Ulepszone polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych reakcji łańcuchowej polimerazy Genotypowanie toksycznych rozdymek za pomocą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas

Podsumowanie

Opisana jest ulepszona metoda polimorfizmu długości fragmentów ograniczających reakcję łańcuchową polimerazy do genotypowania gatunków rozdymek za pomocą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas. Kolumna monolitu krzemionkowego z odwróconymi fazami służy do oddzielania strawionych amplikonów. Metoda ta może wyjaśnić monoizotopowe masy oligonukleotydów, co jest przydatne do identyfikacji składu zasadowego.

Streszczenie

Opisana jest ulepszona wersja metody polimorfizmu długości fragmentów ograniczających reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) do genotypowania toksycznych gatunków rozdymek za pomocą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania (LC/ESI-MS). Ekstrakcję DNA przeprowadza się za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA na bazie błony krzemionkowej. Po amplifikacji PCR przy użyciu buforu PCR bez detergentów, do roztworu dodaje się enzymy restrykcyjne bez oczyszczania roztworu reakcyjnego. Kolumna monolitu krzemionkowego z odwróconymi fazami i spektrometr masowy o wysokiej rozdzielczości z transformacją Fouriera ze zmodyfikowanym analizatorem pułapek Kingdona są stosowane odpowiednio do separacji i wykrywania. Faza ruchoma, składająca się z 400 mM 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanolu, 15 mM trietyloaminy (pH 7,9) i metanolu, jest dostarczana z natężeniem przepływu 0,4 ml/min. Czas cyklu dla analizy LC/ESI-MS wynosi 8 minut łącznie z równoważeniem kolumny. Oprogramowanie dekonwolucyjne posiadające model rozkładu izotopów oligonukleotydu służy do obliczania odpowiedniej masy monoizotopowej ze spektrum masowego. W przypadku analizy oligonukleotydów (zakres 26-79 nukleotydów) dokładność masy wynosiła 0,62 ± 0,74 ppm (n = 280), a doskonała dokładność i precyzja utrzymywały się przez 180 godzin bez użycia wzorca masy LOCK.

Wprowadzenie

Spektrometria mas (MS) jest akceptowaną technologią szybkiej i niezawodnej identyfikacji kwasów nukleinowych, desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą (MALDI) i jonizacja elektronrozpylania (ESI) są używane do jonizacji^1,2. Technika MALDI jest zwykle łączona z analizatorem czasu przelotu (TOF); jednak zastosowanie MALDI-TOF MS jest ograniczone do krótkich oligonukleotydów (~25 nukleotydów (NT)) ze względu na późniejszą fragmentację, tworzenie adduktów i niską wydajność jonizacji^1,2. W przeciwieństwie do tego, ESI ma zastosowanie do dłuższych oligonukleotydów (>100 nt), ale wiele stanów naładowania wielu naładowanych jonów ([M−nH]ⁿ⁻) jest wytwarzanych jednocześnie z biomakrocząsteczek i dlatego masa analitu może przekroczyć górną granicę zakresu m/z spektrometru. Wymaga to interpretacji widm splotowych, tj. przemiany szeregu stanów naładowania na odpowiadającą mu masę poprzez dekonwolucję.

W przypadku pomiaru masy małej cząsteczki, szczyt masy monoizotopowej, tj. masa cząsteczki zawierającej tylko najpowszechniejszy izotop każdego pierwiastka jest najobfitszy i obserwowany naturalnie³. Wraz ze wzrostem masy cząsteczkowej rozkład izotopowy przesuwa się do wyższego m/z, a pik monoizotopowy zostaje przesłonięty przez szum linii podstawowej^3-5. Gdy pik monoizotopowy nie jest już wykrywalny dla mas większych niż 10^kDa3, do pomiaru stosuje się średnią masę cząsteczkową, a nie masę monoizotopową⁵. W takich przypadkach rozkład izotopowy, w którym każdy z pojedynczych pików jest oddzielony 1 Da, można zaobserwować tylko wtedy, gdy do analizy używany jest analizator masy o wysokiej rozdzielczości, taki jak TOF, analizator pułapek Kingdona^{zmodyfikowany transformacją Fouriera 6} lub analizator rezonansu cyklotronowego jonów z transformacją Fouriera. Jednak najliczniejszy pik czasami nie jest zgodny ze średnią masą cząsteczkową⁵. Problemy te mogą prowadzić do trudności w dokładnym określeniu analitów.

Biorąc pod uwagę różnice w naturalnej obfitości stabilnych izotopów i trudności w określeniu średniej masy cząsteczkowej, pomiar masy monoizotopowej jest idealny do charakterystyki masy biomolekuł^3,4. W praktyce, niezależnie od tego, czy można zaobserwować pik monoizotopowy, czy nie, masę monoizotopową można oszacować, porównując wzór obserwowanego rozkładu izotopowego z teoretycznym obliczonym z modelowego analitu^4,7-10. Algorytm dopasowania⁸ jest teraz włączony do zastrzeżonego oprogramowania.

