Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie kompleksów natywnych do badań strukturalnych za pomocą metody tandemowego znacznika powinowactwa

9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54389

⸱

27 lipca 2016

 , 
1Department of Biochemistry, Brandeis University, 2Winship Cancer Institute, Emory University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Metoda Tandem Affinity Purification (TAP) była szeroko stosowana do izolowania natywnych kompleksów z ekstraktu komórkowego, głównie eukariotycznego, do proteomiki. W tym miejscu przedstawiamy protokół metody TAP zoptymalizowany pod kątem oczyszczania kompleksów natywnych do badań strukturalnych.

Streszczenie

Metody oczyszczania powinowactwa okazały się skuteczne w izolowaniu natywnych kompleksów do charakterystyki proteomicznej. Niejednorodność strukturalna i stopień niejednorodności składowej kompleksu zwykle nie hamują postępu w prowadzeniu takich badań. Natomiast kompleks przeznaczony do charakterystyki strukturalnej powinien być oczyszczony w stanie, który jest jednorodny zarówno pod względem składu, jak i struktury, a także w stężeniu wyższym niż wymagane dla proteomiki. W ostatnim czasie nastąpił znaczny postęp w zastosowaniu mikroskopii elektronowej do określania struktury dużych kompleksów makromolekularnych. Spowodowało to wzrost zainteresowania podejściami do oczyszczania natywnych kompleksów o jakości i ilości wystarczającej do określenia struktury za pomocą mikroskopii elektronowej. Metoda Tandem Affinity Purification (TAP) została zoptymalizowana do ekstrakcji i oczyszczania 18-podjednostkowego, ~ 0,8 zespołu rybonukleoproteinowego MDa z pączkujących drożdży (Saccharomyces cerevisiae) nadających się do barwienia ujemnego i kriomikroskopii elektronowej. W niniejszym dokumencie szczegółowo opisano modyfikacje dokonane w metodzie TAP, uzasadnienie wprowadzenia tych zmian oraz podejścia przyjęte do oznaczania jednorodnego składu i struktury kompleksu.

Wprowadzenie

Wiele głównych procesów komórkowych jest przeprowadzanych przez duże kompleksy białkowe i białko-RNA1. Istotnym wąskim gardłem w prowadzeniu badań biofizycznych i strukturalnych takich kompleksów jest uzyskanie ich odpowiedniej jakości (tj. jednorodności) i w odpowiednim stężeniu. Wyizolowanie kompleksu od natywnego źródła ma wiele zalet, w tym zachowanie odpowiednich modyfikacji potranskrypcyjnych i/lub translacyjnych podjednostek oraz zapewnienie prawidłowego składania kompleksu. Jednak duże kompleksy komórkowe są często obecne w komórce przy niskiej liczbie kopii, a oczyszczanie musi być bardzo wydajne i zachodzić w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, aby zapewnić utrzymanie integralności kompleksu. Oczyszczanie kompleksu ze źródła eukariotycznego jest szczególnie trudne i może być zaporowe finansowo. Dlatego bardzo pożądane są strategie lub metody, które są skuteczne i dają jednorodny kompleks.

Strategią, która odniosła sukces w oczyszczaniu natywnych kompleksów z komórek eukariotycznych w celu ich wstępnej charakterystyki, jest metoda Tandem Affinity Purification (TAP)2,3. Metoda TAP została początkowo opracowana w celu oczyszczenia natywnego białka z pączkujących drożdży (S. cerevisiae) w kompleksie z czynnikiem (czynnikami) oddziałującym2. W metodzie TAP wykorzystano dwa znaczniki, z których każdy został połączony z tą samą sekwencją genu kodującego białko. Znaczniki zostały dobrane tak, aby zrównoważyć potrzebę ścisłego i selektywnego wiązania z żywicą o powinowactwie z chęcią utrzymania warunków zbliżonych do fizjologicznych roztworu. Równowaga ta służy zachowaniu stabilnych interakcji znakowanego białka z czynnikiem (czynnikami) oddziaływania w celu charakterystyki po oczyszczeniu. Genomowo włączony znacznik TAP umieszczono na końcu (C-końcu) genu kodującego białko i składał się z sekwencji kodującej peptyd wiążący kalmodulinę (CBP), a następnie białka A - dodatek nieco ponad 20 kDa do znakowanego białka. CBP jest krótkie, 26 aminokwasów i rozpoznawane przez białko Kalmodulina ~ 17 kDa (CaM) w obecności wapnia zK D rzędu 10-9 M 4. Znacznik białka A jest większy, składa się z dwóch powtórzeń po 58 reszt z krótkim łącznikiem między powtórzeniami. Każde powtórzenie 58 aminokwasów jest rozpoznawane przez immunoglobulinę G (IgG) o KD ~ 10-8 M 5. Pomiędzy tymi dwoma znacznikami umieszczono miejsce rozpoznania proteazy TEV, endopeptydazy z wirusa wytrawiania tytoniu6,7. Jak pokazano na rysunku 1, w pierwszym etapie powinowactwa metody białko znakowane TAP jest wiązane z żywicą IgG za pośrednictwem białka A. Znakowane białko jest eluowane przez rozszczepienie na kolumnie po dodaniu proteazy TEV, specyficznie dla miejsca rozszczepiającego między dwoma znacznikami. Jest to konieczny krok, ponieważ oddziaływanie IgG i białka A jest bardzo silne i może być odpowiednio zaburzone tylko w warunkach roztworu denaturującego. Brak znacznika białka A, białko jest wiązane z żywicą CaM w obecności wapnia i eluowane z tej żywicy z dodatkiem chelatora jonów metalu EGTA (kwas tetraoctowy glikolu etylenowego) (ryc. 1).

