Sortowanie przepływowe i sekwencjonowanie egzomu komórek Reeda-Sternberga klasycznego chłoniaka Hodgkina

Podsumowanie

Tutaj opisujemy połączone sortowanie komórek metodą cytometrii przepływowej i protokół budowy biblioteki nowej generacji o niskim wkładzie przeznaczony do generowania wysokiej jakości danych o całym eksomie z komórek Hodgkina Reeda-Sternberga (HRS) klasycznego chłoniaka Hodgkina (CHL).

Streszczenie

Komórki Hodgkina Reeda-Sternberga klasycznego chłoniaka Hodgkina są słabo rozmieszczone na tle zapalnych limfocytów i zazwyczaj stanowią mniej niż 1% masy guza. Materiał pochodzący z guza masowego zawiera zawartość guza w stężeniu niewystarczającym do charakterystyki. Dlatego sortowanie komórek aktywowane fluorescencją przy użyciu ośmiu przeciwciał, a także rozpraszanie boczne i do przodu, jest tutaj opisane jako metoda szybkiego oddzielania i koncentrowania z wysoką czystością tysięcy komórek HRS z guza do późniejszego badania. Jednocześnie, ponieważ standardowe protokoły sekwencjonowania egzomu zazwyczaj wymagają 100-1000 ng wejściowego DNA, co często jest zbyt wysokie, nawet przy sortowaniu przepływowym, zapewniamy również zoptymalizowany, niskowejściowy protokół budowy biblioteki, który jest w stanie wytworzyć wysokiej jakości dane już z 10 ng wejściowego DNA. Ta kombinacja jest w stanie stworzyć biblioteki nowej generacji odpowiednie do hybrydyzacji, przechwytywania przynęt z całego eksomu lub bardziej skoncentrowanych paneli docelowych, w zależności od potrzeb. Sekwencjonowanie egzomu komórek HRS, w porównaniu ze zdrowymi komórkami T lub B wewnątrz guza, może zidentyfikować zmiany somatyczne, w tym mutacje, insercje i delecje oraz zmiany liczby kopii. Odkrycia te wyjaśniają biologię molekularną komórek HRS i mogą ujawnić możliwości celowanego leczenia farmakologicznego.

Wprowadzenie

Postępy w genomice nowotworów wynikające z sekwencjonowania nowej generacji doprowadziły do znaczących przełomów w identyfikacji celów terapeutycznych i prognozowaniu wielu nowotworów hematologicznych i niehematologicznych. Nowe zindywidualizowane strategie leczenia oparte na specyficznych zmianach genomowych są szybko wprowadzane w wielu typach nowotworów (omówione w bibliografii^1,2). Pomimo znacznego postępu w genomice chłoniaka, genom nowotworowych komórek HRS w klasycznym chłoniaku Hodgkina (CHL) był niedostatecznie zbadany. Badania były utrudnione przez niedobór nowotworowych komórek HRS w reaktywnym mikrośrodowisku, co utrudniało wyizolowanie oczyszczonych populacji komórek HRS³.

Metoda izolowania żywotnych komórek HRS z pierwotnych nowotworów została opracowana przez Fromma i wsp.^4,5,6. Metoda wykorzystuje koktajl ośmiu przeciwciał, składający się z CD30, CD15, CD40, CD95, CD45, CD20, CD5 i CD64, do jednoznacznej identyfikacji komórek HRS z zawiesiny guza CHL. Korzystając z tej metodologii, jesteśmy w stanie wyizolować co najmniej 1000 żywotnych komórek HRS ze świeżych lub zamrożonych zawiesin komórkowych z biopsji guza składających się z co najmniej 10⁷ komórek (około 10 mg tkanki). Czystość jest większa niż 90% w analizie cytometrii przepływowej i szacuje się na co najmniej 80% w analizie genomu egzomu w dziesięciu kolejnych przypadkach.

Udoskonaliliśmy technikę izolacji komórek metodą cytometrii przepływowej, która znacznie ułatwiła ten proces, pozwalając na szybką izolację tysięcy żywotnych komórek HRS z pierwotnych nowotworów CHL⁷. Wykorzystaliśmy tę technikę do wytworzenia tego, co uważa się za pierwszą sekwencję całego eksomu komórek nowotworowych w pierwotnych przypadkach chłoniaka Hodgkina. Nasze badania pokazują wykonalność wysokoprzepustowych, obejmujących cały genom badań poszczególnych przypadków CHL i już doprowadziły do zidentyfikowania nowych zmian genomowych, które mogą wyjaśnić aspekty patogenezy CHL.