W kontekście ESI-MS, dysocjacja dupleksu DNA, oczyszczanie i odsalanie są wymagane do bezpośredniego pomiaru, aby uniknąć niepowodzenia jonizacji z powodu tłumienia jonów i tworzenia adduktów^2,10-14. Procedury te są kłopotliwe, jednak w pełni zautomatyzowane systemy analityczne zostały opracowane komercyjnie z udziałem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), przygotowania próbek i ESI-MS do wykrywania patogenów^15-20. Innym podejściem jest wprowadzenie chromatografii cieczowej (LC) do separacji. LC zapewnia separację analityów on-line od substancji współistniejących i nie wymaga pracochłonnego przygotowania próbki przed jonizacją^21,22. Jednak oddzielenie kwasów nukleinowych za pomocą fazy ruchomej zgodnej z MS jest trudniejsze niż w przypadku większości innych związków, takich jak leki, peptydy i białka, ze względu na polianionowy charakter nukleotydów. Najbardziej udanymi przykładami LC/ESI-MS jest zastosowanie LC z odwróconą fazą jonową. Faza ruchoma 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanolu (HFIP)-trietyloaminy (TEA)-metanolu została początkowo zaproponowana przez Apffel i in. do separacji i wykrywania krótkich oligonukleotydów²³. Zastosowanie genotypowania LC/ESI-MS do różnicowania gatunków patogenów, polimorfizmów pojedynczego nukleotydu i krótkich powtórzeń tandemowych opisano przy użyciu kapilarnej kolumny polimer-monolit, która może oddzielać dłuższe oligonukleotydy^1,21,24-33.

W Japonii i Stanach Zjednoczonych doszło do poważnego zatrucia pokarmowego z powodu błędnej identyfikacji i niewłaściwego przygotowania rozdymki, i to pomimo faktu, że dystrybucja i przygotowanie rozdymki jest ściśle kontrolowane przez przepisy dotyczące bezpieczeństwa żywności^34,35. Co więcej, w Japonii doszło do umyślnego zabójstwa z użyciem ekstraktu z rozdymki³⁶. W związku z tym rozdymka jest wymagana zarówno z punktu widzenia zdrowia publicznego, jak i dochodzeń sądowych. Ponadto, ze względu na to, że Takifugu rubripes jest znacznie droższy niż inne rodzaje rozdymki, w kontekście dochodzeń w sprawie fałszowania żywności potrzebna jest również zdolność do różnicowania.

Tutaj opisana jest szczegółowa metoda określania monoizotopowej masy produktu PCR za pomocą LC/ESI-MS przy użyciu monolitu krzemionkowego o odwróconej fazie i spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości. W szczególności podejście to zostało opracowane, aby umożliwić różnicowanie toksycznych gatunków rozdymkowatych w oparciu o zastosowanie metody polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych PCR (RFLP)³⁷, która jest pierwszym przykładem różnicowania gatunkowego zwierząt za pomocą MS.

Protokół

1. Ekstrakcja DNA

Uwaga: Użyj oddzielnego pomieszczenia do ekstrakcji DNA i badań post-PCR, takich jak elektroforeza żelowa i LC/ESI-MS. Dodać etanol do buforu 1 do przemywania (zawierającego chlorowodorek guanidyny) i buforu płuczącego 2 (niezawierającego chlorowodorku guanidyny) zgodnie z protokołem zestawu do ekstrakcji DNA. Próbki ryb uzyskano z hurtowni rybnych i rynków detalicznych w Japonii.

1. Umieścić 30-50 mg tkanki rybnej w probówce mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml lub 1,5 ml. Zmiażdż tkankę za pomocą mikroszpatułki (z wyjątkiem płetwy i skóry).
   Uwaga: W przypadku płetwy do namaczania należy użyć probówki o pojemności 0,5 ml.
2. Dodać 180 μl buforu do lizy i 40 μl proteinazy K i krótko przetrząsnąć. Inkubować w temperaturze 56 °C na blokowym ogrzewaczu przez 2 godziny lub przez noc. Mieszać przez krótkie wirowanie co 15 minut podczas inkubacji.
   Uwaga: Pełna liza nie jest konieczna.
3. Wirować przez 5 minut przy 13 000 x g. Po odwirowaniu, jeśli na powierzchni znajduje się niewielka ilość oleju, w przypadku próbki tłuszczowej, takiej jak wątroba, należy ją wyrzucić. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
4. Dodać 200 μl buforu chaotropowego zawierającego chlorowodorek guanidyny i wymieszać przez wirowanie. Dodać 200 μl etanolu (99,5%) i ponownie wymieszać, ponownie wirując.
5. Przenieść mieszaninę do kolumny wirowej umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Wirować przez 1 minutę przy 13 000 x g. Wyrzuć przepływ.
   Uwaga: Nie dodawaj wybielacza do odpadów, ponieważ guanidyna może tworzyć wysoce reaktywne związki z wybielaczem.
6. Dodać 500 μl buforu płuczącego 1 (zawierającego chlorowodorek guanidyny) i wirować przez 1 minutę przy 13 000 x g. Odrzucić przepływ i probówkę zbiorczą.
7. Umieść kolumnę wirową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml dostarczonej z zestawem. Dodać 500 μl buforu płuczącego 2 i wirować przez 3 minuty przy 20 000 x g. Wyrzucić przelew i probówkę zbiorczą. Przenieść kolumnę wirową do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
8. Odpipetować 200 μl buforu elucyjnego do środka membrany kolumny wirowej. Po 1 minucie odwirować przez 1 minutę przy 6 000 x g.
9. Odpipetować 50 μl eluatu do jednorazowej kuwety UV i zmierzyć widmo UV eluatu przy 220-300 nm oraz absorbancję przy 260 nm za pomocą spektrofotometru.
10. Sprawdź widmo UV DNA ze szczytem przy 260 nm. Oblicz przybliżone stężenie DNA za pomocą prostego równania "Stężenie DNA (ng/μl) = absorbancja przy 260 nm x 50".
    Uwaga: Typowe stężenie DNA ekstrahowanego z płetw rozdymki wynosi 63 ± 30 ng/μl (n = 20).
11. Jeśli stężenie DNA jest wyższe niż 10 ng/μl, próbki DNA należy rozcieńczyć buforem Tris-EDTA (TE) (pH 8) do 5 ng/μl.
12. Przechowywać próbkę w temperaturze -20 °C lub przystąpić do amplifikacji PCR (sekcja 2).