Wkrótce po wprowadzeniu metody TAP, została ona wykorzystana w dużym badaniu do wygenerowania 'mapy' złożonych interakcji w S. cerevisiae8. Co ważne, w wyniku tych starań cała biblioteka yeast-TAP Tagged Open Reading Frame (ORF), a także pojedyncze ORFy9 oznaczone tagiem TAP są dostępne z komercyjnego źródła. W ten sposób można uzyskać dowolny szczep drożdży z oznaczonym białkiem dla dowolnego kompleksu drożdży. Metoda TAP przyczyniła się również do modyfikacji lub wariacji znacznika TAP, w tym: jego zastosowania do oczyszczania kompleksów z innych komórek eukariotycznych i bakteryjnych10,11; projekt "podzielonego znacznika", w którym białko A i CBP są umieszczane na różnych białkach12; a znaczniki zostały zmienione, aby dostosować się do potrzeb badacza, takich jak wrażliwość kompleksu na Ca2+ lub EGTA13.

Ostatnie postępy zarówno w oprzyrządowaniu, jak i metodologii doprowadziły do znacznego postępu w zastosowaniu mikroskopii elektronowej (EM) do określania struktury, co doprowadziło do powstania obrazów kompleksów makromolekularnych o wysokiej, bliskiej rozdzielczości atomowej14. Rozdzielczość, jaką można uzyskać dla kompleksu przez EM, pozostaje jednak uzależniona od jakości badanego kompleksu. W badaniu tym wykorzystano podejście znacznika TAP do oczyszczenia z S. cerevisiae snRNP U1, 18-podjednostkowego (~ 0,8 MDa) kompleksu rybonukleoproteinowego o niskiej liczbie kopii, który jest częścią spliceosomu15,16. Podjęto szereg kroków w celu oczyszczenia tego kompleksu tak, aby był jednorodny i miał odpowiednie stężenie. Opisano potencjalne problemy napotkane na różnych etapach oczyszczania oraz podkreślono strategie podejmowane w celu pokonania wyzwań. Dzięki dokładnej ocenie i optymalizacji etapów oczyszczania, oczyszczony U1 snRNP ma jakość i ilość odpowiednią do badań w barwieniu ujemnym i kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM). Zoptymalizowany protokół metody TAP do oczyszczania kompleksów natywnych do badań strukturalnych jest opisany w niniejszym dokumencie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: Następujący protokół został opracowany dla oczyszczania kompleksu z 4 l hodowli komórkowej, około 40 g mokrej masy komórek. Po przygotowaniu wszystkie powinny być przechowywane w temperaturze 4 °C i zużyte w ciągu miesiąca od ich przygotowania. Środek redukujący i inhibitory proteazy są dodawane do tylko tuż przed użyciem.