Dalej rozwijamy linię do wykorzystania wyekstrahowanego DNA do wysokoprzepustowych badań genomicznych. W celu uzyskania wiarygodnych wyników z zaledwie 1000 posortowanych komórek HRS (minimum uzyskane z sekwencyjnych przypadków), opracowaliśmy zmodyfikowaną procedurę budowy biblioteki DNA nowej generacji⁸, która pozwoliła nam zwiększyć wydajność ligacji adaptorowej i wygenerować biblioteki fragmentów DNA bez nadmiernej amplifikacji. Metoda ta pozwala na analizę rutynowych próbek klinicznych oraz wykrywanie nawracających mutacji i zmian chromosomowych⁷.

Protokół

1. Obróbka i mrożenie tkanek

1. Pobrać tkankę węzłów chłonnych w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) lub pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) i przetworzyć w ciągu 24 h od pobrania. Przenieść wycięte tkanki węzłów chłonnych⁹ do szalki Petriego zawierającej 10 mL RPMI z 2% płodowej surowicy cielęcej (FCS) i drobno posiekać świeżym ostrzem skalpela. Do dalszego rozcierania/dysocjacji tkanki użyć tłoka strzykawki 10-mL.
2. Przenieść ciecz do probówki stożkowej 50-mL przez sitko komórkowe 100 µm. Przepłukać szalkę Petriego oraz filtr dodatkowymi 10 mL RPMI 2% FCS.
3. Wyznaczyć liczbę komórek za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru.
   UWAGA: Z około 5 mm³ tkanki węzłów chłonnych CHL zazwyczaj oczekuje się uzyskania co najmniej 2 x 10⁷ komórek. Oczekiwana żywotność wynosi ponad 80%, jednak może ona różnić się w zależności od próbki.
4. Odwirować komórki przy 400 x g przez 10 min i odessać nadsącz. Probówkę z osadem komórkowym umieścić na lodzie.
5. Wychłodzić medium do mrożenia na lodzie. Resuspendować komórki w zimnym medium do mrożenia do stężenia 2 x 10⁷/mL, mieszając za pomocą pipety. Nie używać wortexa. Inkubować zawiesinę na lodzie przez 10 min.
6. Rozdzielić próbkę do krio probówek (wcześniej schłodzonych na lodzie) w ilości 1 mL/probówka. Przenieść probówki do zamrażarki -80 °C na 1-2 dni, a następnie przenieść je do ciekłego azotu.

2. Przygotowanie zawiesin komórkowych do sortowania komórek

UWAGA: Każda partia przeciwciał musi zostać odpowiednio mianowana z użyciem 10 milionów komórek w objętości barwiącej 300- µΛ. Krew obwodowa może być stosowana dla wszystkich przeciwciał z wyjątkiem CD30, w przypadku którego do mianowania można użyć linii komórkowej KMH2 dodanej do krwi obwodowej¹⁰. Zazwyczaj rozpoczynamy od objętości przeciwciał zalecanej przez producenta i wykonujemy dwa dwukrotne rozcieńczenia oraz jeden dwukrotny wzrost (cztery punkty danych) dla mianowania każdej partii przeciwciał. Na przykład, jeśli producent zaleca objętość 10-µL, mianowanie wykonujemy z użyciem objętości 2, 5, 10 i 20 µL.

1. Ustawić łaźnię wodną na 37 °C. Wymieszać uprzednio wymierzoną ilość przeciwciał w ciemnej fiolce szklanej i dodać PBS + 2% BSA, aby uzyskać całkowitą objętość koktajlu 100 µL.
   UWAGA: Chociaż zaleca się miareczkowanie przeciwciał, jako punkt wyjścia można zastosować następujące objętości: CD64, 20 µL; CD95, 5 µL; CD30, 20 µL; CD5, 10 µL; CD20, 10 µL; CD15, 20 µL; CD40, 5 µL oraz CD45, 10 µL.
2. Przenieść fiolkę z ciekłego azotu do pojemnika z lodem zawierającego suchy lód, aby zapobiec rozmrożeniu. Podgrzać 50 mL medium do rozmrażania zawierającego RPMI/20% FCS/DNazę (100 µg/mL) w 50-ml probówce stożkowej w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
3. Przenieść 45 mL medium do rozmrażania do nowej probówki i utrzymywać w temperaturze 37 °C. Szybko rozmrozić komórki, trzymając fiolkę kriogeniczną w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż pozostanie jedynie bardzo mała zamrożona część.
4. Przenieść zawartość fiolki do probówki zawierającej 45 mL medium do rozmrażania. Przepłukać pustą fiolkę kriogeniczną 2 razy 1 mL medium do rozmrażania i połączyć płukanki.
5. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 15 min, aby umożliwić trawienie przez DNazę i reekwilibrację komórek. Wirować komórki przy 500 x g przez 10 min i odessać nadsącz.
6. Resuspendować komórki w około 200 µL odłożonego medium do rozmrażania (5 mL) i pozostawić do wyrównania temperatury do temperatury pokojowej przez 2-3 min. Oczekiwany jest odzysk >70% zamrożonych żywych komórek.
   UWAGA: Opcjonalnie, w celu uzyskania większej czystości sortowanych komórek HRS, które mogą tworzyć rozetki z przyłączonymi limfocytami T, na tym etapie można dodać koktajl nieznakowanych przeciwciał (patrz protokół opcjonalny).
7. Dodać 100 µL koktajlu przeciwciał i inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej (RT), chroniąc przed światłem. Dodać 3 mL medium do sortowania, wirować komórki przy 500 x g przez 10 min i odessać nadsącz.
8. Resuspendować komórki w 1 mL medium do sortowania i przenieść je na sitko do probówek przepływowych 5 mL.
9. Przepłukać zarówno 50-ml probówkę stożkową, jak i sitko do komórek dodatkową ilością 1 mL medium do sortowania, a następnie umieścić komórki na lodzie.