2. PCR

1. Ustawić 25 μl PCR dla każdej wyekstrahowanej próbki DNA, kontrolę pozytywną (0,2 μM syntetyzowany oligonukleotyd o docelowej sekwencji w buforze TE o pH 8,0) i kontrolę ujemną (ultraoczyszczona woda zamiast próbki DNA) na lodzie zgodnie z tabelami 1 i 2 na czystej ławce, aby uniknąć zanieczyszczenia.
   Uwaga: Aby ułatwić obsługę, przygotuj odpowiednią ilość koktajlu zawierającego wszystkie odczynniki bez matrycy DNA i dozuj go. Użyj polimerazy DNA o działaniu korektorskim, aby uniknąć dodawania zwisów 3' A do produktu PCR.
2. Przeprowadzić amplifikację PCR na termocyklerze, korzystając z programu cyklu przedstawionego w Tabeli 3.

3. Trawienie enzymatyczne

1. Do roztworu PCR dodać 2 μl roztworu zawierającego 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM MgCl₂, 10 mM ditiotreitolu i 500 mM NaCl.
2. Dodać po 1 μl każdego enzymu restrykcyjnego (Dra I i Msp I) i delikatnie wymieszać. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C na termocyklerze.
3. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 72 °C w celu aktywacji pozostałej polimerazy DNA, która wypełnia lepki koniec wytworzony przez Msp I.
4. Opcjonalnie: Analizować każde 2,5 μl roztworu reakcyjnego za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, stosując współczynnik usieciowania (%C, procent bisakryloamidu) wynoszący 3,33 (% wag.) i stężenie żelu poliakryloamidowego (%T) wynoszące 15 (% w/v)³⁸. Wybarwić żel za pomocą fluorescencyjnego barwnika DNA i obserwować dwuniciowe DNA na transiluminatorze światła niebieskiego za pomocą bursztynowego ekranu.
5. Przefiltrować roztwór reakcyjny za pomocą filtra odśrodkowego o średnicy 0,2-0,5 μm, aby zapobiec zatkaniu, które mogłoby uszkodzić kolumnę analityczną.
6. Przenieść filtrat do stożkowej fiolki z polipropylenu i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy.