1. Przygotowanie ekstraktu z całych komórek do tandemowego oczyszczania powinowactwa

  1. Wzrost komórek S. cerevisiae
    1. Umieść żądany szczep S. cerevisiae oznaczony jako TAP z miejsca przechowywania (-80 °C) na płytce dekstrozy peptonowej (YPD) drożdży. Inkubować przez 3 - 5 dni (30 °C), aż komórki drożdży staną się białe i puszyste.
    2. Zaszczepić pasmo o długości około 2mm2 świeżych komórek z płytki do 10 ml pożywki YPD w stożkowej probówce wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml. Potrząśnij rurką z prędkością 180 obrotów na minutę (obr./min) przez noc (30 m°C).
    3. Zaszczepić 2 ml nocnej kultury na litr pożywki YPD w 2 l kolbie Erlenmeyera lub kolbie stożkowej. Wstrząsać przy 180 obr./min (30 °C). Monitoruj wzrost komórek przy gęstości optycznej 600 nm (OD600) do późnej fazy logarytmicznej, OD600 od 1,8 do 2, zwykle 20 - 24 godzin.
  2. Pobieranie komórek S. cerevisiae
    1. Zbierać komórki przez odwirowanie w temperaturze 5 400 x g przez 15 minut (4 °C).
    2. Szybko zdekantować supernatant i utrzymać komórki w temperaturze 4 °C lub na lodzie.
    3. Zawiesić każdy litr osadu komórkowego za pomocą 2 ml schłodzonego buforu do lizy (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 300 mM NaCl; 10 mM KCl; 0,2 mM EDTA, pH 8,0; 5 mM imidazolu, pH 8,0; 10% glicerolu; 0,1% v/v NP-40). Zawiesić komórki przez wirowanie i/lub powtórzenie pipetowania przy użyciu pipety serologicznej o pojemności 10 ml.
      Uwaga: Znaczenie NP-40 w odniesieniu do złożonej analizy jakości i po oczyszczeniu omówiono poniżej.
    4. Przenieść zawiesinę komórkową do pustej stożkowej probówki wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml umieszczonej na lodzie. Umyć każdą butelkę wirówki dodatkowymi 2 ml schłodzonego buforu do lizy i dodać do zawiesiny komórek w probówce o pojemności 50 ml.
    5. Określ mokrą masę osadu komórkowego, ważąc probówkę i odejmując wagę pustej probówki, a także dodanego buforu do lizy.
      Uwaga: Litr kultury komórkowej o OD600 wynoszącym 1,8 to około 10 g.
    6. Utworzyć kąpiel ciekłego azotu w stożkowej probówce wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml. Pobrać zawieszone komórki do strzykawki o pojemności 5 ml. Podłączyć igłę 16 G do strzykawki. Zamrozić zawiesinę komórkową, przepuszczając ją przez strzykawkę/igłę w celu wytworzenia "kropelek" komórek. Szybkość zamrażania powinna wynosić około 1 min/ml.
    7. Przechowywać zamrożone kropelki komórek (-80 °C) lub przystąpić do lizy.
  3. Lizacja komórek i klarowanie lizatu
    1. Zlizuj komórki drożdży za pomocą młynka do kawy. Lizuj komórki osiem do dziewięciu razy z 25-sekundowymi seriami mielenia, potrząsając młynkiem do kawy. Przed użyciem należy wstępnie schłodzić młynek do kawy ciekłym azotem. Co dwie rundy mielenia dodaj płytką warstwę ciekłego azotu do młynka i pozwól mu odparować.
    2. W razie potrzeby wymieszaj szpatułką schłodzoną ciekłym azotem, aby zapobiec zbrylaniu się komórek. Zachowaj ostrożność, aby zapobiec rozmrażaniu komórek, co może spowodować zlepianie się komórek. Po lizie komórki powinny pojawić się jako drobny biały proszek. Jednorazowo można zmielić maksymalnie osad komórkowy z 4 l kultury drożdży (~ 40 g).
      Uwaga: Spostrzeżenia dotyczące metody lizy omówiono poniżej.