3. (Protokół opcjonalny) Blokowanie rozet limfocytów T

UWAGA: Komórki HRS tworzą rozety z limfocytami T w przekrojach tkanek i zawiesinach komórkowych, a limfocyty T te mogą potencjalnie zanieczyszczać posortowaną frakcję HRS. Interakcje te są zapośredniczone przez CD54 i CD58 na komórkach HRS wiążące się z LFA-1 i CD2 na limfocytach T^4,11. Interakcje te można zablokować za pomocą nieoznaczonych przeciwciał przeciwko tym cząsteczkom adhezyjnym.

1. Odmieć od 100 000 do 500 000 komórek w 100 µL medium RPMI.
2. Inkubuj zawiesinę komórkową z nieznakowanymi przeciwciałami przeciwko CD2, CD54, CD58 i LFA-1 (po 10 µL każdego) przez 1 h w temperaturze 0°C. Zawiesinę komórkową można teraz znakować przeciwciałami fluorescencyjnymi.

4. Izolacja komórek HRS, B i T za pomocą sortowania komórek

UWAGA: Chociaż w pracy wykorzystaliśmy specjalistyczny instrument zamawiany na potrzeby badawcze z 5 laserami (patrz arkusz Materiały), wystarczający powinien być każdy sorter z możliwością wykrywania fluorochromów użytych w panelu przeciwciał. Wykonanie poniższych kroków wymaga znajomości funkcji oprogramowania¹² oraz podstawowej wiedzy z zakresu obsługi sortera komórkowego. Szczegółowe instrukcje znajdują się w internetnym podręczniku obsługi oprogramowania.