4. Analiza LC/ESI-MS

1. W butelce o pojemności 1 l odważyć 67,2 g (ok. 42 ml) HFIP i 1,52 g (ok. 2,0 ml) herbaty. Dodać 955 ml ultraoczyszczonej wody (klasa LC/MS) i mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego, aż odczynniki całkowicie się rozpuszczą. Pobrać porcję roztworu i sprawdzić pH (między 7,85 a 7,95; najlepiej pH = 7,9) za pomocą pH-metru.
   Uwaga: Nie wkładaj podwielokrotności do butelki, aby uniknąć zanieczyszczenia jonami metali. Jeśli pH nie wynosi 7,9, dodaj niewielką ilość HFIP lub herbaty, aby dostosować pH i ponownie zmierz pH.
2. Podłączyć butelkę do linii A chromatografu cieczowego z chłodzeniem butelki za pomocą przenośnej lodówki z bezpośrednim chłodzeniem (do użytku domowego), aby zapobiec parowaniu. Podłącz kolejną butelkę wypełnioną metanolem do linii B.
3. Podłączyć kolumnę ochronną i kolumnę analityczną (2,0 x 50 mm, wielkość mezoporów = 30 nm) do chromatografu cieczowego. Rozpocznij przepływ w początkowej fazie ruchomej (95% A i 5% B), aby zrównoważyć kolumny.
4. Przygotować 0,5 mg/ml trifluorooctanu sodu (pH 3,5) w kalibrze³⁹.
   1. Odważyć 50 mg (ok. 34 μl) kwasu trifluorooctowego w zlewce.
   2. Dodać 30 ml ultraoczyszczonej wody i miareczkować do pH 3,5 za pomocą 10 mM wodorotlenku sodu za pomocą pH-metru.
   3. Napełnij do 50 ml ultraoczyszczoną wodą. Dodać 50 ml acetonitrylu (klasy LC/MS) i wymieszać.
   4. Weź porcję roztworu roboczego i przechowuj ją w temperaturze pokojowej. Pozostałą część roztworu przechowywać w temperaturze 4 °C.
5. Zmniejszyć ciśnienie azotu w syfonie C w następujący sposób.
   Uwaga: Najnowsze spektrometry mas z transformacją Fouriera, które nadają się do analizy nienaruszonych białek, są wyposażone w oprogramowanie sterujące do kontroli ciśnienia.
   1. Zdejmij lewą górną pokrywę spektrometru masowego. Zawór pułapki C znajduje się w rogu lewego pierwszego planu.
   2. Sprawdź wartość wysokiego podciśnienia w oknie stanu przyrządu w oprogramowaniu sterującym.
      Uwaga: Wartość wynosi zazwyczaj 3 x 10⁻⁸ barów.
   3. Pociągnij pokrętło, aby odblokować i bardzo powoli obracaj pokrętło w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby zmniejszyć wysokie ciśnienie podciśnienia do 1/3 (zwykle 1 x 10⁻⁸ barów). Wskazane ciśnienie powinno zmieniać się stopniowo w sposób opóźniony. Zignoruj komunikat ostrzegawczy o niskim ciśnieniu. Naciśnij pokrętło, aby się zablokować.
   4. Przywróć górną pokrywę dla bezpieczeństwa.
6. Skalibrować spektrometr masowy za pomocą trifluorooctanu sodu³⁹.
   Uwaga: Codzienna kalibracja masy może zostać zastąpiona tym protokołem, jednak zalecana kalibracja sugerowana przez producenta powinna była zostać zakończona przed tą kalibracją.
   1. Ustaw parametry skanowania i parametry podgrzewanego źródła ESI w skrzynce sterowniczej przyrządu oprogramowania strojeniowego w następujący sposób: typ skanowania pełny MS; zakres skanowania m/z 500-4,000; fragmentacja (napięcie dysocjacji wywołanej kolizją w źródle (CID) 60 eV; polaryzacja ujemna; cel automatycznej kontroli wzmocnienia (AGC) 1 x 10⁶, maksymalny czas wtrysku 50 ms; natężenie przepływu gazu w osłonie 5; natężenie przepływu gazu pomocniczego 0; natężenie przepływu gazu wymiatającego 0; napięcie natrysku 3 kV; temperatura kapilary 320 °C; Poziom częstotliwości radiowej (RF) soczewki S 100; temperatura grzałki 30 °C.
      1. Wprowadź listę jonów ujemnych do monitorowania jako m/z 792.85908, 1064.80870, 1336.75832, 1608.70794, 1880.65755, 2152.60717, 2424.55679, 2696.50640, 2968.45602, 3376.38045.
   2. Przesuń podgrzaną sondę ESI bliżej interfejsu spektrometru mas (pozycja B). Połącz sondę i strzykawkę z rurką.
   3. Wstrzykiwać calibrant w sposób ciągły z natężeniem przepływu 10 μl/min za pomocą wbudowanej pompy strzykawkowej. Sprawdź tylko 6 jonów o niższej masie (m/z 792.85908-2152.60717) w dostosowanej tabeli kalibracyjnej.
      1. Kontynuuj kalibrację po ustabilizowaniu się intensywności sygnałów. Po kalibracji sprawdź tylko sześć jonów o większej masie (m/z 1880.65755-3376.38045) i kontynuuj kalibrację. Unikaj kalibracji przy użyciu wszystkich jonów jednocześnie, aby uniknąć awarii.
7. Ustawić sondę w odpowiedniej pozycji dla natężenia przepływu 0,4 ml/min (pozycja D) i podłączyć do chromatografu cieczowego za pomocą rurki z metalu obojętnego.
8. Ustaw parametry podgrzewanego źródła ESI w skrzynce sterowniczej przyrządu oprogramowania strojeniowego w następujący sposób: natężenie przepływu gazu w osłonie 50; natężenie przepływu gazu pomocniczego 15; natężenie przepływu gazu przemiatającego 1; napięcie rozpylania 2,5 kV; temperatura kapilary 350 °C; Obiektyw typu S o poziomie RF 100; temperatura grzałki 350 °C.
9. Ustawić parametry akwizycji spektrometru mas w oknie ustawień instrumentalnych w następujący sposób: czas trwania metody 8 min; zawór przekierowujący, 3,5-6 min do spektrometru masowego, 0-3,5 i 6-8 min do marnotrawstwa; czas pracy 3,5 do 6 min; polaryzacja ujemna; napięcie CID źródła 15,0 eV; mikroskopy 3; nominalna moc rozdzielczości (przy m/z 200) 140 000; Tarcza AGC 1 x 10⁶; maksymalny czas jonowania 50 ms; liczba skanów 1; Zakres skanowania m/z 700-3,500; Profil typu danych widma.
10. Ustawić parametry chromatografu cieczowego w następujący sposób: temperatura pieca kolumnowego 20 °C; temperatura tacki na próbki 10 °C; program gradientu 0-0,5 min 5% B, 0,5-1 min 5-30% B, 1-3,5 min 30-40% B, 3,5-5 min 40-98% B, 5-6 min 98% B, 6-6,05 min 98-5% B, 6,05-8 min 5% B; natężenie przepływu 0,4 ml/min.
11. Usuń bąbelki, stukając w dno fiolek. Umieść fiolki z próbkami na stojaku na próbki i wstrzyknij 1,0 μl próbki za pomocą automatycznego podajnika próbek, aby rozpocząć analizę.
12. Otwórz pliki z surowymi danymi za pomocą oprogramowania przeglądarki i potwierdź, że wszystkie przejęcia zostały pomyślnie zakończone, w tym kontrole pozytywne i negatywne.
    Uwaga: Zazwyczaj dwa lub trzy piki obserwuje się w chromatogramie całkowitego prądu jonowego w czasie retencji 4-5,5 min, gdy DNA rozdymki jest pomyślnie amplifikowane i trawione.

5. Dekonwolucja i interpretacja

1. Uruchom oprogramowanie do dekonwolucji. Wybierz typ eksperymentu "auto extract (izotopowo rozdzielczy)".
2. Edytuj metodę przy użyciu następujących parametrów: masa wyjściowa M; S/N próg 3, względny próg liczebności 0; ładunek ujemny tak; obliczać chromatogram prądu jonowego wyekstrahowanego (XIC) tak; zakres m/z 700-3 500; nośnik ładunku H⁺; minimalna liczba wykrytych ładunków: 3; nukleotyd o stosunku izotopów; współczynnik dopasowania 80%; pozostałą część 0%; Weź pod uwagę nakładanie się tak; zakres ładowania 3-50; minimalna intensywność 1; Oczekiwany błąd intensywności 3.
   1. Zapisz jako nową metodę i wybierz ją.
3. Wybierz katalog, w którym znajdują się pliki danych pierwotnych. Wybierz pliki danych surowych do analizy i kliknij przycisk "Dodaj do kolejki".
4. Kliknij przycisk "Uruchom" w zakładce "Uruchom kolejkę", aby rozpocząć dekonwolucję.
5. Po zakończeniu kolejki wybierz wiersz i kliknij "Otwórz wynik" w górnym podpisie, aby uzyskać wyniki dekonwolucji.
6. Zinterpretuj wyniki mas monoizotopowych wyprowadzonych z pików w czasie retencji 4-5,5 min, korzystając z tabeli 4.