    3. Oceń stopień lizy komórek za pomocą hemocytometru lub alternatywnej metody zliczania komórek. Aby zapewnić odpowiednią analizę, należy pobrać następujące próbki: (1) przed lizą; (2) po czterech rundach lizy; oraz (3) po lizie. Aby sprawdzić te próbki, należy pobrać niewielką ilość komórek za pomocą szpatułki schłodzonej ciekłym azotem i umieścić w probówce o pojemności 1,5 ml.
    4. Po rozmrożeniu komórek odpipetować 5 μl komórek i wymieszać z 495 μl wody. Jeśli zaobserwuje się 40 - 60% lizę komórek, przejdź do następnego kroku w protokole.
      Uwaga: Obserwacje dotyczące wpływu długich okresów lizy omówiono poniżej.
    5. Po zaobserwowaniu odpowiedniej lizy przechowuj zlizane komórki (-80 °C) lub przejdź do następnego kroku.
    6. Przygotuj dwie stożkowe probówki wirówkowe z polipropylenu o pojemności 50 ml, każda zawierająca 15 ml buforu do lizy, w tym 1 mM fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF), 1 mM ditiotreitolu (DTT) i dostępny w handlu koktajl inhibitorów proteazy.
      Uwaga: Jeśli obserwuje się znaczną proteolizę, rozważ użycie szczepu z niedoborem proteazy.
    7. Za pomocą szpatułki schłodzonej ciekłym azotem nabrać zamrożony proszek z lizy komórkowej do przygotowanych probówek o pojemności 50 ml. Stopniowo dodawać proszek/ciało stałe do komórki do buforu do lizy, zawierającego zarówno reduktor, jak i inhibitor(y) proteazę.
    8. Delikatnie obrócić probówki o pojemności 50 ml w temperaturze pokojowej, aby rozmrozić/rozpuścić komórki, ale także zapobiec tworzeniu się pęcherzyków. Gdy proszek/ciało stałe komórki rozpuści się, dodaj dodatkową komórkę stałą/proszek.
    9. Napełnij każdą z dwóch probówek o pojemności 50 ml, aż do każdej z nich zostanie dodanych około 20 g komórek lub wszystkie komórki. Kontynuować rozmrażanie/rozpuszczanie do momentu, gdy w probówkach o pojemności 50 ml nie zaobserwuje się zamarzniętych grudek komórek. Powinno to zająć około 50 minut.
    10. Odwirować lizat zawieszonych komórek przez 20 minut w temperaturze 25 000 x g (4 °C). Dobrze zlizywane komórki mogą wykazywać niewielką ilość czarnego osadu.
    11. Przenieść 50 ml supernatantu do ultra-wirówek z poliwęglanu (użyto probówek o pojemności 26,3 ml) i dodać 10 μl 200 mM PMSF do każdej pełnej probówki.
    12. Wirować przez 1 godzinę w temperaturze 100 000 x g (4°C). Powinny być widoczne cztery warstwy, od dołu do góry: (1) twardy, przezroczysty osad zawierający kompleksy rybosomalne; (2) miękki osad bogaty w lipidy; (3) duża, przezroczysta, zabarwiona na żółto warstwa zawierająca większość rozpuszczalnych białek i kompleksów komórki; oraz (4) "łuskowatą" warstwę wierzchnią składającą się z lipidów.
    13. Wszystkie kolejne czynności należy wykonać w chłodni (4 °C). Usunąć jak najwięcej wierzchniej "łuszczącej" warstwy lipidowej za pomocą pipety o pojemności 1 ml i wyrzucić. Użyj pipety serologicznej o pojemności 10 ml, aby odzyskać większość żółtej, przezroczystej warstwy.
    14. Odzyskaj ostatnie kilka ml tej warstwy za pomocą pipety o pojemności 1 ml, aby uniknąć naruszenia dwóch dolnych warstw. Z 40 g osadu z mokrych komórek zwykle odzyskuje się około 48 ml środkowej warstwy i usuwa/wyrzuca 8 ml warstwy lipidowej.
      Uwaga: Przepływ oczyszczania kolumny jest znacznie utrudniony przez obecność lipidów, które również mogą obniżyć jakość kompleksu, omówionego poniżej.