1. Konfiguracja cytometru:
   1. Włącz komputer i zaloguj się. Włącz BSC (oraz gniazda zasilania BSC), a następnie uruchom cytometr. Odczekaj co najmniej 90 s na uruchomienie wewnętrznego procesora cytometru, a następnie otwórz oprogramowanie do sterowania laserami i sprawdź, czy wszystkie lasery są włączone. Uruchom oprogramowanie cytometru¹³ i zaloguj się.
   2. W oprogramowaniu cytometru kliknij „Cytometer → View Configurations”. Gdy otworzy się okno dialogowe podprogramu konfiguracji, zaznacz niestandardową konfigurację 130-µm, kliknij „set configuration” oraz „OK”. Wyjdź z podprogramu konfiguracji.
   3. W oknie dialogowym oprogramowania cytometru kliknij „use CS&T settings”. Zamontuj w urządzeniu dyszę 130-µm i uruchom strumień, klikając czerwony przycisk „X” w oknie strumienia. Pozostaw urządzenie do rozgrzania przez co najmniej 30 min.
   4. Przeprowadź kontrolę wydajności urządzenia za pomocą odpowiedniej metody (sortownik opisany w niniejszym tekście zawiera moduł oprogramowania do śledzenia wydajności; patrz instrukcja oprogramowania (str. 117 - 122) oraz standard referencyjny (patrz sekcja Materiały w celu uzyskania informacji o standardzie użytym w tej konfiguracji).
      1. Kliknij „Cytometer → CST”, upewnij się, że w menu rozwijanym w polu „Characterize” wybrano „Check Performance”, i kliknij „Run”. Po wyświetleniu komunikatu z oprogramowania umieść probówkę z cząsteczkami referencyjnymi na uchwycie próbek i kliknij „OK”.
      2. Po zakończeniu pomiaru kliknij „Finish” i zamknij moduł oprogramowania. Gdy oprogramowanie cytometru ponownie połączy się z urządzeniem, kliknij „use CS&T settings” w pojawiającym się oknie dialogowym.
   5. Wyznacz prawidłowe opóźnienie kropli (drop delay) korzystając z funkcji automatycznego wyznaczania opóźnienia w oprogramowaniu cytometru (patrz str. 154 - 161 instrukcji oprogramowania).
      1. Otwórz eksperyment „Drop Delay” w oknie „Browser” oprogramowania cytometru, umieść probówkę z cząsteczkami kalibracyjnymi na uchwycie próbek i kliknij „Load” w oknie „Acquisition Dashboard”. Włącz funkcję automatycznego monitorowania strumienia, klikając przycisk „Sweet Spot” w oknie „Stream”. Funkcja ta powinna pozostać włączona podczas wszystkich kolejnych kroków.
      2. Włącz napięcie płyty odchylającej, klikając przycisk „Voltage” w oknie strumienia bocznego (side-stream), a następnie włącz testowanie sortowania, klikając przycisk „Test Sort” znajdujący się bezpośrednio obok przycisku „Voltage”.
      3. Wyzeruj wszystkie ustawienia strumieni bocznych z wyjątkiem lewego strumienia bocznego. Dostosuj ustawienie lewego strumienia bocznego tak, aby w oknie strumienia bocznego widoczne były dwa punkty strumienia. Kliknij przycisk „Optical Filter” i upewnij się, że punkt lewego strumienia bocznego znajduje się w lewym polu widocznym w czarnym obszarze okna strumienia bocznego.
      4. W razie potrzeby skoryguj ustawienie lewego strumienia bocznego. Wyłącz testowanie sortowania, ponownie klikając przycisk „Test Sort”. W oknie „Browser” rozwiń element „Global Worksheets” eksperymentu „Drop Delay”, klikając znak „+”.
      5. Kliknij dwukrotnie „Sort Layout_001”, aby otworzyć układ sortowania, sprawdź wizualnie, czy lewej populacji sortowanej przypisano oznaczenie „P1”, a następnie kliknij „Sort” w oknie „Sort Layout”. W oknie „Sort Layout” kliknij „Auto Delay”, a następnie „Run”.
      6. Po zakończeniu pomiaru kliknij „Exit”. Umieść na uchwycie próbek probówkę ze sterylną wodą dejonizowaną i kliknij „Load” w oknie „Acquisition Dashboard”. Przepuszczaj wodę przez co najmniej 5 min, aby usunąć z urządzenia pozostałości cząsteczek testowych przed przejściem do kolejnych etapów.
   6. Przeprowadź kontrole kompensacji (używając kulek kompensacyjnych z arkusza Materiały lub odpowiednika) z wykorzystaniem wbudowanej konfiguracji kompensacji w oprogramowaniu sortownika (szczegóły znajdują się na str. 131 - 137 instrukcji oprogramowania).
      1. Utwórz nowy eksperyment, klikając „Experiment New Experiment”. W zakładce „Parameters” okna „Instrument Status” usuń nieużywane parametry, jeśli takie istnieją. Kliknij „Experiment Compensation Setup Create Compensation Controls”.
      2. W oknie „Browser” rozwiń próbkę „Compensation Controls”, klikając znak „+”. Przeprowadź pomiary probówek kontrolnych kompensacji bez zapisywania danych i w razie potrzeby dostosuj napięcia detektorów (w zakładce „Parameters” okna „Instrument Status”) tak, aby populacje kulek z dodatnim barwieniem dla każdego fluorochromu znajdowały się w zakresie kanałów od 10 000 do 100 000 i były najjaśniejsze w swoim głównym kanale detekcji.
      3. Zapisz napięcia wymagane dla każdego parametru w każdej probówce. Zaznacz probówkę „Unstained Control” w sekcji „Compensation Controls”, klikając ją raz lewym przyciskiem myszy. Umieść niebarwioną probówkę kontrolną na uchwycie próbek i kliknij „Load” w oknie „Acquisition Control”.
      4. Ręcznie wprowadź ustalone napięcia uzyskane podczas indywidualnych kontroli kompensacji do pól napięcia detektora dla wszystkich parametrów, a następnie kliknij „Record” w oknie „Acquisition Control”. Przeprowadź wszystkie pozostałe kontrole kompensacji, zapisując dane bez zmiany ustawień detektora. Przed przejściem dalej przepuszczaj przez 5 min sterylną wodę dejonizowaną, aby usunąć z urządzenia wszelkie pozostałości materiału.
2. Gating komórek HRS:
   1. Nabyj i zapisz co najmniej 100 000 zdarzeń do wstępnego gatingu, dostosowując szybkość przepływu tak, aby uzyskać 3 000-4 000 zdarzeń/s (patrz krok 4.1).
      UWAGA: Jeśli stężenie komórek jest zbyt wysokie, może być konieczne dodanie dodatkowego medium do sortowania w celu rozcieńczenia zawiesiny. Zatrzymaj akwizycję.
   2. Wykonaj gating komórek HRS zgodnie z krokami przedstawionymi na Rysunku 1.
      UWAGA: W większości przypadków CHL komórki HRS będą stanowiły od 0,01% do 0,1% wszystkich komórek.
3. Gating limfocytów B i T:
   1. Zidentyfikuj kontrole somatyczne (limfocyty B i T) poprzez gating odpowiednio CD20 i CD5 (gating limfocytów za pomocą CD45/SSH), a następnie analizując CD20 względem CD5 (patrz Rysunek 1).
   2. Kieruj strumienie zbierania do probówek w schłodzonym statywie dwu- lub czterokanałowym. Wypełnij probówki przepływowe lub probówki do wirowania o pojemności 15 mL co najmniej do połowy medium zbierającym.
   3. Przypisz populacje HRS i populacje kontrolne do odpowiednich probówek zbierających w ustawieniach sortowania zgodnie z instrukcjami producenta. Ponownie uruchom akwizycję komórek i rozpocznij sortowanie.
   4. Zbierz wszystkie komórki HRS oraz do 1 miliona limfocytów B i T. Kieruj strumienie zbierania do probówek w schłodzonym statywie czterokanałowym (lub dwukanałowym).