Wyniki

Trzy dostępne na rynku kolumny zostały ocenione pod kątem separacji długich oligonukleotydów przy natężeniach przepływu 100-400 μl/min. Porównano kolumnę krzemionki z szerokoporowym oktadecylowym łańcuchem węglowym (C₁₈), dostępną w handlu kolumnę monolityczną z poli(styrenu-diwinylobenzenu) (PS-DVB) (b) oraz kolumnę monolitu krzemionkowego wiązaną przez C₁₈ (c) (rysunek 1). Trzy pary dupleksów DNA (26, 37 i 53 pz) rozdzielono przy użyciu wszystkich kolumn, a w kolejnych badaniach wykorzystano monolityczną kolumnę krzemionkową wiązaną przez C₁₈.

Reprezentatywne wyniki analizy próbki DNA wyekstrahowanej z mięśnia T. rubripes pokazano na rysunku 2. Piki rozdzielone izotopowo, jak pokazano na rysunku 2a, są wymagane do pomyślnego obliczenia masy monoizotopowej. Teoretyczną i zmierzoną masę monoizotopową T. rubripes przedstawiono na rysunku 2b. Ponieważ trawienie endonukleazami odbywa się tuż po amplifikacji PCR bez oczyszczania, lepki koniec o długości 3 stóp generowany przez endonukleazę Msp I jest wypełniany pozostałą polimerazą DNA. Zgodnie z analizą amplikonów pochodzących z syntetycznych matryc DNA, dokładność masy wahała się od -2,48 do 2,40 ppm (średnio 0,62 ± 0,74 ppm, n = 280). W związku z tym do różnicowania gatunków zastosowano tolerancję masy wynoszącą 3 ppm (tabela 4). Korzystając z tabeli, wszystkie próbki rozdymki uzyskane z targowisk i sklepów zostały prawidłowo zróżnicowane jako poszczególne gatunki³⁷.

Zgodnie z okresową analizą próbki uzyskanej z syntetycznego matrycy DNA T. chrysops, wszystkie monoizotopowe masy analitów zostały pomyślnie określone w zakresie ± 3 ppm przez co najmniej 180 godzin bez żadnej kalibracji masy (Rysunek 3). Oznacza to, że wzorcowanie masy będzie wymagane co tydzień.

Rysunek 1: Chromatogramy całkowitego prądu jonowego produktu PCR-RFLP uzyskanego ze zsyntetyzowanej matrycy DNA T. pardalis przy użyciu kolumny krzemionki z cząstkami krzemionki wiązanej C 18 (a, 3×250 mm, wielkość cząstek 3 μm), monolitycznej kolumny z poli(styrenu-diwinylobenzenu) (PS-DVB) (b, 1,0×250 mm) i monolitycznej kolumny krzemionkowej C ₁₈ (c, teraźniejszej metody). Warunki dla lit. a): natężenie przepływu 0,2 ml/min; stosunek metanolu, 0-2 min 5%, 2-5 min 5%-25%, 5-20 min 25%-40%, 20-35 min 40%-98%, 35-50 min 98%, 50-51 min 98%-5%, 51-65 min 5%. Warunki dla lit. b): natężenie przepływu 0,1 ml/min; stosunek metanolu, 0-2 min 5%, 2-5 min 5%-25%, 5-35 min 25%-40%, 35-40 min 40%-98%, 40-55 min 98%, 55-56 min 98%-5%, 56-70 min 5%. Temperatura dla obu kolumn wynosiła 20 °C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki analizy surowych mięśni T. rubripes. (a) Typowe chromatogramy prądu jonów całkowitych i widmo masowe. b) Teoretyczne i zmierzone masy monoizotopowe produktów PCR-RFLP pochodzących ze zsyntetyzowanej matrycy DNA T. rubripes. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Test stabilności. Strawione amplikony pochodzące z syntetycznego DNA T. chrysops analizowano co 10 godzin. Podczas testu nie przeprowadzono kalibracji masy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

nazwa	kolejność
lago86F powiedział:	5ʹ-CCATGTGGAATGAAAAC-3ʹ
taki114F powiedział:	5ʹ-AAAAACAAGAGCCACAGCTCTAA-3ʹ
fugu86-114R	5ʹ-CCCTAGGGTAACTCGGTTCG-3ʹ

Tabela 1: Startery PCR.

Odczynnik do PCR	Wykorzystana objętość	Końcowe stężenie
Woda ultraoczyszczona	15,75 μl
Bez detergentów 5x bufor	5,0 μl	1x
Mieszanka dNTP (10 mM każdy)	0,5 μl	0,2 mM
Mieszanka podkładowa (po 10 μM lago86F, taki114F i fugu86-114R w buforze TE pH 8,0)	1,0 μl	0,4 μM każdy
Polimeraza DNA (2,5 jednostki/μl)	0,25 μl	0,1 jednostki/μl
Matryca DNA w buforze TE o pH 8,0 (5,0–10 ng/μl dla wyekstrahowanej próbki, 0,2 μM dla syntetycznego DNA jako kontrola pozytywna)	2,5 μl	0,5-1,0 ng/μl dla wyekstrahowanego DNA i 20 nM dla syntetycznego DNA
	Razem: 25 μl

Tabela 2: Składniki PCR w skali 25 μl.

cykl	warunek	funkcja
1	2 min przy 95 °C	Początkowa denaturacja
cyfra arabska	30 s w 95 °C	denaturacja
3	30 s przy 56 °C	Wyżarzanie
4	30 s w 72 °C	Wydłużenie
5	Powtórz 2-4 (łącznie 30 cykli)
6	7 min przy 72 °C	Wydłużenie końcowe
7	Przechowywać w temperaturze 12 °C do momentu usunięcia próbki

Tabela 3: Program PCR.