2. Oczyszczanie kolumny etap 1: Chromatografia IgG

  1. Równoważenie i wiązanie żywicy
    1. Przygotować 300 μl zawiesiny IgG sepharozy na 40 g granulatu komórkowego. Odetnij koniec końcówki pipety o pojemności 1 ml, aby ułatwić pipetowanie zawiesiny. Przepłukać/zrównoważyć żywicę IgG trzykrotnie, za każdym razem za pomocą 5 ml buforu IgGD150 (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 150 mM KCl; 1 mM MgCl2; 5 mM imidazolu, pH 8; 0,1% v/v NP-40; 1 mM DTT; tabletka inhibitora proteazy na 50 ml objętości).
      1. Odwirować do granulki w temperaturze 160 x g (4°C) między praniami i usunąć supernatant.
    2. Obracać żywicę IgG z supernatantem środkowej fazy i dwiema tabletkami inhibitora mini proteazy na 40 g komórek, używając odpowiedniego rotatora, przez 2 godziny (4 °C). To jest roztwór wsadowy IgG.
    3. Przygotuj dwie 10 ml kolumny do przygotowania poli do użycia, przecinając koniec kolumny w celu uzyskania płaskiego cięcia. Aby przyspieszyć pakowanie i mycie kolumny przez przepływ grawitacyjny, należy załadować maksymalnie 200 μl wypełnionej żywicy IgG lub ~ 25 ml roztworu okresowego IgG na kolumnę o pojemności 10 ml.
    4. Wlać roztwór wsadowy IgG do kolumny i pozostawić do osadzania się grawitacyjnie. Jeśli sedymentacja trwa dłużej niż 30 minut, najprawdopodobniej doszło do zanieczyszczenia lipidami podczas odzyskiwania środkowej fazy z probówek wirówkowych.
    5. Przemyć wypełnioną kolumnę czterema kolejnymi objętościami buforu IgGD150 po 10 ml.
  2. Na kolumnie TEV Rozszczepienie
    1. Uszczelnić dno kolumny i dodać 1 ml buforu IgGD150 i 100 μl proteazy TEV (0,6 mg/ml podstawy, zmutowany wariant S219V TEV wyprodukowany we własnym zakresie). Uszczelnić górną część kolumny i mieszać przez 20 minut (18 °C) za pomocą mieszalnika termicznego, wstrząsając z prędkością 750 obr./min. Ponownie zawiesić żywicę i ponownie mieszać przez 20 minut, powtórzyć jeszcze raz, w sumie przez 1 godzinę inkubacji.
      Uwaga: Bardzo ważne jest, aby ograniczyć czas inkubacji do minimum.
    2. Przywrócić temperaturę kolumny do 4 °C i wymyć białko/kompleks grawitacyjnie. Eluować martwą objętość za pomocą dodatkowych 200 μl buforu IgGD150.

3. Oczyszczanie kolumny Krok 2: Chromatografia powinowactwa kalmoduliny

  1. Równoważenie i wiązanie żywicy
    1. Przygotować 200 μl żywicy powinowactwa do kalmoduliny na 40 g osadu komórkowego. Przemyć żywicę trzy razy, za każdym razem 5 ml buforu wiążącego kalmodulinę (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl; 1 mM MgCl2; 5 mM imidazolu, pH 8; 2 mM CaCl2; 0,1% v/v NP-40; 10 mM β-merkaptoetanolu), odwirowując przy 160 x g (4 °C) do granulek przy każdym płukaniu.
    2. Do każdego 1 ml eluatu IgG dodać 3 objętości buforu wiążącego kalmodulinę. Aby utrzymać stały poziom wapnia, dodaj CaCl2 i β-merkaptoetanol, aby uwzględnić brak tych składników w elucji IgG. Stężenia końcowe powinny wynosić 2 mM CaCl2 i 10 mM β-merkaptoetanolu.
    3. Dodać próbkę do żywicy Calmodulin i wiązać przez 1 godzinę (4 °C) za pomocą rotatora rurowego.
  2. Pakowanie i eluowanie z żywicy kalmodulinowej
    1. Przygotować 2 ml kolumny do przygotowania poli na 100 μl zawiesiny kalmoduliny, przecinając koniec kolumny, aby utworzyć płaski otwór. Załadować nie więcej niż 100 μl zawiesiny kalmoduliny na kolumnę, aby zminimalizować ilość żywicy, z którą próbka styka się podczas elucji.
    2. Upakować kolumnę grawitacyjnie i przemyć żywicę w kolumnie trzykrotnie 5 ml buforu wiążącego kalmodulinę.
    3. Białko elutyczne z dodatkiem 200 μl buforu elucyjnego kalmoduliny (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl; 1 mM MgCl2; 5 mM imidazolu, pH 8,0; 4 mM EGTA, pH 8,0; 0,08% v/v NP-40; 10 mM β-merkaptoetanolu). Powtórzyć sześciokrotne dodawanie 200 μl buforu elucyjnego kalmoduliny.
    4. W przypadku elucji od 1 do 3 nanieść objętość na kolumnę i natychmiast zebrać eluat. W przypadku elucji 4 uszczelnić dno kolumny i inkubować z buforem elucyjnym przez 2,5 minuty, a następnie rozszczelnić i pozostawić do wymycia grawitacyjnie. W przypadku elucji 5 inkubować przez 5 minut, a następnie rozszczelnić i wymyć. W przypadku elucji 6 inkubować przez 10 minut, a następnie rozszczelnić i wymyć.
      Uwaga: Integralność kompleksu może się różnić w zależności od elucji/frakcji (patrz sekcja dotycząca wyników reprezentatywnych).
    5. Dializuj roztwory od 2 do 6 indywidualnie przez noc przy użyciu odpowiedniej metody mikrodializy. Dializować frakcje za pomocą buforu dializacyjnego (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl; 1 mM MgCl2; 5 mM imidazolu, pH 8; 10 mM β-merkaptoetanolu).
      Uwaga: NP-40 nie przechodzi znacząco, jeśli w ogóle, przez membranę dializacyjną.