5. Izolacja DNA

1. Zebrane komórki odwiruj w probówkach stożkowych 1,5 mL przy 3,000 x g przez 10 min, a następnie resuspenduj raz w 1 mL PBS w celu przemycia komórek.
2. Ponownie odwiruj przy 3,000 x g przez 10 min i usuń supernatant; należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić niewielkiego osadu.
3. Do przemytych komórek dodaj 150 µL buforu lizującego (lub odpowiednią objętość zgodnie z instrukcją użytego zestawu) i wymieszaj, pipetując w górę i w dół.
   UWAGA: W tym punkcie można przechowywać lizat komórkowy w temperaturze -70 °C, jeśli jest to konieczne.
4. Zmontuj zestaw kolumny, umieszczając kolumnę filtrującą w probówce, a następnie dodaj do kolumny lizat z kroku 5.5. Wirować zestaw przy 13,000 x g przez 3 min.
5. Wyjmij minikolumnę z zestawu i wylej ciecz z probówki zbierającej. Ponownie umieść minikolumnę w probówce zbierającej.
6. Do każdego zestawu dodaj 650 µL roztworu do płukania kolumny. Wiruj przez 1 min przy 13,000 x g. Wylej ciecz z probówki zbierającej. Powtórz ten krok łącznie 4 razy.
7. Wylej ciecz z probówki zbierającej i ponownie zmontuj zestaw minikolumny. Wiruj przez 2 min przy 13,000 x g, aby osuszyć matrycę wiążącą.
8. Przenieś minikolumnę do nowej probówki 1,5 mL i dodaj 25 µL 10 mM Tris-Cl, który jest preferowany do następnego etapu sonikacji, lub wodę wolną od nukleaz podgrzaną do 65 °C. Inkubuj przez 2 min w temperaturze pokojowej i odwiruj zestaw przy 13,000 x g przez 1 min. Powtórz operację jeszcze raz z 25 µL, aby uzyskać łącznie 50 µL.
9. Wymieszaj eluat DNA, pipetując w górę i w dół, a następnie określ jego ilość metodą fluorymetrii¹⁴.