Szczytowa liczba przy czasie przechowywania 4,0-5,5 min	Masa monoizotopowa trzeciego piku w zakresie (Da)		Monoizotopowa masa drugiego piku w zakresie (Da)		Gatunki rozdymki
	Mniejsze pasmo	Większe pasmo	Mniejsze pasmo	Większe pasmo
2	→	→	15890.707–15890.803	16177.531–16177.629	L. inermis
			15921.702–15921.797	16146.537–16146.634	L. gloveri (L. gloveri)
			15930.713–15930.809	16137.525–16137.622	L. lunaris
			15937.697–15937.792	16131.537–16131.634	L. wheeleri
			24173.034–24173.179	24566.905–24567.053	T. chrysops (T. chryzop)
3	16295.706–16295.804	16467.610–16467.709	11341.851–11341.919	11466.875–11466.944	T. pardalis T. snyderi T. ocellatus T. xanthopterus T. stictonotus
			11654.908–11654.978	11770.920–11770.991	T. niphobles (T. niphobles)
	16296.701–16296.799	Nr katalogowy: 16468.605–16468.704	→	→	T. rubripes (T. rubripes)
	16311.701–16311.799	Nr katalogowy: 16452.610–16452.709	→	→	T. poecilonotus T. exascurus
	Nr kat. 16320.713–16320.811	Nr kat. 16443.599–16443.697	→	→	T. porphyreus T. obscurus (T. obscurus)
	16599.751–16599.851	16780.667–16780.767	→	→	T. vermicularis (wątroba)

Tabela 4: Różnicowanie mas rozdymkowatych od monoizotopowych pochodzących z LC/ESI-MS.

Tabela 5: Amplifikowana sekwencja DNA. a) Sekwencja jest identyczna z sekwencją innych gatunków rozdymkowatych, jak opisano w tabeli 4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej tabeli.

Dyskusja

Do ekstrakcji DNA stosuje się komercyjny zestaw do ekstrakcji DNA z krwi i tkanek zgodnie z protokołem producenta z niewielkimi modyfikacjami (ilość proteinazy K i odwirowanie roztworu do lizy). Jednak każdy zestaw do ekstrakcji może być użyty, o ile DNA komórkowe może zostać wyekstrahowane z odpowiednim odzyskiem i czystością do PCR. Ta metoda została przetestowana przy użyciu mięśni, płetw, wątroby, jajnika i skóry³⁷. Fin jest szczególnie odpowiedni ze względu na dużą powierzchnię, która umożliwia szybką lizę z proteinazą K. Próbki świeżych, mrożonych, suszonych, gotowanych i pieczonych rozdymek zostały pomyślnie przetestowane³⁷.

Zestaw starterów PCR (Tabela 1) jest przeznaczony dla rozdymek i wzmacnia mitochondrialny gen 16S rybosomalnego RNA rozdymki. Docelowe DNA do amplifikacji to 114-115 pz (rodzaj Takifugu) i 86 pz (rodzaj Lagocephalus) (Tabela 5). Aby ułatwić opracowanie metody, jako odniesienie wykorzystano zsyntetyzowane oligonukleotydy o sekwencjach docelowych, zamiast zbierać autentyczne okazy rozdymki. Zestaw starterów może być zastąpiony innym zestawem starterów w odpowiedzi na cel, jednak końcowa długość DNA po trawieniu enzymatycznym powinna być mniejsza niż 100 nt pod względem utrzymania jakości widma masowego wymaganej do udanej dekonwolucji. Dodatkowo, ciśnienie azotu w pułapce C powinno być zmniejszone, gdy docelowy oligonukleotyd jest dłuższy niż około 75 nt, a jakość widma masowego jest niewystarczająca do pomyślnej dekonwolucji. Takie ograniczenia można kontrolować za pomocą najnowszych osiągnięć w oprogramowaniu przyrządu, w przeciwnym razie zawór pułapki C wewnątrz podwozia musi być dostrojony zgodnie z opisem w sekcji protokołu. Jeśli chodzi o przygotowanie próbki, użycie odczynników niezawierających detergentów ma kluczowe znaczenie dla późniejszego LC pod względem odpowiedniego kształtu piku, wystarczającej intensywności piku i stabilnego czasu retencji³¹.

Do analizy oligonukleotydów LC/ESI-MS zastosowano monolityczną kolumnę monolityczną kapilarną PS-DVB, kolumnę^23,40,41 krzemionki z odwróconymi fazami C₁₈ oraz kolumnę⁴² chromatografii oddziaływań hydrofobowych (HILIC). Wśród nich kapilarna kolumna monolityczna przewyższa inne pod względem zdolności separacji, jednak kapilarna kolumna monolityczna stosowana w poprzednich badaniach została wykonana we własnym zakresie i pracowała przy niskim natężeniu przepływu (2 μl/min), co wymaga oprzyrządowania dedykowanego do mikro LC. Aby ułatwić obsługę, dostępne na rynku kolumny oceniono pod kątem separacji długich oligonukleotydów przy wyższych prędkościach przepływu (100-400 μl/min). Trzy pary dupleksów DNA (26, 37 i 53 pz) oddzielono za pomocą wyżej wymienionych kolumn, jednak czasy cyklu kolumny krzemionki z wiązaniem C₁₈ i kolumny monolitu PS-DVB wynosiły odpowiednio 65 i 70 min, podczas gdy kolumny monolitu krzemionkowego wiązanej C₁₈ wynosiły 8 min (ryc. 1). Biorąc pod uwagę szybką analizę, kolumna monolityczna z krzemionki C₁₈ została wybrana do naszych celów pomimo ograniczonej zdolności separacji; Jednakże pozostałe dwie kolumny mogą być zastosowane, gdy wymagana jest lepsza separacja. Teoretycznie w przypadku kolumny monolitycznej nie występuje objętość śródmiąższowa, a faza ruchoma byłaby zmuszona do przepływu przez pory fazy stałej przy zachowaniu stałej długości ścieżki, co umożliwiłoby skuteczną separację²⁷. Takie procesy przejawiałyby się, szczególnie w analizie biomakrocząsteczek, takich jak oligonukleotyd, jako powolna dyfuzja dużych cząsteczek. Jedną z praktycznych zalet kolumny monolitycznej jest to, że ciśnienie wsteczne jest niższe niż w kolumnie z cząstkami krzemionki²⁷. Pomimo wysokiego natężenia przepływu (400 μl/min) i niskiej temperatury kolumny (20 °C), maksymalne przeciwciśnienie systemu wynosiło 12,5 MPa³⁷. Jest to pierwsza demonstracja zalet monolitu krzemionkowego z wiązaniem C₁₈ do szybkiej analizy długiego oligonukleotydu. Ze względu na wysokie natężenie przepływu nie jest wymagany dedykowany przyrząd do mikro LC i precyzyjnego ustawiania na interfejsie. Zamiast tego wymagana jest podgrzana sonda ESI do dysocjacji dupleksu DNA i wspomagania jonizacji DNA, jak opisano później.