4. Analizy po oczyszczeniu w celu oceny złożonej jakości

  1. Natywne barwienie żelem i srebrem
    1. Przygotuj 4 - 16% prefabrykowany natywny żel do analizy kompleksu zgodnie z instrukcjami producenta. Użyć odpowiedniego wzorca białka o masie cząsteczkowej i załadować 15 μl każdej z dializowanych elucji/frakcji kalmoduliny na żel.
    2. Elektroforezę żelu pod napięciem 150 V przez około 3 godziny (4 °C).
    3. Srebrem zabarwić żel, aby ocenić jakość każdej z sześciu eluncji. Alternatywnie użyj równie czułych komercyjnych plam fluorescencyjnych. Na tym etapie stężenie kompleksu jest najprawdopodobniej poniżej poziomu wykrywania niebieskiego barwienia Coomassie.
  2. Dodatkowe metody analizy żelu
    1. Aby wykryć białko za pomocą Western blot, rozpuścić kompleks za pomocą SDS lub natywnego PAGE, a następnie zbadać żel pod kątem epitopu peptydu wiążącego kalmodulinę (CBP) za pomocą przeciwciała ze znacznikiem TAP zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Używając specyficznego barwnika fluorescencyjnego, potwierdź obecność i integralność białka i/lub kwasu nukleinowego w kompleksie oczyszczonym TAP. Należy uważać, aby nie wykryto nakładania się widma między tymi plamami.
  3. Wizualizacja mikroskopii elektronów barwienia ujemnego
    1. Używaj ciągłych siatek węglowych rozżarzonych przy -15 mA przez 30 sekund, w ciągu 30 minut od złożonej aplikacji.
    2. Nanieść 3 μl oczyszczonego kompleksu TAP (zwykle o stężeniu 1 nM) na ruszt. Inkubować przez minutę. Osusz z boku siatki, aby usunąć nadmiar bufora.
    3. Przemyć dwukrotnie 20 μl kropli wody dejonizowanej. Boczne plamy między praniami.
    4. Nałożyć siatkę na kroplę o ujemnym bale o pojemności 50 μl i inkubować przez min. Zaleca się barwienie octanem uranylu (2%) lub mrówczanem uranylu (0,75%).
      Uwaga: Sole i roztwory uranylu są słabo radioaktywne i zawierają metale ciężkie. Należy obchodzić się z nimi ostrożnie, a wszystkie materiały, które mają kontakt z tymi roztworami, należy utylizować zgodnie z zalecanymi przez instytucje wytycznymi dotyczącymi odpadów.
    5. Nałóż siatkę na świeżą kroplę ujemnej plamy o pojemności 50 μl, bez osuszania. Inkubuj przez min, następnie osusz w bok, a na koniec wysusz na powietrzu i wizualizuj.
  4. Wizualizacja kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM)
    1. Wykonaj cryo-EM z oczyszczonym kompleksem TAP, chociaż może być konieczna optymalizacja, zgodnie z protokołem producenta.
      Uwaga: Obecność detergentu w wysokich stężeniach może utrudniać postęp i została omówiona poniżej.

5. Złożone przechowywanie

  1. Przygotowanie kompleksu do przechowywania
    1. W razie potrzeby skoncentrować kompleks za pomocą filtra odśrodkowego o odpowiednim odcięciu masy cząsteczkowej dla kompleksu. Wirować z prędkością 14 000 x g przez 1 minutę, aż do osiągnięcia pożądanego stężenia.
      Uwaga: Stężenie NP-40 wzrośnie podczas zagęszczania, ponieważ nie przechodzi przez filtr ani membranę dializacyjną.
    2. Błyskawicznie zamrozić kompleks w 30 μl podwielokrotności w kąpieli etanolowej schłodzonej ciekłym azotem lub suchym lodem, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Opcjonalne usuwanie detergentu po oczyszczeniu

Uwaga: Obecność detergentu, takiego jak NP-40 i w stężeniu wyższym niż jego krytyczne stężenie miceli, może utrudniać lub hamować postęp w niektórych zastosowaniach. Poniżej omówiono konsekwencje jego usunięcia z protokołu, a także zastąpienia go innymi dodatkami lub współrozpuszczalnikami. Jeśli NP-40 nie jest pożądany, istnieje możliwość skorzystania z komercyjnej aplikacji do usunięcia, na przykład Bio-kulek.