6. Konstrukcja biblioteki

1. Przygotowania przed rozpoczęciem:
   1. Ustaw sonikator na poziom wody 12, Intensywność 5, Cykle/burst 200 oraz Temp 7.
   2. Na podstawie dostępnej ilości DNA określonej metodą fluorymetrii oraz projektu eksperymentalnego, ustal ilość DNA do wykorzystania w konstrukcji biblioteki.
      UWAGA: Należy pamiętać, że jeśli zostanie użyte zbyt mało DNA i jakość biblioteki ulegnie pogorszeniu, materiał pozostawiony do celów walidacji może mieć niewielkie zastosowanie. W przypadku niskich ilości materiału wejściowego, im większa masa wejściowa, tym wyższa złożoność wynikającej z tego biblioteki sekwencyjnej. Sugerowane wytyczne dla tego protokołu są następujące: 10 ng powinno przynieść dobre wyniki, a 50 ng można uznać za orientacyjne maksimum.
   3. Ustal molowy stosunek adapter:insert w oparciu o wartości zawarte w Tabeli 1.
   4. Oblicz ilość adaptera do wykorzystania w następujący sposób:
      UWAGA: Liczba moli DNA wejściowego, n
          i. n = 1.54e-12^-12 * masa wejściowa (w ng) / (średnia wielkość fragmentu)
          ii. przy średniej wielkości fragmentu 200 bp wzór upraszcza się do:
      n = 7.7e-15 * masa wejściowa (w ng)
      Liczba moli adaptera do dodania, a
          i. a = n * r
      Objętość zapasu adaptera do wykorzystania w etapie ligacji adaptera, v
          i. v (w µL ) = a /[10^-12 * stężenie zapasu adaptera (w µM )]
      UWAGA: Jeśli stężenie adaptera jest niskie, aby zapewnić dodanie niezbędnej ilości adaptera, można użyć roztworu adaptera do rozcieńczenia odczynników do naprawy końców zamiast wody.
      Przykład: Dla 100 ng DNA wejściowego o średniej wielkości fragmentu 200 bp, przy żądanym molowym stosunku adapter:insert 15:1 i stężeniu zapasu adaptera 2 µM, zalecana objętość adaptera do użycia wynosi 5,8 µL.
   5. Przypisz indeksowane kody kreskowe do próbek.
      UWAGA: Biblioteki, które zostaną połączone w jednej reakcji hybrydyzacji lub w jednym kanale komórki przepływowej sekwenatora, nie mogą zawierać powtarzających się indeksów.
2. Konstrukcja biblioteki – fragmentacja DNA:
   1. Przenieś pełną ilość DNA do wykorzystania do probówki do sonikacji. Jeśli objętość samej próbki zawierającej DNA wejściowe jest mniejsza niż 50 µL, dodaj Bufor EB do uzyskania całkowitej objętości 50 µL i wymieszaj.
   2. Sonikuj przez 30 s.
   3. Wyjmij probówkę i wykonaj krótkie wirowanie w mikrocentry fudze, aby zebrać kropelki z górnej części ścianek mikroprobówki.
   4. Powtórz kroki 6.2.2-6.2.3, wykonując łącznie siedem 30-sekundowych sesji sonikacji, co daje łącznie 210 s sonikacji.
      UWAGA: Można eksperymentować z podziałem 210 s na mniejszą liczbę sesji.
3. Konstrukcja biblioteki – naprawa końców, A-tailing i ligacja adaptera:
   UWAGA: Unikaj przeprowadzania jakiejkolwiek selekcji wielkości przed etapem amplifikacji PCR biblioteki.
   1. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta¹⁹ dotyczącymi naprawy końców i A-tailingu po sonikacji DNA próbki.
   2. Po A-tailingu użyj w reakcji odpowiedniej liczby moli adaptera (obliczonej w kroku 6.1.3). Połącz adapter, fragmenty DNA z końcówkami A, enzym oraz bufor i inkubuj przez noc w 20 °C przez około 16 h.
4. Konstrukcja biblioteki – amplifikacja biblioteki:
   1. Przeprowadź oczyszczanie za pomocą kulek magnetycznych reakcji ligacji adaptera. Po dodaniu kulek do produktu PCR odczekaj 5 min w temperaturze pokojowej. Umieść probówkę na statywie magnetycznym i usuń ciecze, przemyj dwukrotnie w 200 µL 80% etanolu, wysusz kulki wystarczająco długo, aby usunąć większość cieczy bez ich przesuszenia, a następnie eluej DNA z kulek, pipetując 25 µL wody wolnej od nukleaz na kulki, gdy probówka nadal znajduje się na statywie magnetycznym.
      UWAGA: Można próbować przechowywać kulki w glikolu polietylenowym
      (PEG) aż do czasu zakończenia amplifikacji zamiast ich odrzucania, ale nie zostało to sprawdzone.
   2. Dodaj 0,6 µL rozcieńczenia 1:1000 barwnika Green na każde 50 µL master mixu do PCR. Alternatywnie użyj wybranego barwnika interkalującego kompatybilnego z PCR w czasie rzeczywistym w objętości odpowiedniej dla urządzenia.
   3. Zaprogramuj reakcję PCR: 98 °C przez 45 s dla denaturacji wstępnej, a następnie cykl denaturacji, przyłączania i elongacji w 98 °C przez 15 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s lub wybierz odpowiedni program, jeśli używasz innego enzymu polimerazy.
      1. Ustaw urządzenie tak, aby zbierało dane o fluorescencji w 72 °C w każdym cyklu. Zaprogramuj końcową elongację w 72 °C przez 1 min, a następnie podtrzymanie w 4 °C przez czas nieokreślony. Startery PCR do amplifikacji biblioteki z ligowanymi adapterami przy użyciu odczynników z tabeli uzupełniającej to: Oligo 1, AATGATACGGCGACCACCGAGA oraz Oligo 2, CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
   4. Amplifikuj bibliotekę, stosując opisane powyżej warunki PCR, obserwując w czasie rzeczywistym wartości intensywności fluorescencji za pomocą oprogramowania qPCR, przerywając proces tuż przed końcem fazy wzrostu wykładniczego.
   5. Po amplifikacji przeprowadź standardowe oczyszczanie za pomocą kulek (patrz krok 6.4.1), używając 0,8x objętości odzyskanej reakcji amplifikacji, zazwyczaj 0,8 x 50 = 40 µL kulek. Dodaj kulki do produktu PCR i odczekaj 5 min w temperaturze pokojowej.
   6. Umieść probówkę na statywie magnetycznym i usuń ciecze, przemyj dwukrotnie w 200 µL 80% etanolu, wysusz kulki wystarczająco długo, aby usunąć większość cieczy bez ich przesuszenia, a następnie eluej, dodając wodę wolną od nukleaz do suchych kulek.
   7. Ilościowo określ zawartość otrzymanego DNA za pomocą fluorymetrii. Zwizualizuj fragmenty biblioteki pod kątem wielkości; szczegóły znajdują się w sekcji Oczekiwania dotyczące kontroli jakości danych.