Chromatografia par jonowych jest powszechnie stosowana do rozdzielania oligonukleotydów zgodnego z MS. Jednak odczynnik par jonowych na ogół zakłóca proces ESI i zmniejsza czułość ESI-MS. Dlatego HFIP jest często stosowany w fazie ruchomej w celu poprawy wrażliwości oligonukleotydu. Jednak HFIP (temperatura wrzenia 59 °C) szybko odparowuje na granicy faz przed metanolem (temperatura wrzenia 65 °C), a zatem ta utrata rozpuszczalnika zwiększa pH i sprzyja dysocjacji odczynnika par jonowych (tj. TEA) od oligonukleotydu. Ponieważ obecna metoda wykorzystuje podgrzewaną sondę ESI, która nebulizuje eluat gorącym gazowym azotem w temperaturze 350 °C, efekt ten może być nadmiernie podkreślony. Zamiast buforu HFIP-TEA, Erb i Oberacher zalecili octan cykloheksylodimetyloamoniowy (CycHDMAA; pH 8,4) do analizy genotypowania ze względu na zmniejszenie tworzenia adduktów z jonami metali śladowych³³. Autorzy wywnioskowali, że CycHDMAA sam w sobie hamował tworzenie się adduktu metalu. Wbrew literaturze przedmiotu w niniejszej metodzie nie zaobserwowano istotnego powstawania adduktów. Dodatkowo, godną uwagi zaletą systemu HFIP-TEA-metanol jest to, że powierzchnia piku uzyskana za pomocą systemu HFIP-TEA-metanol była 17 razy większa niż uzyskana z systemu CycHDMAA-acetonitryl podczas analizy amplikonu 86 pz T. poecilonotus (dane nie pokazane). Jedną z wad systemu HFIP-TEA-metanol jest jednak zwiększony koszt w stosunku do systemu CycHDMAA-acetonitryl.

Obliczanie masy monoizotopowej wymaga rozdzielenia pików izotopowych jonów o wielokrotnym ładunku. W związku z tym rozdzielczość ma kluczowe znaczenie dla niniejszej analizy. Chociaż wymagana moc rozdzielcza zależy od długości pary zasad analitu, konwencjonalne analizatory TOF, które mają moc rozdzielczą rzędu kilkudziesięciu tysięcy, mogą być ograniczone do analizy krótkich oligonukleotydów.

Teoretyczne masy monoizotopowe przedstawione w tabeli 4 obliczono na podstawie odpowiednich składów zasadowych analitów. Alternatywnie, Muddiman i wsp. Opracowano aplikację do obliczania składu podstawowego na podstawie dokładnej masy⁴³. Podobny program został zintegrowany ze zautomatyzowanym systemem ESI-MS^16-18. Zastosowanie tych algorytmów może poprawić niezawodność obecnej metody, ponieważ zmierzona masa monoizotopowa nie zawsze odpowiada unikalnemu składowi zasadowemu ze względu na tolerancję masy wynoszącą 3 ppm wynikającą z nieuniknionego błędu pomiaru. Niestety, nie udało nam się uzyskać tych produktów oprogramowania do niniejszego badania.

Obecne monoizotopowe oznaczanie gatunków na podstawie masy może być odpowiednie nie tylko do różnicowania rozdymki, ale także do wykrywania innych polimorfizmów DNA, ponieważ obecna metoda opiera się na analizie składu zasad i nie obejmuje procedury specjalnie zaprojektowanej dla rozdymki. Jeśli chodzi o wykrywanie polimorfizmu DNA, dedykowany system ESI-MS jest w pełni zautomatyzowany i łatwy w obsłudze, co może być odpowiednie do zastosowań diagnostycznych, takich jak wykrywanie patogenów^{15,17,18,20,30}. Z drugiej strony, obecna metoda jest wykonalna przy użyciu powszechnie stosowanych instrumentów i aparatury badawczej, a zatem nadaje się do zastosowań badawczych. ESI-MS został już zastosowany do polimorfizmu ludzkiego DNA, takiego jak polimorfizm pojedynczego nukleotydu^13,28,32, krótkie powtórzenia tandemowe²⁶ i analsis mitochondrialnego DNA^16,19. Mikro RNA analizowano również za pomocą kapilarnego LC/ESI-MS⁴⁴. Te opublikowane aplikacje mogą być również realizowane za pomocą obecnej metody. Ponadto metoda ta może być odpowiednia do monitorowania interakcji między oligonukleotydami a związkami o niskiej masie cząsteczkowej, takimi jak oddziaływanie antybiotyków i rybosomalnego RNA⁴⁵ ze względu na separację w niskiej temperaturze. W takich przypadkach oligonukleotydy i związki o niskiej masie cząsteczkowej powinny być wykrywane jednocześnie, co jest zaletą stosowania LC/ESI-MS.

