeciwko znacznikowi CBP
Przeciwciało drugorzędowe	Thermo Fisher Scientific	31341	Kozia anty-królicza fosfataza alkaliczna sprzężona
BCIP/NBT	Thermo Fisher Scientific	34042	5-bromo-4-chloro-3-indolilo-fosforan/nitro niebieski tetrazolium
Jednostki dialazyczne	Thermo Fisher Scientific	88401	Mini jednostki dializacyjne Slide-A-Lyzer
Filtry odśrodkowe, 100kDa MWCO	EMD Millipore	UFC5100008	Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-0,5 z membraną Ultracel-100
Kulki pochłaniające detergenty	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1523920	Absorbanty Bio-bead SM-2
SYBR Green II	Thermo Fisher Scientific	S-7564	Barwnik fluorescencyjny do barwienia kwasów nukleinowych, podczas wykrywania z obecnością rubinu SYPRO należy użyć długości fali wzbudzenia 488 nm i długości fali emisji 532 nm
Rubinowe sondy molekularne	SYPRO	S-12000	Barwnik fluorescencyjny do barwienia białek, podczas wykrywania z obecnością SYBR Green II, należy użyć długości fali wzbudzenia 457 nm i długości fali emisji 670 nm
Siatki miedziane	Mikroskopia elektronowa Nauki	G400-CP