7. Hybrydyzacja egzomu

1. Połącz cztery biblioteki z odrębnymi kodami kreskowymi adapterów.
   UWAGA: Do obliczenia molarności wykorzystuje się masę wyznaczoną fluorymetrią oraz wielkość wyznaczoną za pomocą żelu, a następnie biblioteki łączy się w ilościach ekimolarnych, aby uzyskać całkowitą masę połączonej biblioteki wynoszącą 1,000 ng. Najlepiej pozostawić wszystkie pary nowotwór-tkanka prawidłowa razem, zamiast rozdzielać je na osobne pule.
2. Zastosuj protokół wychwytuu eksomu¹⁵ i przeprowadź 8 cykli PCR po oczyszczaniu produktu wychwytu. Możliwe może być zastosowanie innych celów wychwytu.

8. Sekwencjonowanie multipleksowe

1. Przeprowadź sekwencjonowanie pojedynczej próbki z wychwytu hybrydyzacyjnego zawierającej cztery zmuksylowane biblioteki w jednej ścieżce na platformie sekwencjonującej wskazanej w arkuszu Materiały¹⁶.
   UWAGA: Dla zaawansowanych użytkowników, którzy chcą dalej planować i optymalizować docelową głębokość pokrycia odczytów, możliwe są alternatywne konfiguracje.

9. Analiza (może zostać zastąpiona alternatywnym modelem analizy w razie potrzeby)

1. SNP i małe indels:
   1. Zmapuj surowe dane do ludzkiego genomu referencyjnego, UCSC hg19, używając algorytmu Burrows-Wheeler Aligner (BWA)¹⁷ lub innego wybranego algorytmu. Przefiltruj lub oznakuj odczyty z wynikiem jakości mapowania poniżej 20 oraz duplikaty PCR za pomocą Samtools¹⁸ lub Picard¹⁹.
   2. Wykryj somatyczne warianty nukleotydowe i małe indels w próbkach HRS w porównaniu z somatycznymi kontrolami limfocytów T, korzystając z programu Strelka²⁰ lub innego wybranego narzędzia do wykrywania wariantów. Użyj snpEff²¹ do adnotacji wyników z programu Strelka. W razie potrzeby systematycznie sprawdź loci wariantów pod kątem artefaktów, używając Integrated Genome Viewer (IGV)^22,23.
2. Zmiany liczby kopii:
   1. Oblicz logarytmicznie przekształcony stosunek „ltr” dla każdego interwału docelowego egzomu „i” dla znormalizowanych wewnątrzbibliotecznych liczb odczytów w guzie w stosunku do odczytów w próbce normalnej w następujący sposób:
      
      UWAGA: c to liczba odczytów mapujących do danego interwału wychwytu, l to całkowita wielkość biblioteki, t oznacza guz, a n oznacza próbkę normalną.
   2. Wyklucz interwały z niewystarczającym pokryciem (C_t+C_n < 100 odczytów) z dalszej analizy. Przeprowadź segmentację pan-interwałową przy użyciu DNAcopy v.1.0²⁴ z pakietu Bioconductor w środowisku R.
      UWAGA: Segmenty, w których wartość bezwzględna średniego ltr jest mniejsza niż 0.5, należy uznać za neutralne pod względem liczby kopii. Pozostałe segmenty można oznaczyć jako przyrosty liczby kopii, jeśli znak średniego ltr jest dodatni (innymi słowy, po normalizacji w próbce guza znajduje się znacznie więcej odczytów niż w próbce normalnej), lub jako ubytki liczby kopii, jeśli znak średniego ltr jest ujemny.

Wyniki

Po amplifikacji biblioteki i oczyszczaniu kuleczkami 0,8x należy wykonać analizę bioanalizatorem. Powinien być widoczny „normalny” rozkład wielkości fragmentów w pożądanym zakresie (Rysunek 2a). Odchylenia od tego kształtu, takie jak widoczne „ramię” na krzywej, wskazują na obecność artefaktów o wysokiej lub niskiej masie cząsteczkowej. Na przykład Rysunki 2b-2d przedstawiają przykłady bibliotek zawierających wid...

Dyskusja

Przyszłe zastosowania lub wskazówki po opanowaniu tej techniki

Prace te pozwalają na sekwencjonowanie egzomu z próbek zawierających co najmniej 10 ng DNA. W kontekście klinicznym limit ten nie obejmuje większości próbek aspiracyjnych cienkoigłowych z powodu niewystarczającej ilości materiału, ale obejmuje odpowiednie biopsje gruboigłowe i próbki biopsji wycinającej. Umożliwi to pozyskanie danych z większego zestawu możliwych próbek.