Istnieje ograniczenie polegające na tym, że oprzyrządowanie nie nadaje się do wykonywania analizy równoległej, jak w przypadku konwencjonalnych technik, takich jak sekwencjonowanie Sangera i PCR w czasie rzeczywistym. Ponadto obecna metoda identyfikuje tylko skład zasad i nie można rozróżnić żadnego podstawienia zasad w tej samej cząsteczce. Jednak opisana tutaj analiza DNA oparta na stwardnieniu rozsianym może nadal mieć zalety pod względem dokładności w porównaniu z technikami opartymi na barwniku wiążącym DNA, takimi jak elektroforeza żelowa i PCR w czasie rzeczywistym.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DNeasy Krew & Zestaw tkanek (50)	Qiagen	69504	Zestaw do ekstrakcji DNA
Proteinaza K	Qiagen	19131
Etanol (99,5+ obj.)	Wako	054-07225	Do rozcieńczania płuczących
Bufor TE (pH 8,0)	Wako	310-90023	Do rozcieńczania próbki DNA
Starter PCR	Fasmac	NA	Oczyszczony przez dostawcę z kolumną z wkładem z odwróconymi fazami
Matryca DNA	Eurofins Genomics	NA	Oczyszczona metodą HPLC przez dostawcę
Ultraoczyszczona woda	NA	NA	Generowana za pomocą systemu oczyszczania wody Milli-Q Direct (Merck Millipore), używanego do przygotowania próbki
Bez detergentów 5x Phusion HF Buffer	Thermo Fisher	F-520L	Użyj zamiast dostarczonego buforu polimerazy DNA
Pfu-X Polimeraza DNA	Jena Bioscience	Mieszanka PCR-207S
dNTP (po 20 mM)	Jena Bioscience	NA	Dostarczana z polimerazą DNA
10 i razy; Uniwersalny bufor M	Takara Bio	NA	Zawierający 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol i 500 mM NaCl
Dra I	Thermo Fisher	FD0224	Enzym restrykcyjny
Msp I	Thermo Fisher	FD0544	Enzym restrykcyjny
1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanol (HFIP)	Fluka	42060-50ML	Dodatek eluentowy do klasy LC-MS.
Trietyloamina (HERBATA)	Fluka	65897-50ML	Dodatek eluentowy do klasy LC-MS.
Kwas trifluorooctowy	Sigma-Aldrich	T6508	Do przygotowania kalibru.
Wodorotlenek sodu (1,0 M)	Fluka	72082	Rozcieńczyć do 10 mM ultraoczyszczoną wodą i użyć do miareczkowania kwasu trifluorooctowego.
Acetonitryl	Fluka	34967	Do przygotowania kalibru LC/MS.
Metanol	Kanto	25185-76	Do fazy ruchomej, klasa LC / MS.
Woda	Thermo Fisher	W6-1	Do fazy ruchomej, klasa LC / MS.
Probówka do mikrowirówek (0,5 ml)		Eppendorf	PCR clean grade
(1,5 ml)	Eppendorf	0030123328	PCR clean
grade UVette	Eppendorf	0030106300	Jednorazowa kuweta UV.
Gel Green	Biotium	41004	Fluorescencyjne barwienie DNA
Cosmospin filter G (0,2 μ m)	Nakalai Tesque	06549-44	Wykonany z hydrofilowej membrany z politetrafluoroetylenu (PTFE). Dowolna odśrodkowa jednostka filtrująca (wielkość porów, 0,2 cala; 0,5 μ m) wykonane z hydrofilowego PTFE lub innej membrany o niskim poziomie wiązania.
300 μ l Fiolka z zakrętką PP	Amerykańskie materiały chromatograficzne	V0309P-1232
Wstępnie zmontowana nakrętka i kolumna analityczna	septa Finneran	5395-09R
Monobis C18 (2,0 i razy; 50 mm, wielkość mezoporów = 30 nm)	Kyoto Monotech	2050H30ODS	Poza Japonią, dostępne do zakupu w GL Sciences za pośrednictwem jej dystrybutorów. (http://www.glsciences.com/distributors/)
Kolumna ochronna Monobis C18	Kyoto Monotech	GCSET-ODS3210	Uchwyt w komplecie.
Cadenza CW-C18 (3,0 razy; 250 mm)	Imtakt	CW036	C18-bonded kolumna krzemionkowa
ProSwift RP-4H (1,0&razy; 250 mm)	Thermo Fisher	066640	Monolityczna kolumna z poli(styrenu-diwinylobenzenu)
Themo Mixer C	Eppendorf	5382 000.023	Do trawienia tkanek ryb.
Spektrofotometr	Shimadzu	UV-3150	Kwantyfikacja stężenia DNA.
Termocykler	Bio-Rad	T100
Przenośna lodówka	Twinbird	D-CUBE	Do wodnej fazy ruchomej, aby uniknąć parowania HFIP. Można go zastąpić pojemnikiem na lód.
Chromatograf cieczowy Ultimate 3000	Thermo Fisher	NA
Q Exactive spektrometr masowy	Thermo Fisher	NA	Spektrometr mas z transformacją Fouriera wyposażony w zmodyfikowany analizator pułapek Kingdona.
Dekonwolucja białek 3.0	Thermo Fisher	NA	Użyj wersji 3.0 lub nowszej z izotopowym modelem wzoru nukleotydu.