  1. Wstępnie zrównoważyć dostępne w handlu kulki pochłaniające detergenty w buforze do dializy. Wymieszać pięć kulek na 30 μl kompleksu (zwykle przy stężeniu 10 nM).
  2. Inkubować zrównoważone kulki z kroku 5.2.1 z oczyszczonym kompleksem TAP przez 15 minut na lodzie. Zużyć złożony w ciągu kilku godzin po usunięciu detergentu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Do oczyszczenia kompleksu U1 snRNP, będącego rybonukleoproteinowym kompleksem składającym się z 18 podjednostek z S. cerevisiae, zastosowano zmodyfikowaną metodę TAP. Wstępne oczyszczanie kompleksu metodą TAP zgodnie z opublikowanym protokołem2,3 dało kompleks o niejednorodnym charakterze, który w natywnym żelu poliakrylamidowym barwionym srebrem migrował w postaci trzech prążków (Rysunek 2A). Wielokrotne optymalizacje metody TAP pozwoliły uzyskać komp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metoda TAP wykorzystuje dwa znaczniki, które równoważą potrzebę ścisłego i selektywnego wiązania z żywicą o powinowactwie z pragnieniem utrzymania warunków zbliżonych do fizjologicznych roztworu. Równowaga ta służy zachowaniu stabilnych interakcji znakowanego białka z czynnikiem (czynnikami) oddziaływania w celu charakterystyki po oczyszczeniu. Ponadto pojedyncze ORF-y znakowane TAP są dostępne ze źródła komercyjnego, dzięki czemu można uzyskać dowolny szczep drożdży z oznakowanym białkiem dla dowolnego kompleksu drożdży...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy są wdzięczni za wsparcie i rady Nikolausa Grigoriewa. Dziękujemy Annie Loveland, Axelowi Brilotowi, Chen Xu i Mike'owi Rigneyowi za pomocne dyskusje i wskazówki dotyczące rynków wschodzących. Praca ta została sfinansowana przez National Science Foundation, Nagroda nr 1157892. Placówka Brandeis EM jest wspierana przez grant National Institutes of Health P01 GM62580.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szczep oznaczony tagiem S. cerevisiaeTAP Open BiosystemsYSC1177Jest to główny szczep drożdży użyty do opracowania protokołu TAP. Jego tłem jest S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ 1, leu2 i Delta; 0, met15 i Delta; 0, ura3 i Delta; 0, SNU71::TAP::HIS3MX6
Młynek do kawyMr. CoffeeIDS77Używany do hemocytometru do lizy komórek
, Bright LineHausser Scientific3120Służy do oceny lizy komórek
Wirnik wirówki JA 9.100 Beckman Coulter, Inc.Służy do zbierania komórek drożdży
Wirówka o stałym kącie nachylenia JA 20Beckman Coulter, Inc.Służy do oczyszczania ekstraktu komórkowego z nierozpuszczalnego materiału komórkowego
Ti 60 wirnik wirówki o stałym kącieBeckman Coulter, Inc.Służy do dalszego oczyszczania ekstraktu z komórek rozpuszczalnych
ThermomixerEppendorfR5355Wytrząsarka z kontrolowaną temperaturą
System żelowy NovexThermo Fisher Scientific 
Żywica IgGGE Healthcare17-0969-01Sepharose 6 szybkoprzepływna
żywica CalmodulinAgilent Technologies, Inc.214303Żywica Affinity
Koktajl inhibitorów proteazy, mini tabletkiSigma Aldrich589297Mini cOmplete ultra tabletki wolne od EDTA
Koktajl inhibitorów proteazy, duże tabletkiSigma Aldrich5892953cOmplete ultra Tabletki wolne od EDTA
Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)Rozpuszczony w izopropanolu
2 ml Kolumna Bio-spinBio-Rad Laboratoria, Inc.7326008Służy do pakowania i mycia kolumny poly-prep z żywicy Calmodulin
10 mlBio-Rad Laboratories, Inc.7311550Służy do pakowania i mycia żywicy IgG:
Prefabrykaty, natywne żele PAGE Bis-Tris,Life TechnologiesBN1002Novex, NativePAGE, Bis-Tris 4 - 16% prefabrykowane żele poliakrylamidowe,
standard białka NativeMarkThermo Fisher ScientificLC0725Niebarwiony wzorzec białka stosowany dla natywnego PAGE. Obciążenie 7,5 μ l dla żelu barwionego srebrem i 5 μ l dla SYPRO Żel barwiony rubinowo
Prefabrykaty SDS PAGE Żele Bis-TrisLife TechnologiesNP0321Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% prefabrykowane żele poliakrylamidowe 
PageRuler wzorzec białkaThermo Fisher Scientific26614Niebarwiony wzorzec białka stosowany do Western blotting
SDS running bufferLife TechnologiesNP00011x NuPAGE MOPS SDS
Buffer TAP przeciwciałoThermo Fisher ScientificCAB1001Pierwszorzędowe przeciwciało przeciwko znacznikowi CBP
Przeciwciało drugorzędoweThermo Fisher Scientific31341Kozia anty-królicza fosfataza alkaliczna sprzężona
BCIP/NBTThermo Fisher Scientific340425-bromo-4-chloro-3-indolilo-fosforan/nitro niebieski tetrazolium 
Jednostki dialazyczneThermo Fisher Scientific88401Mini jednostki dializacyjne Slide-A-Lyzer
Filtry odśrodkowe, 100kDa MWCOEMD MilliporeUFC5100008Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-0,5 z membraną Ultracel-100
Kulki pochłaniające detergentyBio-Rad Laboratories, Inc.1523920Absorbanty Bio-bead SM-2
SYBR Green IIThermo Fisher ScientificS-7564Barwnik fluorescencyjny do barwienia kwasów nukleinowych, podczas wykrywania z obecnością rubinu SYPRO należy użyć długości fali wzbudzenia 488 nm i długości fali emisji 532 nm
Rubinowe sondy molekularneSYPROS-12000Barwnik fluorescencyjny do barwienia białek, podczas wykrywania z obecnością SYBR Green II, należy użyć długości fali wzbudzenia 457 nm i długości fali emisji 670 nm
Siatki miedzianeMikroskopia elektronowa NaukiG400-CP
nachylenia , , ,