Krytyczn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Naczynie Petriego lub naczynie do hodowli komórkowych (sterylne)
RPMI-1640 Media	Roswell Park Memorial Institute
Surowica cielęca płodu (FCS), (inaktywowana termicznie)
Pożywka do zamrażania (RPMI, 20% FCS, 10% dimetylosulfotlenku (DMSO))-zachować świeżość i zachować sterylność
RPMI z 2% FCS (świeży lub przechowywać do 1 miesiąca)
skalpel ze świeżym ostrzem
Strzykawka 10 ml (bez igły)
Fiolki kriogeniczne
50 ml stożkowe probówki wirówkowe, wirówka
	zdolna do obsługi stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i zapewniająca 400 g
fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)
Pluoronic-F68	Thermo-Fisher	24040-032
DNAaza-I	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	D4527-10KU	przechowywać jako 5 mg/ml w RPMI w -200 i #176; C
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)
Sortuj podłoża (PBS + 2% BSA + 25 mM HEPES + Pluoronic – F68 (1x))
(22)	Beckman Coulter, Miami, FL		20 μ L sugerowana objętość początkowa; Sugeruje się mianowanie
CD30-PE (BerH83)	BD Biosciences, San Jose, CA		20 μ L sugerowana objętość początkowa; Sugerowane mianowanie
CD5-ECD (BL1a)	Beckman Coulter, Miami, FL		10 μ L sugerowana objętość początkowa; Sugerowane mianowanie
CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10)	Ebiosciences, San Diego, CA		5 μ L sugerowana objętość początkowa; Sugerowane mianowanie
CD20-PC7 (B9E9)	Beckman Coulter, Miami, FL		10 μ L sugerowana objętość początkowa; Sugeruje się mianowanie
CD15-APC (HI98)	BD Biosciences, San Jose, CA		20 μ L sugerowana objętość początkowa; Sugerowane jest miareczkowanie
CD45 APC-H7 (2D1)	BD Biosciences, San Jose, CA		Można zastąpić przez 10 μ L sugerowana objętość CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Sugerowane mianowanie
CD95-Pacific Blue (DX2)	Life Technologies, Grand Island, NY		5 & L sugerowana objętość początkowa; Sugeruje się mianowanie
CD2 (5 μ g; klon RPA-2.10)	Biolegend, San Diego, CA		Dla opcjonalnego protokołu; Sugeruje się mianowanie
CD54 (10 μ g; klon 84H10)	Serotec, Oxford, Wielka Brytania		Dla opcjonalnego protokołu; Sugeruje się mianowanie
CD58 (10 μ g; klon TS2/9)	eBioscience, San Diego, CA		Dla opcjonalnego protokołu; Sugeruje się mianowanie
LFA-1 (12 μ g; klon MHM23)	Novus Biologicals, Littleton, CO		Dla opcjonalnego protokołu; Sugerowane jest mianowanie
BD CS& Koraliki T	BD Biosciences, San Jose, Kalifornia
Koraliki BD Accudrop Koraliki	BD Biosciences, San Jose, Kalifornia
BC Koraliki wychwytywania przeciwciał Versa Comp	Beckman Coulter, Miami, FL		Koraliki kompensacyjne Koraliki
BD-FACS ARIA specjalny instrument badawczy wykorzystujący 5 laserów	BD Biosciences, San Jose, Kalifornia		każda aria BD-FACS z możliwością wykrywania fluorochromów w panelu przeciwciał powinna być wystarczająca
Wizard	Promega	A2360
10 mM Tris-Cl buffer	NA
Qubit dsDNA HS Assay kit	Life Technologies, Carlsbad, CA
S2 Sonicator	Covaris, Woburn, MA		Alternatywy mogą być podstawione
mikroTUBE	Covaris, Woburn, MA
Zestaw do przygotowania biblioteki o niskiej przepustowości	Kapa Biosystems, Wilmington, MA	KK8221
Sybr Green	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S9430
Koraliki Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter, Miami, FL
Bioanalyzer	Agilent Technologies, Santa Clara, CA
SeqCap EZ Exome v.3.0	Roche Nimblegen	6465684001
HiSeq	Illumina
Uniwersalny adapter w stylu TruSeq	Zintegrowane technologie DNA (IDT), Coralville, Iowa		Oczyszczanie HPLC; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACCCGCTCTTCCGAT*C*T
Adapter indeksu w stylu TruSeq	Zintegrowane technologie DNA (IDT), Coralville, Iowa		Oczyszczanie HPLC; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGAGTCACNNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
PCR w stylu TruSeq 1	Zintegrowane technologie DNA (IDT), Coralville, Iowa		AATGATACGGGACCACCGAGA
Starter PCR w stylu TruSeq 2	Zintegrowane technologie DNA (IDT), Coralville, Iowa		CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
Zintegrowany bufor dupleksowy bez nukleaz	Zintegrowane technologie DNA (IDT), Coralville, Iowa
Oprogramowanie BD FACSDIVA	BD Biosciences, San Jose, Kalifornia
BD Falcon Tubes	BD Biosciences, San Jose, Kalifornia
Rurki przepływowe BD	Biosciences, San Jose, Kalifornia