Bibliografia

  1. Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
  2. Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Seraphin, B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  3. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: A general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
  4. Vaillancourt, P., Zheng, C. F., Hoang, D. Q., Breister, L. Affinity purification of recombinant proteins fused to calmodulin or to calmodulin-binding peptides. Methods Enzymol. 326, 340-362 (2000).
  5. Braisted, A. C., Wells, J. A. Minimizing a binding domain from protein A. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (12), 5688-5692 (1996).
  6. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
  7. Nallamsetty, S., et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Protein Expr Purif. 38 (1), 108-115 (2004).
  8. Ghaemmaghami, S., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
  9. Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comp Funct Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
  10. Cox, D. M., Du, M., Guo, X., Siu, K. W., McDermott, J. C. Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells. Biotechniques. 33 (2), 267-268 (2002).
  11. Gully, D., Moinier, D., Loiseau, L., Bouveret, E. New partners of acyl carrier protein detected in Escherichia coli by tandem affinity purification. FEBS Lett. 548 (1-3), 90-96 (2003).
  12. Tharun, S. Purification and analysis of the decapping activator Lsm1p-7p-Pat1p complex from yeast. Methods Enzymol. 448, 41-55 (2008).
  13. Xu, X., Song, Y., Li, Y., Chang, J., Zhang, H., An, L. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr Purif. 72 (2), 149-156 (2010).
  14. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
  15. Gottschalk, A., et al. A comprehensive biochemical and genetic analysis of the yeast U1 snRNP reveals five novel proteins. RNA. 4 (4), 374-393 (1998).
  16. Neubauer, G., Gottschalk, A., Fabrizio, P., Seraphin, B., Luhrmann, R., Mann, M. Identification of the proteins of the yeast U1 small nuclear ribonucleoprotein complex by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (2), 385-390 (1997).
  17. Lucast, L. J., Batey, R. T., Doudna, J. A. Large-scale purification of a stable form of recombinant tobacco etch virus protease. Biotechniques. 30 (3), 544-546 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tandemowa oczyszczanie powinowactwemoczyszczanie kompleks w natywnychocena homogeniczno ci strukturalnejlizy kom rek dro d ywi zanie na Sepharose IgGci cie proteaz TEVwi zanie powinowactwem do kalmodulinyEM z barwieniem negatywowymanaliza SDS PAGEidentyfikacja metod spektrometrii mas
Oczyszczanie kompleksów natywnych do badań strukturalnych za pomocą metody tandemowego znacznika powinowactwa
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.